Introduction
Das Olefin Ethylen (C 2 H 4) wurde zum ersten Mal im Jahre 1901 als Pflanzenhormon entdeckt , wenn es beobachtet wurde , dass Erbsenkeimlinge, in einem Labor gezüchtet , die Kohlegaslampen verwendet, eine abnorme Morphologie zeigten , in denen Stiele (Hypokotylen) waren kürzer, dicker und beugte sich seitwärts im Vergleich zu normalen Erbsenkeimlinge; ein Phänotyp genannt später die dreifache Reaktion 1,2. Nachfolgende Studien zeigten , dass Ethylen ist ein wichtiger Phytohormone , die zahlreiche Entwicklungsprozesse wie Wachstum, Stressreaktion, Fruchtreife und Seneszenz 3. Arabidopsis thaliana, einem Modellorganismus für Pflanzenbiologie Forschung, ist gut untersucht in Bezug auf seine Reaktion auf Ethylen reguliert. Mehrere Ethylen - Antwort - Mutanten sind durch Ausnutzen der dreifache Reaktion Phänotyp beobachtet in dunkel gewachsenen A. isoliert thaliana Keimlinge in Gegenwart von Ethylen 1,4,5. Die Biosynthesevorstufe für die Ethylenproduktion in Pflanzen ist 1-aminocyclopropane Carbonsäure (ACC) 6 und häufig während der dreifachen Reaktion Assay verwendet wird endogenen Ethylenproduktion , die auf den dreifachen Reaktion Phänotyp 1,4,5 führt zu erhöhen.
Obwohl die Ethylen-Antwort in Pflanzen weit untersucht wird, wird die Wirkung der exogenen Ethylen auf Bakterien in beträchtlichem Ausmaß mit Pflanzen trotz der engen Verbindung von Bakterien under. Eine Studie berichtet , daß bestimmte Stämme von Pseudomonas überleben 7 Ethylen als alleinige Quelle für Kohlenstoff und Energie. Jedoch haben nur zwei Studien gezeigt, dass Bakterien an Ethylen reagieren. Die erste Studie zeigte , dass Stämme von Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida und P. syringae waren chemotaktische zu Ethylen unter Verwendung eines Agarose - Plug - Assay , in dem geschmolzene Agarose mit einem Chemotaxis - Puffer wurde mit reinem Ethylengas ins Gleichgewicht gebracht 8. Aber unseres Wissens gab es keine furth gewesener Berichte reines Ethylengas unter Verwendung bakterieller Ethylenantwort zu charakterisieren, wahrscheinlich aufgrund der schwer von Gasen im Labor ohne spezialisierte Ausrüstung Handhabung. Der zweite Bericht der bakteriellen Ethylen - Antwort gezeigt , dass Ethylen xylinus 9 bakterielle Cellulose - Produktion und beeinflusst die Genexpression in der Frucht-assoziierten Bakterium, Komagataeibacter (früher Gluconacetobacter) erhöht. In diesem Fall wurde der Ethylen freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA) verwendete Ethylen in situ innerhalb der Bakterienwachstumsmedium zu erzeugen, wodurch die Notwendigkeit für reines Ethylengas oder spezialisierte Ausrüstung umgeht.
CEPA produziert Ethylen bei einer 1: 1 - Molverhältnis oberhalb von pH 3,5 10,11 durch eine basenkatalysierte, Reaktion erster Ordnung 12 bis 14. Der Abbau von CEPA positiv mit pH und Temperatur 13,14 und Ergebnisse bei der Herstellung von Ethyl korreliertenene, Chlorid und Phosphat. CEPA bietet Forscher interessiert sich für bakterielle Reaktionen auf Ethylen mit einer günstigen Alternative zu gasförmigem Ethylen zu studieren.
Das übergeordnete Ziel der folgenden Protokolle ist es, ein einfaches und effizientes Verfahren zur Verfügung zu stellen bakterielle Ethylenantwort zu untersuchen und umfasst Validierung von physiologisch relevanten Niveaus der Ethylenproduktion von CEPA Zersetzung in Bakterienwachstumsmedium, Analyse der Kultur pH sicherzustellen CEPA Zersetzung nicht beeinträchtigt wird während Bakterienwachstum, und die Beurteilung der Wirkung von Ethylen auf bakterielle Morphologie und Phänotyp. Wir zeigen diese Protokolle K. mit xylinus, jedoch können diese Protokolle angepasst werden Ethylenantwort in anderen Bakterien zu untersuchen , indem die geeigneten Wachstumsmedium und Phänotyp - Analysen.
