Summary
Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l'ensemble de protéasome recombinant.
Abstract
Protéasomes se trouvent dans tous les domaines de la vie. Ils fournissent la principale voie de dégradation intracellulaire des protéines chez les eucaryotes, bien que leur montage ne soit pas complètement compris. Tous les protéasomes contiennent une particule de noyau structurellement conservée (CP), ou le protéasome 20S, contenant deux sous-unités ß des anneaux de heptamériques pris en sandwich entre deux anneaux de sous-unités α heptamériques. Archaea 20S protéasomes ont une composition plus simple par rapport à leurs homologues eucaryotes, mais ils partagent tous deux un mécanisme d'assemblage commun. Par conséquent, 20S archées proteasomes continuent à être des modèles importants pour l'assemblage du protéasome eucaryote. Plus précisément, l'expression recombinante de 20S archées proteasomes couplée à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (PAGE) a donné de nombreuses informations sur protéasome biogenèse. Ici, nous discutons un moyen d'améliorer la stratégie habituelle de coexpression des archées protéasome α et sous-unités ß avant nondenaturing PAGE. Nous démontrons que, bien que rapide et efficace, une approche de coexpression seul peut manquer des intermédiaires d'assemblage clés. Dans le cas du protéasome, coexpression peut ne pas permettre la détection de la demi-protéasome, un contenant un α-anneau complet intermédiaire et un β-anneau complet. Cependant, cet intermédiaire est facilement détectée par lysat mélange. Nous suggérons que la combinaison coexpression avec lysat mélange donne une approche plus approfondie dans l'analyse de l'assemblage, mais il reste encore du travail non intensif. Cette approche peut être utile pour l'étude d'autres complexes multiprotéiques recombinantes.
Introduction
Complexes multiprotéiques effectuent de nombreuses activités cellulaires critiques 1. Pour beaucoup de ces complexes, beaucoup plus on connaît leur structure et leur fonction que de leur assemblage 2,3. Le protéasome est un tel complexe et se retrouve dans tous les domaines de la vie. Chez les eucaryotes, cette machine moléculaire est au cœur du système protéasome / Ubiquitin (UPS) et fournit la principale voie de dégradation des protéines intracellulaires 4. Le protéasome eucaryote (dénommé protéasome 26S) est composé de deux ensembles principaux sous: un protéasome 20S, ou Core particules (CP) 5, qui peut être coiffé sur une ou deux extrémités par une particule réglementaire 19S (RP) 6.
Le protéasome 20S est une grande protéase compartimentée. Sa structure quaternaire est complètement conservée dans tous les domaines de la vie et se compose d'un empilement de quatre cycles à sept chaînons contenant au moins deux types de sous-unités de structure apparentée, α; et ß 5,7,8. Chez les eucaryotes, les deux bagues extérieures sont chacune composées de sept sous-unités a différentes et les deux bagues intérieures sont constitués chacun de sept sous-unités ß distinctes; une activité protéolytique réside dans trois des sous-unités ß. En revanche, les anneaux de CP de archéobactéries et des bactéries sont habituellement constituées d'un seul type de α et une sous-unité β type. Proteasomes Archaea ont fourni un important système modèle pour étudier l' assemblage du protéasome due à la fois à leur simplicité de composition et de leur partager un mécanisme d'assemblage commun avec leurs homologues eucaryotes 9-13. En bref, les sous-unités alpha assemblent en anneaux d'a d'abord, qui servent comme un échafaudage sur lequel ß sous-unités se rassemblent. Les demi-protéasomes résultant (α 7 β 7) dimériser, donnant lieu à des entièrement assemblés CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Au cours de la dimérisation, les propeptides présents sur les sous-unités ßsont enlevées par voie autocatalytique, ce qui expose les thréonines catalytique N-terminal. L'utilisation des protéasomes archéobactéries pour modéliser l' assemblage prend souvent l' avantage de la production de protéines recombinantes dans protéasome archéobactéries Escherichia coli. Cette approche est utile, car elle permet aux sous-unités à produire dans diverses combinaisons, à la fois comme WT et versions mutantes, dans un organisme hôte qui ne produit pas ses propres protéasomes.
