Summary
Detta protokoll använder både subenhet samuttryck och postlysis subenhet blandning i en mer grundlig undersökning av rekombinant proteasom enheten.
Abstract
Proteasomer finns i alla områden i livet. De ger den huvudsakliga vägen för intracellulär proteinnedbrytning i eukaryoter, även om deras montering inte är fullständigt förstådd. Alla proteasomer innehåller en strukturellt konserverad kärnpartikel (CP), eller 20S proteasom, innehållande två heptameric p-subenheten ringar inklämt mellan två heptameric α subenhet ringar. Archaeal 20S proteasomer är sammansättnings enklare jämfört med sina eukaryota motsvarigheter, men de båda har en gemensam monteringsmekanism. Följaktligen archaeal 20S proteasomer fortsätter att vara viktiga modeller för eukaryot proteasom montering. Specifikt har rekombinant uttryck av archaeal 20S proteasomer tillsammans med nondenaturing polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) gav många viktiga insikter proteasom biogenes. Här diskuterar vi ett sätt att förbättra den vanliga strategin för samuttryck av archaeal proteasom α och p subenheter före nondenaturing PAGE. Vi visar att även en snabb och effektiv, kan enbart en samexpression tillvägagångssätt missar viktiga monteringsmellan. I fallet med proteasomen kan samuttryck inte tillåta detektering av den halv-proteasom, en mellanprodukt innehållande en komplett α-ringen och en komplett β-ring. Men detta mellan lätt upptäckas via lysat blandning. Vi föreslår att kombinera samuttryck med lysat blandning ger ett tillvägagångssätt som är mer noggrann i att analysera montering, men förblir arbets nonintensive. Detta tillvägagångssätt kan vara användbart för studier av andra rekombinanta multiproteinkomplex.
Introduction
Multiproteinkomplex utför många kritiska cellulära aktiviteter 1. För många av dessa komplex, mycket mer är känt om deras struktur och funktion än om deras montering 2,3. Proteasomet är ett sådant komplex och finns i alla livsområden. I eukaryoter, är detta molekylär maskin i centrum av ubiquitin / proteasomsystemet (UPS) och ger den huvudsakliga vägen av intracellulär proteinnedbrytning 4. Den eukaryota proteasom (kallad 26S proteasomen) består av två stora underenheterna: a 20S proteasom eller kärnpartikel (CP) 5, som kan förslutas på en eller båda ändarna med en 19S Regulatory partikel (RP) 6.
20S proteasom är ett stort fack proteas. Dess kvatemära strukturen är helt konserverad över alla livsområden och består av en stapel av fyra sju-ledade ringar innehållande två typer av strukturellt besläktade subenheter, α; och p-5,7,8. I eukaryoter, är de två yttre ringarna var och en består av sju distinkta a-subenheter och de två inre ringarna är var och en består av sju distinkta p-subenheter; proteolytisk aktivitet ligger inom tre av p-subenheter. Däremot är de CP ringar av arkéer och bakterier vanligtvis består av endast en typ av α och en typ av β-subenheten. Archaeal proteasomer har gett ett viktigt modellsystem för att studera proteasom montering på grund av både deras sammansättning enkelhet och deras delar en gemensam monteringsmekanism med sina eukaryota motsvarigheter 9-13. I korthet, a-subenheter montera in a ringar första, som tjänar som en byggnadsställning på vilken p-subenheter montera. De resulterande halv proteasomer (α 7 β 7) dimeriserar, vilket ger upphov till fullt monterade CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Under dimerisering, propeptiderna presenterar på p-subenheterär autokatalytiskt bort, utsätta de katalytiska N-terminal treoniner. Användningen av archaeal proteasomer för att modellera sammansättningen har ofta nytta av produktionen av rekombinanta archaeal proteasom proteiner i Escherichia coli. Detta är ett värdefullt tillvägagångssätt eftersom det gör det möjligt för subenheter som skall produceras i olika kombinationer, som både WT och muterade versioner, i en värdorganism som inte producerar sina egna proteasomer.
