Introduction
El etileno olefina (C 2 H 4) fue descubierto por primera vez como una hormona vegetal en 1901 cuando se observó que las plántulas de guisante, cultivadas en un laboratorio que utiliza lámparas de gas de carbón, exhiben una morfología anormal en la que los vástagos (hipocotilos) eran más cortas, más gruesas y dobladas hacia los lados en comparación con las plantas de semillero de guisantes normales; un fenotipo más adelante llamado el 1,2 respuesta triple. Estudios posteriores demostraron que el etileno es una fitohormona vital que regula numerosos procesos de desarrollo tales como el crecimiento, la respuesta al estrés, la maduración del fruto y la senescencia 3. Arabidopsis thaliana, un organismo modelo para la investigación de biología vegetal, ha sido bien estudiado en cuanto a su respuesta al etileno. Varios mutantes de respuesta de etileno se han aislado mediante la explotación del fenotipo triple respuesta observada en la oscuridad de cosecha A. plántulas thaliana en presencia de etileno 1,4,5. El precursor biosintético para la producción de etileno en las plantas es 1-aácido minocyclopropane carboxílico (ACC) 6 y es comúnmente usado para el ensayo de triple respuesta para aumentar la producción de etileno endógeno que conduce a la triple 1,4,5 fenotipo de respuesta.
Aunque la respuesta de etileno es ampliamente estudiado en las plantas, el efecto del etileno exógeno sobre las bacterias es muy poco estudiado a pesar de la estrecha asociación de bacterias con plantas. Un estudio informó de que ciertas cepas de Pseudomonas pueden sobrevivir usando etileno como única fuente de carbono y energía 7. Sin embargo, sólo dos estudios han demostrado que las bacterias responden a etileno. El primer estudio demostró que las cepas de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, y P. syringae eran quimiotáctica hacia etileno usando un ensayo de tapón de agarosa en el que agarosa fundida se mezcló con un tampón de quimiotaxis equilibrada con gas etileno puro 8. Sin embargo, hasta donde sabemos, no ha habido Furthinformes er utilizando gas de etileno puro para caracterizar la respuesta de etileno bacteriana, probablemente debido a la dificultad de manejo de gases en el laboratorio sin equipo especializado. El segundo informe de respuesta a etileno bacteriana demostró que el etileno se incrementó la producción de celulosa bacteriana y la expresión génica influido en la bacteria asociada a fruta, Komagataeibacter (anteriormente Gluconacetobacter) xylinus 9. En este caso, el compuesto que libera etileno, se utilizó ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA) para producir etileno in situ dentro del medio de crecimiento bacteriano, evitando la necesidad de gas de etileno puro o equipo especializado.
CEPA produce etileno a una proporción de 1: 1 molar por encima de pH 3.5 a través de un 10,11, la reacción 12 de primer orden catalizada por base - 14. La degradación de la CEPA se correlaciona positivamente con el pH y la temperatura 13,14 y los resultados en la producción de acetato deeno, cloruro y fosfato. CEPA proporciona a los investigadores interesados en el estudio de las respuestas bacterianas de etileno con una alternativa conveniente a etileno gaseoso.
El objetivo general de los siguientes protocolos es proporcionar un método simple y eficaz para estudiar la respuesta de etileno bacteriana e incluye la validación de los niveles fisiológicamente relevantes de la producción de etileno a partir de la descomposición CEPA en medio de crecimiento bacteriano, el análisis de pH del cultivo para asegurar CEPA descomposición no se vea afectada durante el crecimiento bacteriano, y la evaluación del efecto del etileno sobre la morfología y el fenotipo bacteriano. Demostramos que utilizan estos protocolos K. xylinus, sin embargo, estos protocolos se puede adaptar para estudiar la respuesta de etileno en otras bacterias utilizando el medio de crecimiento apropiado y análisis fenotipo.
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Protocol
1. Productos químicos
- Preparar una solución de CEPA 500 mM (144,49 g / mol), y una solución que consiste en tanto NaCl 500 mM (58,44 g / mol) y 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) en acidificada (pH 2.5) agua ultra-pura o HCl 0,1 N. Mezclar utilizando un vórtice hasta que las soluciones son claras.
- En serie diluir (10x) las soluciones 500 mM en el mismo disolvente para obtener 5 mM y 50 mM de existencias.
- Preparar una solución de 10 mM de 1-aminocyclopropane ácido carboxílico (ACC; 101,1 g / mol) en agua ultra-pura.
- Filtro-esterilizar las soluciones madre y almacenar alícuotas a -20 ° C.
- Filtrar esterilizar celulasa. alícuotas se almacenan a 4 ° C.
2. Verificación de Producción de etileno a partir de 2-cloroetilfosfónico Ácido descomposición: Ensayo de Respuesta Triple
- Superficie-esterilizar Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia Semillas Uso de la fase de vapor Método:
PRECAUCIÓN: El siguiente paso produce tóxica gas de cloro. Llevar a cabo la esterilización de semillas en una campana de humos.- Obtener un recipiente hermético suficientemente profunda como para dar cabida a un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml para la esterilización de semillas y lo coloca en una campana de humos.
- Añadir A. thaliana semillas a un tubo de microcentrífuga y colocar el tubo en una gradilla. Coloque el bastidor que contiene el tubo abierto en el recipiente hermético.
Nota: No llenar tubos individuales sobre medio lleno para que el gas de cloro para penetrar en las semillas inferiores. - Colocar un vaso de precipitados de 250 ml que contiene 100 ml de lejía comercial en el recipiente sellable. Añadir cuidadosamente 3 ml de HCl concentrado a la lejía y sellar inmediatamente el recipiente con su tapa.
PRECAUCIÓN: El cloro y HCl reaccionan para producir gas de cloro tóxico que actúa a la superficie a esterilizar las semillas. - Se incuban las semillas en la presencia de gas cloro durante 4 horas en la campana de humos.
Nota: Los tiempos de esterilización más largos reducen la eficiencia de la germinación. - Después de la esterilización, permitir que el chlorine de gas de ventilación en la campana de humos durante al menos 1 hora y luego sellar el tubo de microcentrífuga. Deje la mezcla de cloro y HCl en la campana de humos durante al menos 24 horas antes de desechar.
Nota: Las semillas esterilizadas se pueden almacenar a temperatura ambiente para su uso inmediato. - Mantenga semillas a 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Llevar las semillas a temperatura ambiente antes de abrir el tubo de microcentrífuga para evitar la condensación. Guarde las semillas en la oscuridad.
- Preparar las placas de agar en placas de Petri 4 del sector (90 x 15 mm):
- Preparar 110 ml de medio de crecimiento para A. thaliana plántulas: 1x Murashige y Skoog (MS) medio basal 15 (4,33 g / L) que contenía 1% (w / v) de sacarosa y 0,8% (w / v) de agar. Ajustar el medio MS a pH 6 con NaOH.
- Preparar 100 ml de medio de crecimiento bacteriano para la descomposición CEPA: Schramm y Hestrin (SH) medio 16 que contiene 1,5% (w / v) de agar. Ajustar el medio SH a pH 7 con NaOH.
- Esterilizar en autoclave y medios temper en un baño de agua a 55 ° C.
- Una vez que el agar MS ha templado, añadir 40 ml a un matraz estéril. Para preparar el medio de crecimiento control positivo para A. thaliana plántulas, complementan la alícuota 40 ml de agar MS con 40 l de ACC 10 mM para obtener una concentración final de 10 mM ACC.
- Añadir 5 ml de medio a los cuadrantes correspondientes de los platos de Petri sectorizadas (Figura 1) y permitir que el agar se solidifique. Preparar todas las placas por triplicado.
Nota: CEPA no se añade al medio de crecimiento hasta más tarde en el protocolo.
Figura 1:. Configuración de placas de agar utilizados para el ensayo de respuesta triple con CEPA Un diagrama esquemático ilustra los cuadrantes específicos para el control negativo (A), control positivo (B), y las placas experimentales (C). Esta cifra ha sido modificado a partir de Augimeri y 9 de la correa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Estratificar A. Las semillas thaliana para asegurar una germinación sincrónico:
- Añadir aproximadamente el cincuenta por A. semillas thaliana en cada cuadrante que contiene MS o MS + ACC agar. Asegurarse de semillas se distribuyen uniformemente para facilitar la extracción y el análisis de las plántulas.
- Incubar las placas que contienen semillas en la oscuridad a 4 ° C durante 3-4 días.
- Descomponer CEPA el crecimiento bacteriano Medio (SH) y realizar Triple ensayo de respuesta:
- Después de la estratificación, exponer las semillas a la luz fluorescente durante 2 horas.
- Spread 10 l de la CEPA mM solución madre 500 en los cuadrantes de las placas de agar que contienen experimentales SH (pH 7; Figura 1) para obtener una concentración final CEPAde 1 mM.
- Sellar las placas con película de laboratorio y cubrir con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro para las semillas.
- Germinar las semillas mediante la incubación de las placas en la oscuridad a 23 ° C durante 3 días con el agar hacia abajo.
Nota: Las placas pueden ser apiladas, pero los controles negativos se deben colocar en la parte inferior desde el etileno es más ligero que el aire.
- Analizar Triple respuesta del ensayo de datos:
- Con unas pinzas esterilizadas a la llama, retire una plántula de una placa correspondiente a cada tratamiento y vistas bajo un microscopio de disección o digital USB. Asegúrese de que la parte inferior de las plántulas están alineados y la fotografía.
- Retire 30 plántulas de cada cuadrante (60 plántulas por repetición biológica y 180 plántulas por tratamiento). Alinear en una superficie con un fondo negro y una fotografía con una regla.
- Medir la longitud del hipocotilo (mm) de las plántulas replicados utilizando el software ImageJ 17. Establecer la escala haciendo clic y arrastrando el recto * *herramienta para seleccionar una longitud de 10 mm. Seleccione "Escala de Ajuste" en la pestaña "Analizar" y ajuste la distancia conocida a 10. Con la herramienta * * segmentado, haga clic y arrastre para seleccionar la longitud del hipocotilo y pulse M para medir la distancia. Comparar las medias de réplicas biológicas utilizando un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias se consideraron significativas si p <0,05.
3. Análisis de pH en todo el crecimiento bacteriano
- Crecer y cuantificar Komagataeibacter culturas xylinus arranque por triplicado:
- Se inocula una sola colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubar cultivos a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO 600 se alcanza de 0,3 a 0,4 (alrededor de 72 hr).
- Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml 0,85% estéril (w / v) NaCll solución, lavar las células dos veces y resuspender el sedimento celular. Mantener las células en hielo.
- Cuantificar las células utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser.
- Inocular cultivos para el análisis de pH:
- Añadir 150 ml de caldo de SH (pH 7) suplementado con 0,2% (v / v) de celulasa esterilizada por filtración a doce 500 ml frascos con tapas de aluminio. Inocular matraces con K. cultivos iniciadores xylinus a una concentración de 10 5 células / ml. El uso de los tres cultivos iniciadores, se preparan tres repeticiones por tratamiento biológico.
- culturas suplemento con 300 l de las soluciones madre de CEPA mM 5, 50, o 500 para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Suplemento los cultivos de control no tratados con 300 l de disolvente utilizado para disolver CEPA.
- Sellar los matraces con cinta adhesiva firmemente las tapas de papel de aluminio a los matraces y se incuban los cultivos durante 14 días a 30 ° C con agitación a 150 rpm.
- Cada día, asepticaLLY eliminar muestras de 5 ml de cada matraz y las células de pellets por centrifugación (2.000 xg; 4 ° C; 10 min). Transferencia de los sobrenadantes a un tubo limpio y medir el pH de cada réplica biológica utilizando un medidor de pH.
- Analizar los datos de tiempo-por supuesto graficando el pH promedio de las réplicas biológicas.
Nota: Es importante que el pH del cultivo no sea inferior a 3,5; un pH del cultivo de 5 reduce significativamente la liberación de etileno a partir de CEPA, y un pH inferior a 3,5 inhibe completamente la liberación de etileno. - Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH 2 PO 4 utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente.
4. Morfología de colonias
- Crecer K. Los cultivos xylinus de arranque, por triplicado:
- Se inocula una sola colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubadorasculturas TE a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO 600 de 0,3 a 0,4 se alcanza (aproximadamente 72 hr).
- Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml de solución salina estéril, se lavan las células y luego resuspender el botón celular. Mantener las células en hielo.
- Preparar 24 placas de agar que contienen 25 ml de SH (pH 7) medio con 1,5% (w / v) de agar.
- Una vez que el agar se ha solidificado, se extendió 50 l de la 5, 50, y 500 de CEPA mM de soluciones madre en el agar para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Creados placas de control no tratados y de disolvente, que constan de ninguna modificación y difusión de 50 l de disolvente usado para disolver los compuestos de ensayo.
- Placas de imagen unidimensional para las colonias aisladas con un bucle completo (~ 5 l) de K. xylinus cultivo iniciador y sellarlos con película de parafina. Inocular todas las placas por triplicado. Incubar las placas durante cinco días a 30 ° C.
- Fotoograph colonias de 20 aumentos con un microscopio digital USB y la evaluación cualitativa de producción de celulosa y la morfología colonial en medio sólido.
Nota: Celulosa aparece como una sustancia nebuloso lo largo del margen de la colonia. - Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH 2 PO 4 utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente.
5. Ensayos de película
- Crecer y cuantificar K. Los cultivos xylinus de arranque, por triplicado:
- Por triplicado, inocular una única colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubar cultivos a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO 600 se alcanza de 0,3 a 0,4 (alrededor de 72 hr).
- Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml de solución salina estéril, lavar tél células dos veces y volver a suspender el sedimento celular. Mantener las células en hielo.
- Cuantificar las células utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser.
- Preparar las mezclas maestras para inocular placas de 24 pocillos:
- Suplemento 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 l de la 5, 50, y las poblaciones de 500 mM de CEPA para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Suplemento otros 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 l de disolvente utilizado para disolver CEPA. Vórtice para mezclar.
- Dividir cada una de 60 ml de CEPA que contienen medio en cuatro alícuotas de 14 ml. Inocular tres de los 14 ml alícuotas con réplicas biológicas de cultivo iniciador a una concentración de 10 5 células / ml. Mantenga los tubos con las células en hielo para evitar la producción de celulosa.
Nota: La alícuota restante 14 ml se utilizará para los pocillos de control estériles.
- Inocular placas de 24 pocillos:
- Pruebe cada tratamiento en su propio plato con tres filas de réplicas biológicas yuna fila de controles estériles (Figura 2).
Figura 2:. Diagrama de flujo que ilustra el protocolo utilizado para el ensayo de película y el análisis complementado-CEPA Stock medio SH pH 7 (60 ml) se dividió en alícuotas de tres inoculaciones repetidas biológica separada y un control estéril (14 ml cada uno). Estos cultivos se dividen en partes alícuotas en seis repeticiones técnica (2 ml) en una placa de 24 pocillos y luego se sellan con película de parafina. Después de la incubación durante 7 días a 30 ° C, unas películas se cosechan y se caracterizan por la determinación del peso en húmedo, grosor, peso seco, y la cristalinidad mediante FT-IR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura
- El uso de la mezcla maestra de 14 ml, añadir 2 ml en EACh de seis pocillos de una placa de 24 pocillos estériles. Completar las tres repeticiones biológica y el control estéril (Figura 2). Repita este procedimiento para cada tratamiento.
- placas de sellado con película de parafina y se incuba estáticamente durante 7 días a 30 ° C.
- Medir la cosecha y Pellicle Wet peso, grosor, peso seco (rendimiento de celulosa) y la cristalinidad (Figura 2):
- Presione un lado de la película para elevar el borde película contrario y eliminar unas películas individuales con fórceps. Al tiempo que mantiene el agarre, colocarlos sobre una toalla de papel limpia durante 3 segundos para eliminar el exceso de medio antes de pesar para determinar sus pesos en húmedo.
- Alinear unas películas adyacentes a un gobernante y una fotografía de la cara usando una cámara digital de alta resolución.
- El uso de software ImageJ 17, medir el espesor de película en el hombro izquierdo, hombro derecho y el centro de cada película. Un promedio de todos los técnicos repeticiones para cada RepliCat biológicami.
- Individualmente transferir las unas películas en los pocillos de una placa de 6 pocillos. El tratamiento de unas películas con 12 ml de NaOH 0,1 N a 80 ° C durante 20 minutos para lisar las células.
- Retire el NaOH y neutralizar unas películas mediante el lavado con agua ultra pura durante 24 horas con agitación. Cambie el agua cada 6 horas.
Nota: unas películas deben ser de color blanco tras la finalización de la etapa de lavado. - Coloque unas películas en las esteras de silicio y seco a 50 ° C durante 48 horas hasta peso constante. Una vez seco, retirar de esteras y medir los pesos peliculares en una balanza analítica para determinar el rendimiento de celulosa bacteriana.
- Analizar cristalinidad película usando transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojos (FT-IR) usando 32 barridos y una resolución de 4 cm -1 en el rango de 4.000 a 650 cm -1. Calcular el índice de cristalinidad, CI (IR), usando un 1437 / A 895; la relación de absorbancia de la "banda cristalina" y "banda amorfa", como se ha descrito previamente 18.
- Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH 2 PO 4 utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente.
- Analizar Pellicle datos:
- Calcular la hidratación película mediante la determinación de la diferencia entre la película de peso húmedo y el peso seco.
- La media de los valores de todas las repeticiones técnica para obtener un valor único para cada réplica biológica para el análisis estadístico. Comparación de tratamientos usando un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias son significativas si p <0,05.
- Normalizar los datos como el porcentaje de los controles no tratados y trazar los medios de réplicas biológicas.
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Representative Results
Una configuración de placa esquemática para la verificación de la liberación de etileno de CEPA en medio SH (pH 7) mediante el ensayo de triple respuesta se muestra en la Figura 1A - C. Un diagrama de flujo que ilustra el protocolo de película se muestra en la Figura 2. Dark-adulto A. thaliana plántulas exhiben el fenotipo de triple respuesta (hipocotilo corto y más grueso con un gancho apical exagerada) en presencia de ACC y en presencia de etileno producido a través de la descomposición de CEPA en medio SH (pH 7), pero no en condiciones no tratados (Figura 3A) 9. La longitud del hipocotilo de derivados de CEPA ACC- y tratada de etileno A. semillas thaliana fueron significativamente (p <0,0001) más corto que los controles no tratados (Figura 3B) 9, lo que confirma que el etileno fue puesto en CEPA en medio SH (pH 7) a una concentración fisiológicamente relevanteción. El pH de K. no tratado y tratado con CEPA culturas xylinus mantuvieron por encima de 5 (Figura 4) 9; Por lo tanto, la descomposición de CEPA en etileno no se vio afectada debido a la producción de ácidos orgánicos bacteriana. Etileno derivado de CEPA aumentó la producción de celulosa bacteriana cuando K. xylinus se cultivó en medio SH sólido (pH 7) (Figura 5) 9. Todas las concentraciones de etileno derivado de CEPA disminuyeron significativamente película peso húmedo (Figura 6A), no afectó espesor película (Figura 6B) y peso seco incrementado significativamente película (el rendimiento de celulosa; Figura 6C) 9. Una foto representativa tomada para la medición de espesor de película se muestra en la Figura 7. Hidratación Pellicle se redujo en todas las concentraciones de etileno derivada de CEPA (Figura 8A) 9, mientras que todas las concentraciones de CEPA derivado de etileno 9 aumentaron pellicle cristalinidad (Figura 8B). Los efectos de NaCl y NaH 2 PO 4 fueron insignificantes en todos los casos (datos no mostrados) confirmando que los fenotipos observados fueron causados por etileno derivada de CEPA.
Figura 3: CEPA se descompone en medio SH (pH 7) para producir etileno fotografías de microscopio digital USB muestran que oscuro crecido A.. thaliana plántulas muestran el fenotipo de respuesta triple (hipocotilo más corto, más grueso hipocotilo y exagerada gancho apical) cuando se cultivan en presencia de ACC y etileno derivada de CEPA en comparación con el control sin tratar (A). La longitud del hipocótilo de las plántulas cultivadas en la presencia de CAC y etileno derivado de CEPA eran significantly más corto que el control no tratado (B). Barra de escala = 1 mm. Las barras de error muestran SD (n = 3). Las barras con letras diferentes son significativamente diferentes (p <0,0001). Esta cifra ha sido modificado a partir de Augimeri y 9 de la correa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El pH de K. xylinus culturas sigue siendo lo suficientemente alta para la descomposición CEPA en medio SH (pH 7). El pH del cultivo se mantiene por encima 5, lo que permite la descomposición eficiente de CEPA en etileno en todo el ciclo de crecimiento bacteriano. El pH de K. culturas xylinus deben ser controlados, ya que segregan y se reabsorben ácidos orgánicos. La leyenda muestra las concentraciones ensayadas de CEPA. Tenga en cuenta que comienza el eje ya pH 5. Las barras de error muestran SD (n = 3). Esta cifra ha sido modificado a partir de Augimeri y 9 de la correa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: etileno derivado de CEPA aumenta la producción de celulosa por K. xylinus en un medio sólido. K. xylinus se cultivó en placas de agar SH (pH 7) que estaban sin tratar (A), o pre-tratado con acidificada (pH 2,5) de agua ultra-pura (B), fosfato y cloruro de (C - E) o CEPA (F - H ). se muestran colonias representativas. La celulosa de flecha muestra producida por K. xylinus, visto como la sustancia nebulosa alrededor de la colonia. Barra de escala = 0,5 mm. Esta cifra haHa sido modificado a partir de Augimeri y la correa 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: etileno derivado de CEPA disminuye la capacidad de retención de agua y aumenta el rendimiento de K. xylinus unas películas de celulosa. Los cultivos se desarrollaron en caldo estáticamente SH (pH 7) suplementado con CEPA en placas de 24 pocillos, y se incubaron a 30 ° C durante 7 días antes de se recogieron y se analizaron unas películas. Etileno derivada de la disminución de la CEPA película peso húmedo (A), no tuvo ningún efecto en el grosor de película (B) y el aumento de peso en seco película (C). Los diferentes tratamientos de CEPA no fueron significativamente diferentes entre sí. Las barras de error muestran SD (n = 3). Las barras conletras diferentes son significativamente diferentes (p <0,05). Esta cifra ha sido modificado a partir de Augimeri y 9 de la correa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: fotografía representativa de K. unas películas xylinus. espesor película se midió a partir de fotografías utilizando el software ImageJ. Barra de escala = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: etileno derivado de CEPA reduce la hidratación deK. xylinus unas películas de celulosa mediante el aumento de la cristalinidad película. Los cultivos se desarrollaron en caldo estáticamente SH (pH 7) en placas de 24 pocillos, y se incubaron a 30 ° C durante 7 días antes de se recogieron y se analizaron unas películas. hidratación Pellicle se calculó como la diferencia entre la película húmeda y el peso seco. CEPA derivados de etileno reducido hidratación película (A) mediante el aumento de la cristalinidad película (B). Los diferentes tratamientos de CEPA no fueron significativamente diferentes entre sí. Las barras de error muestran SD (n = 3). Las barras con letras diferentes son significativamente diferentes (p <0,05). Esta cifra ha sido modificado a partir de Augimeri y 9 de la correa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos descritos aquí describen la producción in situ de etileno a partir de CEPA para el estudio de la respuesta de etileno bacteriana usando el organismo modelo, K. xylinus. Este método es muy útil como etileno puede ser producido por complementar cualquier medio acuoso que tiene un pH mayor que 3,5 10,11 con CEPA negando la necesidad de gas de etileno puro o equipo de laboratorio especializado. Este método no se limita a estudiar los efectos del etileno CEPA derivados de bacterias, pero también se puede adaptar para estudiar la respuesta de etileno en organismos eucariotas. Es importante que los experimentos de control en paralelo pueden realizar con fosfato y cloruro ya que estos compuestos también son producidos de la descomposición CEPA in situ. Otro control necesario es determinar si misma CEPA ejerce un efecto directo sobre los cultivos microbianos que se investigan. Fisiológicamente concentraciones de etileno irrelevantes se produjeron cuando K. culturas xylinus nosotrosre crecido en un medio SH pH 5 y por lo tanto servir como un control para los efectos de CEPA 9; Sin embargo, este enfoque sólo funciona para organismos tolerantes ácidos.
El uso de etileno derivada de CEPA para estudios biológicos en un medio de crecimiento acuoso requiere la verificación de que el etileno de hecho se produce dentro del sistema. El método descrito aquí utiliza la A. ensayo thaliana triple respuesta que explota el fenotipo triple respuesta exhibida por las plantas de semillero cultivadas en la oscuridad en la presencia de etileno 1. placas de Petri divide en cuatro cuadrantes permita que las plántulas que se cultivaron en medio MS por separado, pero adyacente al medio de crecimiento microbiano relevante. Aplicación de solución CEPA sobre el medio de crecimiento microbiano facilita la producción de etileno y expone las plántulas adyacentes a una fuente exógena de etileno, ya que se infiltra en el espacio de cabeza. Suplementando el medio MS con ACC proporciona un control positivo, ya que mejora el producto endógenoion de etileno por A. thaliana y la posterior inducción de la respuesta fenotipo triple.
El pH del cultivo es otra consideración importante cuando la producción de etileno a partir de la CEPA en medio de crecimiento microbiano 13,14. El medio SH típicamente usado para cultivar K. xylinus tiene un pH de aproximadamente 5 que reduce sustancialmente la producción de etileno derivada de CEPA (Augimeri y correa, datos no publicados); Por lo tanto, el medio se ajustó a pH 7 9. Esto es coherente con otros estudios que demostraron que la velocidad de descomposición CEPA es extremadamente lento en o por debajo de pH 5, al tiempo que se mejora en gran medida a pH 7 13. Es por lo tanto esencial para asegurar que el medio de crecimiento del organismo de ensayo se mantiene por encima de pH 5. K. culturas xylinus alcanzaron un pH mínimo de aproximadamente 5,5, lo que permite la evolución de etileno 9. Es importante señalar que la concentración absoluta de etileno no puede ser controlada bajo estas c culturaondiciones.
El efecto del etileno CEPA derivados en el crecimiento, la producción de celulosa, y las propiedades peliculares de K. xylinus se utilizó para ilustrar que las respuestas de etileno bacterianas podrían ser examinados utilizar CEPA. La adaptación de estos métodos para estudiar la respuesta de etileno en otros organismos es tan simple como cambiar el medio de crecimiento y análisis fenotipo. El uso de CEPA proporciona a los investigadores un sustituto conveniente para el gas etileno y puede animar a más estudios de etileno mediada en bacterias.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
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