Introduction
Het olefine etheen (C 2 H 4) werd ontdekt als een plantenhormoon in 1901 toen het werd vastgesteld dat erwt zaailingen, gekweekt in een laboratorium steenkolengas lampen gebruikt, vertoonde een abnormale morfologie waarbij stengels (hypocotylen) waren korter, dikker en boog zich zijwaarts ten opzichte van de normale erwt zaailingen; een fenotype later aangeduid als de triple respons 1,2. Latere studies toonden aan dat ethyleen een belangrijke plantenhormoon dat talrijke ontwikkelingsprocessen zoals groei, stressrespons, rijping van fruit en senescence 3. Arabidopsis thaliana, modelorganisme voor plantenbiologie onderzoek regelt, werd bestudeerd met betrekking tot de reactie op ethyleen. Verschillende ethyleen reactie mutanten zijn geïsoleerd door het benutten van de triple respons fenotype waargenomen in het donker-volwassen A. thaliana zaailingen in aanwezigheid van etheen 1,4,5. De biosynthetische voorloper voor ethyleen productie in planten is 1-aminocyclopropane carbonzuur (ACC) 6 en wordt vaak gebruikt in de drievoudige respons assay endogene etheenproduktie die leidt naar de drievoudige respons fenotype 1,4,5 verhogen.
Hoewel de ethyleenreactie schaal bestudeerd in planten, is het effect van exogeen ethyleen op bacteriën zeer weinig bestudeerd ondanks de nauwe associatie van bacteriën met planten. Een studie meldde dat bepaalde Pseudomonas stammen kunnen overleven met behulp van ethyleen als enige bron van koolstof en energie 7. Echter slechts twee studies aangetoond dat de bacteriën reageren op ethyleen. De eerste studie toonde aan dat stammen van Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida en P. syringae waren chemotactische richting van ethyleen met gebruik van agarose plug assay waarin gesmolten agarose werd gemengd met een chemotaxis buffer geëquilibreerd met zuiver ethyleengas 8. Echter, voor zover ons bekend, zijn er geen furth geweester rapporten met behulp van zuiver ethyleengas om bacteriële ethyleen reactie, waarschijnlijk te karakteriseren als gevolg van de moeilijkheid van de behandeling van gassen in het laboratorium zonder gespecialiseerde apparatuur. Het tweede rapport van bacteriële ethyleen reactie aangetoond dat ethyleen verhoogde bacteriële cellulose productie en beïnvloed genexpressie in de fruit-geassocieerde bacterie, Komagataeibacter (voorheen Gluconacetobacter) xylinus 9. In dit geval, de ethyleen vrijmakende verbinding, 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA) werd gebruikt om ethyleen in situ te produceren binnen het bacteriële groeimedium, het omzeilen van de behoefte aan zuivere ethyleengas of gespecialiseerde apparatuur.
CEPA ethyleengas in een 1: 1 molaire verhouding boven pH 3,5 10,11 via een base gekatalyseerde eerste orde reactie 12-14. De afbraak van CEPA is positief gecorreleerd met pH en temperatuur 13,14 en resulteert in de productie van ethylalcoholeen, chloride en fosfaat. CEPA biedt onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van bacteriële reacties op ethyleen met een handig alternatief voor gasvormige ethyleen.
Het algemene doel van de volgende protocollen wordt een eenvoudige en efficiënte werkwijze voor bacteriële ethyleenreactie bestuderen en inclusief validering van fysiologisch relevante niveaus etheenproductiefaciliteiten van CEPA decompositie in bacteriële groeimedium analyse cultuur pH te waarborgen CEPA ontleding, niet verminderd tijdens de groei van bacteriën, en de evaluatie van het effect van ethyleen op de bacteriële morfologie en fenotype. We laten deze protocollen het gebruik van K. xylinus echter deze protocollen kunnen worden aangepast ethyleenrespons bij andere bacteriën bestuderen door het geschikte groeimedium en fenotype analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stoffen
- Bereid een oplossing van 500 mM CEPA (144,49 g / mol) en een oplossing die zowel uit 500 mM NaCI (58,44 g / mol) en 500 mM NaH 2 PO 4 · H2O (137,99 g / mol) in aangezuurd (pH 2.5) ultra-zuivere water of 0,1 N HCl. Meng met behulp van een vortex totdat de oplossingen zijn duidelijk.