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Protocol
1. Chemikalien
- Eine Lösung aus 500 mM CEPA (144.49 g / mol) und eine Lösung von sowohl aus 500 mM NaCl (58,44 g / mol) und 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137.99 g / mol) in angesäuert (pH 2.5) von ultrareinem Wasser oder 0,1 N HCl. Mischen mit einem Vortex, bis die Lösungen klar sind.
- Abwechselnd verdünnen (10x), die 500 mM Lösungen in dem gleichen Lösungsmittel 5 mM und 50 mM Bestände zu erhalten.
- Bereiten Sie eine 10 mM Lösung von 1-Aminocyclopropancarbonsäure (ACC; 101,1 g / mol) in ultrareinem Wasser.
- Filter-sterilisieren Stammlösungen und speichern Aliquots bei -20 ° C.
- Filter-sterilisieren Cellulase. Store Aliquots bei 4 ° C.
2. Überprüfen der Ethylenproduktion von 2-Chlorethylphosphonsäure Zersetzung: Triple Antwort Assay
- Oberflächen sterilisieren Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia Seeds Mit der Vapor-Phase - Methode:
ACHTUNG: Der folgende Schritt erzeugt toxic Chlorgas. Führen Saatgut Sterilisation in einem Abzug.- Besorgen Sie sich einen verschließbaren Behälter tief genug, um einen 250-ml-Glasbecher für Saatgut Sterilisation aufzunehmen und es in einer Abzugshaube.
- In A. thaliana Samen zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie den Schlauch in einem Rack. Legen Sie das Rack mit dem offenen Rohr in den verschließbaren Behälter enthält.
Hinweis: Füllen Sie nicht einzelne Rohre über halb voll Chlorgas zu erlauben, die unteren Samen eindringen. - Legen Sie ein 250-ml-Becher 100 ml handelsübliche Bleiche in dem verschließbaren Behälter enthält. Vorsichtig 3 ml konzentrierter HCl zu dem Bleichmittel und sofort den Behälter mit dem Deckel zu versiegeln.
ACHTUNG: Bleach und HCl reagieren und giftige Chlorgas zu erzeugen, die die Samen an die Oberfläche zu sterilisieren wirkt. - Inkubieren der Samen in Gegenwart von Chlorgas für 4 Stunden in den Abzugsschrank.
Hinweis: Längere Sterilisationszeiten wird die Keimung Effizienz reduzieren. - Nach der Sterilisation ermöglichen, die chlorine Gas für mindestens 1 Stunde in der Abzugshaube zu entlüften dann das Reaktionsgefäß verschließen. Lassen Sie das Bleichmittel und HCl-Gemisch in der Abzugsschrank für mindestens 24 Stunden vor dem Wegwerfen.
Hinweis: Die sterilisierten Samen kann bei Raumtemperatur zur sofortigen Verwendung gelagert werden. - Halten Samen bei 4 ° C für die langfristige Lagerung. Bringen Sie Samen auf Raumtemperatur vor dem Reaktionsgefäß zu öffnen Kondensation zu vermeiden. Shop Samen im Dunkeln.
- Bereiten Agar-Platten in 4-Sektor Petrischalen (90 x 15 mm):
- Bereiten 110 ml Wachstumsmedium für A. thaliana Keimlinge: 1x Murashige und Skoog (MS) Basismedium 15 (4,33 g / l) mit 1% (w / v) Sucrose und 0,8% (w / v) Agar. Stellen Sie die MS-Medium auf pH 6 mit NaOH.
- Herstellung von 100 ml der Bakterienwachstumsmedium für CEPA Zersetzung: Schramm und Hestrin (SH) -Medium , enthaltend 1,5 16% (w / v) Agar. Stellen Sie den SH-Medium auf pH 7 mit NaOH.
- Sterilisieren Medien durch Autoklavieren und temper in einem 55 ° C Wasserbad.