Contrôle de l'assemblage des complexes multi-protéiques nécessite biochimiquement une sorte de méthode de fractionnement qui sépare les complexes entièrement assemblés à partir des intermédiaires d'assemblage et de précurseurs. En raison de sa capacité de résoudre supérieure, non dénaturant sur gel de polyacrylamide L' électrophorèse (PAGE) est avéré être particulièrement utile pour le fractionnement de divers grands complexes multiprotéiques 14-17. La combinaison de la production de protéasome Archaea recombinant et PAGE dénaturant est devenue une approche puissante en dissecting assemblage de protéasome 9,11,12,18. Cependant, la méthode habituelle par laquelle cette approche est appliquée ( par exemple. Par la co - expression recombinante de sous - unités a et ß) présente un inconvénient important. Les réactions de l' Assemblée sont coopératifs et fortement dépendante de la concentration 3. Étant donné que la concentration de la protéine dans les cellules est très élevée 19, en raison des effets de volume exclu, les réactions d'assemblage se déroulent rapidement in vivo. Il est donc possible de manquer des intermédiaires d'assemblage importants lorsque a et ß sous-unités sont coexprimaient.
Ici, nous plaidons pour une approche combinée à l'étude de l'ensemble de protéasome en utilisant des sous-unités du protéasome archées recombinantes. Dans cette approche, les deux méthodes de mélange coexpression et lysat sont utilisés. La première permet une analyse rapide de l'ensemble parce coexpression est moins de travail. Celle-ci dépend de l'expression séparée des sous-unités a et ß, suivi par le mélange. Bien que ce requires un peu plus d'effort que coexpression, il est plus que compensée par la capacité à détecter les intermédiaires qui sont manqués pendant coexpression. Ensemble, ces deux méthodes peuvent fournir une image plus complète de l'ensemble de protéasome.
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Protocol
1. Expression bactérienne.
Nota: Les plasmides d'expression utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 1. Solutions, les médias et les tampons utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 2. Le clonage des gènes de sous - unités du protéasome archées et la génération de plasmides d'expression sont décrits ailleurs 18,20. En bref, des plasmides pour coexpression recombinant de sous - unités emploient une stratégie de opéron bicistronique qui aide à obtenir des niveaux d'expression comparables de sous - unités individuelles 18,20. Les paramètres d'expression énumérés ci-dessous ont été déterminées de façon empirique comme étant optimale pour les sous-unités du protéasome dans cette étude. Il peut être nécessaire pour optimiser l'expression d'autres mutants protéasome, pour proteasomes d'autres espèces d'archées, ou pour d'autres complexes de protéines recombinantes (voir Discussion).
- Transformer le plasmide d' expression d'intérêt dans chimiquement compétente E.coli BL21 (DE3).
- Ajouter 1 - 2 pi de plasmide (généralement 50 - 100 ng) à une aliquote de cellules DE3 qui ont été fraîchement décongelé sur de la glace, et de continuer à incuber sur de la glace pendant 20 min.
- Le choc thermique des cellules à 42 ° C pendant 45 s et le tube de retour à la glace pour additionl 2 min.
- Ajouter 1 ml de milieu LB et on incube à 37 ° C sous agitation (150 tpm) pendant 1 h.
- Étaler 1-200 ul du mélange de transformation sur du milieu LB-kan plaques (plaques contenant du milieu LB solide, additionné de kanamycine (tous les plasmides utilisés dans cette résistance de codage d'étude à cet antibiotique)). Incuber les plaques à 37 ° C O / N.
- Le lendemain, inoculer une seule colonie de la plaque de LB-kan dans 3 ml de liquide milieu LB-kan dans un tube de culture en verre. Incuber à 37 ° C sous agitation (150 rpm) pendant environ 2,5 à 3 h, ou jusqu'à ce que la turbidité est observée.
- Mesurer la densité optique de la culture à 600 nm (DO 600) dans un spectrophotomètre. Diluer le culte cellulaireure avec une quantité appropriée de milieu LB préchauffée-KAN à une DO 600 de 0,4 dans un volume final de 6 ml. Reprendre agitation à 37 ° C pendant 40 min.
- Induire l'expression des protéines dans les cultures liquides en ajoutant IPTG à partir d'une solution mère à une concentration finale de 1 mM. Incuber à 37 ° C sous agitation (150 rpm) pendant environ 6-7 h.
- Récolte des cultures de cellules bactériennes dans leur intégralité dans 1,5 ml microtubes.
- Ajouter 1,5 ml d'une culture dans le tube à centrifuger. Centrifugeuse à 10.000 x g pendant 1 min.
- Jeter le surnageant et on ajoute encore 1,5 ml de la même culture de la pastille. Centrifugeuse à 10.000 x g pendant 1 min.
- Répétez l'étape 1.11 jusqu'à ce que toute la culture est récolté dans le tube à centrifuger.