- Serieel verdund (10x) de 500 mM oplossingen in hetzelfde oplosmiddel tot 5 mM en 50 mM voorraden te verkrijgen.
- Bereid een 10 mM oplossing van 1-aminocyclopropaancarbonzuur (ACC; 101,1 g / mol) in ultra-zuiver water.
- Filter-steriliseren voorraad oplossingen en bewaar monsters bij -20 ° C.
- Filter-steriliseren cellulase. WINKEL porties bij 4 ° C.
2. Controleren Ethyleen Productie van 2-Chloroethylphosphonic Acid afbraak: Triple Response Assay
- Oppervlakte-steriliseren Arabidopsis thaliana Ecotype Columbia Seeds Het gebruik van de Vapor-fase Methode:
LET OP: De volgende stap produceert toxic chloorgas. Gedrag zaad sterilisatie in een zuurkast.- Het verkrijgen van een afsluitbare container diep genoeg om een 250 ml glazen beker voor zaadsterilisatie huisvesten en plaats deze in een zuurkast.
- A. toevoegen thaliana zaden een microcentrifugebuis en plaatst de buis in een rek. Plaats het rek met de open buis in de afsluitbare container.
Opmerking: Weet individuele buizen vullen niet meer dan de helft vol om chloorgas aan de lagere zaden te dringen. - Plaats een 250 ml bekerglas met 100 ml commercieel bleekmiddel de afsluitbare container. Voeg voorzichtig 3 ml geconcentreerd HCl aan het bleekmiddel en meteen de container met het deksel af te dichten.
LET OP: Bleach en HCl te reageren op giftige chloorgas die werkt aan de oppervlakte-steriliseren van de zaden te produceren. - Incubeer de zaden in de aanwezigheid van chloorgas gedurende 4 uur in de zuurkast.
Let op: Langere sterilisatie tijden zullen kieming efficiëntie. - Na sterilisatie, zodat de chlorine gas te ventileren in de zuurkast gedurende ten minste 1 uur dan sluit de microcentrifugebuis. Verlaat het bleekmiddel en HCl mengsel in de zuurkast gedurende ten minste 24 uur voor weggooien.
Opmerking: Gesteriliseerde zaden kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur voor gebruik. - Geen zaden bij 4 ° C voor langdurige opslag. Breng zaden op kamertemperatuur voor het openen van de microcentrifugebuis om condensvorming te voorkomen. Store zaden in het donker.
- Bereid Agar Platen in 4-sector Petrischalen (90 x 15 mm):
- Bereid 110 ml groeimedium voor A. thaliana zaailingen: 1x Murashige en Skoog (MS) basaal medium 15 (4,33 g / l) bevattende 1% (w / v) sucrose en 0,8% (w / v) agar. Stel de MS-medium op pH 6 met NaOH.
- Bereid 100 ml van bacteriële groeimedium voor CEPA ontleding: Schramm en Hestrin (SH) 16 medium bevattende 1,5% (w / v) agar. Stel de SH medium op pH 7 met NaOH.
- Steriliseren media autoclaaf en temper in een 55 ° C waterbad.
- Zodra de MS agar heeft getemperd, voeg 40 ml in een steriele kolf. Om de positieve controle groeimedium voor te bereiden A. thaliana zaailingen vult deze 40 ml van MS agar met 40 ui 10 mM ACC tot een eindconcentratie van 10 uM ACC verkrijgen.
- Voeg 5 ml medium met de juiste kwadranten van de sectored Petrischalen (figuur 1) en laat de agar vast worden. Bereid alle platen in drievoud.
Opmerking: CEPA wordt niet toegevoegd aan het kweekmedium tot later in het protocol.
Figuur 1:. Instellen van agarplaten voor de drievoudige respons assay met CEPA Een schematisch illustreert specifiek voor de negatieve controle (A), positieve controle (B) kwadranten en experimentele platen (C). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Augimeri en Strap 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Stratify A. thaliana zaden naar Synchrone Germination Zorgen:
- Voeg ongeveer vijftig A. thaliana zaden op elk kwadrant met MS of MS + ACC agar. Zorg ervoor dat zaden worden gelijkmatig verdeeld over zaailing verwijdering en analyse te vergemakkelijken.