- Sobald die MS-Agar temperiert hat, dann werden 40 ml in einen sterilen Kolben. Um die positive Kontrolle Wachstumsmedium für A. Vorbereitung thaliana Keimlinge, ergänzen die 40 ml Aliquot von MS - Agar mit 40 & mgr; l 10 mM ACC zu einer Endkonzentration von 10 uM ACC zu erhalten.
- 5 ml Medium zu den entsprechenden Quadranten der sectored Petrischalen (1) und damit der Agar verfestigt. Bereiten Sie alle Platten in dreifacher Ausfertigung.
Hinweis: CEPA ist nicht auf das Wachstumsmedium zugegeben, bis später in dem Protokoll.
Abb . 1: Aufbau von Agarplatten für die Dreifachantwort Assay mit CEPA verwendet eine schematische veranschaulicht die Quadranten spezifisch für die negative Kontrolle (A), Positivkontrolle (B) und Versuchsplatten (C). Diese Zahl hat sich von Augimeri und Bügel 9 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Stratify A. thaliana Samen zur Sicherung Synchrone Keimung:
- In etwa fünfzig A. thaliana Samen auf jeden Quadranten enthält , MS oder MS + ACC - Agar. Stellen Sie sicher, Samen werden gleichmäßig zu erleichtern Sämling Entnahme und Analyse verteilt.
- Inkubieren Platten Samen im Dunkeln bei 4 enthält ° C für 3-4 Tage.
- Zerlege CEPA auf das Bakterienwachstum Medium (SH) und Triple Response-Test durchführen:
- Nach Schichtung, setzen die Samen Fluoreszenzlicht für 2 Std.
- Verbreiten 10 ul der 500 mM Stammlösung CEPA auf den Quadranten der experimentellen Platten mit SH - Agar (pH 7; Figur 1) , um eine endgültige Konzentration zu erhalten CEPAvon 1 mM.
- Verschließen Sie die Platten mit Laborfolie und mit Folie abdecken einer dunklen Umgebung für die Samen zu schaffen.
- Keimen Samen nach unten Platten im Dunkeln bei 23 ° C für 3 Tage mit der Agarseite Inkubieren.
Hinweis: Die Platten gestapelt werden können, aber negative Kontrollen sollten auf dem Boden platziert werden, da Ethylen leichter als Luft ist.
- Analysieren Triple-Response-Assay Daten:
- Mit flamm sterilisierten Pinzette entfernen einzelne Sämlinge von einer Platte zu jeder Behandlung und Sicht unter einem Präpariermikroskop oder digitale USB-Mikroskop entspricht. Achten Sie darauf, den Boden der Sämlinge ausgerichtet sind und zu fotografieren.
- Entfernen 30 Sämlinge aus jedem Quadranten (60 Setzlinge pro biologische Replikation und 180 Setzlinge pro Behandlung). Richten Sie auf einer Oberfläche mit einem schwarzen Hintergrund und ein Foto mit einem Lineal.
- Messen Sie die Hypokotyls Länge (mm) von Wiederholungs Sämlinge mit ImageJ Software 17. Stellen Sie die Waage durch Klicken und Ziehen Sie die * gerade *Werkzeug mit einer Länge von 10 mm zu wählen. Wählen Sie "Scale" unter dem "Analyze" Registerkarte und stellen Sie den bekannten Abstand bis 10. Die Verwendung von * Segmented * Werkzeug, klicken Sie auf und ziehen, um wählen Sie die Länge des Hypokotyl und drücken Sie M Distanz zu messen. Vergleichen Sie die Mittel der biologischen Replikaten unter Verwendung einer Einweg-ANOVA mit einem Mehrfachvergleichstest des Tukey. Unterschiede werden als signifikant angesehen , wenn p <0,05.
3. Analyse der pH-Wert im gesamten Bakterienwachstum
- Wachsen und Quantify Komagataeibacter xylinus Starterkulturen in dreifacher Ausführung:
- Impfen eine einzige Kolonie von K. xylinus in 5 ml SH - Medium (pH 5) , supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase. Inkubieren Kulturen bei 30 ° C unter Rühren bei 150 rpm bis zu einer OD 600 von 0,3 bis 0,4 erreicht ist (ca. 72 h).