- Stocker les pastilles induites à -80 ° C jusqu'à ce que la lyse.
2. Lyse bactérienne et Lysat de mélange.
Remarque:
- La lyse des cellules bactériennes et de préparation de fractions solubles.
- Décongeler le culot cellulaire induite par de la glace pendant 5 min. Remettre en suspension le culot dans 600 pl de tampon de lyse.
- IncUbate la suspension à 30 ° C sous agitation (150 rpm) pendant 30 min pour générer lysat brut au total.
Remarque: L'étape suivante et le paragraphe qui suit sont facultatifs. - Retirer les deux 25 aliquotes ul du lysat brut totale dans 1,5 ml microtubes séparés et effectuer une analyse de TSP comme suit.
- L'une des deux aliquotes de 25 ul, ajouter du tampon d'échantillon SDS 5X à une concentration finale de 1X. Etiqueter le tube avec "T" pour "lysat brut total».
- Incuber l'échantillon "T" à 100 ° C pendant 5 min pour dénaturer complètement les protéines.
- Pendant ce temps, prendre la deuxième partie aliquote de 25 pi et centrifuger à 10000 × g pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant sans perturber le petit culot, et le transférer dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 ml. Nommez ce nouveau tube "S" pour "fraction soluble".
- Pour les behi minuscules granulés gauchee à l'étape précédente, ajouter 25 ul de tampon de lyse et le vortex pour remettre en suspension. Nommez ce tube "P" pour "fraction de culot".
- Ajouter 6 tampon d'échantillon pl de 5X SDS aux tubes et "S" "P" et incuber à 100 ° C comme décrit ci-dessus.
Remarque: Si les échantillons TSP ne seront pas utilisés ce jour - là pour analyser l' expression, ils peuvent être congelés à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Une fois décongelé, elles doivent être remises à incuber à 100 ° C, comme décrit ci-dessus, immédiatement avant le chargement sur un gel SDS-PAGE standard de 12% et / ou 15%.
- Bien que l'analyse de TSP est effectuée, centrifugeuse 550 pi restante de lysat brut totale (ou la totalité de 600 pi de lysat brut total si l' analyse TSP est pas effectuée) à 10.000 x g pendant 10 min. Recueillir le surnageant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ceci est le lysat soluble qui sera utilisé pour la purification.
- Lysat mélange.
- Effectuer la lyse comme décrit dans les étapes 2.1.1 et 2.1.2 ci-dessus.
- Mélanger 600 pi de lysat brut total provenant de bactéries exprimant la sous-unité α désiré avec 600 pi de lysat brut total provenant de bactéries exprimant la sous-unité β souhaitée. Incuber à 37 ° C avec une lente agitation pendant 30 min.
Remarque: Il peut être nécessaire d'optimiser le temps d'incubation pour obtenir l' assemblage maximum pendant lysat de mélange (voir Discussion). Le temps et la température présentée ici sont optimales pour les protéines recombinantes dans cette étude et ont été déterminées ailleurs 18. - Centrifuger le lysat mélangé à 10 000 xg pendant 10 min pour séparer les matières solubles du culot insoluble. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Utilisez ce lysat soluble mixte pour la purification des protéines.
3. Purification de la protéine par affinité Immobilisé cobalt Résine(I VOITURE).
- Equilibrer la résine.
- Remettre en suspension soigneusement la résine en retournant la bouteille et le transfert de 50 ul de la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 700 x g pendant 2 min à la résine de granules. Aspirer soigneusement surnageant.
Note: Nous réalisons l' aspiration de la pipette en utilisant une pointe de 1 ml de pipette bleu pour éliminer la majeure partie du liquide. Une pointe de 2 pi blanc est utilisé pour un contrôle fin de l'enlèvement du surnageant restant, laissant une très mince couche de liquide recouvrant les perles. - Ajouter 1 ml de tampon A. Mélanger doucement pour remettre en suspension la résine et centrifuger à 700 x g pendant 2 min pour sédimenter la résine. Aspirer délicatement le surnageant et répéter cette étape de lavage une fois de plus.
- Remettre en suspension soigneusement la résine en retournant la bouteille et le transfert de 50 ul de la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 700 x g pendant 2 min à la résine de granules. Aspirer soigneusement surnageant.
- Appliquer lysat soluble obtenue précédemment dans la section 2.1 ou 2.2 à la résine équilibrée. Incuber le tube avec une légère rotation à 4 ° C pendant 60 min. Centrifuger le tube à 700 × g </ Em> pendant 5 min et soigneusement Aspirer le surnageant.
- Laver la résine comme suit pour éliminer les protéines non spécifiquement liées.
- résine Resuspendre avec 1 ml de tampon A et incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 10 min. Centrifuger le tube à 700 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant. Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
- résine Resuspendre avec 1 ml de tampon B (tampon A avec mM imidazole 5) et incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 5 min. Centrifuger le tube à 700 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant. Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
- résine Resuspendre avec 1 ml de tampon C (tampon A avec 10 mM d'imidazole) et incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 5 min. Centrifuger le tube à 700 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant.
- Éluer la protéine par addition de 400 ul de tampon E (tampon A avec 200 mM d'imidazole) to la résine. Incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 5 min. Centrifuger à 700 g pendant 5 min.
- Transférer le surnageant contenant la protéine purifiée dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 ml.
- Dessaler la protéine purifiée par centrifugation série comme suit.
- 400 ul de protéine purifiée, ajouter 100 pi de tampon A (ce qui réduit la concentration de 200 mM d'imidazole à 160 mM). Appliquer la protéine purifiée à 0,5 ml filtres ultracentrifugation avec 10 kDa de poids moléculaire de coupure. Centrifugeuse à 14000 × g pendant 5 min.
- Jeter le filtrat et ajouter 400 ul de tampon A à diluer le rétentat et centrifuger à nouveau. Continuer les cycles de centrifugation / dilution jusqu'à ce que la concentration en imidazole tombe en dessous de 4 mM. A titre d'exemple, si chaque centrifugation, 500 ul concentre jusqu'à ~ 70 pl (soit environ 7 fois), puis deux cycles permettra de réduire la concentration de 160 mM d'imidazole de départ (7 x 7 = 49 fois) à APPRoximately 3,3 mM.
- Mesurer la concentration en protéines de l'échantillon dessalé en utilisant le dosage BCA 21.
Remarque: Le dessalage est nécessaire pour réduire les niveaux Imidazole dessous de la limite de tolérance pour le dosage BCA, comme décrit dans les instructions du fabricant. Notre laboratoire préfère le dosage BCA, car il est sensible, a une grande gamme dynamique, et présente beaucoup moins de variation de protéine à la protéine. Cependant, d'autres méthodes pour déterminer la concentration en protéine peut être remplacé par le test de BCA. La clé est d'être conscient des avantages et des limites de chaque méthode.
- Ajouter un tampon d'échantillon natif 5X à une concentration finale de 1X et procéder à une électrophorèse. Vous pouvez également conserver les échantillons à -20 ° C pour une analyse ultérieure.
4. dénaturant gel de polyacrylamide électrophorèse (PAGE).
Attention: acrylamide non polymérisé est une neurotoxine. Porter gea de protection appropriér.
- Préparer le gel dénaturant PAGE de la manière suivante.
- Préparer la cassette de gel pour la coulée en utilisant des plaques de verre propres et de coulée stand. Placez le fabricant gradient au-dessus d'un petit agitateur magnétique et placer une barre d'agitation minuscule dans chaque chambre.
- En utilisant 40% (p / v) d'acrylamide et de 2% (p / v) de solutions mères bisacrylamide, de préparer 5% et 10% (p / v) de solutions de gel d'acrylamide dans un tampon la résolution native. Veiller à ce que le rapport de l'acrylamide à bisacrylamide totale est de 37,5: 1. Frissons sur la glace avant la coulée.
Remarque: Le système dénaturant PAGE utilisé ici est essentiellement identique au système SDS-PAGE Laemmli, avec SDS omis 22. - Ajouter Ammonium Persulfate (de 10% (p v) solution / mère préparée dans de l'eau) pour les solutions d'acrylamide pour amorcer la polymérisation. La concentration finale de persulfate d'ammonium est de 0,1% (p / v).
- Verser la solution d'acrylamide dans les deux chambres de la machine à gradient. Avec le b tubulure de sortie inséréntre les plaques de la cassette de gel, d'activer l'agitateur magnétique et d'ouvrir les vannes à gradient de fabricant. Verser le 5 - gel à gradient dénaturant de 10%.
- Une fois coulé, recouvrir le gel avec une couche mince d'alcool isopropylique et laisser le gel se polymériser pendant 30 minutes. Pendant ce temps, préparer la solution de gel d'acrylamide à 5% frais dans un tampon natif résoudre. Après les jeux de gel, verser Isopropanol et rincer la partie supérieure du gel avec de l'eau déminéralisée à partir d'une bouteille d'injection.
- A la solution de gel 5% préparée ci-dessus, ajouter Persulfate d'ammonium (exactement comme décrit dans 4.1.3) et verser sur le dessus du gel polymérisé jusqu'à ce que les plaques de verre sont pleines. Insérez un peigne de gel. Laisser le gel de superposition polymériser pendant 30 minutes supplémentaires.
- Une fois que le gel est polymérisé, assembler la cassette de gel dans l'appareil d'électrophorèse. Vous pouvez également stocker le gel à 4 ºC, enveloppé dans des serviettes en papier humides et une pellicule de plastique jusqu'à utilisation.
- Une fois que le gel de PAGE non dénaturant est assemblé dans elecappareil de phorèse, remplir le réservoir avec un tampon de fonctionnement natif 1X fraîchement préparés à partir d'un tampon 10X de fonctionnement natif stock.
- Charge 10 pg de protéine purifiée, obtenue à la fin de l'article 3, dans chaque puits à l'aide d'une seringue en verre.
- Charge 2 ul d'étalon de poids moléculaire élevé native de la protéine (dilué dans du tampon de fonctionnement natif 1X) dans l'un des puits.
- Exécutez gel à 55 V et 4 ºC jusqu'à ce que le front de colorant coule le gel (environ 4 à 4,5 h).
- En plus du gel non dénaturant, l' analyse des aliquotes de la protéine purifiée par SDS-PAGE 22 norme.
- Mélanger aliquotes (10 ug) des échantillons de protéines purifiées, obtenues à la fin de l'article 3, avec un tampon 5X SDS-échantillon à une concentration finale de 1X.
- Incuber à 100 ° C pendant 5 min et charger sur la norme de 12% et / ou 15% des gels SDS-PAGE 22.
- Exécutez à 80V pendant 20 min, puis à 120 V jusqu'à ce que le front de colorant coule le gel (ce qui est d'environ un additional 75 min pour un gel à 12% et 120 min pour un gel à 15%).
Activité 5. Visualisation et coloration des protéines.
- Après électrophorèse, les plaques de verre soigneusement séparé et transférer le gel non dénaturant à une plaque de gel contenant 50 ml d'eau déminéralisée. Rincer gel avec doux balancement pendant 5 min. Jeter l'eau et répétez cette étape de lavage à trois reprises.
- Effectuer test de recouvrement de substrat comme suit.
- Ajouter 1 ml de tampon de développement contenant le substrat peptidique fluorogène Suc-LLVY-AMC et étaler uniformément sur le gel. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque: une tige de verre ou d' un agent libérant de gel (petit coin de plastique utilisé pour les plaques de verre séparées) peuvent être utilisées pour répartir le liquide sur le gel. - transférer soigneusement le gel sur le transilluminateur UV du système d'imagerie de gel et d'observer la fluorescence due au substrat peptidique clivé. image Record. Soigneusement transférer les ba de gelck sur le plateau de gel.
- Rincer le gel deux fois avec 50 ml d'eau déminéralisée pendant 5 min avec doux balancement.
- Colorer le gel avec 10 ml d'un réactif de Coomassie tache colloïdale pendant 60 min avec doux balancement. gel de Destain avec 50 ml d'eau jusqu'à ce fond devient clair. Cette étape de coloration applique aux gels SDS-PAGE standard ainsi.
- Ajouter 1 ml de tampon de développement contenant le substrat peptidique fluorogène Suc-LLVY-AMC et étaler uniformément sur le gel. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
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Representative Results
Protéasome assemblage (Figure 1) commence lorsque les sous - unités alpha se combinent pour former des anneaux 9. Ceci peut être illustré lorsque a sous - unités de l'archée Methanococcus maripaludis S2 sont exprimés dans E. coli C-terminale hexahistidine marqué (son-tagged) dérivés (tableau 1). Lorsque le recombinant α-sa protéine a été purifiée par ICAR et analysé par PAGE non dénaturant, deux bandes ont été observées (Figure 2A, piste 1). Nous avons déjà démontré que ceux - ci correspondent à anneaux simples d'a (SR) et doubles a-Rings (DR) 18. Le DR est une espèce impasse qui ne sont pas productifs pour l' assemblage ultérieur 9,18.
Quand a-ses sous-unités ont été co-exprimés avec des sous-unités ß, ce qui représente la méthode habituelle par laquelle le montage du protéasomes archées recombinantes est dosée, on a observé une espèce nouvelle migration près du stand 670 de taille kDaard (Figure 2A, piste 3). Cette espèce était une activité protéolytique (Figure 2B, piste 3) et contenait des sous - unités ß seulement complètement matures (mβ) dont les propeptides ont été enlevés (figure 2C, piste 3). Cette espèce est le CP en pleine maturité. Cet échantillon contenait également certaines espèces SR, qui était attendu parce que SR est un assemblage intermédiaire connu, mais aucune espèce de DR. L'absence de DR quand a-son et des sous - unités ß sont co - exprimées suggère que l' assemblage correct se produisait assez rapidement de telle sorte que l' incorporation de sous - unités ß a pu supplanter la formation improductive de DR (pour une analyse plus détaillée , voir 18).
Pour démontrer la limitation de la méthode de coexpression, et plaider en faveur de l'utilité d'une approche combinée, α-son et des sous - unités ß ont été exprimées séparément dans E. coli. Après la lyse, les fractions solubles ont été mélangés et les protéines ont été purifiées par ICAR avantAnalyse par PAGE non dénaturante. Entièrement proteasomes fonctionnels ont également été générés via le lysat de mélange approche (figure 2A et 2B, piste 2), et a également été observé les espèces SR comme prévu. La réapparition de l'espèce de DR dans le lysat mélange échantillon indique que, une fois formé, des sous-unités ß sont incapables de se désassembler de manière réversible elle; cela souligne la nature morte fin de la DR. Fait intéressant, une nouvelle espèce est également apparu dans le lysat de mélange échantillon, migration juste en dessous du CP (appelé «moitié»). Récemment, nous avons montré que cette espèce correspond à la demi-protéasome (a β 7 7) 18. Pour illustrer cela ici, un mutant de la sous-unité β (R166W) a été utilisé. Cette mutation perturbe β-β anneau interaction, conduisant à une altération de la demi-protéasomes dimérisation 18. Depuis demi-protéasomes sont les précurseurs immédiats de CP, la mutation R166W devrait conduire à la fois l'accumulation de demi-protéasomes uneda diminution de la formation de CP. Lorsque lysat mélange avec a-ses et ß (R166W) sous - unités a été réalisée, des niveaux inférieurs de CP et l' augmentation des niveaux des "demi" espèces ont été observées (Figure 2A, piste 4). Cela est compatible avec une relation précurseur-produit pour ces deux bandes, et confirme l'identité de l'espèce «moitié» que la demi-protéasome. La migration légèrement plus rapide de la demi-protéasome dans l'échantillon mutant (piste 4 par rapport à la piste 2) est probablement due à la mutation R166W modifiant le rapport de masse à charge de la sous-unité β.
La possibilité de visualiser la demi-protéasome pendant le mélange lysat est due principalement à des concentrations de protéines beaucoup plus faibles dans le lysat par rapport aux fortes concentrations de protéines dans les cellules. Des concentrations plus faibles se traduisent par moins efficace (c. -à- lent) l' assemblage, ce qui permet des intermédiaires pour devenir plus peuplée et donc détectable. En plus de l'apparition de la demi-protéasome, une observation supplémentaire met en évidence l'efficacité de l'ensemble diminué au cours de lysat mélange: sous-unités ß non transformés, qui conservent leurs propeptides, deviennent détectables (proβ). Puisque le traitement de propeptide ne se produit pas jusqu'à ce que proteasomes demi dimériser, l'apparition de la forme proβ immature est en corrélation avec le niveau d'accumulation demi-protéasome (comparer la figure 2C, piste 3 par rapport à la piste 2 par rapport à la piste 4). Dans le cas du mutant R166W, l'échec de traitement de propeptide pendant lysat mélange est absolue, même si une petite quantité de CP se forme. En effet , le traitement de propeptide nécessite non seulement une demi-dimérisation protéasome, mais aussi une β-β interface d'anneau convenablement formé 23 lequel la mutation ne donne pas R166W. Un récit plus détaillé de coexpression contre lysat mélange, en ce qui concerne l'assemblage du protéasome recombinant, peut être trouvée ici 18.
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Figure 1: un schéma simplifié de base de particules (CP) de l' Assemblée.
Les sous-unités alpha peut assembler en une seule α-premier anneau (SR), qui sert de matrice pour l'incorporation de sous-unités ß. Cela conduit à la génération de la demi-protéasome intermédiaire (demi) qui se dimérise rapidement. Parallèlement à la dimérisation, les pro-peptides de sous-unité β (non représentés) sont enlevées par voie autocatalytique donnant lieu à la particule de noyau entièrement fonctionnel (CP). Double a-anneaux (DR) peuvent provenir de SR et ne sont pas compétents pour l'assemblage en CP. Leur formation représente une voie d'assemblage improductive (flèche en pointillés), contrairement à des événements d'assemblage productifs (flèches pleines). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: une approche combinée pour le dosage de l' Assemblée protéasome.
Coexpression (C) et le lysat de mélange (L) ont été utilisées pour étudier l' assemblage de protéasomes recombinantes de la archée M. maripaludis. Les protéines ont été purifiées par Immobilisé Cobalt Affinity Resin (ICAR). (A, B) des protéines purifiées (10 ug) ont été chargés sur dénaturantes non de 5 à 10% de gels de gradient. Après électrophorèse, l' activité peptidase a été visualisée en superposant le gel avec une solution tampon contenant un substrat peptidique fluorogène Suc-LLVY-AMC (B) avant la coloration du gel avec un réactif de Coomassie colloïdal de coloration (A). Noir flèches indiquent les positions de la particule de noyau 20S assemblées (CP), demi-protéasome intermédiaire (la moitié), double α-ring (DR) et α-anneau unique (SR). La migration de plusieurs normes de taille moléculaire (en kDa) est indiquée à droite. (C) un ont également été chargés sur 15% de gels de SDS-PAGE. Après électrophorèse, les gels ont été colorés avec un réactif de Coomassie tache colloïdale. La migration des α-son sous-unité et de pleine maturité (mβ) et immature (proβ) sous-unités ß est indiquée. La position de la 25 kDa de taille standard moléculaire est indiqué à droite. Asterisk indique une α-son fragment de sous-unité tronquée résultant de la protéolyse non spécifique lors de la lyse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Plasmide | Génotype | La source |
| AKB191 | pET42 PSMA-son | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA son PSMB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 PSMB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 PSMB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tableau 1: Plasmides bactériens utilisés dans cette étude. le PSMA est le gène de la sous-unité α et archéobactéries PSMB est le gène de la sous-unité β d'archéobactéries.
| tampon A | 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2. | Des tampons B, C et E, sont des dérivés de tampon A contenant de l'imidazole. Il est utile d'ajouter Imidazole à partir d'un stock 2 M préparé dans l'eau et stockée dans l'obscurité. |
| tampon natif résoudre | 375 mM de Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) de tétraméthyll'éthylène diamine (TEMED) et 0,1% (p / v) d'ammonium Perulfate (APS). | Préparé frais pas plus d'une heure avant le gel est à polymériser et conservés sur la glace. Lors de la préparation des solutions de gel d'acrylamide dans un tampon natif de résoudre, il est utile d'ajouter le Tris-HCl à partir d'un stock 4X (1,5 M de Tris-HCl, pH 8,8). L'APS est ajouté immédiatement avant la polymérisation. |
| tampon de fonctionnement natif 10X stock | Tris 250 mM, 1,92 M glycine, ne pas ajuster le pH. | |
| tampon d'échantillon natif 5X | 0,5 M de Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) de glycerol, des traces de bleu de bromophénol. | Des traces se réfère à une très petite quantité, habituellement quelques grains transférés par l'intermédiaire d'une spatule. |
| 5X SDS échantillon-tampon | 0,3 M de Tris-HCl, pH 6,8, dithiothréitol 600 mM (DTT), 10% (p / v) de SDS, 50% (v / v) de glycerol et des traces de bleu de bromophénol. | Des traces se réfère à une très petite quantité, habituellement quelques grains transférés par l'intermédiaire d'une spatule. |
| Développer un tampon | 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 1 mM d' ATP, 50 mM de Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC est un substrat peptidique fluorogène utilisé pour doser l'activité du protéasome. |
Tableau 2: Solutions, médias et Tampons utilisés dans cette étude.
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Discussion
Nous démontrons au profit d'une approche combinée à l'analyse de l'assemblage du protéasome par dénaturants PAGE en utilisant proteasomes archées recombinantes. La méthode habituelle 9,11 de coexpression bactérienne des sous - unités du protéasome permet une analyse rapide , mais peut ne pas révéler des intermédiaires d'assemblage clés. Nous vous suggérons de combiner coexpression avec lysat de mélange pour développer une image plus large des événements de l'Assemblée.
L'avantage de cette approche combinée est que, malgré nécessitant l'expression distincte du α et ß sous-unités pour lysat mélange, il est encore relativement favorable à l'emploi. Les résultats peuvent également être semiquantitatif si l'on assure des niveaux d'expression comparables et cohérentes des protéines individuelles. À cette fin, nous recommandons d'effectuer l'optimisation habituelle d'expression de protéines recombinantes pour déterminer les conditions qui permettent des niveaux comparables de protéines exprimées avant lysat mélange. L'optimisation peut inclure des variables d'induction time, la température d'induction, la densité optique à l'induction, la souche d'expression bactérien, et ainsi de suite jusqu'à ce que les niveaux de protéine soluble souhaités sont atteints. Ceci est particulièrement important lorsque l'on compare les versions WT et mutant d'une protéine parce que parfois le mutant peut présenter des niveaux d'expression comparables, mais a diminué la solubilité. Nous soulignons également l'importance de déterminer les concentrations en protéines des échantillons de ICAR purifié avant de charger la PAGE dénaturant. Même avec l'optimisation d'expression en place, et avec le meilleur soin pour garantir que les échantillons parallèles sont traités à travers les étapes de purification de la même manière, la variance peut encore être introduite par inadvertance. Une mesure de la concentration en sorte que la même quantité de protéine totale est chargée par puits d'échantillon. Cela rend les comparaisons des intensités de bande de voie à voies pour une donnée espèces migratrices plus significative.
Si les niveaux d'expression de protéines comparables et cohérentes ne peuvent être atteints pour lysate mélange, on peut toujours purifier tous les composants au préalable et réaliser des expériences de mélange avec des protéines pures. Cela a l'avantage de permettre des déterminations de protéines plus précises et rend l'approche quantitative ainsi. Cependant, l'inconvénient de la purification complète est que le processus devient beaucoup plus de main - d'œuvre, ce qui peut empêcher une analyse rapide de mutants multiples simultanément 18. Une dernière mise en garde à noter est que parfois séparer l'expression des sous-unités α et ß peuvent ne pas être possible. Cela peut se produire si une mutation provoque une sous - unité à être insoluble dans E. coli lorsqu'elle est exprimée en soi , mais permet la solubilité pour être récupérée lorsque le mutant est exprimé avec son partenaire de liaison. Si cela se produit, il va limiter l'analyse à coexpression seulement. Cependant, ceci est une mise en garde qui peuvent survenir au cours de l' expression de protéine recombinante en général, et ne sont pas spécifiques aux sous - unités du protéasome archées 24,25.
Nous avons choisi de gennérer dérivés his-tagged de nos protéines protéasome en raison de la facilité de purification et l'abordabilité de la résine ICAR. D'autres marqueurs d'epitope sont possibles, y compris ceux pour la purification à base d'anticorps, et nous avons exprimé avec succès et les versions purifiées étiquetée FLAG de nos sous-unités du protéasome (non représenté). Toutefois, si la purification à l'homogénéité (ou d'augmenter l'échelle de production) est nécessaire, les versions de son balisés offrent les moyens les plus rapides et les plus rentables de le faire.
Il est une donnée que les résultats obtenus avec des protéines recombinantes, qu'elles soient archéobactéries ou des protéines eucaryotes produites dans des bactéries, gagnera plus de sens que si un suivi avec les observations in vivo. Cependant, une approche in vivo ne peut pas toujours être immédiatement accessible expérimentalement. Cela est particulièrement vrai lorsque le sujet d'étude est un grand, multisubunit complexe comme le protéasome. La protéine recombinante se rapproche de fournir un point de lancement important pour future expériences. Dans le cas du protéasome, l' appariement production de protéasome Archaea recombinant avec PAGE dénaturant continuera d'être très efficace pour élucider les principales caractéristiques de l' ensemble de protéasome, qui sont partagés entre les espèces d' archées et eucaryotes 9,11,12,18. Une telle approche est susceptible d'être utile pour étudier l'ensemble des autres grands complexes multiprotéiques ainsi. Récemment, nous avons utilisé cette stratégie pour démontrer que les protéasomes archées peuvent assembler par plus d'une voie, et que les a-anneaux ne sont pas les intermédiaires obligatoires lors de l' assemblage qu'ils ont été pensés pour être 18. Il reste à déterminer si la même chose est vraie pour proteasomes eucaryotes.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par un soutien des fonds de subvention de la recherche (RSFG) de l'Indiana University-Purdue, Indianapolis, et en partie par un prix de l'American Heart Association 14GRNT20390154, à ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
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