- Incubeer platen die zaden in het donker bij 4 ° C gedurende 3-4 dagen.
- Ontleden CEPA op bacteriegroei Medium (SH) en het uitvoeren van Triple Response Assay:
- Na stratificatie, bloot de zaden tot tl-licht gedurende 2 uur.
- Verspreid 10 gl van de 500 mM voorraadoplossing CEPA op de kwadranten van de experimentele platen die SH-agar (pH 7 Figuur 1) tot een uiteindelijke concentratie te verkrijgen CEPAvan 1 mM.
- Dicht de platen met laboratorium film en dek af met folie om een donkere omgeving voor de zaden te maken.
- Ontkiemen zaden door het incuberen platen in het donker bij 23 ° C gedurende 3 dagen met de agar naar beneden.
Opmerking: De platen kunnen worden gestapeld, maar negatieve controles moeten op de bodem worden geplaatst, aangezien ethyleen is lichter dan lucht.
- Analyseer Triple Response Analyse van de gegevens:
- Met vlam gesteriliseerd pincet, verwijder enkele zaailingen van een plaat die overeenkomt met elke behandeling en het zicht onder een dissectie of digitale USB microscoop. Zorgen de onderkant van de zaailingen worden uitgelijnd en foto.
- Verwijder 30 zaailingen van elk kwadrant (60 zaailingen per biologische repliceren en 180 zaailingen per behandeling). Lijn op een oppervlak met een zwarte achtergrond en een foto met een liniaal.
- Meet de hypocotyl lengte (mm) van repliceren zaailingen met behulp van ImageJ software 17. Stel de schaal door te klikken en slepen van de * Straight *gereedschap een lengte van 10 mm te kiezen. Selecteer "Set Scale" onder het tabblad "Analyseren" en stel de bekende afstand tot 10. Met behulp van de * gesegmenteerde * tool, klik en sleep om de lengte van de hypocotyl en druk op M selecteren om afstand te meten. Vergelijk middel van biologische replicaten met een one-way ANOVA met meervoudige vergelijkingstest een Tukey. Verschillen worden significant geacht wanneer p <0,05.
3. Analyse van de pH tijdens bacteriegroei
- Groeien en te kwantificeren Komagataeibacter xylinus Starter Culturen in drievoud:
- Inoculeer een enkele kolonie van K. xylinus in 5 ml SH-medium (pH 5) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase. Incubeer kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm tot een OD600 van 0,3-0,4 bereikt (ongeveer 72 uur).
- Oogst starterculturen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Met 5 ml steriel 0,85% (w / v) NaCll oplossing, de cellen tweemaal wassen en resuspendeer de celpellet. Houd cellen op ijs.
- Kwantificeren cellen met behulp van een Petroff-Hausser telkamer.
- Inoculeer Cultures for Analyse van de pH:
- Voeg 150 ml SH-bouillon (pH 7) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase twaalf 500 ml kolven met folie deksels. Wordt geënt in flessen met K. xylinus zuursels in een concentratie van 10 5 cellen / ml. Met behulp van de drie starter culturen, bereiden drie biologische herhalingen per behandeling.
- Supplement kweken met 300 pi van de 5, 50 of 500 mM voorraadoplossingen CEPA definitieve CEPA verdunningen bereid van 0,01, 0,1 en 1,0 mM, respectievelijk. Supplement de onbehandelde controlekweken met 300 ul van het gebruikte oplosmiddel voor CEPA lossen.
- Dicht de flessen stevig door taping de folie deksels kolven en incubeer gedurende 14 dagen kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm.
- Elke dag, aseptically verwijderen 5 ml monsters van elke kolf en pellet cellen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Transfer supernatanten een schone buis en meet de pH van elk biologisch repliceren met behulp van een pH meter.
- Analyseer het tijdsverloop data door grafieken de gemiddelde pH van het biologische herhalingen.