- Erntestarterkulturen durch Zentrifugation (2.000 × g, 4 ° C, 10 min). Mit 5 ml steriler 0,85% (w / v) NaCl Lösung, waschen Sie die Zellen zweimal und Zellpellet. Halten Sie Zellen auf Eis.
- Quantifizieren Zellen eine Petroff-Hausser-Zählkammer verwendet wird.
- Impfen Kulturen zur Analyse von pH-Wert:
- Zugabe von 150 ml SH-Brühe (pH 7), supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase bis zwölf 500 ml-Kolben mit Foliendeckeln. Impfen Flaschen mit K. xylinus Starterkulturen in einer Konzentration von 10 5 Zellen / ml. Mit den drei Starterkulturen, bereiten drei biologische Wiederholungen pro Behandlung.
- Supplement Kulturen mit 300 & mgr; l der 5, 50 oder 500 mM CEPA-Stammlösungen zu erhalten endgültige CEPA Konzentrationen von 0,01, 0,1, und 1,0 mM, respectively. Ergänzung zu den unbehandelten Kontrollkulturen mit 300 & mgr; l des verwendeten Lösungsmittels CEPA aufzulösen.
- Verschließen Sie die Flaschen durch dicht Taping der Foliendeckel auf den Kolben und Inkubation Kulturen für 14 Tage bei 30 ° C unter Rühren bei 150 Umdrehungen pro Minute.
- Jeden Tag aseptically entfernen 5-ml-Proben aus jedem Kolben und Pellet-Zellen durch Zentrifugation (2000 × g, 4 ° C, 10 min). Übertragen Überstand in ein sauberes Röhrchen und messen den pH-Wert jeder biologische Replikation unter Verwendung eines pH-Meters.
- Analysieren Sie die Zeitverlaufsdaten durch den mittleren pH-Wert der biologischen Replikaten der grafischen Darstellung.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Kultur pH-Wert unter 3,5 nicht absinkt; eine Kultur pH-Wert von 5 deutlich reduziert Ethylen Freisetzung von CEPA und einem pH-Wert unter 3,5 hemmt vollständig Ethylen-Release. - Um zu steuern , für Chlor und Phosphatspiegel, führen ein identisches Experiment unter Verwendung von 0,01, 0,1, und 1,0 mM des NaCl-NaH 2 PO 4 -Lösung unter Verwendung der 5, 50 und 500 mM Bestände, respectively.
4. Koloniemorphologie
- Wachsen K. xylinus Starterkulturen in dreifacher Ausführung:
- Impfen eine einzige Kolonie von K. xylinus in 5 ml SH - Medium (pH 5) , supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase. Incubate Kulturen bei 30 ° C unter Rühren bei 150 rpm bis zu einer OD 600 von 0,3 bis 0,4 erreicht ist (ca. 72 h).
- Erntestarterkulturen durch Zentrifugation (2.000 × g, 4 ° C, 10 min). Mit 5 ml steriler Kochsalzlösung, Waschen der Zellen und das Zellpellet zu resuspendieren. Halten Sie Zellen auf Eis.
- Vorbereitung 24 Agarplatten, enthaltend 25 ml SH (pH 7) -Medium mit 1,5% (w / v) Agar.
- Sobald der Agar sich verfestigt hat, verteilt 50 ul der 5, 50 und 500 mM CEPA Stammlösungen auf dem Agar endgültigen CEPA Konzentrationen von 0,01, 0,1, und 1,0 mM jeweils zu erhalten. Richten Sie unbehandelt und Lösungsmittel-Kontrollplatten, die keine Änderung bestehen und Verbreitung von 50 & mgr; l des Lösungsmittels verwendet, um die Testverbindungen zu lösen.
- Streak Platten für isolierte Kolonien mit einer Schleife voll (~ 5 & mgr; l) von K. xylinus Starterkultur und versiegeln sie mit Paraffinfilm. Impfen alle Platten in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren Platten für 5 Tage bei 30 ° C.
- Photograph Kolonien bei 20-facher Vergrößerung eine digitale USB-Mikroskop und qualitativ Koloniemorphologie und Zellstoffproduktion auf festem Medium zu bewerten.
Hinweis: Cellulose wird als trübe Substanz entlang des Randes der Kolonie. - Um zu steuern , für Chlor und Phosphatspiegel, führen ein identisches Experiment unter Verwendung von 0,01, 0,1, und 1,0 mM des NaCl-NaH 2 PO 4 -Lösung unter Verwendung der 5, 50 und 500 mM Bestände, respectively.
