Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utnytte Etylen-frigjørende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som et verktøy for å studere Etylen Response i Bakterier

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54682
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Microbial Biochemistry Laboratory, Faculty of Science (Applied Bioscience Program), University of Ontario Institute of Technology

Introduction

Olefinet etylen (C 2 H 4) ble først oppdaget som en plante hormon i 1901 da det ble observert at ert frøplanter, dyrket i et laboratorium som brukes kull gass lamper, oppviste en unormal morfologi hvori stengler (hypocotyls) var kortere, tykkere og bøyd sidelengs i forhold til normal ert frøplanter; en fenotype senere kalt trippel respons 1,2. Etterfølgende studier viste at etylen er et viktig phytohormone som regulerer mange utviklingsmessige prosesser som for eksempel vekst, stressrespons, fruktmodning og senescens 3. Arabidopsis thaliana, modellorganisme for plantebiologi forskning, har blitt godt undersøkt i forhold til sitt svar til etylen. Flere etylen respons mutanter har blitt isolert ved å utnytte trippel respons fenotype observert i mørke vokst A. thaliana planter i nærvær av etylen 1,4,5. Den biosyntetisk forløper for etylenproduksjon i planter er 1-enminocyclopropane karboksylsyre (ACC) 6, og brukes vanligvis i løpet av tre reaksjon assay for å øke endogen etylenproduksjon som fører til trippel respons fenotype 1,4,5.

Selv om etylen responsen er mye studert i planter, er effekten av eksogene etylen på bakterier langt studerte til tross for tett sammenslutning av bakterier med planter. En studie rapporterte at visse Pseudomonas-stammer som kan overleve ved anvendelse av etylen som en eneste kilde for karbon og energi 7. Imidlertid har bare to studier har vist at bakterier svare til etylen. Den første studien viste at stammer av Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, og P. syringae var kjemotaktiske mot etylen ved hjelp av en agarose-plugg analyse hvor det smeltede agarose ble blandet med en kjemotaksis-buffer ekvilibrert med ren etylengass 8. Men til vår kunnskap, har det ikke vært noen Furthere rapporter ved hjelp av ren etylengass for å karakterisere bakteriell etylen respons, sannsynligvis på grunn av den så lett å håndtere gasser i laboratoriet uten spesialutstyr. Den andre rapporten fra bakteriell etylen respons viste at etylen økt bakteriell cellulose produksjon og påvirket genuttrykk i frukt-assosiert bakterien, Komagataeibacter (tidligere Gluconacetobacter) xylinus 9. I dette tilfellet er den etylen-frigjørende forbindelse, 2-chloroethylphosphonic syre (CEPA) ble anvendt for å fremstille etylen in situ inne i bakterievekstmedium, omgå behovet for ren etylengass eller spesialisert utstyr.

CEPA produserer etylen ved et 1: 1 molart forhold over pH 3,5 10,11 via en base-katalysert, førsteorden-reaksjon 12 - 14. Nedbrytningen av CEPA er positivt korrelert med pH og temperatur 13,14 og resulterer i produksjon av etylen, klorid og fosfat. CEPA gir forskere interessert i å studere bakteriesvar til etylen med et praktisk alternativ til gass etylen.

Det overordnede målet for følgende protokoller er å gi en enkel og effektiv metode for å studere bakteriell etylen respons og inkluderer validering av fysiologisk relevante nivåer av etylenproduksjonen fra CEPA nedbrytning i bakterievekst medium, til analyse av kultur pH sikre CEPA dekomponering ikke er svekket i løpet av bakterievekst og vurdering av effekten av etylen på bakteriell morfologi og fenotype. Vi viser disse protokollene ved hjelp K. xylinus, men disse protokollene kan tilpasses for å studere etylen respons i andre bakterier ved anvendelse av det egnede vekstmedium og fenotype analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kjemikalier

