Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Med användning av eten-frigörande förening, 2-kloretylfosfonsyra, som ett verktyg för att studera Eten Response i bakterier

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54682
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Microbial Biochemistry Laboratory, Faculty of Science (Applied Bioscience Program), University of Ontario Institute of Technology

Introduction

Olefinen eten (C2 H4) upptäcktes först som en växthormon 1901 när det konstaterades att ärta plantor, odlas i ett laboratorium som använde kol gaslampor, uppvisade en onormal morfologi där stammar (hypokotyler) var kortare, tjockare och böjd i sidled jämfört med normala ärter plantor; en fenotyp senare kallas triple svars 1,2. Senare studier har visat att eten är en viktig fytohormonerna som reglerar många utvecklingsprocesser som tillväxt, stress, fruktmognad och åldrande 3. Arabidopsis thaliana, en modellorganism för växtbiologisk forskning, har studerats i avseende på dess svar på eten. Flera eten mutanter svars har isolerats genom att utnyttja den tredubbla svars fenotypen observerats i mörker vuxen A. thaliana plantor i närvaro av eten 1,4,5. Den biosyntetiska prekursorn för etenproduktion i växter är 1-aminocyclopropane karboxylsyra (ACC) 6 och används ofta under trippel svar analys för att öka endogen etenproduktion som leder till det tredubbla svars fenotypen 1,4,5.

Även eten svaret studerats ingående i växter, är effekten av exogena eten på bakterier kraftigt understudied trots det nära sambandet av bakterier med växter. En studie rapporterade att vissa Pseudomonas stammar kan överleva med hjälp av eten som en enda källa för kol och energi 7. Dock har bara två studier har visat att bakterier svarar på eten. Den första studien visade att stammar av Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, och P. syringae var kemotaktiska mot eten med användning av en agarosplugg analys, i vilken smälta agarosen blandades med en kemotaxibuffert jämviktad med ren etylengas 8. Men så vitt vi vet, har det inte funnits något furthER rapporter med hjälp av ren etengas att karakterisera bakteriell eten svar, sannolikt på grund av den svårighet att hantera gaser i laboratoriet utan specialutrustning. Den andra rapporten av bakteriell eten svar visade att eten ökad bakteriecellulosaproduktion och påverkat genuttrycket i frukten associerade bakterie, Komagataeibacter (tidigare Gluconacetobacter) xylinus 9. I detta fall, eten-frisättande förening, var 2-kloretylfosfonsyra (CEPA) som används för tillverkning av eten in situ inuti den bakteriella tillväxtmediet, förbi behovet av ren eten gas eller specialutrustning.

CEPA producerar eten vid ett 1: 1 molförhållande över pH 3,5 10,11 genom en baskatalyserad, första ordningens reaktion 12-14. Nedbrytningen av CEPA är positivt korrelerad med pH och temperatur 13,14 och resulterar i produktionen av etylen, klorid och fosfat. CEPA förser forskare som är intresserade av att studera bakterie svar på eten med ett bekvämt alternativ till gasformig eten.

Det övergripande målet för följande protokoll är att tillhandahålla en enkel och effektiv metod för att studera bakteriell eten svar och inkluderar validering av fysiologiskt relevanta nivåer av etenproduktion från CEPA nedbrytning i bakterieodlingsmedium, analys av kultur pH säkerställa CEPA sönderfall inte försämras under bakterietillväxt och utvärdering av effekten av eten på bakteriell morfologi och fenotyp. Vi visar dessa protokoll med hjälp av K. xylinus emellertid dessa protokoll kan anpassas för att studera eten svar i andra bakterier genom användning av den lämpliga tillväxtmedium och fenotyp-analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kemikalier

  1. Bered en lösning av 500 mM CEPA (144,49 g / mol) och en lösning bestående av både 500 mM NaCl (58,44 g / mol) och 500 mM NaH 2 PO 4 • H2O (137,99 g / mol) i surgjordes (pH 2,5) ultra-rent vatten eller 0,1 N HCl. Blanda med hjälp av en virvel tills lösningarna är klara.
  2. Seriellt utspädd (10x) de 500 mM lösningar i samma lösningsmedel för erhållande av 5 mM och 50 mM lager.
  3. Förbered en 10 mM lösning av 1-aminocyklopropan karboxylsyra (ACC, 101,1 g / mol) i ultrarent vatten.
  4. Filtrera-sterilisera stamlösningar och butiks alikvoter vid -20 ° C.
  5. Filtrera-sterilisera cellulas. Förvara alikvoter vid 4 ° C.