5. Pellicle Assays
- Wachsen und Quantify K. xylinus Starterkulturen in dreifacher Ausführung:
- In dreifacher Ausführung, eine einzige Kolonie von K. impfen xylinus in 5 ml SH - Medium (pH 5) , supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase. Inkubieren Kulturen bei 30 ° C unter Rühren bei 150 rpm bis zu einer OD 600 von 0,3 bis 0,4 erreicht ist (ca. 72 h).
- Erntestarterkulturen durch Zentrifugation (2.000 × g, 4 ° C, 10 min). Mit 5 ml steriler Kochsalzlösung, Waschen ter Zellen zweimal und Zellpellet. Halten Sie Zellen auf Eis.
- Quantifizieren Zellen eine Petroff-Hausser-Zählkammer verwendet wird.
- Bereiten Sie Mastermixe 24-Well-Platten zu inokulieren:
- Ergänzung 60 ml SH-Medium (pH 7) mit 120 ul der 5, 50 und 500 mM Bestände CEPA endgültige CEPA Konzentrationen von 0,01, 0,1, und 1,0 mM zu erhalten, respectively. Ergänzen weitere 60 ml SH-Medium (pH 7) mit 120 & mgr; l des verwendeten Lösungsmittels CEPA aufzulösen. Vortex mischen.
- Teilen Sie die jeweils 60 ml CEPA-haltiges Medium in vier 14-ml-Aliquoten. Beimpfen von drei der 14 ml - Aliquots mit biologischen Replikate von Starterkultur bei einer Konzentration von 10 5 Zellen / ml. Halten Sie Röhrchen mit Zellen auf Eis Cellulose-Produktion zu verhindern.
Hinweis: Die verbleibenden 14 ml aliquoten wird für sterile Kontrollvertiefungen verwendet werden.
- Impfen 24-Well-Platten:
- Testen Sie jede Behandlung in einer eigenen Platte mit drei Reihen von biologischen Replikaten undeine Reihe von sterilen Kontrollen (Abbildung 2).
Fig . 2: Ablaufdiagramm des Protokolls für Pellicle - Assay und die Analyse verwendet , veranschaulicht Vektor CEPA-ergänztem pH 7 SH - Medium (60 ml) wird drei getrennten biologischen replicate Inokulationen und einen sterilen Kontrolle (14 ml jeweils) aliquotiert. Diese Kulturen werden dann in Aliquots aufgeteilt in sechs technische Replikate (2 ml) in eine 24-Well-Platte und dann mit Paraffinfilm versiegelt. Nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen bei 30 ° C, Häutchen werden geerntet und gekennzeichnet durch Nassgewicht zu bestimmen, Dicke, Trockengewicht und Kristallinität durch FT-IR. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen
- Mit dem 14 ml Master-Mix, 2 ml in each von sechs Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte. Füllen Sie für die drei biologischen Replikaten und Sterilkontrolle (Abbildung 2). Wiederholen Sie für jede Behandlung.
- Dichtungsplatten mit Paraffinfilm und inkubieren statisch für 7 Tage bei 30 ° C.
- Ernte und Pellicle Wet Gewicht, Dicke, Trockengewicht (Cellulose - Ausbeute) und Kristallinität (Abbildung 2) messen:
- Drücken Sie eine Seite des Häutchen die gegnerische Häutchen Kante zu heben und zu entfernen einzelne Häutchen mit einer Pinzette. Während Griff halten, legen Sie sie auf frisches Papiertuch für 3 Sekunden überschüssige Medium zu entfernen, bevor mit einem Gewicht von ihren nassen Gewichte zu bestimmen.
- Richten Sie Häutchen neben einem Lineal und Foto von der Seite eine hochauflösende Digitalkamera.
- Mit ImageJ Software 17 messen Häutchen Dicke auf der linken Schulter, rechte Schulter und der Mitte jedes Häutchen. Durchschnittlich alle technischen Replikate für jede biologische RepliCate.
- Individuell übertragen Sie die Häutchen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Behandlung Häutchen mit 12 ml 0,1 N NaOH bei 80 ° C für 20 min Zellen zu lysieren.