Övervakning av montering av multiproteinkomplex biokemiskt kräver någon form av fraktioneringsmetod som separerar färdigmonterade komplex från monterings intermediärer och prekursorer. På grund av dess överlägsna upplösningskapacitet, nondenaturing polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) har visat sig vara speciellt användbar vid fraktionering av olika stora multiproteinkomplex 14-17. Kombinationen av rekombinant archaeal proteasom produktion och nondenaturing blivit en kraftfull metod i dissecting proteasom aggregatet 9,11,12,18. Men den vanliga metoden genom vilken denna metod används (dvs.. Via rekombinanta samuttryck av a- och P-subenheter) har en viktig nackdel. Monterings reaktioner är samarbetsvillig och starkt koncentrationsberoende tre. Med tanke på att proteinkoncentrationen inuti celler är mycket hög 19, på grund av uteslutna volymeffekter, monterings reaktioner fortskrider snabbt in vivo. Därför är det möjligt att missa viktiga monteringsmellan när a- och p-subenheter samuttrycks.
Här argumenterar vi för ett kombinerat tillvägagångssätt i studien av proteasom montering med rekombinanta archaeal proteasom subenheter. I detta tillvägagångssätt, är båda samuttryck och lysat blandningsmetoder användes. Den förra möjliggör snabb analys av montering eftersom samuttryck är mindre arbetskrävande. Det senare beror på separat uttryck av a- och P-subenheter, följt av blandning. Även om detta behöver utförasres lite mer ansträngning än samuttryck, är det mer än kompenseras av förmågan att upptäcka mellan som missats under samexpression. Tillsammans kan dessa två metoder ge en mer fullständig bild av proteasom enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriell expression.
Anmärkning: Expressionsplasmider används i denna studie beskrivs i tabell 1. Lösningar, media och buffertar som används i denna studie beskrivs i tabell 2. Kloningen av archaeal proteasom gener från subenheten och genereringen av expressionsplasmider beskrives annorstädes 18,20. I korthet, plasmider för rekombinant samuttryck av subenheter anställa en bicistronisk operon strategi som hjälper till att uppnå jämförbara expressionsnivåer av individuella subenheter 18,20. Uttrycket parametrar som anges nedan var empiriskt bestämt sig för att vara optimal för proteasom subenheter i denna studie. Det kan vara nödvändigt för att optimera uttryck för andra proteasom mutanter, för proteasomer från andra archaeal arter, eller för andra rekombinanta proteinkomplex (se diskussion).
- Omvandla expressionsplasmid av intresse i kemiskt kompetenta E. coli BL21 (DE3) -celler.
- Tillsätt 1 - 2 | il av plasmid (typiskt 50 - 100 ng) till en alikvot av DE3 celler som var nyligen tinades på is, och fortsätta att inkubera på is under 20 min.
- Värmechock cellerna vid 42 ° C under 45 s och returrör till is under additionl 2 min.
- Tillsätt 1 ml LB-medium och inkubera vid 37 ° C med skakning (150 rpm) under 1 h.
- Sprid 100-200 mikroliter av transformationsblandningen på LB-kan plattor (plattor innehållande fast LB-medium, kompletterat med kanamycin (alla plasmider som användes i denna studie koda resistens mot detta antibiotikum)). Inkubera plattorna vid 37 ° C O / N.
- Nästa morgon, inokulera en enda koloni från LB-kan plattan i 3 ml flytande LB-kan media i en glas odlingsrör. Inkubera vid 37 ° C med skakning (150 rpm) i ca 2,5-3 h, eller tills grumlighet observeras.
- Mät den optiska tätheten av kulturen vid 600 nm (OD 600) i en spektrofotometer. Späd cellkulture med en lämplig mängd av förvärmd LB-kan media till en OD 600 av 0,4 i en slutlig volym av 6 ml. Återuppta skakning vid 37 ° C under 40 min.
- Inducera proteinexpression i de flytande kulturerna genom att tillsätta IPTG från en stamlösning till en slutlig koncentration av 1 mM. Inkubera vid 37 ° C med skakning (150 rpm) under ca 6-7 timmar.
- Harvest bakteriecellkulturer i sin helhet i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1,5 ml av en kultur in i mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 10000 x g under 1 min.
- Kasta bort supernatanten och tillsätt ytterligare 1,5 ml av samma kultur till pelleten. Centrifugera vid 10000 x g under 1 min.
- Upprepa steg 1,11 tills hela kulturen skördas i mikrocentrifugrör.
- Lagra de inducerade pellets vid -80 ° C tills lys.
