Introduction
올레핀 에틸렌 (C 2 H 4)는 석탄 가스 램프를 사용하여 실험실에서 성장 완두콩 모종, (배축)이 짧았다 유래 된 비정상적인 형태를 나타낸다 관찰되었을 때 제 1901 식물 호르몬으로 발견 두꺼운 정상 완두콩 모종에 비해 옆으로 구부러진; 표현형 나중에 트리플 응답 1,2라고. 후속 연구는 에틸렌은 성장, 스트레스 반응, 과일 숙성 및 노화 3. 애기 장대 식물 생물학 연구를위한 모델 생물로 다수의 발달 과정을 조절하는 중요한 phytohormone가 잘 에틸렌에 대한 응답에 관해서 연구되어왔다 있음을 보여 주었다. 몇몇 에틸렌 반응 돌연변이 어두운 자란 A. 관찰 트리플 반응 표현형을 이용하여 분리 된 에틸렌 1,4,5의 존재 장대 모종. 식물에서 에틸렌 생합성 제조를위한 전구체는 1-A 인minocyclopropane 카복실산 (ACC) (6)과 공통 트리플 응답 표현형 1,4,5 리드 내생 에틸렌 생산을 증가시키는 트리플 응답 분석시 사용된다.
에틸렌 반응은 식물에 널리 연구되고 있지만, 세균에 외인성 에틸렌의 효과는 크게 식물 세균의 확대에도 불구 파악 하였다 연관된다. 한 연구는 특정 슈도모나스 균주는 탄소와 에너지 (7)의 유일한 소스로 에틸렌을 사용하여 살아남을 수 있다고보고했다. 그러나,이 연구는 박테리아가 에틸렌에 반응 것을 증명하고있다. 첫 번째 연구는 보여 주었다 녹농균, P.의 균주 fluorescens, P. 푸티 및 P. syringae 용융 아가 순수한 에틸렌 가스 (8) 평형화 화성 완충액과 혼합 한 아가 플러그 어 세이를 사용하여 에틸렌을 향해 주 화성이었다. 그러나, 우리의 지식, 더 푸르트는 없었다순수한 에틸렌 가스를 사용하여 응급실 보고서 때문에 특별한 장비없이 실험실 가스 운반의 성사 때문일 세균 에틸렌 응답을 특성화한다. 세균 에틸렌 반응의 두번째 보고서 에틸렌 9 xylinus 과일 관련 세균 Komagataeibacter (이전 Gluconacetobacter)에서 박테리아 셀룰로오스 생산 영향 유전자 발현이 증가하는 것이 보였다. 이 경우에, 에틸렌 - 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 포스 폰산 (에 CEPA)은 순수한 에틸렌 가스 또는 특수 장비에 대한 필요성을 우회하여 박테리아 성장 배지 내에서 동일계 에틸렌을 제조 하였다.
- 14 염기 - 촉매, 일차 반응 pH를 3.5 내지 12 10,11 전술 한 몰 비율은 1 CEPA 에틸렌을 생성한다. CEPA의 열화가 긍정적 에틸의 제조에서 pH와 온도를 13, 14 및 결과와 상호 관련엔, 염화 인산염. CEPA는 기체 에틸렌 편리한 대안 에틸렌 박테리아 응답을 공부에 관심있는 연구자를 제공합니다.
다음 프로토콜의 전반적인 목적은 박테리아의 에틸렌 반응을 연구하는 간단하고 효율적인 방법을 제공하는 박테리아 성장 배지의 CEPA 분해로부터 에틸렌 생산의 생리 학적 관련성 레벨 검증을 포함하는, 배양 pH를 분석 CEPA 분해가 동안 손상되지 않게하려면 세균의 성장 및 박테리아 형태 및 표현형에 에틸렌의 효과 평가. 우리는 K.을 사용하여 이러한 프로토콜을 보여 xylinus 그러나, 이러한 프로토콜들은 적절한 성장 배지를 사용하여 표현형 분석하여 다른 세균에서 에틸렌 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다.
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Protocol
1. 화학
- 500 밀리미터의 NaH 2 PO 4 · 산성화의 H 2 O (137.99 g / mol)의 (PH 500 mM의 CEPA (144.49 g / 몰)의 용액에, 두 500 mM의 염화나트륨 (58.44 g / 몰)로 이루어진 용액을 준비 2.5) 초순수 0.1 N 염산. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다.