  1. Fremstille en oppløsning av 500 mM CEPA (144,49 g / mol), og en oppløsning bestående av både 500 mM NaCl (58,44 g / mol) og 500 mM NaH 2PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) i surgjort (pH 2.5) ultrarent vann eller 0,1 N HCl. Bland ved hjelp av en vortex inntil de er klare.
  2. Serielt fortynnet (10x) til 500 mM løsninger i det samme løsningsmiddel for å oppnå 5 mM og 50 mM aksjer.
  3. Forbered en 10 mM løsning av 1-aminocyclopropane karboksylsyre (ACC, 101,1 g / mol) i ultrarent vann.
  4. Filter-sterilisere stamløsninger og butikk delmengder ved -20 ° C.
  5. Filter-sterilisere cellulase. Oppbevar alikvoter ved 4 ° C.

2. Kontrollere Ethylene Produksjonen fra 2-Chloroethylphosphonic Acid Nedbrytning: Triple Response analyse

  1. Surface-sterilisere Arabidopsis thaliana ecotype Columbia Frø Bruke Vapor-fase Metode:
    FORSIKTIG: Det neste trinnet produserer toksisk klorgass. Gjennomføre frø sterilisering i en avtrekkshette.
    1. Få tak i en lukket beholder dypt nok til å romme en 250 ml begerglass for frø sterilisering og legg den i en avtrekkshette.
    2. Legg A. thaliana frø til en mikro tube og plassere røret i et rack. Sett stativet inneholdende den åpne røret i lukket beholder.
      Merk: Ikke fyll individuelle rør over en halv full slik at klorgass for å trenge gjennom lavere frø.
    3. Plasser en 250 ml begerglass inneholdende 100 ml kommersiell blekemiddel i lukket beholder. Tilsett forsiktig 3 ml konsentrert HCl til blekemiddel og umiddelbart forsegle beholderen med sitt lokk.
      FORSIKTIG: Bleach og HCl reagerer å produsere giftig klorgass som virker til overflaten-sterilisere frøene.
    4. Inkuber frø i nærvær av klorgass i 4 timer i fumehood.
      Merk: Lengre steriliseringstider vil redusere spiring effektivitet.
    5. Etter steriliseringen la chlorine gass for å lufte i avtrekksskap i minst en time og deretter forsegle mikrosentrifugerør. La blekemiddel og HCl blandingen i fumehood i minst 24 timer før du kasserer.
      Merk: Steriliserte frø kan lagres ved romtemperatur i umiddelbar bruk.
    6. Hold frø ved 4 ° C for langtidslagring. Ta med frø til romtemperatur før du åpner mikrosentrifugerør å unngå kondens. Oppbevar frøene i mørket.
  2. Forbered agar plater i fire-sektor Petri Retter (90 x 15 mm):
    1. Forbered 110 ml vekstmedium for A. thaliana planter: 1x Murashige og Skoog (MS) basalmedium 15 (4,33 g / l) inneholdende 1% (vekt / volum) sukrose og 0,8% (w / v) agar. Juster MS mediet til pH 6 med NaOH.
    2. Fremstille 100 ml av bakterievekstmedium for CEPA dekomponering: Schramm og Hestrin (SH) medium 16 inneholdende 1,5% (w / v) agar. Juster SH mediet til pH 7 med NaOH.
    3. Steriliser media ved autoklave og temper i et 55 ° C vannbad.
    4. Når MS agar har herdet, legg 40 ml til en steril flaske. For å fremstille den positive kontroll vekstmedium for A. thaliana frøplanter, supplere 40 ml alikvot av MS-agar med 40 ul 10 mM ACC for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 10 uM ACC.
    5. Tilsett 5 ml av medium til de aktuelle kvadranter av sectored petriskåler (figur 1) og la agar å stivne. Forbered alle platene i tre eksemplarer.
      Merk: CEPA er ikke lagt til vekstmediet før senere i protokollen.