2. Bakteriell lys och lysat Blandning.
Notera: (dvs. verifierar att proteinet uttrycktes och löslig). Därför rekommenderar vi starkt inklusive TSP analys från början. När en optimal protokoll har uppnåtts för en särskild subenhet kombination, TSP analys inte absolut nödvändigt och det är därför det beskrivs som tillval nedan.
- Lys av bakterieceller och förberedelse av lösliga fraktioner.
- Tina inducerade cellpelleten på is i 5 minuter. Återsuspendera pelleten i 600 | il lysbuffert.
- incUbate suspensionen vid 30 ° C med skakning (150 rpm) under 30 min för att generera totalt rå lysatet.
Anmärkning: Följande steg och underavsnittet som följer är valfria. - Ta bort de två 25 mikroliter alikvoter från den totala rå lysatet i separata 1,5 ml mikrocentrifugrör och genomföra TSP analys enligt följande.
- Till en av de två 25 mikroliter alikvoter, tillsätt 5X SDS-provbuffert till en slutlig koncentration av 1X. Märk röret med "T" för "total rålysat".
- Inkubera "T" provet vid 100 ° C under 5 minuter för att helt denaturera proteiner.
- Samtidigt tar den andra 25 mikroliter alikvot och centrifugera det vid 10000 x g under 10 minuter. Försiktigt bort supernatanten utan att störa den lilla pelleten, och överföra den till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör. Märk denna nya röret "S" för "lösliga fraktionen".
- Till liten pellet vänster behind i föregående steg, tillsätt 25 | il lysbuffert och vortexa att resuspendera. Märk detta rör "P" för "pelletfraktion".
- Lägga 6 mikroliter av 5X SDS-provbuffert till "S" och "P" rör och inkubera vid 100 ° C såsom beskrivits ovan.
Obs: Om TSP proverna inte kommer att användas den dagen för att analysera uttryck, kan de frysas vid -20 ° C tills det behövs. När tinats, måste de återinkuberades vid 100 ° C, som beskrivits ovan, omedelbart före lastning på en 12% och / eller 15% standard SDS-PAGE-gel.
- Medan TSP analysen utförs, centrifugera återstående 550 mikroliter av den totala rå lysat (eller hela 600 mikroliter av den totala rå lysat om TSP analys utförs inte) vid 10000 x g under 10 minuter. Samla in supernatanten i en färsk 1,5 ml mikrocentrifugrör. Detta är den lösliga lysat som kommer att användas för rening.
- Lysat blandning.
- Utför lys som beskrivs i steg 2.1.1 och 2.1.2 ovan.
- Blanda 600 mikroliter av den totala rå lysat från bakterier som uttrycker den önskade α-subenheten med 600 mikroliter av den totala rå lysat från bakterier som uttrycker den önskade β-subenheten. Inkubera vid 37 ° C med långsam skakning i 30 min.
Obs: Det kan vara nödvändigt att optimera inkubationstiden för att uppnå maximal montering under lysat blandning (se diskussion). Tiden och temperaturen som presenteras här är optimala för de rekombinanta proteinerna i denna studie och bestämdes på annan plats 18. - Centrifugera den blandade lysatet vid 10.000 x g under 10 min för att separera lösligt material från olösligt pellet. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Använd denna blandade lösligt lysat för proteinrening.
3. Protein Purification via Immobilized Cobalt Affinity Resin(ICAR).
- Jämvikta hartset.
- Grundligt resuspendera hartset genom att vända flaskan och överför 50 | il av uppslamningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 700 x g under 2 minuter till pellets harts. Försiktigt aspirera supernatanten.
Notera: Vi utför pipett aspiration med användning av en blå 1 ml pipettspets för att avlägsna huvuddelen av vätskan. En vit 2 mikroliter spets används för finreglering av avlägsnande av den kvarvarande supematanten och lämnar ett mycket tunt skikt av vätska som täcker pärlorna. - Lägg 1 ml Buffert A. Blanda försiktigt för att återsuspendera hartsen och centrifugera vid 700 x g under 2 min för att pelletera harts. Försiktigt aspirera supernatanten och upprepa detta tvättsteg en gång.
- Grundligt resuspendera hartset genom att vända flaskan och överför 50 | il av uppslamningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 700 x g under 2 minuter till pellets harts. Försiktigt aspirera supernatanten.