- 직렬 5 mM 내지 50 mM의 축적량을 획득하기 위해 동일한 용매 (10 배), 500 mM의 용액을 희석.
- 초순수의 1-aminocyclopropane 카르 복실 산 (101.1 g / 몰 ACC)의 10 mM의 솔루션을 준비합니다.
- 살균 필터 -20 ° C에서 원액 저장할 분취한다.
- 필터 - 소독 셀룰라아제를. 4 ° C에서 보관 씩.
2- 클로로 에틸 산 분해 2. 확인 에틸렌 생산 : 트리플 응답 분석
- 기상 방법을 사용하여 생태형 컬럼비아 씨앗 장대 애기 장대를 표면 소독 :
주의 : 다음 단계는 t을 생산호기 염소 가스. 흄 후드에서 종자 소독을 실시한다.- 종자 살균을위한 250 ml의 유리 비커를 수용하고 흄 후드에 배치 깊은 충분히 밀폐 용기를 얻습니다.
- A. 추가 장대 미세 원심 관에 씨와는 랙에 튜브를 배치합니다. 밀봉 가능한 용기에 오픈 튜브를 포함하는 선반을 두십시오.
참고 : 염소 가스가 낮은 씨앗을 통과 할 수 있도록 반 전체에 걸쳐 개별 튜브를 기입하지 마십시오. - 밀봉 가능한 용기에 상업 표백제 100 ㎖를 포함하는 250 ㎖의 비커를 놓습니다. 조심스럽게 표백제에 진한 염산 3 ㎖를 추가하고 즉시 뚜껑이있는 용기를 밀봉.
주의 : 표백제 HCl을 씨앗 표면 살균 작용 독성 염소 가스를 생성하는 반응. - fumehood 4 시간 동안 염소 가스의 존재하에 씨를 부화.
참고 : 긴 살균 시간은 발아 효율을 감소시킬 것이다. - 멸균 후, C 허용hlorine 가스는 적어도 1 시간 동안 흄 후드 벤트 microcentrifuge 관을 밀봉합니다. 폐기하기 전에 최소 24 시간의 fumehood에 표백제 및 염산의 혼합물을 둡니다.
주 : 소독 종자 즉시 사용을 실온에서 저장 될 수있다. - 장기 저장을 위해 4 ° C에서 씨앗을 보관하십시오. 응축을 방지하기 위해 microcentrifuge 관을 열기 전에 실온 씨앗을 가지고. 어둠에 보관 씨앗.
- 4 부문 페트리 접시 (90 X 15mm)에 한천 플레이트를 준비합니다 :
- A. 성장 배지 110 mL로 준비 장대 모종 : 1X 무라 시게 및 1 % 함유 스쿡 (MS) 기본 배지 (15) (4.33 g / L) (w / v)를 수크로오스 0.8 % (W / V) 한천. NaOH로 pH를 6으로 MS 매체를 조정합니다.
- CEPA의 분해 박테리아 성장 배지 100㎖를 준비한다 슈람 및 Hestrin 16 1.5 %를 함유하는 (SH) 매체 (W / V) 한천. NaOH로 pH를 7로 SH 매체를 조정합니다.
- 고압 증기 멸균 및 템피에 의해 미디어를 소독55 ° C의 물을 욕조에 연구.
- MS는 한천이 강화되면, 멸균 플라스크에 40ml를 추가합니다. A.에 대한 양성 대조군 성장 배지를 제조 장대 모종 10 μM ACC의 최종 농도를 얻기 위해 10mM의 ACC 40 μL와 MS 한천의 40 ml의 분취 량을 보완.
- 섹터 배양 접시 (그림 1)의 해당 사분면에 매체의 5 ML을 추가하고, 한천이 응고 할 수 있습니다. 세중의 모든 접시를 준비합니다.
주 : CEPA 나중에 프로토콜까지 성장 배지에 첨가되지 않는다.