Let op: Het is belangrijk dat de cultuur pH niet minder dan 3,5 heeft laten vallen; een kweek van pH 5 vermindert ethyleen vrijlating uit CEPA en een pH beneden 3,5 remt etheen release. - Te controleren chloor en fosfaatspiegels Voer een identiek experiment met 0,01, 0,1, en 1,0 mM van NaCl-NaH 2PO 4 oplossing met behulp van de 5, 50 en 500 mM voorraden respectievelijk.
4. Kolonie morfologie
- Grow K. xylinus Starter Culturen in drievoud:
- Inoculeer een enkele kolonie van K. xylinus in 5 ml SH-medium (pH 5) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase. Incubate kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm tot een OD600 van 0,3-0,4 bereikt (ongeveer 72 uur).
- Oogst starterculturen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Met 5 ml steriele zoutoplossing, was de cellen en resuspendeer de celpellet. Houd cellen op ijs.
- Bereid 24 agarplaten die 25 ml SH (pH 7) medium met 1,5% (w / v) agar.
- Zodra de agar gestold, verspreid 50 ul van de 5, 50 en 500 mM voorraadoplossingen CEPA op agar definitieve CEPA concentraties van 0,01, 0,1 en 1,0 mM te verkrijgen, respectievelijk. Opgericht onbehandelde oplosmiddelcontrole platen, die uit niet wijziging en verspreiding van 50 gl van het gebruikte oplosmiddel voor de testverbindingen lossen.
- Streak platen voor geïsoleerde kolonies met een lus vol (~ 5 pl) van K. xylinus starter cultuur en verzegelen ze met paraffine film. Inoculeer alle platen in drievoud. Incubeer de platen gedurende vijf dagen bij 30 ° C.
- Photograph kolonies bij een vergroting van 20x met behulp van een digitale USB microscoop en kwalitatief beoordelen koloniale morfologie en cellulose productie op vast medium.
Opmerking: Cellulose verschijnt als een wazige stof langs de rand van de kolonie. - Te controleren chloor en fosfaatspiegels Voer een identiek experiment met 0,01, 0,1, en 1,0 mM van NaCl-NaH 2PO 4 oplossing met behulp van de 5, 50 en 500 mM voorraden respectievelijk.
5. Pellicle Testen
- Groeien en te kwantificeren K. xylinus Starter Culturen in drievoud:
- In drievoud Inoculeer een enkele kolonie van K. xylinus in 5 ml SH-medium (pH 5) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase. Incubeer kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm tot een OD600 van 0,3-0,4 bereikt (ongeveer 72 uur).
- Oogst starterculturen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Met 5 ml steriele zoutoplossing, wassen thij cellen tweemaal en resuspendeer de celpellet. Houd cellen op ijs.
- Kwantificeren cellen met behulp van een Petroff-Hausser telkamer.
- Bereid Master Mixes om geënt 24-well platen:
- Supplement 60 ml SH-medium (pH 7) met 120 ul van de 5, 50 en 500 mM CEPA voorraden CEPA uiteindelijke concentraties te verkrijgen van 0,01, 0,1 en 1,0 mM, respectievelijk. Supplement andere 60 ml SH-medium (pH 7) met 120 ul van het gebruikte oplosmiddel voor CEPA lossen. Vortex te mengen.
- Verdeel elk 60 ml van CEPA-bevattend medium in vier 14 ml porties. Enten van de drie 14 ml porties biologische herhalingen startercultuur bij een concentratie van 10 5 cellen / ml. Blijf buizen met cellen op ijs te voorkomen celluloseproduktie.
Opmerking: De resterende 14 ml monster wordt gebruikt voor steriele controleputjes.
- Wordt geënt in 24-well platen:
- Test elke behandeling in zijn eigen plaat met drie rijen en biologische repliceerteen rij van steriele controles (figuur 2).
Figuur 2:. Stroomschema illustreert het protocol voor vlies bepaling en analyse De CEPA gesupplementeerd pH 7 SH-medium (60 ml) wordt in porties gedurende drie aparte biologische herhaalde inoculaties en een steriele controle (14 ml elk). Deze kweken worden vervolgens in porties verdeeld in zes technische replicaten (2 ml) in een 24 wells plaat en vervolgens afgedicht met paraffine film. Na incubatie gedurende 7 dagen bij 30 ° C, worden pellicles geoogst en gekenmerkt door het bepalen van natte gewicht en de dikte droog gewicht, en kristalliniteit door FT-IR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken
- Met behulp van de 14 ml master mix, voeg 2 ml in each zes putjes van een steriele 24-putjes plaat. Voltooi de drie biologische repliceert en steriele controle (Figuur 2). Herhaal dit voor elke behandeling.