- Applicera lösligt lysat som erhållits tidigare i avsnitt 2.1 eller 2.2 till den ekvilibrerade harts. Inkubera röret med försiktig rotation vid 4 ° C under 60 min. Centrifugera röret vid 700 x g </ Em> under 5 min och försiktigt aspirera supernatanten.
- Tvätta hartset enligt följande för att avlägsna icke-specifikt bundna proteiner.
- Återsuspendera-harts med 1 ml av Buffert A och inkubera med försiktig skakning vid 4 ° C i 10 min. Centrifugera röret vid 700 x g under 5 min och försiktigt aspirera supernatanten. Upprepa detta tvättsteg en gång.
- Återsuspendera-harts med 1 ml buffert B (buffert A med 5 mM imidazol) och inkubera med försiktig skakning vid 4 ° C i 5 min. Centrifugera röret vid 700 x g under 5 min och försiktigt aspirera supernatanten. Upprepa detta tvättsteg en gång.
- Återsuspendera-harts med 1 ml buffert C (buffert A med 10 mM imidazol) och inkubera med försiktig skakning vid 4 ° C i 5 min. Centrifugera röret vid 700 x g under 5 min och försiktigt aspirera supernatanten.
- Eluera proteinet genom att tillsätta 400 mikroliter av Buffert E (buffert A med 200 mM imidazol) to hartset. Inkubera med försiktig skakning vid 4 ° C i 5 min. Centrifugera vid 700 x g under 5 min.
- Överför supernatanten innehållande renat protein till en ny 1,5 ml centrifugrör.
- Avsalta det renade proteinet genom seriell centrifugering enligt följande.
- Till 400 mikroliter av renat protein, tillsätt 100 mikroliter buffert A (detta minskar Imidazol koncentration från 200 mM till 160 mM). Tillämpa renat protein till 0,5 ml ultracentrifugal filter med en 10 kDa molekylviktsgräns. Centrifugera vid 14000 x g under 5 min.
- Kassera filtratet och tillsätt 400 | il buffert A för att späda retentatet och centrifugera igen. Fortsätt cykler av centrifugering / utspädning tills imidazol koncentration faller under 4 mM. Som ett exempel, om varje centrifugering koncentrerar 500 pl ner till ~ 70 | j, l (eller approximativt 7-faldig), därefter två cykler kommer att minska med början 160 mM imidazol koncentration (7 × 7 = 49-faldig) till caoximately 3,3 mM.
- Mäta proteinkoncentrationen av den avsaltade provet med hjälp av BCA-analys 21.
Obs: Avsaltning krävs för att minska Imidazol nivåer under toleransgränsen för BCA-analys, som beskrivs i tillverkarens instruktioner. Vårt laboratorium föredrar BCA-analys eftersom den är känslig, har ett stort dynamiskt omfång, och uppvisar mycket mindre protein-till-protein variation. Emellertid kan andra metoder för att bestämma proteinkoncentration användas i stället för BCA-analys. Det viktiga är att vara medveten om varje metod fördelar och begränsningar.
- Lägga 5X nativ provbuffert till en slutlig koncentration av 1X och fortsätt till elektrofores. Alternativt, lagra proverna vid -20 ° C för senare analys.
4. Nondenaturing polyakrylamidgelelektrofores (PAGE).
Varning: Opolymeriserat akrylamid är ett nervgift. Bär lämplig skyddsutrustning gear.
- Förbered nondenaturing PAGE-gelen på följande sätt.
- Förbered gelkassetten för gjutning med hjälp av rena glasplattor och gjutning monter. Placera lutning maker på toppen av en liten magnetomrörare och placera en liten omrörare i varje kammare.
- Med användning av 40% (vikt / volym) akrylamid och 2% (vikt / volym) bisakrylamid stamlösningar, förbereda 5% och 10% (vikt / volym) akrylamidgel lösningar i en nativ lösa buffert. Se till att förhållandet mellan total akrylamid till bisakrylamid är 37,5: 1. Chill på is före upphällningen.
Obs: nondenaturing PAGE system som används här är i huvudsak identisk med den Laemmli SDS-PAGE-system, med SDS utelämnade 22. - Lägga Ammoniumpersulfat (från en 10% (vikt / volym) stamlösning framställd i vatten) till lösningarna akrylamid att initiera polymerisation. Slutlig koncentration av ammoniumpersulfat 0,1% (vikt / volym).
- Häll lösningarna akrylamid i de två kamrarna av gradienten maker. Med utloppsslangen införas bindexets plattorna i gelén kassetten, aktivera magnetomrörare och öppna gradient kokare ventiler. Häll 5-10% nondenaturing gradientgel.
- Gång hälls, överlagra gelén med ett tunt skikt av isopropanol och tillåta gelén polymerisera under 30 min. Under denna tid, förbereda färsk 5% akrylamidgel lösning i nativ lösa buffert. Efter gelen uppsättningar, häll bort Isopropanol och skölj toppen av gelén med avjoniserat vatten från en sprutflaska.
- Till gellösningen 5% framställd ovan, tillsätt ammoniumpersulfat (exakt såsom beskrivits i 4.1.3) och häll på toppen av den polymeriserade gelén tills glasplattor är fulla. Sätt gel kam. Tillåta den överlagrade gel för att polymerisera under ytterligare 30 min.
- När gel är polymeriserad, montera gelkassetten i elektroforesapparaten. Alternativt, lagra gelén vid 4 ° C, insvept i fuktade pappershanddukar och plastfolie tills klar för användning.
- Gång nondenaturing PAGE-gel är monterad i elektrophoresis apparat, fylla tanken med 1X infödda rinnande buffert beredda färska från en 10X infödd rinnande buffertlager.
- Belastning 10 mikrogram av renat protein, som erhållits vid slutet av avsnitt 3, i varje brunn med hjälp av en glasspruta.
- Last 2 mikroliter av hög vikt nativt protein standard molekyl (utspädd i 1X infödda rinnande buffert) i en av brunnarna.
- Kör gelen vid 55 V och 4 ° C tills färgen rinner av gelen (ca 4-4,5 timmar).
- Förutom den nondenaturing gel, analysera alikvoter av det renade proteinet genom standard SDS-PAGE 22.
- Blanda portioner (10 pg) av de renade proteinprover, erhållna vid slutet av avsnitt 3, med 5X SDS-provbuffert till en slutlig koncentration av 1X.
- Inkubera vid 100 ° C under 5 min och laddar in standard 12% och / eller 15% SDS-PAGE-geler 22.
- Kör vid 80V i 20 minuter och sedan vid 120 V tills färgen rinner av gelen (detta är ungefär en addnella 75 min för en 12% gel och 120 min för en 15% gel).
5. Visualisering-aktivitet och proteinfärgning.
- Efter elektrofores noga separata glasplattor och överför nondenaturing gel till en gel bricka innehåller 50 ml avjoniserat vatten. Skölj gel med försiktig skakning under 5 minuter. Kasta vatten och upprepa detta tvättsteg tre gånger.
- Utför substrat overlay-analysen enligt följande.
- Tillsätt 1 ml av att utveckla buffert innehållande det fluorogena peptidsubstratet Suc-LLVY-AMC och spreds likformigt över gelén. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
Notera: En glasstav eller en gel lösgör (liten kil av plast som används för att separera glasplattor) kan användas för att sprida vätskan över gelén. - Försiktigt överföra gelen på UV-transilluminator av gelen avbildningssystemet och observera fluorescens på grund av den kluvna peptidsubstratet. Record bild. Försiktigt överföra gel back till gelbricka.
- Skölj gelén två gånger med 50 ml avjoniserat vatten under 5 min med försiktig skakning.
- Fläcka gelén med 10 ml av en kolloidal coomassie stain-reagens under 60 min med försiktig skakning. Avfärgning gel med 50 ml vatten tills bakgrunden blir klar. Denna färgning steg gäller de vanliga SDS-PAGE-geler liksom.
- Tillsätt 1 ml av att utveckla buffert innehållande det fluorogena peptidsubstratet Suc-LLVY-AMC och spreds likformigt över gelén. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteasom aggregatet (figur 1) börjar när a-subenheter kombineras för att bilda ringar 9. Detta kan illustreras när a-subenheter från arkebakterie Methanococcus maripaludis S2 uttrycks i E. coli som C-terminalt hexahistidin tagged (his-taggade) derivat (tabell 1). När det rekombinanta α-his-protein renades genom ICAR och analyseras genom nondenaturing PAGE, var två band observerades (figur 2A, spår 1). Vi har tidigare visat att dessa överensstämmer med enkel a Rings (SR) och dubbel a-ringar (DR) 18. DR är en återvändsgränd arter som inte är produktiv för efterföljande montering 9,18.
När a-hans subenheter var samuttrycktes med p-subenheter, som representerar den vanliga metoden genom vilken sammansättning av rekombinanta archaeal proteasomer analyseras, var en ny art observeras migrera nära 670 kDa storlek standard (figur 2A, bana 3). Denna art var proteolytiskt aktiv (figur 2B, spår 3) och innehöll bara helt mogna p-subenheter (mβ) vars propeptider har tagits bort (Figur 2C, spår 3). Denna art är fullt mogna CP. Detta prov innehöll också några SR arter, som förväntades eftersom SR är en känd montering mellan, men inga DR arter. Bristen på DR när a-his och p subenheter samuttrycks tyder på att korrekt montering förekom tillräckligt snabbt så att införlivandet av p-subenheter kunde konkurrera ut den nonproductive bildandet av DR (för en mer detaljerad analys se 18).
För att demonstrera begränsning av samuttryck metoden, och argumentera för nyttan av ett kombinerat tillvägagångssätt, α-hans och P-subenheter uttrycktes separat i E. coli. Efter lys, de lösliga fraktionerna blandades och proteiner renades genom ICAR föreanalys genom nondenaturing PAGE. Fullt fungerande proteasomer ades också alstras via lysatet blandningstillvägagångssättet (figur 2A och 2B, bana 2), och de SR arter observerades också som förväntat. Återkomsten av DR arter i lysatet blanda provet indikerar att en gång bildats, p-subenheter är inte reversibelt isär det; Detta understryker återvändsgränd natur DR. Intressant, en ny art syntes också i lysat blanda provet, migrerar strax under CP (kallas "halv"). Nyligen visade vi att denna art motsvarar halv proteasom (a 7 β 7) 18. För att illustrera detta här, var en β-subenheten mutant (R166W) användes. Denna mutation avbryter β-β ring interaktion, vilket leder till försämrad halv proteasomerna dimerisering 18. Eftersom halv proteasomer är de omedelbara prekursorer till CP, bör R166W mutationen leda till både ackumulering av halv proteasomer enda minskning i CP bildning. När lysat blandning med a-hans och p (R166W) subenheter utfördes, lägre nivåer av CP och ökade nivåer av "halv" arter observerades (figur 2A, bana 4). Detta stämmer överens med en prekursor-produktförhållande för dessa två band, och bekräftar identiteten av de "halva" art som halv-proteasomen. Den något snabbare migrering av halv proteasom i mutanten prov (spår 4 mot bana 2) beror sannolikt på den R166W mutationen förändra förhållandet massa till laddning av β-subenheten.
Förmågan att visualisera halv-proteasom under lysat blandning beror främst på mycket lägre proteinkoncentrationer i lysatet jämfört med de höga proteinkoncentrationer inuti celler. Lägre koncentrationer resulterar i mindre effektiv (dvs långsammare) montering, som gör det möjligt för mellan att bli mer befolkat och därmed detekterbara. Förutom utseendet på halv-proteasom, en ytterligare observation belyser den minskade monteringseffektiviteten under lysat blandning: obearbetade p-subenheter, som bibehåller sina propeptider, blir detekterbara (proβ). Eftersom propeptid bearbetning inte sker förrän halv proteasomer dimeriserar, utseendet på omogna proβ formen korrelerar med nivån av halv-proteasom ackumulering (jämför figur 2C, lane 3 versus lane 2 versus lane 4). I fallet med R166W mutanten är propeptid bearbetning fel under lysat blandning absolut trots en liten mängd CP gör formen. Detta beror på att propeptid bearbetning kräver inte bara halv-proteasom dimerisering, men också en korrekt bildade β-β ringgränssnittet 23 vilka R166W mutationen inte har råd med. En mer detaljerad berättelse om samexpression mot lysat blandning, eftersom det avser rekombinant proteasom montering, kan hittas här 18.
gur 1 "src =" / filer / ftp_upload / 54.860 / 54860fig1.jpg "/>
Figur 1: ett förenklat schema av kärnpartikel (CP) Montering.
A-subenheterna kan sätta ihop till en enda α-ring först (SR) som fungerar som en mall för inkorporering av P-subenheter. Detta leder till generering av halv proteasom mellan (halv) som snabbt dimeriserar. Samtidigt med dimerisering är de β-subenheten propeptiderna (ej visade) autokatalytiskt avlägsnades, vilket gav upphov till fullt fungerande kämpartikeln (CP). Dubbla a-ringar (DR) kan uppstå från SR och är inte behörig för montering i CP. Deras bildande representerar en icke-produktiv monterings väg (streckad pil) i motsats till produktiva monterings händelser (heldragna pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ett kombinerat tillvägagångssätt för att analysera Proteasome Assembly.
Samuttryck (C) och lysat blandning (L) användes för att studera sammansättning av rekombinanta proteasomer från arkebakterie M. maripaludis. Proteiner renades genom Immobilized Cobalt Affinity Resin (ICAR). (A, B) Renade proteiner (10 ^ g) satsades på icke-denaturerande 5-10% gradientgeler. Efter elektrofores var peptidasaktivitet visualiseras genom att överlagra av gelén med buffertlösning innehållande det fluorogena peptidsubstratet Suc-LLVY-AMC (B) före färgning av gelén med kolloidalt coomassie stain-reagens (A). Svarta pilhuvuden betecknar lägena för de hopsatta 20S kämpartikeln (CP), halv-proteasom intermediär (halv), dubbel α-ringen (DR) och enkel α-ringen (SR). Migreringen av flera molekylära storleksstandarder (i kDa) indikeras till höger. (C) A var också laddades på 15% SDS-PAGE-geler. Efter elektrofores överfördes gelerna färgades med en kolloidal coomassie fläck reagens. Migration av α-hans-subenheten och fullt utvecklad (mβ) och omogna (proβ) p-subenheter indikeras. Placeringen av molekylstorlek standarden 25 kDa visas till höger. Asterisk indikerar en stympad α-hans subenhet fragment som härrör från ospecifik proteolys under lys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| plasmid | Genotyp | Källa |
| AKB191 | pET42 PSMA-his | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA-his psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabell 1: Bakterie Plasmider som används i denna studie. PSMA är ett archaeal α subenhetsgenen och psmB är archaeal β subenhetsgenen.
| buffert A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2. | Buffertar B, C och E, är derivat av buffert A innehållande imidazol. Det är användbart för att lägga till imidazol från en 2 M förråds beredas i vatten och lagrades i mörker. |
| Nativ lösa buffert | 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (vol / vol) tetrametyletylendiamin (TEMED) och 0,1% (vikt / volym) Ammonium Perulfate (APS). | Beredda färska inte mer än en timme före gelén skall polymeriseras och hölls på is. När man förbereder akrylamid gellösningar i nativ lösa buffert, är det användbart att tillsätta Tris-HCl från en 4X lager (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8). APS tillsättes omedelbart före polymerisation. |
| Native rinnande buffert 10X lager | 250 mM Tris, 1,92 M glycin, inte justera pH. | |
| 5X infödda provbuffert | 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (volym / volym) glycerol, spår av bromfenolblått. | Spår hänvisar till en mycket liten mängd, vanligen några korn överföras via spatel. |
| 5X SDS-provbuffert | 0,3 M Tris-HCl, pH 6,8, 600 mM ditiotreitol (DTT), 10% (vikt / volym) SDS, 50% (volym / volym) glycerol och spår av bromfenolblått. | Spår hänvisar till en mycket liten mängd, vanligen några korn överföras via spatel. |
| utveckla buffert | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC är ett fluorogent peptidsubstrat användes för att analysera proteasom-aktivitet. |
Tabell 2: Solutions, Media och buffertar som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visar fördelen med en kombinerad metod för att analysera proteasom enheten genom nondenaturing PAGE med användning av rekombinanta archaeal proteasomer. Den vanliga metoden 9,11 av bakteriell samuttryck av proteasom subenheter möjliggör snabb analys men kan inte avslöja viktiga monteringsmellan. Vi föreslår att kombinera samuttryck med lysat blandning för att utveckla en bredare bild av monterings händelser.
Fördelen med denna kombinerade tillvägagångssätt är att trots att kräva separat expression av α och p-subenheter för lysat blandning, är det fortfarande relativt arbetsvänlig. Resultaten kan också vara semikvantitativ, om en säkerställer jämförbara och expressionsnivåer av de individuella proteinerna. För detta ändamål rekommenderar vi att utföra den vanliga optimering av uttryck av rekombinant protein för att bestämma förhållanden som tillåter jämförbara nivåer av uttryckta proteiner före lysat blandning. Optimering kan innefatta varierande induktion time, induktionstemperatur, optisk densitet vid induktion, bakteriell expression-stam, och så vidare, tills önskade nivåer av lösligt protein uppnås. Detta är särskilt viktigt när man jämför WT och muterade versioner av ett protein eftersom det ibland mutanten kan uppvisa jämförbara expressionsnivåer, men minskad löslighet. Vi belyser också vikten av att bestämma proteinkoncentrationer av ICAR-renade prover före laddning av nondenaturing PAGE. Även med expressionsoptimering på plats, och med bästa omsorg vidtas för att säkerställa att parallella sampel behandlas genom de reningssteg på samma sätt, varians fortfarande kan oavsiktligt introduceras. En koncentrationsmätning säkerställer att samma mängd av totalt protein är laddad per provbrunn. Detta gör lane-to-lane jämförelser av bandintensiteter för en viss migrerande arter mer meningsfull.
Om jämförbara och konsekventa nivåer av proteinuttryck inte kan uppnås för lysate blandning, kan en alltid rena alla komponenter i förväg och utföra blandningsexperiment med rena proteiner. Detta har den fördelen att det möjliggör mer exakta proteinbestämningar och därmed gör det tillvägagångssätt kvantitativ. Emellertid är nackdelen med fullständig rening att processen blir betydligt mer arbetsintensiv, vilket kan hindra en snabb analys av multipla mutanter samtidigt 18. En slutlig varning värt att nämna är att ibland skilja uttryck av α och P-subenheter kan vara omöjligt. Detta kan inträffa om en mutation orsakar en subenhet för att vara olöslig i E. coli när det uttrycks på egen hand men tillåter löslighet att återtas när mutanten uttrycks med dess bindningspartner. Om detta inträffar, kommer det att begränsa analysen till endast samuttryck. Detta är dock en varning som kan uppstå under rekombinant proteinuttryck i allmänhet, och är inte specifikt för archaeal proteasom subenheter 24,25.
Vi valde att genrera his-taggade derivat av våra proteasomal proteiner på grund av att underlätta rening och överkomliga priser på ICAR harts. Andra epitopmärkningar är möjliga, bland annat för antikroppsbaserad rening, och vi har framgångsrikt uttryckt och renade Flag-märkta versioner av våra proteasom subenheter (ej visad). Men om rening till homogenitet (eller öka produktion skala) erfordras, hans-märkta versioner ger den snabbaste och mest kostnadseffektiva sättet att göra detta.
Det är en tanke på att resultat som erhållits med rekombinanta proteiner, oavsett om de är archaeal eller eukaryota proteiner producerade i bakterier, kommer att få ytterligare betyder när de följs upp med in vivo observationer. Emellertid kan ett in vivo tillvägagångssätt inte alltid är omedelbart tillgänglig experimentellt. Detta är särskilt sant när föremål för studien är en stor, multisubunit komplex, såsom proteasomen. Rekombinant protein närmar sig en viktig startpunkt för future experiment. I fallet med proteasomen, kommer att para rekombinant archaeal proteasom produktion med nondenaturing PAGE fortsätta att vara mycket effektiv i att belysa viktiga funktioner i proteasom montering, vilka är gemensamma för archaeal och eukaryota arter 9,11,12,18. Ett sådant tillvägagångssätt är sannolikt att vara användbart för att studera montering av andra stora multiproteinkomplex som väl. Nyligen använde vi denna strategi för att visa att archaeal proteasomer kan montera via mer än en väg, och att a-ringar är inte de obligata mellan under monteringen att de ansågs vara 18. Det återstår att fastställa om samma gäller för eukaryota proteasomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av en forsknings Support Funds Grant (RSFG) från Indiana University-Purdue University, Indianapolis, och delvis av en utmärkelse från American Heart Association 14GRNT20390154 till ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