그림 1 :. CEPA와 트리플 응답 분석에 사용 한천 플레이트의 설치 개략도합니다 (음성 대조군 (A), 양성 대조군 (B)에 대한 특정 사분면, 실험 판을 보여줍니다C). 이 그림은 Augimeri과 스트랩 (9)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 계층화 된 A. 장대 씨앗 동기 발아를 확인합니다 :
- 약 오십 A. 추가 MS 또는 MS + ACC 한천을 포함하는 각 사분면 상 장대 씨앗. 확인 씨가 균일하게 종묘 제거 및 분석을 용이하게하기 위해 배포됩니다.
- 판 4에서 어둠 속에서 씨앗을 포함 품어 3~4일에 대한 C를 °.
- 트리플 응답 분석을 세균 성장 중간에 CEPA (SH)를 분해 수행
- 층화 한 후, 2 시간 동안 형광등에 씨앗을 노출.
- SH 한천 함유 실험 판의 사분면에 500 mM의 CEPA 스톡 용액 10 μl를 확산 (PH 7;도 1) CEPA 최종 농도를 수득1 mm의.
- 실험실 필름과 판을 밀봉하고 종자 어두운 환경을 만들기 위해 호일로 다룹니다.
- 아래 한천 측면로 3 일 동안 23 ° C에서 어둠 속에서 판을 배양하여 씨앗을 발아.
주 : 매 적층 될 수 있지만, 에틸렌이 공기보다 가볍기 때문에 네거티브 컨트롤 아래쪽에 배치되어야한다.
- 트리플 응답 분석 데이터 분석 :
- 화염 소독 집게로, 해부 또는 디지털 USB 현미경으로 각 처리 및보기에 해당하는 플레이트에서 하나의 모종을 제거합니다. 상기 모종의 하단에 정렬 및 사진을 확인합니다.
- 각 사분면에서 30 모종 (생물 복제 60 모종 및 치료 당 180 모종)를 제거합니다. 통치자와 검은 색 배경 사진으로 표면에 맞 춥니 다.
- ImageJ에 소프트웨어 (17)를 사용하여 복제 모종의 배축 길이 (mm)를 측정한다. 클릭하고 * 스트레이트를 드래그하여 크기를 설정 *도구 10 mm의 길이를 선택합니다. 은 "분석"탭에서 "설정 규모"를 선택하고 * * 분단 된 도구를 사용하여 (10)로 알려진 거리를 설정, 클릭 및 드래그 거리를 측정하기 위해 배축를 눌러 M의 길이를 선택할 수 있습니다. Tukey의 다중 비 교 검정으로 일방 ANOVA를 사용하여 생물학적 복제 수단을 비교한다. 차이는 <0.05 중요한 경우 페이지 간주됩니다.
세균의 성장을 통해 pH를 3. 분석
- 세중 xylinus 스타터 문화를 성장 및 정량화 Komagataeibacter :
- K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. 0.4-0.3 (600)에 도달하는 OD (약 72 시간)까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양 물을 인큐베이션.
- 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 5 ㎖의 멸균 된 0.85 %와 NAC (/ V w)L 용액, 세포를 두 번 세척하고 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다.
- Petroff-Hausser 계산 실을 사용하여 세포를 정량화.
- 산도의 분석을위한 문화 접종 :
- 호일 뚜껑 열두 500 ml의 플라스크에 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 국물 (PH 7) 150 ㎖를 추가합니다. K.와 플라스크를 접종 105 세포 / ml의 농도로 xylinus 종자 배양. 세 스타터 문화를 사용, 처리 당 세 생물학적 복제를 준비합니다.
- 5, 50, 500 mM의 CEPA의 원액 300 μL와 보충 문화는 각각 1.0 mM의 0.01, 0.1의 최종 CEPA 농도를 획득하고있다. CEPA를 용해하는데 사용되는 용매 300 μL로 처리되지 않은 대조군 배양액을 보완.
- 단단히 플라스크에 호일 뚜껑을 테이핑하여 플라스크를 밀봉하고 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 14 일 동안 문화를 품어.
- 매일 aseptica에서야 베드로 (10 분, 4 ° C 2,000 XG) 원심 분리하여 각각의 플라스크 및 펠릿 세포 5 ml의 샘플을 제거합니다. 깨끗한 튜브로 상청액을 옮기고 pH 미터를 이용하여 각 생체 복제의 pH를 측정한다.
- 생물 복제의 평균 pH는 그래프에 의해 시간 코스 데이터를 분석 할 수 있습니다.
참고 : 문화의 pH가 3.5 이하로 떨어지지 않도록하는 것이 중요하다; (5)의 문화 pH는 크게 CEPA에서 에틸렌 방출을 감소시키고, 3.5 이하의 pH는 완전히 에틸렌 방출을 억제한다. - 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로.
4. 식민지 형태학
- K. 성장 세중 xylinus 스타터 문화 :
- K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. Incuba0.4-0.3의 OD 600까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 TE 배양 (약 72 시간)에 도달한다.
- 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 멸균 생리 식염수 5 mL로 세포를 세척 한 다음 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다.
- 1.5 %의 SH 25 ml에 포함 된 24 한천 플레이트 (PH 7) 매체를 준비 (W / V) 한천.
- 한천은 고형화되면, 각각 0.01, 0.1, 1.0 mM의 최종 CEPA 농도를 얻기 위해 5, 50 μL의 50 및 500 mM의 한천 CEPA 스톡 솔루션 확산. No 변경 구성하고, 용매를 50 μL 확산 설정 미처리 용매 제어 플레이트는, 시험 화합물을 용해시키기 위해 사용된다.
- K.의 루프 전체 (~ 5 μL) 절연 식민지에 대한 킬 판 xylinus 스타터 문화와 파라핀 필름을 밀봉. 세중의 모든 판을 접종한다. 30 ° C에서 5 일 동안 번호판을 품어.
- 포트질적으로 디지털 USB 현미경을 사용하여 20X 배율에서 ograph 식민지는 고체 배지에 식민지 형태와 셀룰로오스 생산을 평가합니다.
참고 : 셀룰로오스는 식민지의 여백을 따라 불투명 한 물질로 나타납니다. - 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로.
5. 펠리클 분석 실험
- 성장 및 정량화 K. 세중 xylinus 스타터 문화 :
- 세중에서, K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. 0.4-0.3 (600)에 도달하는 OD (약 72 시간)까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양 물을 인큐베이션.
- 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 멸균 생리 식염수 5 mL로, t 씻어그 세포를 두번 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다.
- Petroff-Hausser 계산 실을 사용하여 세포를 정량화.
- 24 웰 플레이트에 접종하는 마스터 믹스를 준비합니다 :
- 각각 0.01, 0.1, 1.0 mM의 최종 CEPA 농도를 얻기 위해 5 50 120 μL, 500 mM의 CEPA 축적량 SH 배지 60 ㎖ (pH가 7)를 보완. CEPA를 용해하는 데 사용되는 용매의 120 μL와 SH 매체 (PH 7)의 또 다른 60 ml의 보충. 소용돌이는 혼합한다.
- 사 14 ml의 분취 량으로 CEPA 함유 매체의 각 60ml를 나눈다. 105 세포 / ml의 농도로 배양 스타터 생물학적 복제와 14 ml의 분취 량 세 접종. 셀룰로오스 생산을 방지하기 위해 얼음에 세포와 튜브를 유지합니다.
주 : 나머지 14 mL를 분취 멸균 대조군 웰에 대해 사용된다.
- 24 웰 플레이트에 접종 :
- 세 생물 복제의 행과 함께 자신의 접시에 각각의 처리를 테스트멸균 컨트롤의 행 (그림 2).
그림 2 :. 펠리클 분석 및 분석 주식 CEPA 보충 된 pH가 7 SH 매체 (60 ㎖)에 사용되는 프로토콜을 나타낸 플로우 차트는 세 개의 분리 된 생물학적 복제 예방 접종 및 살균 제어 (14 씩으로)을 위해 분주합니다. 이러한 배양 물은 24 웰 플레이트 여섯 기술 복제 (2 mL)에 분주 한 후 파라핀 필름으로 밀봉된다. 30 ℃에서 7 일간 배양 한 후, 펠리클은 수확 및 FT-IR에 의해 습 중량, 두께, 건조 중량 및 결정 성을 결정하는 것이 특징. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오
- 14 ml의 마스터 믹스를 사용하여, EAC로 2를 가하여멸균 24 웰 플레이트의 여섯 우물의 시간. 세 가지 생물학적 복제 및 살균 제어 (그림 2)에 대한 완료합니다. 각 치료를 반복합니다.