2. Kontrollera etenproduktion från 2-kloretylfosfonsyra nedbrytningsprocess: Triple Response analys

  1. Utanpå sterilisera Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia frön Använda Vapor-fas Metod:
    VARNING: Följande steg alstrar toxiska klorgas. Genomför utsäde sterilisering i ett dragskåp.
    1. Skaffa en förslutningsbar behållare djupt nog att rymma en 250 ml glasbägare för utsäde sterilisering och placera den i ett dragskåp.
    2. Lägg A. thaliana frön till ett mikrocentrifugrör och placera röret i ett ställ. Placera stället som innehåller det öppna röret i den förseglingsbara behållaren.
      Obs! Fyll inte individuella rör över halvfullt att låta klorgas att penetrera de nedre frön.
    3. Placera en 250 ml bägare innehållande 100 ml kommersiellt blekmedel i förslutbar behållare. Tillsätt försiktigt 3 ml koncentrerad HCl till blekmedlet och omedelbart försegla behållaren med dess lock.
      VARNING: Bleach och HCl reagera för att producera giftig klorgas som verkar för att yt-sterilisera fröna.
    4. Inkubera fröna i närvaro av klorgas under 4 timmar i fumehood.
      Obs: Längre steriliseringstider minskar grobarheten effektivitet.
    5. Efter sterilisering tillåter chlorine gas att ventilera i dragskåp under minst en timme sedan försegla mikrocentrifugrör. Låta blekmedlet och HCl-blandningen i fumehood under minst 24 h före kassering.
      Obs: Steriliserade frön kan förvaras vid rumstemperatur för omedelbar användning.
    6. Hålla frön vid 4 ° C under långtidsförvaring. Ta frön till rumstemperatur innan du öppnar mikrocentrifugrör för att förhindra kondens. Förvara frön i mörker.
  2. Förbereda Agarplattor i 4-sektorpetriskålar (90 x 15 mm):
    1. Bered 110 ml av odlingsmedium för A. thaliana plantor: 1x Murashige och Skoog (MS) basal-medium 15 (4,33 g / L) innehållande 1% (vikt / volym) sackaros och 0,8% (vikt / volym) agar. Justera MS-medium till pH 6 med NaOH.
    2. Bereda 100 ml av bakterietillväxtmedium för CEPA sönderdelning: Schramm och Hestrin (SH) medium 16 innehållande 1,5% (vikt / volym) agar. Justera SH mediet till pH 7 med NaOH.
    3. Sterilisera media genom autoklavering och temper i ett 55 ° C vattenbad.
    4. När MS agar har härdat, tillsätt 40 ml till en steril flaska. För att förbereda den positiva kontrollen tillväxtmedium för A. thaliana plantor, komplettera 40 ml portion av MS-agar med 40 pl 10 mM ACC för att erhålla en slutlig koncentration av 10 | iM ACC.
    5. Tillsätt 5 ml medium till lämpliga kvadranter av sektorpetriskålar (Figur 1) och låta ägarn stelna. Förbered alla plattor i tre exemplar.
      Obs: CEPA läggs inte till tillväxtmediet förrän senare i protokollet.