- Seal-platen met paraffine film en incubeer statisch gedurende 7 dagen bij 30 ° C.
- Harvest en Meet Pellicle Wet gewicht en de dikte droog gewicht (Cellulose Yield) en de kristalliniteit (figuur 2):
- Druk op de ene kant van het vlies aan de tegenpartij vlies rand verheffen en te verwijderen individuele pellicles met een pincet. Met behoud van grip, leg ze op nieuw papier handdoek voor 3 sec om het overtollige medium te verwijderen voorafgaand aan het wegen om hun natte gewichten te bepalen.
- Lijn pellicles naast een liniaal en een foto van de zijkant met behulp van een hoge resolutie digitale camera.
- Met behulp van ImageJ software 17, meten vlies dikte op de linker schouder, rechter schouder en het midden van elke vliesje. Gemiddeld alle technische replica voor elke biologische Replicate.
- Individueel de pellicles overbrengen in de putjes van een 6-wells plaat. Pellicles behandelen met 12 ml 0,1 N NaOH bij 80 ° C gedurende 20 min te lyseren.
- Verwijder de NaOH en geneutraliseerd pellicles door wassen met ultrazuiver water gedurende 24 uur onder roeren. Ververs het water elke 6 uur.
Opmerking: Pellicles moet wit na voltooiing van de was- stap. - Plaats pellicles op silicium matten en droog bij 50 ° C gedurende 48 uur tot constant gewicht. Eenmaal droog, te verwijderen uit matten en meet vlies gewichten op een analytische schaal bacteriële cellulose opbrengst te bepalen.
- Analyseer vliesje kristalliniteit via Fourier-transform infrarood spectroscopie (FT-IR) met behulp 32 scans en een resolutie van 4 cm -1 in het traject van 4000 tot 650 cm -1. Bereken de kristalliniteitsindex, CI (IR) met behulp van een 1437/895 A; de absorptieverhouding van de "kristallijne band" en "band amorf" zoals eerder beschreven 18.
- Te controleren chloor en fosfaatspiegels Voer een identiek experiment met 0,01, 0,1, en 1,0 mM van NaCl-NaH 2PO 4 oplossing met behulp van de 5, 50 en 500 mM voorraden respectievelijk.
- Analyseer Pellicle gegevens:
- Bereken vliesje hydratatie door het verschil te bepalen tussen vlies nat gewicht en droog gewicht.
- Het gemiddelde van de waarden van alle technische replicaten een bepaalde waarde voor elke biologische repliceren voor statistische analyse te verkrijgen. Vergelijk behandelingen met een one-way ANOVA met meervoudige vergelijkingstest Tukey. Verschillen significant als p <0,05.
- Normaliseren data als het percentage van de onbehandelde controles en plot de middelen om biologische repliceert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische opzet plaat voor het verifiëren van ethyleen bevrijding van CEPA in SH-medium (pH 7) van de drievoudige respons assay wordt getoond in Figuur 1A - C. Een stroomschema illustreert de pellicule protocol wordt getoond in figuur 2. donker-gekweekte A. thaliana zaailingen vertonen drievoudige respons fenotype (korter en dikker hypocotyl met een overdreven apicale haak) in aanwezigheid van ACC en in aanwezigheid van etheen geproduceerd door de ontleding van CEPA op SH-medium (pH 7), maar niet onder omstandigheden onbehandeld (Figuur 3A) 9. Het hypocotyl lengte van de ACC- en CEPA-afgeleide ethyleen behandeld A. thaliana zaden waren significant (p <0,0001) minder dan onbehandelde controles (Figuur 3B) 9 bevestigd dat etheen werd vrijgelaten CEPA op SH-medium (pH 7) bij een fysiologisch relevante concentratiestie. De pH van onbehandelde en behandelde K. CEPA- xylinus culturen bleef boven 5 (figuur 4) 9; Daarom CEPA ontleding in ethyleen werd niet in het gedrang te wijten aan bacteriële organisch zuur productie. CEPA-afgeleide ethyleen verhoogde bacteriële cellulose productie bij K. xylinus werd gekweekt op vast SH medium (pH 7) (Figuur 5) 9. Alle concentraties van CEPA-afgeleide ethyleen aanzienlijk gedaald vlies nat gewicht (figuur 6A), had geen invloed op pellicule dikte (figuur 6B) en aanzienlijk toegenomen vlies droog gewicht (cellulose opbrengst; figuur 6C) 9. Een representatieve foto genomen pellicule diktemeting wordt getoond in figuur 7. Pellicle hydratatie verminderd met alle concentraties van CEPA-afgeleide etheen (figuur 8A) 9, terwijl alle concentraties CEPA-afgeleide etheen 9 verhoogd pellicle kristalliniteit (Figuur 8B). De effecten van NaCl en NaH 2 PO 4 waren significant in alle gevallen (gegevens niet getoond) bevestigde dat de waargenomen fenotypes veroorzaakt door CEPA-afgeleide etheen.