- 파라핀 필름 인감 접시와 30 ℃에서 7 일간 정적을 품다.
- 수확 및 측정 펠리클 젖은 무게, 두께, 건조 중량 (셀룰로오스 수율) 및 결정화도 (그림 2)
- 대향 펠리클 에지 올리고 집게 개별 펠리클을 제거하는 펠리클의 일측 우울. 그립을 유지하면서, 자신의 젖은 가중치를 결정하기 위해 무게 전에 초과 매체를 제거하기 위해 3 초 동안 신선한 종이 타월에 배치.
- 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 측면에서 통치자와 사진에 인접 펠리클을 맞 춥니 다.
- ImageJ에 소프트웨어 (17)를 사용하여, 왼쪽 어깨, 오른쪽 어깨와 각 펠리클의 중심 펠리클의 두께를 측정한다. 각 생물 replicat에 대한 모든 기술 복제 평균이자형.
- 개별적 6- 웰 플레이트의 웰에 펠리클을 전송. 20 분 세포 용균을 위해 80 ℃에서 0.1 N의 NaOH 12 ㎖로 펠리클 치료.
- 의 NaOH를 제거하고 교반과 함께 24 시간 동안 초순수로 세척하여 펠리클을 중화. 물마다 6 시간을 변경합니다.
주 : 펠리클이 세정 공정 완료시 백색이어야한다. - 장소 실리콘 매트에 펠리클과 일정 중량으로 48 시간 동안 50 ° C에서 건조. 건조되면, 박테리아 셀룰로오스 수율을 결정하기 위해 분석 규모의 페리 클 가중치를 매트에서 제거하고 측정한다.
- 4000 ~ 650 cm의 범위에있는 적외선 분광기 (FT-IR) 32 스캔을 사용하여 4 cm의 해상도 -1 푸리에 변환을 이용하여 펠리클 결정 분석 -1. 1437 / A (895) 사용의 결정 지수 CI (IR)를 계산하게하고; 은 "결정 밴드"와 "비정질 밴드"의 흡광도 비는 앞서 설명한 18.
- 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로.
- 펠리클 데이터 분석 :
- 펠리클 습윤 중량 및 건조 중량 사이의 차이를 결정하여 펠리클 수화를 계산한다.
- 통계적 분석을 위해 각각의 생물학적 복제에 대한 단일 값을 얻기 위해 모든 기술 복제의 값을 평균. Tukey에의 다중 비교 시험으로 일방 ANOVA를 사용하여 치료를 비교한다. 차이는 P의 경우 <0.05 중요하다.
- 처리되지 않은 컨트롤의 비율로 데이터를 정상화 생물 복제의 수단을 플롯.
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Representative Results
트리플 응답 분석하여 SH 배지에서 CEPA에서 에틸렌 해방 (PH 7)의 검증을위한 개략도 판 설치는 그림 1A에 표시됩니다 - C를. 펠리클 프로토콜을 도시하는 흐름도는도 2 다크 성장한 A. 같다 장대 모종 ACC의 존재 및 SH 매체 CEPA의 분해를 통해 제조 된 에틸렌 (pH가 7)의 존재하에 삼중 반응 표현형 (과장 정점 후크 짧고 두꺼운 배축)를 나타낼 수 있지만 비 처리 조건 (그림 3A) 9. ACC- 및 CEPA 파생 에틸렌 처리 (A)의 배축 길이 장대 씨앗 유의하게 (P <0.0001) 생리 관련 집중하고에 SH 매체 (PH 7)에 CEPA에서 발표 된 치료 컨트롤 (그림 3B) (9), 에틸렌을 확인보다 짧은기. 미처리 및 CEPA 처리의 pH K. xylinus 문화는 5 위 (그림 4) 9 남아; 따라서 에틸렌으로 CEPA 분해로 인해 세균의 유기산 생산에 손상되지 않았습니다. CEPA 유래 에틸렌 때 K.을 박테리아 셀룰로오스 생산 증가 xylinus 고체 SH 매체에 성장 (PH 7) (그림 5) 9. CEPA 파생 된 에틸렌의 모든 농도는 크게 박막 두께 (그림 6B)와 유의하게 증가 페리 클 건조 중량에 영향을 미치지 않았다, 페리 클 습 중량 (그림 6A)를 감소 (셀룰로오스 수율도 6C) 9. 펠리클의 두께 측정에 소요 대표 사진을도 7에 나타낸다. 펠리클 수화 CEPA 유래 에틸렌 (도 8a) (9)의 전체 농도를 감소시키고, CEPA 유래의 모든 농도는 에틸렌 9 펠 증가하면서licle 결정 (도 8b). 염화나트륨과의 NaH 2 PO 4의 효과는 관찰 된 표현형 CEPA 유래 에틸렌 기인 것을 확인 하였다 (데이타는 도시되지 않음) 모든 경우에 미미 하였다.