- Entfernen Sie die NaOH und neutralisieren Häutchen von unter Rühren mit ultrareinem Wasser für 24 Stunden zu waschen. Wechseln Sie das Wasser alle 6 Stunden.
Anmerkung: Pellikel sollte nach Beendigung des Waschschritt weiß sein. - Ort Häutchen auf Silizium Matten und trocken bei 50 ° C für 48 Stunden bis zur Gewichtskonstanz. Nach dem Trocknen von Matten entfernen und Häutchen Gewichte im analytischen Maßstab messen, um bakterielle Cellulose-Ausbeute zu bestimmen.
- Analysieren Pellicle Kristallinität unter Verwendung Fourier-Transformations - Infrarotspektroskopie (FT-IR) unter Verwendung von 32 Scans und einer Auflösung von 4 cm -1 im Bereich von 4000 bis 650 cm -1. Berechnen Sie den Kristallinitätsindex, CI (IR), unter Verwendung von A 1437 / A 895; das Absorptionsverhältnis des "kristallinen Band" und "amorphen Band" , wie zuvor beschrieben 18.
- Um zu steuern , für Chlor und Phosphatspiegel, führen ein identisches Experiment unter Verwendung von 0,01, 0,1, und 1,0 mM des NaCl-NaH 2 PO 4 -Lösung unter Verwendung der 5, 50 und 500 mM Bestände, respectively.
- Analysieren Pellicle Daten:
- Berechnen Häutchen Hydratation durch den Unterschied zwischen Häutchen Nassgewicht und Trockengewicht zu bestimmen.
- Der Mittelwert der Werte aller technischen Replikate für die statistische Analyse einen einzelnen Wert für jede biologische Replikation zu erhalten. Vergleichen Sie die Behandlung ein one-way ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichstest. Die Unterschiede sind signifikant , wenn p <0,05.
- Normalisieren Daten als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollen und plotten die mittels biologischer Replikaten.
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Representative Results
C - Eine schematische Plattenaufbau zur Verifikation von Ethylen Befreiung von CEPA in SH - Medium (pH 7) durch den Dreifachantwort Assay wird in 1A gezeigt. Ein Flussdiagramm , das die Pellicle - Protokoll veranschaulicht , ist in Figur 2 Dark-grown A. gezeigten thaliana Keimlinge weisen die Dreifachantwort Phänotyp (kürzer und dicker Hypocotyl mit einer übertriebenen apikalen hook) in Gegenwart von ACC und in Gegenwart von Ethylen durch die Zersetzung von CEPA auf SH - Medium (pH 7) hergestellt, jedoch nicht unter Bedingungen unbehandelt (3A) 9. Die Hypokotyls Länge von ACC- und CEPA abgeleitete Ethylen behandelt A. thaliana Samen waren signifikant (p <0,0001) , die kürzer als die unbehandelten Kontrollen (3B) 9, die bestätigt , daß Ethylen aus CEPA auf SH - Medium (pH 7) bei einem physiologisch relevanten Konzentrationen freigesetzt wurdetion. Der pH - Wert von unbehandeltem und CEPA behandelten K. xylinus Kulturen blieb über 5 (4) , 9; daher CEPA Zersetzung in Ethylen wurde nicht durch bakterielle organischen Säureproduktion beeinträchtigt. CEPA abgeleitete Ethylen erhöhte bakterielle Produktion Zellulose als K. xylinus wurde auf festem SH - Medium (pH 7) gewachsen (Abbildung 5) 9. Alle Konzentrationen von CEPA abgeleitete Ethylen signifikant verringert Häutchen Nassgewicht (6A), nicht Häutchen Dicke (6B) und signifikant erhöhte Häutchen Trockengewicht nicht beeinträchtigte (Cellulose - Ausbeute; 6C) 9. Ein repräsentatives Bild für Pellicle Dickenmessung gemacht wird in 7 gezeigt. Pellicle Hydratation von allen Konzentrationen von CEPA-derived Ethylen (8A) 9, während alle Konzentrationen von CEPA-derived Ethylen 9 erhöht pel reduziertlicle Kristallinität (8B). Die Wirkungen von NaCl und NaH 2 PO 4 wurden in allen Fällen unbedeutend bestätigt (Daten nicht gezeigt), die beobachteten Phänotypen von CEPA-derived Ethylen verursacht wurden.