Figur 1
Fig. 1: Innstilling av agarplater som brukes for trippel respons analysen med CEPA Et skjematisk illustrerer de kvadranter som er spesifikke for den negative kontroll (A), positiv kontroll (B), og eksperimentelle plater (C). Dette tallet har blitt forandret fra Augimeri og stropp 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Stratify A. thaliana frø for å sikre Synkron Spiring:
    1. Legg ca femti A. thaliana frø bort på hver kvadrant med MS eller MS + ACC agar. Sørg frø er jevnt fordelt til rette frøplante fjerning og analyse.
    2. Inkuber platene inneholder frø i mørke ved 4 ° C i 3-4 dager.
  2. Brytes CEPA på Bakteriell vekstmedium (SH) og utfør Triple Response analyse:
    1. Etter stratifisering, utsette frøene til fluorescerende lys i 2 timer.
    2. Spre 10 pl av 500 mM CEPA stamløsning på kvadrantene av de eksperimentelle plater inneholdende SH-agar (pH 7, figur 1) for å oppnå en sluttkonsentrasjon CEPApå 1 mM.
    3. Tett platene med laboratorie film og dekk med folie for å skape et mørkt miljø for frøene.
    4. Spire frø ved å inkubere platene i mørke ved 23 ° C i 3 dager med agar siden ned.
      Merk: Plater kan stables, men negative kontroller skal plasseres på den nedre siden av etylen er lettere enn luft.
  3. Analyser Triple Response analyse av data:
    1. Med flamme sterilisert pinsett, fjerner enkelt frøplanter fra en plate som tilsvarer hver behandling og visning under en dissekere eller digital USB mikroskop. Sørg for at bunnen av frøplantene er justert og fotografi.
    2. Fjern 30 frøplanter fra hver kvadrant (60 frøplanter pr biologisk replikere og 180 stiklinger per behandling). Juster på en overflate med en svart bakgrunn og fotografere med en linjal.
    3. Mål hypocotyl lengde (mm) av replikere frøplanter bruker ImageJ programvare 17. Still skalaen ved å klikke og dra * Rett *verktøy for å velge en lengde på 10 mm. Velg "Sett Scale" under "Analyser" -fanen og angi kjent avstand til 10. Bruke * Segmentert * verktøyet, og klikk og dra for å velge lengden på hypocotyl og trykk på M for å måle avstand. Sammenlign hjelp av biologiske replikater ved hjelp av en enveis ANOVA med en Tukey multiple sammenligningstest. Forskjeller anses vesentlig dersom p <0,05.

3. Analyse av pH gjennom bakteriell vekst

  1. Grow og kvantifisere Komagataeibacter xylinus startkulturer i tre eksemplarer:
    1. Vaksinere en enkelt koloni av K. xylinus inn i 5 ml SH medium (pH 5) supplert med 0,2% (v / v) filter-sterilisert cellulase. Inkubere kulturene ved 30 ° C med omrøring ved 150 rpm inntil en OD 600 på 0,3 til 0,4 oppnådd (ca. 72 timer).
    2. Feiestartkulturer ved sentrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Med 5 ml steril 0,85% (w / v) NaCll løsning, vaske cellene to ganger og cellepelleten suspenderes. Hold celler på is.
    3. Kvantifisere celler ved hjelp av en Petroff-Hausser tellekammer.
  2. Vaksinere kulturer for analyse av pH:
    1. Legg 150 ml SH buljong (pH 7) supplert med 0,2% (v / v) filter-sterilisert cellulase til tolv 500 ml kolber med folielokk. Vaksinere kolber med K. xylinus startkulturer i en konsentrasjon på 10 5 celler / ml. Ved hjelp av de tre startkulturer, forberede tre biologiske replikater per behandling.
    2. Supplement kulturer med 300 ul av 5, 50 eller 500 mM CEPA-lagerløsninger for å oppnå slutt CEPA-konsentrasjoner på 0,01, 0,1, og 1,0 mM, respektivt. Supplere de ubehandlede kontrollkulturer med 300 ul av det løsningsmiddel som anvendes for å oppløse CEPA.
    3. Forsegl kolbene ved tett taping folielokk til kolbene og inkuber kulturer i 14 dager ved 30 ° C under omrøring ved 150 rpm.
  3. Hver dag, aseptically fjerne 5 ml prøver fra hver kolbe og pellets celler ved sentrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Overfør supernatanten til et rent rør og måling av pH i hver biologisk gjengivelse ved hjelp av et pH-meter.
  4. Analyser tidsforløpet data ved grafisk fremstilling av den midlere pH-verdien av de biologiske replikater.
    Merk: Det er viktig at kulturen pH ikke faller under 3,5; en kultur pH på 5 reduserer etylen utgivelse fra CEPA, og en pH under 3.5 hemmer helt etylen utgivelse.
  5. For å kontrollere for klor og fosfatnivåer, utføre en identisk eksperiment ved bruk av 0,01, 0,1, og 1,0 mM NaCl-NaH 2PO 4-løsning ved bruk av 5, 50 og 500 mM lager, henholdsvis.