그림 3 : CEPA는 에틸렌을 생산하는 SH 매체 (PH 7)에 분해 디지털 USB 현미경 사진이 보여 그 어두운 성장의 A.. 장대 모종 트리플 응답 표현형 표시 (짧은 배축 두꺼운 배축 및 정점 후크 과장) 처리되지 않은 대조군 (A)에 비해 ACC 및 CEPA 유래의 에틸렌의 존재하에 성장한 경우. ACC 및 CEPA 유래의 에틸렌의 존재하에 성장한 모종의 배축 길이 significantl 있었다처리되지 않은 대조군 (B)보다 짧아 Y. 스케일 바 = 1mm. 오차 막대를 표시 SD (n = 3)를 나타낸다. 다른 글자와 바는 유의 한 차이 (p <0.0001)이다. 이 그림은 Augimeri과 스트랩 (9)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : K.의 pH xylinus 문화 SH 배지에서 CEPA 분해 (PH 7). 배양 pH가 박테리아의 성장주기에 걸쳐 에틸렌으로 CEPA의 효과적인 분해를 허용, 5 위 유지를위한 충분 남아있다. K.의 pH xylinus 문화는 분비로 모니터링 및 유기산을 재 흡수해야합니다. 전설은 테스트 CEPA 농도를 보여줍니다. Y 축이 시작합니다5. pH에서 오차 막대를 표시 SD (n = 3)를 나타낸다. 이 그림은 Augimeri과 스트랩 (9)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 : CEPA 유래 에틸렌 K. 의해 셀룰로오스의 생산을 증가 고체 매체에 xylinus. K. 또는 CEPA (F - H - xylinus는 (A) 비 처리 또는이었다 SH 아가 플레이트 (pH가 7)을 성장시켰다 산성화 (PH 2.5) 초순수 (B) 인산 클로라이드 (E C)로 전처리 ). 대표적인 식민지가 표시됩니다. K. 제조 화살표 방송 셀룰로오스 xylinus, 식민지 주변의 불투명 한 물질로 간주. 스케일 바 = 0.5 mm. 이 그림 하Augimeri 및 스트랩 (9)에서 수정 된 s의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 : CEPA 에틸렌 유래의 보수력 줄어들고 K.의 수율을 증가 펠리클 수확되고 분석되기 전에 xylinus 셀룰로오스 펠리클. 배양 24 웰 플레이트에서 CEPA 보충 SH 배지 (pH가 7)에 정적으로 성장하고, 7 일 동안 30 ℃에서 배양 하였다. CEPA 유래 에틸렌, 펠리클 습윤 중량 (A)을 감소 펠리클의 두께 (B) 및 증가 된 펠리클 건조 중량 (C)에 영향을 미치지 않았다. 서로 다른 CEPA 처리는 서로 유의 한 차이가 없었다. 오차 막대를 표시 SD (n = 3)를 나타낸다. 와 바다른 문자는 유의 한 차이 (p <0.05)이다. 이 그림은 Augimeri과 스트랩 (9)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : K.의 대표 사진 xylinus의 펠리클. 펠리클 두께 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 사진에서 측정 하였다. 스케일 바 = 10 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : CEPA 유래 에틸렌의 수분을 감소K. xylinus 셀룰로오스 펠리클 결정화도를 증가시킴으로써 펠리클. 배양 24 웰 플레이트에서 SH 배지 (pH가 7)에 정적으로 성장하고, 펠리클 수확되고 분석되기 전에 7 일 동안 30 ℃에서 배양 하였다. 펠리클 수화 펠리클은 습윤 및 건조 중량 사이의 차이로 계산되었다. 증가 페리 클 결정 (B) 에틸렌 감소 페리 클 수화 (A)를 CEPA 유래. 서로 다른 CEPA 처리는 서로 유의 한 차이가 없었다. 오차 막대를 표시 SD (n = 3)를 나타낸다. 다른 글자와 바는 유의 한 차이 (p <0.05)이다. 이 그림은 Augimeri과 스트랩 (9)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 방법은 모델 생물, K.를 사용하여 세균 에틸렌 반응의 연구 CEPA에서 에틸렌의 생산 현장에서 개요 xylinus. 에틸렌의 pH를 CEPA 순수한 에틸렌 가스 또는 전문 실험실 장비에 대한 필요성을 부정하는 이상으로 3.5 10,11이있는 수성 매체를 보충함으로써 제조 할 수 있으므로이 방법은 매우 유용하다. 이 방법은 세균에서 유래 CEPA 에틸렌의 효과를 연구에 국한되지 않고, 진핵 생물에서의 에틸렌 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 이들 화합물은 또한 시츄 CEPA 분해로부터 생성 될 때 병렬 제어 실험 인산 클로라이드로 수행하는 것이 중요하다. 다른 필요한 제어 CEPA 자체 조사중인 미생물 배양에 직접적인 영향을 미치지 여부를 확인하는 것이다. 생리 학적으로 관련이없는 에틸렌 농도 때 K.를 제작했다 xylinus 문화 우리pH가 5 SH 배지에서 성장과 CEPA 효과 (9)에 대한 제어 역할을하므로 다시; 그러나, 이러한 접근은 단지 산 내성 유기체에 대해 작동한다.
수성 성장 배지에서 생물학적 연구 CEPA 유래 에틸렌의 사용은 에틸렌 실제로 시스템 내에서 제조되고 있는지 확인이 필요하다. 여기에 기재된 방법은 A.를 이용 에틸렌 1의 존재에 어두운 성장 모종에 의해 전시 된 트리플 응답 표현형을 이용 장대 트리플 응답 분석. 네 개의 사분면으로 분할 된 배양 접시는 모종 별도로 MS 배지에서 성장하지만, 관련 미생물의 성장 배지에 인접 할 수있다. 미생물 성장 배지 상 CEPA 용액의 적용은 에틸렌 생산을 촉진하고 상부 공간 침투로 에틸렌 외인성 소스에 인접한 묘를 공개한다. 이 내인성 생성물을 향상으로 ACC와 MS 배지를 보충하는 양의 제어를 제공한다A.로 에틸렌의 이온 장대와 트리플 응답 표현형의 후속 유도.
미생물 성장 매체 (13, 14)에 CEPA에서 에틸렌을 제조 할 때 문화 pH는 또 다른 중요한 고려 사항이다. 일반적으로 문화 K.에 사용되는 SH 매체 xylinus 실질적 CEPA 유래 에틸렌 (Augimeri 스트랩, 미발표 데이타)의 생산 감소는 약 5의 pH를 갖고; 따라서, 매질 pH를 7~9로 조정 하였다.이 그것이 크게 pH를 7 내지 13로 확장하면서 CEPA 고장의 레이트에서, 또는 pH가 5 이하 매우 느린 것으로 입증 다른 연구와 일치한다. 보장하는 것이 중요 시험 미생물의 성장 배지의 pH는 5 이상으로 유지하는 것이 K. xylinus 문화 에틸렌 (9)의 진화를 허용, 약 5.5의 최소 산도에 도달했습니다. 이 에틸렌의 절대 농도는 이러한 배양 C에 따라 제어 될 수 없다는 것을 유의해야onditions.
K. 성장 셀룰로오스 생산 및 펠리클 특성에 CEPA 에틸렌 유래의 효과 xylinus 세균 에틸렌 응답 CEPA를 사용하여 검사 될 수 있음을 설명하기 위해 사용되었다. 다른 생물에서 에틸렌 반응을 연구하기 위해 이러한 방법을 적응하는 것은 성장 매체를 변경하고 표현형 분석 한 간단합니다. CEPA의 사용은 에틸렌 가스에 대한 편리한 대체와 연구자를 제공하고, 세균에 더 많은 에틸렌 - 중재 연구를 장려 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
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