Figuur 3: CEPA ontleedt bij SH-medium (pH 7) om ethyleen te produceren Digitale USB Microscoop foto's tonen aan dat donker-gekweekte A.. thaliana zaailingen tonen de drievoudige respons fenotype (hypocotyl kortere, dikkere hypocotyl en overdreven apicale haak) wanneer gekweekt in de aanwezigheid van ACC en CEPA-afgeleide etheen vergeleken met de onbehandelde controle (A). De hypocotyl lengte van zaailingen gekweekt in de aanwezigheid van ACC en CEPA-afgeleide etheen significantly kleiner dan de onbehandelde controle (B). Schaal bar = 1 mm. Foutenbalken tonen SD (n = 3). Staven met verschillende letters zijn significant verschillend (p <0,0001). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Augimeri en Strap 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De pH van K. xylinus culturen hoog genoeg blijft voor CEPA afbraak in SH-medium (pH 7). De cultuur blijft pH boven 5, waardoor efficiënte ontleding van CEPA etheen gehele bacteriële groeicyclus. De pH van K. xylinus culturen moeten worden gecontroleerd als ze scheiden en resorb organische zuren. De legenda geeft de CEPA geteste concentraties. Merk op dat de y-as begintbij pH 5. Foutenbalken tonen SD (n = 3). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Augimeri en Strap 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: CEPA-afgeleide ethyleen verhoogt cellulose-productie door K. xylinus op een vast medium. K. xylinus werd gegroeid op SH agarplaten (pH 7) die onbehandeld (A) of werden voorbehandeld met aangezuurd (pH 2,5) ultrazuiver water (B), fosfaat en chloride (C - E) of CEPA (F - H ). Representatieve kolonies worden getoond. De pijl toont cellulose door K. xylinus, gezien als wazige stof rond de kolonie. Schaal bar = 0,5 mm. Dit cijfer has aangepast is Augimeri en Strap 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: CEPA-afgeleide ethyleen vermindert de water-holding capaciteit en verhoogt de opbrengst van K. xylinus cellulose pellicles. Kweken werden statisch gekweekt in SH-bouillon (pH 7), aangevuld met CEPA in 24-putjes platen en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 7 dagen vóór pellicles werden geoogst en geanalyseerd. CEPA-afgeleide etheen verminderde vlies natgewicht (A), had geen effect op vlies dikte (B) en verhoogde vlies drooggewicht (C). De verschillende CEPA behandelingen waren niet significant verschillend van elkaar. Foutenbalken tonen SD (n = 3). bars metverschillende letters zijn significant verschillend (p <0,05). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Augimeri en Strap 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatieve foto van K. xylinus pellicles. Pellicle dikte werd gemeten van foto's met behulp van ImageJ software. Schaal bar = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: CEPA-afgeleide etheen verminderde de hydratatie vanK. xylinus cellulose pellicles door verhoging vliesje kristalliniteit. Kweken werden statisch gekweekt in SH-bouillon (pH 7) in 24-putjes platen en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 7 dagen vóór pellicles werden geoogst en geanalyseerd. Pellicle hydratatie werd berekend als het verschil tussen vlies nat en droog gewicht. CEPA-afgeleide etheen verlaagde vlies hydratatie (A) door verhoging vlies kristalliniteit (B). De verschillende CEPA behandelingen waren niet significant verschillend van elkaar. Foutenbalken tonen SD (n = 3). Staven met verschillende letters zijn significant verschillend (p <0,05). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Augimeri en Strap 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven werkwijzen beschrijven de in situ bereiding van ethyleen uit CEPA voor de studie van bacteriële ethyleenreactie met het modelorganisme, K. xylinus. Deze werkwijze is zeer nuttig als ethyleen kan worden verkregen door aanvulling elk waterig medium dat een pH heeft hoger dan 3,5 10,11 met CEPA ontkennen de noodzaak van zuivere ethyleengas of gespecialiseerde laboratoriumapparatuur. Deze methode is niet beperkt tot het bestuderen van de effecten van CEPA afgeleide etheen bacteriën, maar kan ook worden aangepast om ethyleenrespons bij eukaryoten bestuderen. Het is belangrijk dat parallel controle-experimenten uitgevoerd met fosfaat en chloride als deze verbindingen ook worden bereid uit CEPA ontleding in situ. Een andere noodzakelijke controle is na te gaan of CEPA zelf oefent een direct effect op de microbiële culturen in onderzoek. Fysiologisch relevant ethyleenconcentraties geproduceerd wanneer K. xylinus culturen weopnieuw gekweekt in een pH 5 SH-medium en dienen daarom als controle voor CEPA effecten 9; Maar deze aanpak werkt alleen voor zuurbestendige organismen.
Het gebruik van CEPA-afgeleide etheen voor biologische studies in een waterig groeimedium vereist verificatie dat inderdaad etheen wordt geproduceerd in het systeem. De hier beschreven methode maakt gebruik van de A. thaliana triple respons assay die de drievoudige respons fenotype vertoond door dark-gegroeid zaailingen in de aanwezigheid van ethyleen 1 exploiteert. Petrischalen verdeeld in vier kwadranten kan de zaailingen worden gekweekt in MS medium afzonderlijk, doch dicht bij de relevante microbiële groeimedium. Toepassing van CEPA oplossing op het microbiële groeimedium vergemakkelijkt ethyleenproductie en onthult de aangrenzende zaailingen een exogene ethyleen zoals de kopruimte infiltreert. In aanvulling op de MS-medium met ACC zorgt voor een positieve controle omdat het de endogene product verbetertIon van etheen door A. thaliana en daaropvolgende inductie van de drievoudige respons fenotype.
Cultuur pH is een andere belangrijke overweging bij het produceren van ethyleen uit CEPA in microbiële groeimedium 13,14. De SH medium meestal gebruikt om de cultuur K. xylinus heeft een pH van ongeveer 5 die de productie van CEPA-afgeleide etheen (Augimeri en riem, ongepubliceerde gegevens) aanzienlijk verminderd; Daarom werd het medium op pH 7 9. Dit is consistent met andere onderzoeken die toonden dat de snelheid van CEPA eruit extreem traag of beneden pH 5, terwijl het sterk is verbeterd bij pH 7 13. Het is daarom van essentieel belang dat het groeimedium van de test organisme blijft boven pH 5. K. xylinus culturen bereikt minste pH van ongeveer 5,5, waardoor evolutie van etheen 9. Het is belangrijk op te merken dat de totale concentratie aan etheen niet onder deze kweek c worden geregeldaarden.
Het effect van CEPA afgeleide etheen op de groei, celluloseproduktie en vlies eigenschappen K. xylinus werd gebruikt om te illustreren dat bacteriële ethyleen reacties kunnen worden onderzocht met behulp van CEPA. Het aanpassen van deze methoden om ethyleen reactie in andere organismen te bestuderen is even eenvoudig als het veranderen van het groeimedium en fenotype analyses. Het gebruik van CEPA biedt onderzoekers met een handige vervanging voor ethyleengas en kunnen meer ethyleen-gemedieerde studies in bacteriën te stimuleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
- Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
- Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
- Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
- Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
- Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
- Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
- Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
- Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
- Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
- Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
- Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
- Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I.