4. Colony Morfologi

  1. Grow K. xylinus startkulturer i tre eksemplarer:
    1. Vaksinere en enkelt koloni av K. xylinus inn i 5 ml SH medium (pH 5) supplert med 0,2% (v / v) filter-sterilisert cellulase. Incubate kulturer ved 30 ° C med omrøring ved 150 rpm inntil en OD 600 på 0,3 til 0,4 oppnådd (ca. 72 timer).
    2. Feiestartkulturer ved sentrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Med 5 ml sterilt saltvann, vask cellene og deretter cellepelleten suspenderes. Hold celler på is.
  2. Fremstille 24-agar plater inneholdende 25 ml SH (pH 7) medium med 1,5% (w / v) agar.
  3. Når agaren er stivnet, spredt 50 pl av 5, 50 og 500 mM CEPA-stamløsninger på agar for å oppnå slutt CEPA-konsentrasjoner på 0,01, 0,1 og 1,0 mM, respektivt. Sett opp ubehandlede og løsningsmiddelkontrollplater, som består av ingen endring og spredning av 50 ul av det løsningsmiddel som anvendes for å oppløse testforbindelsene.
  4. Streak plater for isolerte kolonier med en loop-full (~ 5 mL) av K. xylinus startkultur og forsegle dem med parafin film. Inokulere alle platene i tre eksemplarer. Inkuber platene i fem dager ved 30 ° C.
  5. Photograph kolonier på 20X forstørrelse med et digitalt USB mikroskop og kvalitativt vurdere koloni morfologi og celluloseproduksjon på fast medium.
    Merk: Cellulose vises som en disig stoff langs kanten av kolonien.
  6. For å kontrollere for klor og fosfatnivåer, utføre en identisk eksperiment ved bruk av 0,01, 0,1, og 1,0 mM NaCl-NaH 2PO 4-løsning ved bruk av 5, 50 og 500 mM lager, henholdsvis.

5. pellicle Analyser

  1. Grow og kvantifisere K. xylinus startkulturer i tre eksemplarer:
    1. I tre eksemplarer, vaksinere en enkelt koloni av K. xylinus inn i 5 ml SH medium (pH 5) supplert med 0,2% (v / v) filter-sterilisert cellulase. Inkubere kulturene ved 30 ° C med omrøring ved 150 rpm inntil en OD 600 på 0,3 til 0,4 oppnådd (ca. 72 timer).
    2. Feiestartkulturer ved sentrifugering (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Med 5 ml sterilt saltvann, vaske than cellene to ganger og cellepelleten suspenderes. Hold celler på is.
    3. Kvantifisere celler ved hjelp av en Petroff-Hausser tellekammer.
  2. Forbered Master Mixes å pode 24-brønners plater:
    1. Supplement 60 ml SH-medium (pH 7) med 120 ul av 5, 50 og 500 mM CEPA-stocks å oppnå slutt CEPA-konsentrasjoner på 0,01, 0,1, og 1,0 mM, respektivt. Supplement en annen 60 ml SH-medium (pH 7) med 120 ul av løsningsmiddel som anvendes for å oppløse CEPA. Vortex å blande.
    2. Dele hver 60 ml CEPA-holdig medium i fire 14 ml porsjoner. Inokuler tre av de 14 ml porsjoner med biologiske replikater av startkulturen ved en konsentrasjon på 10 5 celler / ml. Hold rør med celler på is for å hindre celluloseproduksjonen.
      Merk: De resterende 14 ml porsjon vil bli brukt for sterile kontrollbrønnene.
  3. Vaksinere 24-brønners plater:
    1. Test hver behandling i sin egen plate med tre rader med biologiske replikat ogen rad av sterile kontroller (figur 2).

Figur 2
Fig. 2: Flyt-diagram som illustrerer den protokollen som brukes for hinne analyse og analyse Stock CEPA-supplert pH 7 SH-medium (60 ml) blir alikvotert i tre forskjellige biologiske replikate inokulasjoner og en steril kontroll (14 ml hver gang). Disse kulturene blir deretter alikvotert inn i seks tekniske replikater (2 ml) i en 24 brønn plate og deretter forseglet med parafin film. Etter inkubasjon i 7 dager ved 30 ° C, er pellicles høstet og karakterisert ved å bestemme våtvekt, tykkelse, tørrvekt, og krystallinitet av FT-IR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet

  1. Bruke 14 ml mester mix, tilsett 2 ml i EACh av seks brønner i en steril 24-brønns plate. Fullfør for de tre biologiske replikater og sterilt kontroll (figur 2). Gjenta for hver behandling.
  2. Seal plater med parafin film og inkuberes statisk i 7 dager ved 30 ° C.
  1. Harvest og Mål pellicle våtvekt, Tykkelse, tørrvekt (Cellulose Yield) og Krystalliniteten (figur 2):
    1. Trykk den ene siden av pellicle å heve den motsatte pellicle kanten og fjerne enkelt pellicles med pinsett. Samtidig beholde grep, plassere dem på fersk papirhåndkle for 3 sek for å fjerne overflødig medium før veiing for å bestemme deres våte vekter.
    2. Rett pellicles ved siden av en linjal og fotografere fra siden ved hjelp av et høyoppløselig digitalt kamera.
    3. Bruke ImageJ programvare 17, måle pellicle tykkelse på venstre skulder, høyre skulder og midten av hver hinne. Gjennomsnittlig alle tekniske replikater for hvert biologisk Repe.
    4. Individuelt overføre pellicles inn i brønnene i en 6-brønns plate. Behandle pellicles med 12 ml 0,1 N NaOH ved 80 ° C i 20 minutter for å lysere cellene.
    5. Ta ut NaOH og nøytralisere pellicles ved vasking med ultrarent vann i 24 timer under omrøring. Endre vann hver 6 time.
      Merk: Pellicles skal være hvite ved gjennomføring av vasketrinnet.
    6. Plasser pellicles på silisium matter og tørr ved 50 ° C i 48 timer til konstant vekt. Når tørr, fjern fra matter og måle pellicle vekter på en analytisk skala for å bestemme bakteriell cellulose yield.
    7. Analyser pellicle krystallinitet ved hjelp av Fourier-transform infrarød spektroskopi (FT-IR) under anvendelse av 32 skanninger og en oppløsning på 4 cm -1 i området fra 4000 til 650 cm-1. Beregn krystallinitet indeksen, CI (IR), ved hjelp av A 1437 / A 895; absorbansen forholdet mellom "krystallinsk band" og "amorf band" som tidligere beskrevet 18.
    8. For å kontrollere for klor og fosfatnivåer, utføre en identisk eksperiment ved bruk av 0,01, 0,1, og 1,0 mM NaCl-NaH 2PO 4-løsning ved bruk av 5, 50 og 500 mM lager, henholdsvis.
    9. Analyser pellicle Data:
      1. Beregn pellicle hydrering ved å bestemme differansen mellom pellicle våtvekt og tørrvekt.
      2. Gjennomsnittlig verdiene av alle tekniske replikater for å oppnå en enkelt verdi for hvert biologisk replikat for statistisk analyse. Sammenligne behandlinger med en enveis ANOVA med Tukey multippel sammenligningstest. Forskjellene er store hvis p <0,05.
      3. Normal data som prosent av ubehandlede kontroller og plotte hjelp av biologiske replikater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk plate oppsett for verifisering av etylen frigjøring fra CEPA i SH-medium (pH 7) ved trippel responsen analysen er vist i figur 1A - C. Et flytskjema som illustrerer pellicle protokollen er vist i figur 2. mørke-dyrket A. thaliana planter oppviser trippel respons fenotype (kortere og tykkere hypocotyl med en overdrevet apikale krok) i nærvær av ACC, og i nærvær av etylen produsert ved dekomponering av CEPA på SH-medium (pH 7), men ikke i henhold til ubehandlede betingelser (Figur 3A) 9. Den hypocotyl lengde ACC- og CEPA-avledet etylen behandlet A. thaliana frø var signifikant (p <0,0001) kortere enn ubehandlede kontroller (figur 3B) 9, som bekrefter at etylen ble frigitt fra CEPA på SH-medium (pH 7) ved en fysiologisk relevant konsensjon. PH-verdien for ubehandlede og behandlede CEPA-K. xylinus kulturer holdt seg over fem (figur 4) 9; derfor CEPA nedbrytning til etylen ikke ble svekket på grunn av bakteriell organisk syre produksjon. CEPA-avledet etylen økt bakteriell cellulose produksjon når K. xylinus ble dyrket på fast SH medium (pH 7) (Figur 5) 9. Alle konsentrasjoner av CEPA-avledede etylen betydelig redusert hinne våtvekt (figur 6A), påvirket ikke hinne tykkelse (figur 6B), og en signifikant økning hinne tørrvekt (cellulose utbytte; figur 6C) 9. Et representativt bilde tatt for hinne tykkelsesmåling er vist i figur 7. Hinne hydratisering ble redusert ved alle konsentrasjoner av CEPA-avledet etylen (figur 8A) 9, mens alle konsentrasjoner av CEPA-avledede etylen 9 økes pellicle krystallinitet (figur 8B). Virkningene av NaCl og NaH 2PO 4 var ubetydelig i alle tilfeller (data ikke vist) bekreftet at de observerte fenotyper var forårsaket av CEPA-avledet etylen.

Figur 3
Figur 3: CEPA dekomponerer på SH medium (pH 7) til å produsere etylen Digital USB mikroskop fotografier viser at mørke voksen A.. thaliana planter viser trippel respons fenotypen (hypocotyl kortere, tykkere hypocotyl og overdrevet apikale krok) når den dyrkes i nærvær av ACC og CEPA-avledet etylen sammenlignet med den ubehandlede kontroll (A). Den hypocotyl Lengden av frøplanter dyrket i nærvær av ACC og CEPA-avledede etylen var significantly kortere enn den ubehandlede kontroll (B). Scale bar = 1 mm. Feilsøylene viser SD (n = 3). Barer med forskjellige bokstaver er signifikant forskjellige (p <0,0001). Dette tallet har blitt forandret fra Augimeri og stropp 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: pH-verdi på K. xylinus kulturer forblir høy nok for CEPA dekomponering i SH-medium (pH 7). Kulturen pH forblir over 5, slik at for effektiv dekomponering av CEPA til etylen i løpet av bakterievekstsyklusen. PH-verdien av K. xylinus kulturer må overvåkes fordi de skiller ut og resorb organiske syrer. Legenden viser CEPA konsentrasjonene som ble testet. Merk at y-aksen begynnerved pH 5. Feilsøylene viser SD (n = 3). Dette tallet har blitt forandret fra Augimeri og stropp 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: CEPA-avledet etylen øker cellulose produksjon av K. xylinus på et fast medium. K. xylinus ble dyrket på SH agarplater (pH 7) som var ubehandlet (A) eller forbehandlet med surgjort (pH 2.5) ultrarent vann (B), fosfat og klorid (C - E) eller CEPA (F - H ). Representative kolonier vises. Pilen viser cellulose produsert av K. xylinus, sett på som disig stoff rundt kolonien. Scale bar = 0,5 mm. Dette tallet haer blitt endret fra Augimeri og stropp 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: CEPA-avledet etylen reduserer vannholdekapasitet og øker utbyttet av K. xylinus cellulose pellicles. Kulturer ble dyrket i statisk SH buljong (pH 7) supplert med CEPA i 24-brønners plater, og inkubert ved 30 ° C i 7 dager før pellicles ble høstet og analysert. CEPA-avledet etylen redusert hinne våtvekt (A), hadde ingen effekt på hinne tykkelse (B) og øket hinne tørrvekt (C). De forskjellige CEPA-behandlingene var ikke signifikant forskjellige fra hverandre. Feilsøylene viser SD (n = 3). barer medforskjellige bokstaver er signifikant forskjellige (p <0,05). Dette tallet har blitt forandret fra Augimeri og stropp 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7
Figur 7: Representative fotografi av K. xylinus pellicles. Pellicle tykkelse ble målt fra fotografier ved hjelp ImageJ programvare. Scale bar = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8: CEPA-avledet etylen redusert hydratisering avK. xylinus cellulose pellicles ved å øke hinne krystallinitet. Kulturer ble dyrket i statisk SH buljong (pH 7) i 24-brønners plater, og inkubert ved 30 ° C i 7 dager før pellicles ble høstet og analysert. Pellicle hydrering ble beregnet som differansen mellom pellicle våt og tørrvekt. CEPA-avledet etylen redusert hinne hydrering (A) ved å øke hinne krystallinitet (B). De forskjellige CEPA-behandlingene var ikke signifikant forskjellige fra hverandre. Feilsøylene viser SD (n = 3). Barer med forskjellige bokstaver er signifikant forskjellige (p <0,05). Dette tallet har blitt forandret fra Augimeri og stropp 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som beskrives her skissere in situ fremstilling av etylen fra CEPA for studier av bakteriell etylen respons ved bruk av modellorganisme, K. xylinus. Denne metoden er meget anvendelig som etylen, kan fremstilles ved å supplere hvilket som helst vandig medium som har en pH større enn 3,5 10,11 med CEPA oppheve behovet for ren etylengass eller spesialisert laboratorieutstyr. Denne metoden er ikke begrenset til å studere effekten av CEPA-avledede etylen på bakterier, men kan også tilpasses for å studere etylenresponsen i eukaryote organismer. Det er viktig at det parallelt kontrollforsøk utføres med fosfat og klorid som disse forbindelsene er også fremstilles fra CEPA nedbrytning in situ. En annen nødvendig kontroll er å finne ut om CEPA selv utøver en direkte effekt på de mikrobielle kulturer under etterforskning. Fysiologisk irrelevante etylen konsentrasjoner ble produsert når K. xylinus kulturer vire dyrket i en pH 5 SH medium og således tjene som en kontroll for CEPA-effekter 9; Men denne tilnærmingen fungerer bare for syretolerant organismer.

Bruken av CEPA-avledede etylen for biologiske studier i et vandig vekstmedium krever bekreftelse på at etylen er faktisk blir produsert i systemet. Den metode som er beskrevet her utnytter A. thaliana trippel respons analyse som utnytter den trippel respons fenotype utstilt ved mørke-vokst frøplanter i nærvær av etylen en. Petriskålene delt inn i fire kvadranter tillate spirene å bli dyrket i MS-medium separat, men ved siden av den relevante mikrobiologisk vekst-medium. Anvendelse av CEPA løsningen på den mikrobielle vekstmediet letter etylenproduksjon og eksponerer de tilstøtende spirene til en eksogen kilde av etylen som den infiltrerer topprommet. Supplering MS medium med ACC gir en positiv kontroll som det forbedrer den endogene produktetion av etylen ved A. thaliana og påfølgende induksjon av trippel respons fenotype.

Kultur pH er en annen viktig faktor når du produserer etylen fra CEPA i mikrobiell vekst medium 13,14. SH-medium som vanligvis brukes til kulturen K. xylinus har en pH på ca. 5 som i vesentlig grad reduserer produksjonen av CEPA-avledet etylen (Augimeri og rem, upubliserte data); Derfor, ble mediet justert til pH 7 9. Dette er konsistent med andre studier som viste at frekvensen av CEPA sammenbrudd er ytterst langsom ved eller under pH 5, mens det er betydelig forbedret ved pH 7 13. Det er derfor viktig å sikre at vekstmediet av testorganismen forblir over pH-verdi 5. K. xylinus kulturene nådde et minimum pH-verdi på omtrent 5,5, slik at for utviklingen av etylen ni. Det er viktig å merke seg at den absolutte konsentrasjon av etylen ikke kan kontrolleres i henhold til disse kultur conditions.

Effekten av CEPA-avledede etylen på veksten, cellulose, og hinne egenskaper av K. xylinus ble brukt for å illustrere det bakterielle etylen-responser kan bli undersøkt ved å bruke CEPA. Tilpasning disse metodene for å studere etylen respons i andre organismer er så enkelt som å endre vekstmediet og fenotype analyser. Bruken av CEPA gir forskere med en praktisk erstatning for etylengass og kan oppmuntre flere etylen-mediert studier i bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) Sigma A3903 Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish Phoenix Biomedical CA73370-022 For testing triple response
Agar BioShop AGR001.1 To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera Canon 3818B004 For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921  Sigma C2730 Aqueous solution
Citric acid BioShop CIT002.500 For SH medium
Commercial bleach Life Brand 57800861874 Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl BioShop HCL666.500 Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope Plugable N/A For pictures of colonies
Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) Sigma C0143 Ethylene-releasing compound
Glucose BioBasic GB0219 For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 ATCC 53582 Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube LifeGene LMCT1.7B 1.7 ml microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium  Sigma M5519 Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O  BioShop SPD579.500 Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl BioBasic SOD001.1 Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O  BioShop SPM306.500 Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH BioShop SHY700.500 Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film Parafilm PM996 For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological) BioShop PEP403.1 For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific 3900 Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm VWR 28145-501 For sterilizing cellulase
Sucrose BioShop SUC600.1 Sucrose for MS medium
Yeast extract BioBasic G0961 For SH medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
  2. Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
  3. Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
  4. Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
  5. Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
  6. Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
  7. Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
  8. Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
  9. Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
  10. Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
  11. Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
  12. Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
  13. Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
  14. Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).

Tags

Biokjemi 2-chloroethylphosphonic syre CEPA etylen, Bakteriell cellulose pellicle trippel respons analyse
Utnytte Etylen-frigjørende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som et verktøy for å studere Etylen Response i Bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Augimeri, R. V., Varley, A. J.,… More

Augimeri, R. V., Varley, A. J., Strap, J. L. Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria. J. Vis. Exp. (117), e54682, doi:10.3791/54682 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter