Summary
이 프로토콜은 서브 유닛의 동시 발현 재조합 프로 테아 좀 어셈블리의보다 철저한 검사를 위해 혼합 postlysis 서브 유닛을 모두 사용합니다.
Abstract
프로 테아 좀은 삶의 모든 영역에서 발견된다. 자신의 어셈블리를 완전히 이해되지 않지만 그들은, 진핵 생물의 세포 내 단백질 분해의 주요 경로를 제공합니다. 모든 프로 테아 두 heptameric α 서브 유닛 반지 사이에 끼워 두 heptameric β 서브 유닛 반지를 포함, 구조적으로 보존 된 코어 입자 (CP), 또는 20S 프로 테아 좀 (proteasome)를 포함한다. 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 생물의 대응에 비해 구조적으로 간단, 아직 그들은 모두 공통의 조립 메커니즘을 공유 할 수 있습니다. 따라서, 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 세포 프로 테아 조립을위한 중요한 모델이 될 것을 계속한다. 특히, 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)와 결합 고세균 (20S)의 프로 테아 좀의 재조합 발현는 프로 테아 좀의 생합성에 많은 중요한 통찰력을 산출했다. 여기, 우리는 고세균 프로 테아 α의 동시 발현의 일반적인 전략을 개선하는 방법을 논의하고 β 서브 유닛 전에 nondenaturi하기NG PAGE. 우리는 신속하고 효율적인 있지만, 혼자 동시 발현 방식이 키 어셈블리 중간체를 놓칠 수 있다는 것을 보여줍니다. 프로 테아 좀의 경우, 동시 발현은 반 프로 테아 좀의 감지, 중간 포함하는 하나의 완전한 α-링과 하나의 완전한 β-링을 허용하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 중간 용이 해물 혼합을 통해 검출된다. 우리는 해물 혼합과 동시 발현을 결합하는 어셈블리를 분석에 더 철저 접근을 산출, 아직 노동 nonintensive 유지하는 것이 좋습니다. 이 접근은 다른 재조합 multiprotein 복합체의 연구에 유용 할 수있다.
Introduction
Multiprotein 단지는 수많은 중요한 세포 활동 1을 수행한다. 이 단지의 많은, 더 많은 그들의 조립 2,3에 대한보다 자신의 구조와 기능에 대한 알려져있다. 프로 테아는 하나의 복잡하고 삶의 모든 영역에서 발견된다. 진핵 생물에서이 분자 기계는 유비퀴틴 / 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 핵심이며, 세포 내 단백질 분해 (4)의 주요 경로를 제공합니다. 20S 프로 테아 솜을, 또는 코어 입자 (CP) (5), 즉, 19S 규제 입자 (RP) (6)에 의해 하나 또는 양 말단에서 캡핑 될 수합니다 (26S 프로 테아라고 함) 진핵 테아는 두 개의 주요 서브 어셈블리로 이루어진다.
20 대 프로 테아 큰 구획 단백질 분해 효소이다. 그 급 구조가 절대적으로 삶의 모든 영역에 걸쳐 보존과 구조적으로 관련 서브 유닛의 두 가지 유형을 포함하는 4 ~ 7 원환의 스택으로 구성되며, α; 그리고 5,7,8을 β. 진핵 생물에있어서, 2 개의 외부 링은 각각 일곱 별개의 α 서브 유닛으로 구성되며, 두 개의 내부 링은 각각 일곱 별개 β 소단위로 구성된다; 단백질 분해 활성은 β 서브 유닛의 세 내에 존재한다. 대조적으로, 고세균 및 세균의 CP 링은 일반적으로 오직 하나의 α 형과 β 서브 유닛의 한 형태로 구성된다. 고세균 프로 테아 좀은 그들의 조성 단순성 및 그들의 대응 진핵 9-13과 공통 어셈블리기구 공유 모두 테아 조립체를 연구하는 것이 중요 모델 시스템을 제공했다. 요약하면, α 서브 유닛은 서브 유닛 조립 β있는에 발판 역할을하는 첫 번째 α 링으로 조립한다. 상승을주는 결과 반 프로 테아 좀 (α 7 β 7) 이량은 완전히 CP (α 7 β 7 β 7 α 7) 조립합니다. 이량 동안 propeptides은 β 서브 유닛에 존재자기 촉매 촉매 N 말단 트레오닌를 노출, 제거됩니다. 어셈블리를 모델링 고세균 프로 테아 좀의 사용은 빈번하게 대장균에서 재조합 고세균 테아 단백질의 생성을 이용한다. 이 다양한 조합으로 제조 될 수있는 서브 유닛 자체 프로 테아 좀을 생산하지 않는 숙주 유기체에서 WT 및 돌연변이 버전 모두 같은 수 있기 때문에 가치가있는 접근법이다.
다중 단백질 복합체의 조립을 모니터링 생화학 조립 중간체 및 전구체에서 완전히 조립 된 복합체를 분리하는 분류 방법의 일종이 필요합니다. 때문에 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (PAGE) 비 변성 뛰어난 해결 능력, 다양한 큰 multiprotein 단지 14 ~ 17의 분류에서 특히 유용한 것으로 입증되었습니다. 재조합 고세균 테아 생산 및 비 변성 PAGE의 조합 dissectin에서 강력한 접근되었다g의 프로 테아 좀 어셈블리 9,11,12,18. 그러나,이 방법이 적용되는 (즉. α 및 β 서브 유닛의 동시 발현 재조합을 통해) 통상의 방법은 중요한 단점을 갖는다. 조립 협동 반응은 강하게 농도 의존적 3이다. 세포 내부의 단백질 농도로 인해 배제 체적 효과 (19)이 매우 높은 점을 감안, 조립 반응은 생체 내에서 급속하게 진행. 따라서 α와 β 서브 유닛이 동시 발현 될 때 중요한 조립 중간체를 그리워하는 것이 가능하다.
여기, 우리는 재조합 고세균 프로 테아 서브 유닛을 사용하여 프로 테아 좀 어셈블리의 연구에서 결합 된 접근 방식에 대한 주장한다. 이 방식에서, 두 동시 발현과 해물 혼합 방법이 이용된다. 동시 발현 덜 노동 집약적이기 때문에 전자는 어셈블리의 신속한 분석이 가능합니다. 후자는 혼합하여 α와 β 서브 유닛, 별도의 표현에 따라 달라집니다. 이 requi 비록동시 발현보다 고해상도 조금 더 많은 노력, 그것은 동시 발현 동안 놓친 중간체를 검출 할 수있는 능력에 의해 보상 이상이다. 함께, 이러한 방법은 두 테아 조립체의 더욱 완전한 그림을 제공 할 수있다.
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Protocol
1. 세균성 식입니다.
참고 : 본 연구에 사용 된 발현 플라스미드는하기 표 1에 기재되어있다. 본 연구에서 사용 된 용액, 미디어, 버퍼는 표 2에 기재되어있다. 고세균 테아 소단위 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 발생이 다른 18,20 설명한다. 요컨대, 서브 유닛의 재조합 동시 발현을위한 플라스미드는 각각의 서브 유닛 (18, 20)의 비교 발현 수준을 획득하는 데 도움이 bicistronic 오페론 전략을 사용한다. 아래에 나열된 식 매개 변수는이 연구에서 프로 테아 서브 유닛에 대한 최적의 것으로 경험적으로 결정했다. 다른 고세균 종에서, 또는 다른 재조합 단백질 복합체 (토론 참조) 프로 테아를 들어, 다른 프로 테아 돌연변이에 대한 표현을 최적화 할 필요가있다.
- (화학적으로 유능한 대장균 BL21에 관심의 발현 플라스미드를 변환DE3) 세포.
- 갓 얼음에 해동 된 DE3 세포의 나누어지는로 - (100 NG 일반적으로 50), 20 분 동안 얼음에 품어 계속 플라스미드의 2 μL - 1을 추가합니다.
- 열 충격 45 초 동안 42 ° C에서 세포와 additionl 2 분 동안 얼음에 튜브를 반환합니다.
- LB 배지 1 mL를 넣고 1 시간 동안 (150 rpm으로)을 진탕 37 ° C에서 품어.
- ((카나마이신이 보충 된 LB 고체 배지를 함유하는 플레이트이 항생제 본 연구 인코딩 저항에 사용 된 모든 플라스미드)) 관 LB 플레이트 상에 형질 전환 혼합물의 200 μL - 100 확산. 37 ºC O / N에서 번호판을 품어.
- 다음 날 아침, 유리 문화 튜브에 액체 LB-관 미디어의 3 mL의에 LB-칸 판에서 단일 콜로니를 접종. 약 2.5 (150 RPM)을 진탕 37 ºC에서 품어 - 3 시간, 또는까지 혼탁이 관찰된다.
- 분광 광도계 600 nm의 (OD 600)에서 문화의 광학 밀도를 측정한다. 셀 숭배를 희석6 ㎖의 최종 부피 0.4의 OD 600 데워진 LB 관 매체 적당량 URE. 40 분 37 ºC에서 진탕 다시 시작합니다.
- 1 mM의 최종 농도 원액에서 IPTG를 첨가하여 액체 배양 물에서 단백질 발현을 유도한다. 7 시간 - 약 6 (150 RPM)을 진탕 37 ºC에서 품어.
- 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브에 그 전체가 세균 세포 배양을 수확.
- microcentrifuge 관에 문화의 1.5 ML을 추가합니다. 1 분 동안 10,000 × g에서 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 펠렛에 동일한 문화의 또 다른 1.5 mL를 넣어. 1 분 동안 10,000 × g에서 원심 분리기.
- 전체 문화까지 단계를 반복 1.11은 microcentrifuge 관에 수확한다.
- 용해 될 때까지 -80 ° C에서 유도 된 펠렛을 저장합니다.
2. 세균 용해와 해물을 혼합.
노트: (즉,이 단백질이 발현 및 가용성 것을 확인합니다) 중요한 제어 기능을 제공합니다. 따라서, 우리는 매우 초기 TSP 분석을 포함하는 것이 좋습니다. 최적의 프로토콜은 특정 서브 유니트 조합에 대해 달성되면, TSP 분석 엄격 이하 선택적으로 설명하는 이유이다 필요하지 않다.
- 균체 및 가용성 분획 제제의 용해.
- 5 분 동안 얼음에 유도 된 세포 펠렛을 해동. 용해 완충액 600 μL에 펠렛을 재현 탁.
- Inc의총 조질 용 해물을 생성하기 위해 30 분 동안 (150 RPM)를 진탕하면서 30 ºC의 현탁액 ubate.
참고 : 다음 단계 및 다음 하위 섹션은 선택 사항입니다. - 별도의 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브에 총 원유 해물에서 두 25 μL 씩을 제거하고 다음과 같이 TSP 분석을 실시하고 있습니다.
- 두 25 μL 씩 중 하나, 1X의 최종 농도로 5 배 SDS 샘플 버퍼를 추가한다. "총 원유 해물"에 대한 "T"와 튜브 라벨.
- 5 분 완전히 단백질을 변성하는 100 ºC에서 "T"샘플을 품어.
- 한편, 제 25 μL 나누어지는을 10 분간 10,000 × g에서이를 원심 분리. 조심스럽게 작은 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. "가용 분"에 대한 새로운 관 "S"를 레이블.
- 작은 펠릿 왼쪽 behi에차 이전 단계에서, 재현 탁에 용해 버퍼와 소용돌이의 25 μL를 추가합니다. "펠릿 부분"이 관 "P"를 레이블.
- 은 "S"와 "P"튜브에 6 μL 5 배의 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 상술 한 바와 같이 100 ºC에서 품어.
참고 : TSP 샘플 표현을 분석하는 그 날 사용하지 않을 경우 필요할 때까지, 그들은 -20 ºC에서 동결 할 수있다. 12 % 및 / 또는 15 % 표준 SDS-PAGE 겔에 바로로드되기 전에, 상기 한 바와 같이 일단 해동, 그들은, 100 ºC에서 reincubated해야합니다.
- TSP에 분석이 수행되는 동안 원심 총 조질 용 해물의 잔여 550 μL 10 분 동안 10,000 × g에서 (또는 총 조질 용 해물의 전체 600 μL TSP 분석이 수행되지 않은 경우). 신선한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 수집합니다. 이 정제에 사용되는 수용성 분해물이다.
- 해물 혼합.
- 단계 2.1.1 위 2.1.2에 설명 된대로 용해을 수행하십시오.
- 원하는 β 서브 유닛을 표현하는 박테리아에서 총 원유 해물의 600 μL를 사용하여 원하는 α 서브 유닛을 표현하는 박테리아에서 총 원유 해물의 600 μL를 섞는다. 천천히 30 분 동안 진탕 37 ºC에서 품어.
주 :이 (논의 참조) 혼합 용 해물 중에 최대 어셈블리를 달성하는 인큐베이션 시간을 최적화하는 것이 필요할 수있다. 시간과 여기에 제시된 온도는이 연구에서 재조합 단백질에 최적이며, 다른 곳에서 (18)를 측정 하였다. - 원심 분리기 10 분 동안 10,000 × g에서 혼합 해물은 불용성 펠렛에서 용해성 물질을 분리합니다. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 단백질 정제에 대해이 혼합 용해 해물을 사용합니다.
고정화 코발트 친 화성 수지를 통해 3. 단백질 정제(ICAR).
- 수지 평형.
- 철저하게 병을 반전 수지를 재현 탁하고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 슬러리의 50 μL를 전송합니다. 펠릿 수지 2 분 동안 700 × g에서 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 대기음.
참고 : 우리는 액체의 대부분을 제거하기 위해 파란색 1 mL를 피펫 팁을 사용하여 피펫 포부를 실시하고 있습니다. 백색 2 μL 팁 비드를 덮는 액체의 매우 얇은 층을 남겨두고 나머지 상층 액 제거의 미세 제어를 위해 사용된다. - 부드럽게 수지 펠렛 2 분 동안 700 × g에서 수지와 원심 분리기를 재현 탁 1 mL의 버퍼 A. 믹스의 추가합니다. 조심스럽게 뜨는을 대기음이 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
- 철저하게 병을 반전 수지를 재현 탁하고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 슬러리의 50 μL를 전송합니다. 펠릿 수지 2 분 동안 700 × g에서 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 대기음.
- 평형화 수지에 2.1 또는 2.2에서 이전에 취득한 가용성 해물을 적용합니다. 60 분 4 ºC에서 부드러운 회전 튜브를 품어. g <700 ×에서 튜브를 원심 분리기/ 5 분 안에> 조심스럽게 뜨는을 대기음.
- 비특이적으로 결합 단백질을 제거하기 위해 다음과 같이 수지를 씻으십시오.
- 버퍼 (A)의 1 mL의에 재현 탁 수지는 부드러운 10 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 재현 탁 버퍼 B 1 용액 (5 mM의 이미 다졸와 버퍼 A)와 수지와 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 재현 탁 버퍼 C 1 ㎖ (10 mM의 이미 다졸와 버퍼 A)와 수지와 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음.
- t (200 mM의 이미 다졸과 완충액 A) 버퍼 (400)의 E μL를 첨가하여 단백질을 용리수지 O. 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 원심 분리기.
- 새로운 1.5 mL의 원심 분리 관에 정제 된 단백질을 포함하는 상층 액을 전송합니다.
- 다음 연속 원심 분리에 의해 정제 된 단백질을 탈염.
- 정제 된 단백질의 400 μL에 (이 160 밀리미터에서 200 밀리미터에서 이미 다졸 농도를 감소) 100 μL 완충액 A를 추가합니다. 10 kDa의 분자량 컷 - 오프 0.5 mL를 ultracentrifugal 필터로 정제 된 단백질을 적용합니다. 5 분 동안 14,000 × g에서 원심 분리기.
- 여과 액을 취소하고 다시 보유 및 원심 분리기를 희석 400 μL 완충액 A를 추가합니다. 이미 다졸 농도가 아래 4 mm로 떨어질 때까지 원심 분리 / 희석주기를 계속합니다. 각 원심 분리 ~ 70 μL (또는 약 7 배)까지 500 μl를 집중하는 경우 예를 들어, 두 개의 사이클 appr, 출발 160 mM의 이미 다졸 농도 (7 × 7 = 49 배)을 줄일oximately 3.3 mm이다.
- BCA 분석 (21)를 사용하여 탈염 샘플의 단백질 농도를 측정한다.
주 : 제조자의 지침에 따라 탈염은 BCA 분석에 대한 허용 한계 이하로 이미 다졸 농도를 감소시킬 필요가있다. 본 연구실은 민감하기 때문에 BCA 분석을 선호 큰 동적 범위를 가지며, 더 적은 단백질을 단백질의 변화를 나타낸다. 그러나, 단백질의 농도를 측정하는 다른 방법은 BCA 분석을 대체 할 수있다. 핵심은 각 방법의 장점과 한계를 인식하는 것입니다.
- 1X의 최종 농도 5 배 기본 샘플 버퍼를 추가하고 전기를 진행합니다. 또한, 매장 샘플 나중에 분석을 위해 -20 ºC에서.
4. 비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (PAGE).
주의 : 미 중합 아크릴 아미드는 신경독이다. 적절한 보호 GEA을 착용아르 자형.
- 다음과 같이 비 변성 PAGE 젤을 준비합니다.
- 깨끗한 유리 플레이트를 사용하여 주조 스탠드 주조 겔 카세트를 준비한다. 작은 자석 교반기 위에 그라데이션 메이커를 놓고 각 챔버에 작은 교반 막대를 배치합니다.
- (/ V W) 아크릴 아미드 및 2 % (W / V) 비스 아크릴 스톡 용액은 5 %와 10 %를 준비하여 40 % (W / V) 네이티브 해결 버퍼에서 아크릴 아마이드 겔 용액. 비스 아크릴 아미드하는 총 아크릴 아미드의 비율이 37.5 있는지 확인하십시오 : 1. 얼음에 칠 쏟아져하기 전에.
주 : 여기에서 사용되는 비 변성 PAGE 시스템은 램 믈리 SDS-PAGE 시스템과 본질적으로 동일하고, SDS (22)를 생략하여. - 중합을 개시 아크릴 아미드 솔루션 (물에서 제조 / v)의 원액 w (10 %에서) 황산 암모늄을 추가합니다. 황산 암모늄의 최종 농도는 0.1 %이다 (W / V).
- 그라데이션 메이커의 두 챔버에 아크릴 아미드 솔루션을 따르십시오. 출구 튜브 삽입 B를etween 겔 카세트의 판, 자석 교반기를 활성화하고 그라데이션 메이커 밸브를 엽니 다. 10 % 비 변성 그라데이션 젤 - 5를 따르십시오.
- 일단 부, 이소프로판올의 얇은 층으로 겔을 오버레이하여 겔을 30 분 동안 중합 할 수있다. 이 기간 동안, 네이티브 해결 버퍼에 신선한 5 % 아크릴 아마이드 겔 용액을 준비합니다. 젤 세트 후, 아이소 프로필 알코올을 부어 물총 병에서 탈 이온수로 겔의 상단을 씻어.
- 상기 제조 한 5 % 겔 용액 (정확히 같은 4.1.3에 기재되어 있음)과 황산 암모늄을 추가 한 유리판가 가득 할 때까지 중합 된 겔 위에 붓는다. 젤 빗를 삽입합니다. 오버레이 젤은 추가로 30 분 동안 중합하도록 허용합니다.
- 겔 중합되면, 전기 영동 장치에 겔 카세트를 조립한다. 또한, 사용할 준비가 될 때까지 젖은 종이 타월 및 플라스틱 랩에 싸서 4 ºC에서 젤을 저장합니다.
- 일단 비 변성 PAGE 젤 ELEC에 조립영동 장치는 10 배 네이티브 실행 버퍼 재고 신선한 준비 1X 기본 실행 버퍼 탱크를 채우십시오.
- 각 웰 유리 주사기를 사용으로, (3)의 단부에서 얻어진 정제 된 단백질 10 μg의로드.
- 웰 중 하나에 (1X 네이티브 실행 완충액에 희석 된) 고 분자량 천연 단백질 표준로드 2 μL.
- (- 4.5 시간 약 4) 55 V, 4 ºC에서 젤을 실행 염료 전면 겔을 실행 할 때까지.
- 비 변성 겔뿐만 아니라, 표준 SDS-PAGE (22)에 의해 정제 된 단백질의 분취 량을 분석한다.
- 1X의 최종 농도로 5 배 SDS 샘플 완충액 (3)의 단부에서 얻어진 정제 된 단백질 샘플의 분취 량 (10 μg의)를 섞는다.
- 5 분 동안 100 ºC에서 품어 12 표준 % 및 / 또는 15 % SDS-PAGE 젤 (22)에로드합니다.
- 20 분 동안 80V에서 실행하고 염료 전면 겔 (도망 때까지 120 V에서이 약의 추가이다itional 12 % 겔 75 분, 및 15 % 겔을 120 분).
5. 떠올리 활동 및 단백질 염색법.
- 전기 신중 별도의 유리판에 이어 탈 이온수 50 ㎖를 함유하는 겔 트레이에 비 변성 겔 옮긴다. 부드러운 5 분 동안 흔들와 젤을 씻어. 물을 버리고이 세척 단계를 세 번 반복한다.
- 다음과 같이 기판 오버레이 분석을 수행합니다.
- 형광 펩타이드 기질 SUC-LLVY-AMC를 포함하는 버퍼를 개발의 1 mL를 넣고 겔에 걸쳐 균일하게 확산. 30 분 37 ºC에서 품어.
주 : 유리로드 또는 겔 릴리 (별도의 유리판, 플라스틱에 사용되는 작은 쐐기)는 겔상의 액체를 확산하는데 사용될 수있다. - 조심 의한 절단 된 펩티드 기질에 겔 촬상 시스템의 UV transilluminator가 겔 상으로 전송 및 형광을 관찰한다. 기록 이미지입니다. 조심스럽게 겔 바 전송겔 트레이 (CK).
- 부드럽게 흔들 5 분 동안 탈 이온수 50 mL로 두 번 씻어 겔.
- 부드럽게 흔들 60 분 동안 콜로이드 쿠마시 염색 용 시약을 10 mL로 젤을 염색. 배경까지 50 mL의 물 Destain 젤은 분명해진다. 이 염색 공정뿐만 아니라 표준 SDS-PAGE 겔에 적용된다.
- 형광 펩타이드 기질 SUC-LLVY-AMC를 포함하는 버퍼를 개발의 1 mL를 넣고 겔에 걸쳐 균일하게 확산. 30 분 37 ºC에서 품어.
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Representative Results
α 서브 유닛이 형태 링 (9)에 결합하면 프로 테아 좀 어셈블리 (그림 1) 시작합니다. C는 말단 헥사 히스티딘은 (그의 태깅) 유도체 (표 1) 태그로서 호열 Methanococcus maripaludis S2에서 α 서브 유닛을 대장균에서 발현되는 경우가 설명 될 수있다. 재조합-α 단백질 자신의 페이지를 비 변성하여 ICAR 그래피 분석 한 결과, 두 개의 밴드 (도 2A, 레인 1)을 관찰 하였다. 우리는 이전에이 싱글 α 링 (SR) 및 더블 α-링 (DR) (18)에 대응 증명하고있다. 재해 복구 이후 조립 9,18에 대한 생산되지 않는 막 다른 종입니다.
α-그의 경우 서브 유닛은 재조합 고세균 프로 테아 좀의 어셈블리가 670 kDa의 크기 스탠드 근처에 이주, 새로운 종을 관찰 분석되고있는 일반적인 방법을 나타내는 β 서브 유닛과 동시 발현되었다ARD (도 2A, 레인 3). 이 종은 (그림 2B, 레인 3) 단백질 가수 분해 활성이었고, 그 propeptides (그림 2C, 레인 3)이 제거 된 경우에만 완전히 성숙한 β 서브 유닛 (mβ)를 포함. 이 종은 완전히 성숙 CP입니다. 이 샘플은 SR 중간 알려진 어셈블리이기 때문에 예상 된 일부 SR 종, 있지만 DR 종을 포함. DR의 부족은 α-그 때 β 서브 유닛이 동시 발현하는 것은 올바른 어셈블리 β 서브 유닛의 결합은 DR의 비생산적인 형성을 outcompete 수 있었다 충분히 빨리 이러한 발생 (더 자세한 분석을 위해 18 참조)되었음을 의미한다.
동시 발현 방법의 한계를 보여주는 및 결합 방법의 유용성에 대해 논의하기는 α-β 서브 유닛 및 그의 대장균 별도로 표현 하였다. 용해 후, 가용성 분획을 혼합하고, 단백질은 종래에 의해 정제 하였다 ICAR비 변성 PAGE에 의해 분석. 완전 기능 프로 테아도 해물 혼합 방법 (도 2a 및도 2b를 참조하면, 레인 2)를 통해 생성 된 예상대로 SR 종 관찰 하였다. 샘플을 혼합 해물의 DR 종의 재현은, β 서브 유닛은 가역적를 분해 할 수없는 한 번 형성을 나타냅니다; 이는 DR의 막 다른 성격을 강조한다. 흥미롭게도, 새로운 종은 또한 단지 ( "반"이라고)가 CP 아래 마이그레이션, 해물 혼합 샘플에서 나타났다. 최근에, 우리는이 종은 18 (7 β 7 α) 반 프로 테아 좀에 해당하는 것으로 나타났다. 여기서이를 설명하기 위해, β 소 단위체 돌연변이 (R166W)를 사용 하였다. 이 돌연변이는 손상 반 프로 테아 이량 (18)로 이어지는, β-β 링의 상호 작용을 방해. 반 프로 테아가 CP에 직접적인 전구체되기 때문에, R166W 돌연변이 반 프로 테아 좀의 모두 축적으로 이어질한다CP 형성에 다 감소. 분해물 및 그의 α-β (R166W) 서브 유닛과 혼합하면 CP의 낮은 수준과 "절반"종의 증가 된 레벨은 (도 2A, 레인 4) 관찰하여 수행 하였다. 이 두 밴드에 대한 전구체 생성물 관계와 일치하고, 반 테아로서 "절반"종의 신원을 확인한다. 돌연변이 샘플 (레인 2 대 레인 4)에서 반 - 프로 테아 좀의 약간 빠른 이동으로 인해 β 서브 유닛의 전하 대 질량비를 변경 R166W 돌연변이 가능성이있다.
세포 내부의 높은 단백질 농도에 비해 파쇄 혼련시 반 테아 시각화하는 능력은 용 해물의 훨씬 낮은 단백질 농도에 주로 기인한다. 낮은 농도는 더 많은 인구 때문에 검출 될 중간체 수 있습니다 덜 효율적 (즉 느리게) 조립, 초래한다. 반 테아의 모양 외에, 추가적인 관찰 해물 혼합 동안 감소 조립 효율을 강조한다 : 그 propeptides 유지되지 않은 β 서브 유닛은, (proβ) 검출된다. 프로 펩티드 처리 반 프로 테아 좀의 이량까지 발생하지 않기 때문에, 미숙 proβ 형태의 외관은 반 테아 퇴적 레벨 (도 2C, 레인 4 대 2 레인 대 레인 3과 비교)과 상관. R166W 돌연변이의 경우, 용 해물 혼합시 프로 펩티드 처리 실패 CP 소량 형태 않더라도 절대. 프로 펩티드 처리뿐만 아니라 반 프로 테아 이량 필요하지만, 또한 R166W 돌연변이가 제대로 형성 β-β 링 인터페이스 (23) 여유가되지 않는 때문이다. 이 재조합 테아 조립체에 관한 해물로 혼합 대 동시 발현에 대한 상세한 서술은 여기 18 찾을 수있다.
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그림 1 : 코어 입자 (CP) 어셈블리의 단순화 된 도식.
α 서브 유닛은 β 서브 유닛의 결합에 대한 템플릿 역할을하는 하나의 α-링 첫 번째 (SR)로 조합 할 수 있습니다. 이것은 신속 dimerizes 반 테아 중간체 (반)의 발생을 이끈다. 이량와 동시, (도시하지 않음)를 β 서브 유닛의 propeptides은 자기 촉매 기능을 제대로 갖춘 코어 입자 (CP)에 상승을 제공 제거됩니다. 더블 α 링 (DR)는 SR에서 발생하고 CP에 조립 능력이 없습니다 수 있습니다. 이들의 형성은 생산 조립 이벤트 (실선 화살표)과는 대조적으로 비생산적인 조립 경로 (점선 화살표)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 시금 프로 테아 어셈블리에 대한 결합 접근.
동시 발현 (C)과 해물 혼합 (L)은 호열 M. maripaludis에서 재조합 프로 테아 좀의 조립을 연구하기 위해 사용되었다. 단백질 고정화 코발트 선호도 수지 (ICAR)로 정제 하였다. 10 % 구배 겔 - (A, B)으로 정제 된 단백질 (10 μg의)는 비 변성 (5) 상에 로딩 하였다. 전기 영동 후에, 펩 티다 제 활성을 형광 펩티드 기질을 함유하는 완충액으로 겔을 중첩하여 시각화 하였다 SUC-LLVY-AMC (B) 콜로이드 쿠마시 염색 용 시약 (A)로 겔을 염색 전에. 블랙 화살촉은 조립 20S 코어 입자 (CP), 반 프로 테아 중간 (반)을 두 번 α 링 (DR) 및 단일 α-링 (SR)의 위치를 나타낸다. (kDa의에서) 여러 분자 크기 표준의 이동은 오른쪽에 표시됩니다. (기음) A로부터 g> 정제 된 단백질 (10 μg의)도 15 % SDS-PAGE 젤에 로딩 하였다. 전기 영동 후, 겔은 콜로이드 쿠마시 염색 용 시약으로 염색 하였다. α-자신의 서브 유닛과 완전히 성숙 (mβ)와 미숙 (proβ) β 서브 유닛의 마이그레이션이 표시됩니다. 25 kDa의 분자 크기 표준의 위치는 오른쪽에 표시됩니다. 별표 용해시 비특이적 단백질 분해에 의한 절단 α-자신의 서브 유닛 단편을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라스미드 | 유전자형 | 출처 |
| AKB191 | pET42 PSMA-그의 | Kusmierczyk 등., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA-그의 PSMB | Kusmierczyk 등., (2011) |
| AKB946 | pET42 PSMB | Panfair 등., (2015) |
| AKB952 | pET42 PSMB (R166W) | Panfair 등., (2015) |
표 1 :이 연구에서 사용 된 박테리아 플라스미드. PSMA는 고세균 α 소단위 유전자와 PSMB는 고세균 β 소단위 유전자이다.
| 완충액 A | 의 50 mM HEPES-NaOH를, pH가 7.5, 300 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2. | 버퍼 B, C 및 E, 완충액 A 함유 이미 다졸 유도체이다. 2 M 재고 물에 준비하고 어둠에 저장된에서 이미 다졸을 추가하는 데 유용합니다. |
| 기본 해결 버퍼 | 375 mM 트리스 - 염산, pH가 8.8, 0.1 % (v / v)의 테트라에틸렌 디아민 (TEMED) 및 0.1 % (W / V) 암모늄 Perulfate (APS). | 중합과 얼음에 보관하는 젤이되기 전에 한 시간보다 더 신선한 준비합니다. 네이티브 해결 버퍼에서 아크릴 아마이드 겔 용액을 제조 할 때, 4 배 스톡 (1.5 M 트리스 -HCl, pH를 8.8)에서 트리스 - 염산을 추가하는 것이 유용하다. APS의 중합 직전에 추가됩니다. |
| 기본 실행 버퍼 10X 재고 | 250 mM 트리스는 1.92 M 글리신, pH를 조정하지 않습니다. | |
| 5 배 기본 샘플 버퍼 | 0.5 M 트리스 -HCl pH 8.8, 50 % (v / v) 글리세롤, 브로 모 페놀 블루 흔적. | 트레이스는 보통 몇 마리 주걱 통해 전송 매우 작은 양을 의미한다. |
| 5X SDS 샘플 완충액 | 0.3 M 트리스 -HCl, pH가 6.8, 600 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 10 % (W / V) SDS, 50 % (V / V) 글리세롤 및 브로 모 페놀 블루 흔적. | 트레이스는 보통 몇 마리 주걱 통해 전송 미량을 말한다. |
| 개발 버퍼 | 에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM의의 MgCl 2, 1 mM의 ATP, 50 mM의 SUC-LLVY-AMC. | SUC-LLVY-AMC는 프로 테아 솜 활성을 분석하기 위해 사용되는 형광 펩타이드 기질이다. |
표 2 : 솔루션, 미디어 및 버퍼는이 연구에 사용 하였다.
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Discussion
우리는 재조합 고세균 프로 테아 좀을 이용하여 비 변성 PAGE를 테아 조립체 분석에 결합 방법의 이점을 보여준다. 프로 테아 서브 유닛의 박테리아 동시 발현의 일반적인 방법 9,11 신속한 분석이 가능하지만 키 어셈블리 중간체를 공개하지 않을 수 있습니다. 우리 조립체 이벤트의 더 넓은 영상을 개발하는 혼합 용 해물과 동시 발현을 조합 한 제안.
이러한 결합 접근법의 장점은 별도의 α 발현을 요구하고 해물 믹싱 β 서브 유닛에도 불구하고, 여전히 비교적 노동 친화적이라는 것이다. 하나가 각각의 단백질의 대등 일관된 발현 수준을 보장하는 경우는 반 정량적 결과 일 수있다. 이를 위해 파쇄 혼합 전에 발현 된 단백질의 대등 한 수준의 허용 조건을 결정하기 위해, 재조합 단백질 발현의 일반적인 최적화를 수행 바랍니다. 최적화 유도 팀을 변경 포함 할 수 있습니다즉, 온도 감응 유도 박테리아 발현 균주에서 광학 밀도 등, 가용성 단백질의 목적하는 수준까지 달성된다. 종종 돌연변이 유사한 발현 수준을 나타낼 수 있기 때문에 단백질의 변이체 및 WT 버전을 비교하지만, 용해도가 감소하는 경우에 특히 중요하다. 또한 이전에 비 변성 PAGE 로딩에 ICAR 정제 샘플의 단백질 농도를 결정하는 중요성을 강조. 비록 위의 식 최적화 및 병렬 샘플을 동일한 방법으로 정제 단계를 통해 처리되도록 취해진 가장주의, 분산 여전히 의도 도입 될 수있다. 농도 측정은 총 단백질의 동일한 양이 아니라 샘플 당 로딩되는 것을 보장한다. 이 종은보다 의미있는 마이그레이션 주어진에 대한 밴드 강도의 차선으로 차선을 비교한다.
단백질 발현을 비교하고 일관된 레벨 lysa 달성 될 수 없다면테 혼합, 사람은 항상 사전에 모든 구성 요소를 정화하고 순수한 단백질과 실험을 혼합 수행 할 수 있습니다. 이것은보다 정확한 단백질 결정을 허용하는 장점을 가지며, 따라서, 어프로치 정량한다. 그러나, 완전 정제 결점은 프로세스가 여러 돌연변이를 동시에 18의 신속한 분석을 방해 할 수 집중 상당히 노동,가되도록한다. 언급 할 가치가 마지막으로주의해야 할 점은 때때로 α의 발현을 분리 β 서브 유닛이 가능하지 않을 수 있다는 것이다. 돌연변이 자체에 표시 할 때 대장균에 불용성이 될 수있는 서브 유닛이 발생하지만 돌연변이가 그 결합 파트너로 표현 될 때 용해도가 회복 할 수 있습니다 경우에 발생할 수 있습니다. 이 경우, 그것은 단지 동시 발현하는 분석을 제한합니다. 그러나, 이것은 일반적으로 재조합 단백질 발현 중에 발생할 수있는 경고이며 고세균 테아 서브 유닛 (24, 25)에 고유하지 않다.
우리는 세대에 선택ICAR 수지의 정제의 용이성과 경제성으로 인해 우리의 프로 테아 좀 단백질의 자신의 태그가 파생 상품을 생이. 기타 에피토프 태그 항체 기반 정제 포함한 가능하며 우리는 성공적 표명하고 테아 단위체 정제 플래그 - 태그 버전 (도시하지 않음). 균질성 (또는 생산 규모의 증가)에 정제가 필요한 경우, 그의 태그 된 버전은 그렇게하는 가장 신속하고 비용 효율적인 수단을 제공한다.
이 결과는 재조합 단백질을 얻을하는 주어, 생체 내 관찰로 추적 할 때 의미를 더 얻게 될 것이다, 그들은 고세균 또는 박테리아에서 생산 진핵 세포 단백질합니다. 그러나, 생체 내 접근법은 항상 실험적으로 즉시 액세스 할 수 없습니다. 연구의 대상이 클 때, 같은 프로 테아로 복잡한 multisubunit 특히 사실이다. 재조합 단백질은 futu을위한 중요한 시작 지점을 제공 접근실험을 다시. 프로 테아 좀의 경우, 비 변성 PAGE와 재조합 고세균 프로 테아 생산을 페어링하는 고세균과 진핵 생물 종 9,11,12,18 사이에 공유하는 프로 테아 좀 어셈블리의 주요 기능을 해명하는데 매우 효과적이 될 것. 이러한 접근은 다른 대형 multiprotein 복합체의 조립체를 연구하는데 유용 할 것으로 보인다. 최근에는 프로 테아 고세균 하나 이상의 통로를 통해 조립할 수 있고, 그 α 링들은 18 것으로 생각되었다 어셈블리 동안 의무적 중간체 아니라는 것을 보여주기 위해이 전략을 이용했다. 동일한 진핵 프로 테아도 마찬가지 경우 결정될 남아있다.
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Acknowledgments
이 작품은 ARK로, 미국 심장 협회 14GRNT20390154에서 수상에 의해 부분적으로 인디애나 대학교 - 퍼듀 대학교 인디애나 폴리스에서 연구 지원 기금 그랜트 (RSFG)에 의해 부분적으로 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
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