Abbildung 3: CEPA zersetzt sich beim SH - Medium (pH 7) zur Herstellung von Ethylen Digital USB-Aufnahmen zeigen , dass die dunkel gewachsenen A.. thaliana Keimlinge zeigen die dreifache Antwort Phänotyp (kürzere Hypokotyls, dicker Hypokotyls und übertriebene apikal Haken) , wenn in Gegenwart von ACC und CEPA abgeleitete Ethylen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (A) gewachsen. Das Hypokotyl Länge von Sämlingen in Gegenwart von ACC und CEPA-derived Ethylen gewachsen waren significantly kürzer als die unbehandelte Kontrolle (B). Maßstabsbalken = 1 mm. Die Fehlerbalken zeigen SD (n = 3). Balken mit verschiedenen Buchstaben sind signifikant verschieden (p <0,0001). Diese Zahl hat sich von Augimeri und Bügel 9 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Der pH - Wert K. xylinus Kulturen bleibt hoch genug für CEPA Zersetzung in SH - Medium (pH 7). Die Kultur pH bleibt oberhalb von 5, so dass für einen effizienten Abbau von CEPA in Ethylen im gesamten bakteriellen Wachstumszyklus. Der pH - Wert K. xylinus Kulturen müssen überwacht werden , da sie organische Säuren absondern und resorbieren. Die Legende zeigt die CEPA-Konzentrationen getestet. Man beachte, dass die y-Achse beginntbei pH 5. Die Fehlerbalken zeigen SD (n = 3). Diese Zahl hat sich von Augimeri und Bügel 9 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: CEPA abgeleitete Ethylen erhöht die Cellulose - Produktion durch K. xylinus auf einem festen Medium. K. xylinus wurde auf SH - Agar - Platten (pH 7) gezüchtet , die unbehandelt waren (A), oder mit angesäuert (pH 2,5) vorbehandelten Reinstwasser (B), Phosphat- und Chlorid (C - E) oder CEPA (F - H ). Repräsentative Kolonien gezeigt. Der Pfeil zeigt Cellulose durch K. hergestellt xylinus, gesehen als die trübe Substanz um die Kolonie. Maßstabsbalken = 0,5 mm. Diese Zahl has von Augimeri und Strap 9 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: CEPA abgeleitete Ethylen verringert die Wasserhaltefähigkeit und erhöht die Ausbeute an K. xylinus Cellulosehäutchen. Die Kulturen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen und inkubiert bei 30 ° C für 7 Tage statisch in SH - Brühe (pH 7) , supplementiert mit CEPA gezüchtet , bevor Häutchen wurden geerntet und analysiert. CEPA abgeleitete Ethylen vermindert Häutchen Nassgewicht (A), hatte keinen Einfluss auf Häutchen Dicke (B) und erhöhte Häutchen Trockengewicht (C). Die verschiedenen CEPA Behandlungen unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Die Fehlerbalken zeigen SD (n = 3). Bars mitverschiedenen Buchstaben sind signifikant verschieden (p <0,05). Diese Zahl hat sich von Augimeri und Bügel 9 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Repräsentative Foto von K. xylinus Häutchen. Pellicle Dicke wurde von den Fotografien mit ImageJ Software gemessen. Maßstabsbalken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: CEPA abgeleitete Ethylen reduziert die Hydrierung vonK. xylinus Cellulosehäutchen durch Pellicle Kristallinität zu erhöhen. Die Kulturen wurden statisch in SH broth (pH 7) gezüchtet in Platten mit 24 Vertiefungen, und bei 30 ° C inkubiert für 7 Tage vor Häutchen wurden geerntet und analysiert. Pellicle Hydratation wurde als die Differenz zwischen Häutchen Nass- und Trockengewicht berechnet. Ethylen reduziert Pellicle Hydratation (A) durch Erhöhen Pellicle Kristallinität (B) CEPA-abgeleitet. Die verschiedenen CEPA Behandlungen unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Die Fehlerbalken zeigen SD (n = 3). Balken mit verschiedenen Buchstaben sind signifikant verschieden (p <0,05). Diese Zahl hat sich von Augimeri und Bügel 9 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die hier beschriebenen Methoden skizzieren die in - situ - Herstellung von Ethylen aus CEPA für die Untersuchung von bakteriellen Ethylenantwort des Modellorganismus, K. xylinus. Dieses Verfahren ist sehr geeignet als Ethylen können durch Ergänzung beliebigen wässrigen Medium hergestellt werden, die einen pH - Wert größer als 3,5 10,11 mit CEPA negiert die Notwendigkeit für reines Ethylengas oder spezielle Laborausrüstung hat. Dieses Verfahren ist auf die Untersuchung der Wirkungen von CEPA-derived Ethylen auf Bakterien beschränkt, sondern kann auch zu studieren Ethylenantwort in eukaryotischen Organismen angepasst werden werden. Es ist wichtig , dass parallel Kontrollexperimente mit Phosphat und Chlorid durchgeführt werden , da diese Verbindungen auch aus CEPA Zersetzung in situ erzeugt werden. Eine weitere notwendige Steuerung ist zu prüfen, ob CEPA selbst eine direkte Auswirkung auf die Mikrobenkulturen untersuchten ausübt. Physiologisch irrelevant Ethylen - Konzentrationen wurden bei K. hergestellt xylinus Kulturen wirwieder in einem pH - Wert 5 SH - Medium gezüchtet und dienen somit als Kontrolle für CEPA Effekte 9; aber dieser Ansatz funktioniert nur für säuretoleranten Organismen.
Die Verwendung von CEPA abgeleitete Ethylen für biologische Studien in einem wässrigen Wachstumsmedium erfordert Überprüfung, dass Ethylen ist in der Tat innerhalb des Systems erzeugt wird. Das hier beschriebene Verfahren nutzt das A. thaliana triple Antwort Assay, der die dreifache Reaktion Phänotyp von dunklen gewachsenen Keimlinge in Gegenwart von Ethylen 1 zeigte ausnutzt. Petrischalen, in vier Quadranten unterteilt erlauben die Sämlinge in MS-Medium separat angebaut werden, sondern neben dem relevanten mikrobiellen Wachstumsmedium. Die Anwendung der CEPA-Lösung auf das mikrobielle Wachstumsmedium erleichtert die Ethylenproduktion und macht die benachbarten Sämlinge zu einer exogenen Quelle von Ethylen, wie es den Luftraum eindringt. In Ergänzung zu den MS-Medium mit ACC liefert eine positive Kontrolle, da sie die endogene Produkt verbessertIonen von Ethylen durch A. thaliana und anschließende Induktion der dreifachen Reaktion Phänotyp.
Kultur pH ist ein weiterer wichtiger Faktor , wenn Sie in der mikrobiellen Wachstumsmedium 13,14 Ethylen aus CEPA erzeugen. Das SH - Medium typischerweise Kultur K. verwendet xylinus einen pH - Wert von etwa 5 , die im wesentlichen die Herstellung von CEPA-derived Ethylen (Augimeri und Riemen, nicht veröffentlichte Daten) reduziert; Daher wurde das Medium auf pH 7 eingestellt . 9 Diese mit anderen Studien überein, die zeigten , dass die Rate der CEPA Abbau bei oder unter pH extrem langsam ist 5, während es stark bei pH 7 13 verstärkt wird. Es ist daher wichtig , um sicherzustellen , daß das Wachstumsmedium des Testorganismus bleibt oberhalb pH 5. K. xylinus Kulturen erreicht einen minimalen pH - Wert von etwa 5,5, so dass für die Evolution von Ethylen 9. Es ist wichtig, daß die absolute Konzentration von Ethylen zu beachten, nicht unter diesen Kultur c gesteuert werdenie Bedingungen.
Die Wirkung von CEPA abgeleitete Ethylen auf das Wachstum, die Cellulose - Produktion und Häutchen Eigenschaften von K. xylinus wurde verwendet , um darzustellen , daß bakterielle Ethylenantworten unter Verwendung CEPA untersucht werden konnte. diese Methoden Anpassung Ethylenantwort in anderen Organismen zu studieren, ist so einfach wie das Wachstumsmedium ändert und Phänotyp-Analysen. Die Verwendung von CEPA bietet Forschern ein bequemer Ersatz für Ethylengas und kann mehr Ethylen-vermittelte Studien in Bakterien fördern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
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