Figur 1
Figur 1:. Inställning av agarplattor som används för trippel-respons-analysen med CEPA En schematisk illustrerar kvadranterna som är specifika för den negativa kontrollen (A), positiv kontroll (B), och experimentella plattor (C). Denna siffra har modifierats Augimeri och Strap 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Stratify A. thaliana frön att säkerställa synkron Groning:
    1. Tillsätt ungefär femtio A. thaliana frön på varje kvadrant innehåller MS eller MS + ACC agar. Säkerställa fröna jämnt fördelade för att underlätta plantor bort och analys.
    2. Inkubera plattorna innehåller frön i mörker vid 4 ° C under 3-4 dagar.
  2. Sönderdelas CEPA på bakterietillväxt Medium (SH) och Utför Triple Response analys:
    1. Efter skiktning, utsätta fröna till fluorescerande ljus under 2 h.
    2. Sprid 10 pl av 500 mM CEPA lager lösningen på kvadranter av de experimentella plattor innehållande SH agar (pH 7; Figur 1) för att erhålla en slutlig CEPA koncentrationav 1 mM.
    3. Täta plattor med laboratoriefilm och täck med folie för att skapa en mörk omgivning för fröna.
    4. Gro frön genom att inkubera plattorna i mörker vid 23 ° C under 3 dagar med agar sidan nedåt.
      Obs: Plattorna kan staplas, men negativa kontroller ska placeras på botten eftersom eten är lättare än luft.
  3. Analysera Triple Response analysdata:
    1. Med brand steriliserade pincett, ta bort enstaka plantor från en platta som motsvarar varje behandling och visa under en dissekera eller digital USB mikroskop. Säkerställa botten av plantorna är i linje och fotografi.
    2. Ta bort 30 plantor från varje kvadrant (60 plantor per biologisk replikera och 180 plantor per behandling). Passa på en yta med en svart bakgrund och fotografera med en linjal.
    3. Mät hypokotyl längd (mm) av upprepade plantor med hjälp av ImageJ programvara 17. Ställ in skala genom att klicka och dra * Straight *verktyg för att välja en längd av 10 mm. Välj "Set Scale" under fliken "Analysera" och ställa det kända avståndet till 10. Använda * Segmenterad * verktyg, klicka och dra för att välja längden på hypokotyl och tryck på M för att mäta avståndet. Jämföra hjälp av biologiska replikat med användning av en envägs ANOVA med ett Tukeys multipla jämförelsetest. Skillnaderna anses signifikanta om p <0,05.

3. Analys av pH under bakterietillväxt

  1. Växa och kvantifiera Komagataeibacter xylinus Starter Cultures i tre exemplar:
    1. Ympa en enda koloni av K. xylinus in i 5 ml av SH-medium (pH 5) som kompletterats med 0,2% (vol / vol) filtersteriliserad cellulas. Inkubera kulturer vid 30 ° C under omröring vid 150 rpm tills en OD 600 av 0,3-0,4 uppnåtts (ca 72 h).
    2. Harvest startkulturer genom centrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Med 5 ml steril 0,85% (vikt / volym) NAcl lösning, tvätta cellerna två gånger och resuspendera cellpelleten. Håll celler på is.
    3. Kvantifiera celler med hjälp av en Petroff-Hausser räknekammare.
  2. Inokulera kulturer för analys av pH:
    1. Tillsätt 150 ml SH-buljong (pH 7) kompletterad med 0,2% (vol / vol) filtersteriliserad cellulas till tolv 500 ml kolvar med folielock. Inokulera kolvar med K. xylinus startkulturer vid en koncentration av 10 5 celler / ml. Med användning av de tre startkulturer, förbereda tre biologiska replikat per behandling.
    2. Tillägg kulturer med 300 ul av de 5, 50, eller 500 mM CEPA stamlösningar för erhållande av slut CEPA koncentrationer av 0,01, 0,1, och 1,0 mM, respektive. Komplettera de obehandlade kontrollkulturer med 300 | il av det använda lösningsmedlet för upplösning av CEPA.
    3. Försegla kolvarna genom tätt tejpning folielocken till kolvarna och inkubera kulturer under 14 dagar vid 30 ° C under omröring vid 150 varv per minut.
  3. Varje dag, aseptically avlägsna 5 ml prov från varje kolv och pelletceller genom centrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Överföra supernatanterna till ett rent rör och mäta pH för varje biologisk replikat med användning av en pH-mätare.
  4. Analysera data tidsförloppet genom grafmedel pH av de biologiska replikat.
    Obs: Det är viktigt att kulturen pH inte sjunker under 3,5; en kultur pH av 5 minskar avsevärt eten befrielse från CEPA, och ett pH-värde under 3,5 hämmar helt eten release.
  5. För att kontrollera klor och fosfatnivåer, utföra ett identiskt experiment med 0,01, 0,1 och 1,0 mM 4 lösning NaCl-NaH 2 PO hjälp av 5, 50 och 500 mm lager, respektive.

4. Colony Morfologi

  1. Växa K. xylinus startkulturer i tre exemplar:
    1. Ympa en enda koloni av K. xylinus in i 5 ml av SH-medium (pH 5) som kompletterats med 0,2% (vol / vol) filtersteriliserad cellulas. Incubate kulturer vid 30 ° C under omröring vid 150 varv per minut tills en OD 600 av 0,3 till 0,4 uppnås (ca 72 h).
    2. Harvest startkulturer genom centrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Med 5 ml steril saltlösning, tvätta cellerna och sedan resuspendera cellpelleten. Håll celler på is.
  2. Förbered 24 agar plattor innehållande 25 ml SH (pH 7) medel med 1,5% (vikt / volym) agar.
  3. När ägarn har stelnat, spreds 50 pl av 5, 50, och 500 mM CEPA stamlösningar på agar för att erhålla slutliga CEPA koncentrationer av 0,01, 0,1, och 1,0 mM, respektive. Ställ upp obehandlade och kontrollplattor med lösningsmedel, som består av någon ändring och spridning av 50 pl av lösningsmedel som används för att lösa testföreningarna.
  4. Streak plattor för isolerade kolonier med en slinga full (~ 5 pl) av K. xylinus startkultur och täta dem med paraffinfilm. Ympa alla plattor i tre exemplar. Inkubera plattorna under fem dagar vid 30 ° C.
  5. Photograph kolonier vid 20X förstoring med hjälp av en digital USB mikroskop och kvalitativt bedöma koloniala morfologi och cellulosaproduktion på fast medium.
    Obs: Cellulosa visas som en dimmig ämne längs kanten av kolonin.
  6. För att kontrollera klor och fosfatnivåer, utföra ett identiskt experiment med 0,01, 0,1 och 1,0 mM 4 lösning NaCl-NaH 2 PO hjälp av 5, 50 och 500 mm lager, respektive.

5. pellikel Analyser

  1. Växa och kvantifiera K. xylinus startkulturer i tre exemplar:
    1. I tre exemplar, ympa en enda koloni av K. xylinus in i 5 ml av SH-medium (pH 5) som kompletterats med 0,2% (vol / vol) filtersteriliserad cellulas. Inkubera kulturer vid 30 ° C under omröring vid 150 rpm tills en OD 600 av 0,3-0,4 uppnåtts (ca 72 h).
    2. Harvest startkulturer genom centrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Med 5 ml steril saltlösning, tvätta than cellerna två gånger och resuspendera cellpelleten. Håll celler på is.
    3. Kvantifiera celler med hjälp av en Petroff-Hausser räknekammare.
  2. Förbereda master mixar till Inokulera 24-brunnars plattor:
    1. Supplement 60 ml SH-medium (pH 7) med 120 | il av 5, 50, och 500 mM CEPA lagren för att erhålla slutliga CEPA koncentrationer av 0,01, 0,1, och 1,0 mM, respektive. Komplettera ytterligare 60 ml av SH-medium (pH 7) med 120 pl av det använda lösningsmedlet för upplösning av CEPA. Vortex för att blanda.
    2. Dela varje 60 ml CEPA-medium i fyra 14 ml portioner. Inokulera tre av de 14 ml alikvoter med biologiska replikat av startkultur vid en koncentration av 10 5 celler / ml. Håll rören med celler på is för att förhindra cellulosaproduktion.
      Notera: De återstående 14 ml alikvot kommer att användas för sterila kontrollbrunnar.
  3. Inokulera 24-brunnsplattor:
    1. Testa varje behandling i sin egen tallrik med tre rader av biologiska replikat ochen rad av sterila kontroller (Figur 2).

figur 2
Figur 2:. Flödesschema som illustrerar protokollet som används för hinnan-analys och analys Stock CEPA-kompletterat pH 7 SH-medium (60 ml) alikvoteras för tre separata biologiska replikat inokuleringar och en steril kontroll (14 ml vardera). Dessa kulturer därefter i alikvoter i sex tekniska replikat (2 ml) i en 24 brunnars platta och sedan förseglas med paraffin film. Efter inkubation under 7 dagar vid 30 ° C, är pellicles skördas och kännetecknas genom att bestämma våtvikt, tjocklek, torrvikt, och kristallinitet av FT-IR. Klicka här för att se en större version av denna siffra

  1. Använda 14 ml Master Mix, tillsätt 2 ml i EACh på sex brunnar i en steril 24-brunnars platta. Slutföra de tre biologiska replikat och steril kontroll (Figur 2). Upprepa för varje behandling.
  2. Tätningsplattor med paraffin film och inkubera statiskt under 7 dagar vid 30 ° C.
  1. Skörd och Mät pellikel Våt vikt, tjocklek, torr vikt (cellulosautbytet) och Kristallinitet (Figur 2):
    1. Tryck ena sidan av hinnan för att höja den motstående hinna kanten och ta bort enskilda pellicles med pincett. Bibehållen grepp, placera dem på nytt papper handduk för tre sekunder för att avlägsna överskott medium innan vägning för att bestämma deras våta vikter.
    2. Rikta pellicles intill en linjal och fotografi från sidan med hjälp av en digitalkamera med hög upplösning.
    3. Använda ImageJ programvara 17 mäta hinna tjocklek på vänster axel, höger axel och mitten av varje hinna. Genomsnitt alla tekniska replikat för varje biologisk Replicate.
    4. Individuellt överföra pellicles i brunnarna på en 6-brunnsplatta. Behandla pellicles med 12 ml av 0,1 N NaOH vid 80 ° C under 20 min för att lysera cellerna.
    5. Avlägsna NaOH och neutralisera pellicles genom tvättning med ultra-rent vatten under 24 timmar med omrörning. Byt vatten varje sex timmar.
      Notera: Pellicles bör vara vit vid fullbordan av tvättsteget.
    6. Place pellicles på kiselmattor och torka vid 50 ° C under 48 h till konstant vikt. När torr, ta bort från mattor och mäta hinna vikter på en analytisk skala för att bestämma bakteriecellulosautbytet.
    7. Analysera hinna kristallinitet med hjälp av Fourier-transform infraröd spektroskopi (FT-IR) med hjälp av 32 skanningar och en upplösning på 4 cm -1 i intervallet 4000 till 650 cm -1. Beräkna kristalliniteten index, CI (IR), med A 1437 / A 895; absorbansen förhållandet mellan "kristallina band" och "amorf band" som tidigare beskrivits 18.
    8. För att kontrollera klor och fosfatnivåer, utföra ett identiskt experiment med 0,01, 0,1 och 1,0 mM 4 lösning NaCl-NaH 2 PO hjälp av 5, 50 och 500 mm lager, respektive.
    9. Analysera hinna Data:
      1. Beräkna pellikel hydratisering genom bestämning av skillnaden mellan hinnan våtvikt och torrvikt.
      2. Genomsnitt värdena för alla tekniska replikat för att erhålla ett enda värde för varje biologisk replikera för statistisk analys. Jämföra behandlingar med användning av en envägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest. Skillnaderna är signifikanta om p <0,05.
      3. Normalisera data som procent av obehandlade kontroller och plotta hjälp av biologiska replikat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En schematisk platta setup för verifiering av eten befrielse från CEPA i SH-medium (pH 7) vid trippelsvarsanalysen visas i figur 1A - C. Ett flödesschema som illustrerar pellikeln protokoll visas i figur 2. Mörker-odlade A. thaliana plantor uppvisar trippel svar fenotyp (kortare och tjockare hypokotyl med en överdriven apikal krok) i närvaro av ACC och i närvaro av eten som produceras genom nedbrytning av CEPA på SH-medium (pH 7), men inte i obehandlade villkor (Figur 3A) 9. Hypokotyl längd ACC- och CEPA-härledda eten behandlad A. thaliana frön var signifikant (p <0,0001) kortare än obehandlade kontroller (Figur 3B) 9, vilket bekräftar att eten släpptes från CEPA på SH-medium (pH 7) vid en fysiologiskt relevant koncention. PH-värdet hos obehandlade och CEPA-behandlade K. xylinus kulturer kvar över 5 (Figur 4) 9; därför CEPA nedbrytning i eten inte försämras på grund av bakteriell organisk syraproduktion. CEPA-derived etylen ökad bakteriecellulosaproduktion när K. xylinus odlades på fast SH-medium (pH 7) (Figur 5) 9. Alla koncentrationer av CEPA-härledda eten minskat betydligt hinna våtvikt (Figur 6A), påverkade inte hinna tjocklek (figur 6B) och avsevärt ökad hinnan torrvikt (cellulosautbytet, Figur 6C) 9. Ett representativt foto tas för pellikel tjockleksmätning visas i figur 7. Pellikel hydratisering minskades med alla koncentrationer av CEPA-härledda etylen (Figur 8A) 9, medan alla koncentrationer av CEPA-härledda etylen 9 ökade pellicle kristallinitet (Figur 8B). Effekterna av NaCl och NaH 2 PO 4 var obetydlig i samtliga fall (data ej visade) bekräftar att observerade fenotyper orsakades av CEPA-derived eten.

Figur 3
Figur 3: CEPA sönder på SH-medium (pH 7) för tillverkning av eten Digital USB mikroskopfotografier visar att mörk vuxen A.. thaliana plantor visar trippel svar fenotypen (kortare hypokotyl, tjockare hypokotyl och överdrivna apikala krok) när den odlas i närvaro av ACC och CEPA-härledda eten jämfört med den obehandlade kontrollen (A). Hypokotyl längd av plantor som odlas i närvaro av ACC och CEPA-härledda eten var significantly kortare än den obehandlade kontrollen (B). Skalstreck = 1 mm. Felstaplar visar SD (n = 3). Barer med olika bokstäver är signifikant olika (p <0,0001). Denna siffra har modifierats Augimeri och Strap 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: pH-värdet för K. xylinus kulturer förblir tillräckligt hög för CEPA nedbrytning i SH-medium (pH 7). förblir Kulturen pH över 5, vilket tillåter för effektiv sönderdelning av CEPA i etylen under hela bakterietillväxten cykeln. PH-värdet för K. xylinus kulturer måste övervakas eftersom de utsöndrar och resorberar organiska syror. Legenden visar CEPA testade koncentrationerna. Notera att y-axeln börjarvid pH 5. Felstaplar visar SD (n = 3). Denna siffra har modifierats Augimeri och Strap 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: CEPA-härledda etylen ökar cellulosaproduktion av K. xylinus på ett fast medium. K. xylinus odlades på SH-agarplattor (pH 7) som var obehandlade (A), eller förbehandlade med surgjord (pH 2,5) ultrarent vatten (B), fosfat och klorid (C - E) eller CEPA (F - H ). Representativa kolonier visas. Pilen visar cellulosa som produceras av K. xylinus, ses som oklar substans runt kolonin. Skalstreck = 0,5 mm. Denna siffra has ändrats från Augimeri och Strap 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: CEPA-härledda etylen minskar den vattenhållande kapaciteten och ökar utbytet av K. xylinus cellulosa pellicles. Kulturer odlades statiskt i SH-buljong (pH 7) kompletterad med CEPA i 24-brunnars plattor och inkuberades vid 30 ° C under 7 dagar innan pellicles skördades och analyserades. CEPA-derived eten minskade hinna våtvikt (A), hade ingen effekt på hinnan tjocklek (B) och ökad hinnan torrvikt (C). De olika CEPA behandlingar var inte signifikant från varandra. Felstaplar visar SD (n = 3). barer medolika bokstäver är signifikant olika (p <0,05). Denna siffra har modifierats Augimeri och Strap 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7: representant fotograferar av K. xylinus pellicles. Hinna tjocklek mättes från fotografier med ImageJ programvara. Skala bar = 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8: CEPA-härledda eten minskade hydrering avK. xylinus cellulosa pellicles genom att öka pellikel kristallinitet. Kulturer odlades statiskt i SH-buljong (pH 7) i 24-brunnars plattor och inkuberades vid 30 ° C under 7 dagar innan pellicles skördades och analyserades. Pellikel hydratisering beräknades som skillnaden mellan hinnan våt och torr vikt. CEPA-derived eten reducerade hinna hydrering (A) genom att öka hinna kristallinitet (B). De olika CEPA behandlingar var inte signifikant från varandra. Felstaplar visar SD (n = 3). Barer med olika bokstäver är signifikant olika (p <0,05). Denna siffra har modifierats Augimeri och Strap 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder som beskrivs här beskriva in situ produktion av eten från CEPA för studier av bakteriell eten svar med hjälp av modellorganism, K. xylinus. Denna metod är mycket användbar som eten kan framställas genom att komplettera någon vattenhaltigt medium som har ett pH större än 3,5 10,11 med CEPA eliminerar behovet för ren etylengas eller specialiserad laboratorieutrustning. Denna metod är inte begränsad till att studera effekterna av CEPA härrörande eten på bakterier, men kan också anpassas för att studera eten svar i eukaryota organismer. Det är viktigt att parallellt kontrollexperiment utföras med fosfat och klorid, eftersom dessa föreningar är också produceras av CEPA nedbrytning in situ. En annan nödvändig kontroll är att avgöra om CEPA själv utövar en direkt effekt på de mikrobiella kulturerna under utredning. Fysiologiskt irrelevanta etenkoncentrationer producerades när K. xylinus kulturer vire odlas i ett pH 5 SH-medium och därför tjäna som en kontroll för CEPA effekter 9; emellertid detta tillvägagångssätt fungerar bara för syratoleranta organismer.

Användningen av CEPA härrörande eten för biologiska studier i ett vattenbaserat odlingsmedium kräver kontroll av att eten faktiskt produceras inom systemet. Den här beskrivna metoden utnyttjar A. thaliana trippel respons-analys som utnyttjar den tredubbla svars fenotypen som uppvisas av mörka vuxna plantor i närvaro av eten 1. Petriskålar uppdelade i fyra kvadranter tillåta plantorna som skall odlas i MS-medium var för sig, men i anslutning till den relevanta mikrobiella tillväxtmediet. Applicering av CEPA lösningen på den mikrobiella tillväxtmediet underlättar etenproduktion och exponerar de intilliggande plantor till en exogen källa av eten som det infiltrerar gasutrymmet. Komplettering av MS-medium med ACC ger en positiv kontroll eftersom det stärker den endogena produktenion av eten av A. thaliana och efterföljande induktion av trippelsvars fenotypen.

Kultur pH är en annan viktig faktor vid framställning av eten från CEPA i mikrobiell tillväxt mediet 13,14. SH-medium som vanligtvis används för att odla K. xylinus har ett pH av ca 5, som väsentligen minskar produktionen av CEPA-härledda eten (Augimeri och rem, opublicerade data); Därför byttes mediet justerades till pH 7 9. Detta överensstämmer med andra studier som visade att graden av CEPA fördelningen är extremt långsam vid eller under pH 5, medan den har ökat avsevärt vid pH 7 13. Det är därför viktigt att säkerställa att tillväxtmediet av testorganismen förblir över pH 5. K. xylinus kulturer nådde en lägsta pH av cirka 5,5, vilket möjliggör utveckling av eten 9. Det är viktigt att notera att den absoluta koncentrationen av eten inte kan kontrolleras i enlighet med dessa odlings cILLKOR.

Effekten av CEPA-derived eten på tillväxten, cellulosaproduktion och hinna egenskaper K. xylinus användes för att illustrera att bakterieeten svar kan undersökas med hjälp av CEPA. Anpassning av dessa metoder för att studera eten svar i andra organismer är så enkelt som att ändra tillväxtmediet och fenotyp analyser. Användningen av CEPA förser forskare med en bekväm ersättning för etylengas och kan uppmuntra fler eten-medierad studier i bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) Sigma A3903 Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish Phoenix Biomedical CA73370-022 For testing triple response
Agar BioShop AGR001.1 To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera Canon 3818B004 For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921  Sigma C2730 Aqueous solution
Citric acid BioShop CIT002.500 For SH medium
Commercial bleach Life Brand 57800861874 Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl BioShop HCL666.500 Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope Plugable N/A For pictures of colonies
Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) Sigma C0143 Ethylene-releasing compound
Glucose BioBasic GB0219 For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 ATCC 53582 Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube LifeGene LMCT1.7B 1.7 ml microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium  Sigma M5519 Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O  BioShop SPD579.500 Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl BioBasic SOD001.1 Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O  BioShop SPM306.500 Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH BioShop SHY700.500 Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film Parafilm PM996 For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological) BioShop PEP403.1 For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific 3900 Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm VWR 28145-501 For sterilizing cellulase
Sucrose BioShop SUC600.1 Sucrose for MS medium
Yeast extract BioBasic G0961 For SH medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
  2. Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
  3. Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
  4. Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
  5. Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
  6. Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
  7. Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
  8. Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
  9. Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
  10. Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
  11. Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
  12. Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
  13. Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
  14. Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).

Tags

Biokemi 2-kloretylfosfonsyra CEPA etylen, Bakteriell cellulosa hinna trippel svarsanalys,
Med användning av eten-frigörande förening, 2-kloretylfosfonsyra, som ett verktyg för att studera Eten Response i bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Augimeri, R. V., Varley, A. J.,… More

Augimeri, R. V., Varley, A. J., Strap, J. L. Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria. J. Vis. Exp. (117), e54682, doi:10.3791/54682 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter