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Biochemistry

एक संयुक्त दृष्टिकोण के लिए प्रकरण: संयोजक अर्चेअल Proteasomes और Nondenaturing पेज के साथ Proteasome विधानसभा की जांच

Published: December 17, 2016 doi: 10.3791/54860
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

Summary

इस प्रोटोकॉल दोनों सबयूनिट Coexpression और postlysis सबयूनिट पुनः संयोजक एंटीबॉडी विधानसभा का एक और अधिक पूरी तरह से परीक्षा के लिए मिश्रण का उपयोग करता है।

Abstract

Proteasomes जीवन के सभी क्षेत्रों में पाए जाते हैं। वे eukaryotes में intracellular प्रोटीन गिरावट का प्रमुख मार्ग प्रदान करते हैं, हालांकि उनके विधानसभा पूरी तरह से समझ नहीं है। सभी proteasomes, एक संरचनात्मक रूप से संरक्षित कोर कण (सीपी), या 20S एंटीबॉडी शामिल दो heptameric β सबयूनिट दो heptameric α सबयूनिट के छल्ले के बीच sandwiched छल्ले हैं। अर्चेअल 20S proteasomes उनकी यूकेरियोटिक समकक्षों की तुलना में compositionally सरल कर रहे हैं, फिर भी वे दोनों एक आम विधानसभा तंत्र का हिस्सा है। नतीजतन, अर्चेअल 20S proteasomes यूकेरियोटिक एंटीबॉडी विधानसभा के लिए महत्वपूर्ण मॉडल होना जारी है। विशेष रूप से, अर्चेअल 20S nondenaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) के साथ मिलकर proteasomes की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति एंटीबॉडी जीवजनन में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त हुए है। यहाँ, हम अर्चेअल एंटीबॉडी α के Coexpression के सामान्य रणनीति पर सुधार करने के लिए एक साधन के बारे में चर्चा और nondenaturi को बीटा सब यूनिटों से पहलेएनजी पृष्ठ। हम जानते हैं कि हालांकि तेजी से और कुशल, एक Coexpression अकेले दृष्टिकोण महत्वपूर्ण विधानसभा मध्यवर्ती याद कर सकते हैं प्रदर्शित करता है। एंटीबॉडी के मामले में, Coexpression आधा एंटीबॉडी का पता लगाने, एक मध्यवर्ती युक्त एक पूरा α अंगूठी और एक पूरा β-अंगूठी अनुमति नहीं हो सकती। हालांकि, इस मध्यवर्ती आसानी से lysate मिश्रण के माध्यम से पता चला है। हमारा सुझाव है कि lysate मिश्रण के साथ Coexpression संयोजन एक दृष्टिकोण है कि विधानसभा का विश्लेषण करने में और अधिक गहन है पैदावार, अभी तक श्रम nonintensive बनी हुई है। यह दृष्टिकोण अन्य पुनः संयोजक multiprotein परिसरों के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है।

Introduction

Multiprotein परिसरों कई महत्वपूर्ण सेलुलर गतिविधियों 1 बाहर ले। इन परिसरों से कई के लिए, बहुत अधिक उनके विधानसभा 2,3 के बारे में की तुलना में उनकी संरचना और समारोह के बारे में जाना जाता है। एंटीबॉडी एक ऐसी जटिल है और जीवन के सभी क्षेत्रों में पाया जाता है। Eukaryotes में, यह आणविक मशीन Ubiquitin / Proteasome प्रणाली (यूपीएस) के मूल में है और intracellular प्रोटीन गिरावट 4 के प्रमुख मार्ग प्रदान करता है। यूकेरियोटिक एंटीबॉडी (26S एंटीबॉडी के रूप में) के दो प्रमुख उप असेंबलियों के शामिल है: एक 20S एंटीबॉडी, या कोर कण (सीपी) 5, कि एक 19S नियामक कण (आरपी) 6 से एक या दोनों सिरों पर छाया हुआ जा सकता है।

20S एंटीबॉडी एक बड़ी बंटे प्रोटीज है। इसके चतुर्धातुक संरचना पूरी तरह से जीवन के सभी डोमेन में संरक्षित और चार से सात अंग का संरचनात्मक रूप से संबंधित सब यूनिटों के दो प्रकार युक्त छल्ले के एक ढेर के होते है, α; और 5,7,8 बीटा। eukaryotes में, दो बाहरी छल्ले प्रत्येक सात अलग α सब यूनिटों के शामिल हैं और दो भीतर के छल्ले प्रत्येक सात अलग β सब यूनिटों के शामिल हैं, प्रोटिओलिटिक गतिविधि β सब यूनिटों में से तीन के भीतर रहता है। इसके विपरीत, जीव और जीवाणु के सीपी के छल्ले आमतौर पर α का ही एक प्रकार है और β सबयूनिट का एक प्रकार के शामिल हैं। अर्चेअल proteasomes उनकी compositional सादगी और उनके समकक्षों उनकी यूकेरियोटिक 9-13 के साथ एक आम विधानसभा तंत्र को साझा करने के लिए दोनों के कारण एंटीबॉडी विधानसभा अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली प्रदान की है। संक्षेप में, α सब यूनिटों पहले α छल्ले में इकट्ठा है, जो एक पाड़ पर जो बीटा सब यूनिटों को इकट्ठा के रूप में सेवा करते हैं। जिसके परिणामस्वरूप आधा proteasomes (α 7 β 7) dimerize, जन्म देने के लिए पूरी तरह से सीपी (α 7 β 7 β 7 α 7) इकट्ठे करने के लिए। dimerization के दौरान, propeptides बीटा सब यूनिटों पर पेशautocatalytically हटा रहे हैं, उत्प्रेरक एन टर्मिनल threonines उजागर। अर्चेअल proteasomes के उपयोग के विधानसभा मॉडल करने के लिए अक्सर कोलाई में पुनः संयोजक अर्चेअल एंटीबॉडी प्रोटीन के उत्पादन का लाभ लेता है। यह एक सार्थक दृष्टिकोण है, क्योंकि यह सब यूनिटों विभिन्न संयोजनों में उत्पादित करने के लिए सक्षम बनाता है, दोनों WT और उत्परिवर्ती संस्करणों के रूप में, एक मेजबान जीव है कि अपनी ही proteasomes का उत्पादन नहीं करता है।

बहु-प्रोटीन परिसरों की विधानसभा निगरानी biochemically विभाजन तरीका है कि विधानसभा मध्यवर्ती और व्यापारियों से पूरी तरह से इकट्ठे परिसरों को अलग से किसी तरह की आवश्यकता है। अपनी बेहतर हल करने की क्षमता है, nondenaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) के कारण विभिन्न बड़े multiprotein परिसरों 14-17 के विभाजन में विशेष रूप से उपयोगी साबित हो गया है। पुनः संयोजक अर्चेअल एंटीबॉडी उत्पादन और nondenaturing पेज के संयोजन dissectin में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन गया हैजी एंटीबॉडी विधानसभा 9,11,12,18। हालांकि, सामान्य विधि है जिसके द्वारा इस दृष्टिकोण लागू किया जाता है (यानी। Α और β सब यूनिटों की पुनः संयोजक Coexpression के माध्यम से) एक महत्वपूर्ण खामी है। विधानसभा प्रतिक्रियाओं सहकारी और दृढ़ता से एकाग्रता पर निर्भर 3 रहे हैं। यह देखते हुए कि प्रोटीन एकाग्रता कोशिकाओं के अंदर बाहर रखा मात्रा प्रभाव की वजह से, बहुत अधिक 19 है, विधानसभा प्रतिक्रियाओं विवो में तेजी से आगे बढ़ें। इसलिए यह महत्वपूर्ण विधानसभा मध्यवर्ती याद आती है जब α और β सब यूनिटों coexpressed कर रहे हैं संभव है।

यहाँ, हम पुनः संयोजक अर्चेअल एंटीबॉडी सब यूनिटों का उपयोग कर एंटीबॉडी विधानसभा के अध्ययन में एक संयुक्त दृष्टिकोण के लिए तर्क है। इस दृष्टिकोण में, दोनों Coexpression और lysate मिश्रण तरीकों कार्यरत हैं। क्योंकि Coexpression कम श्रम गहन पूर्व विधानसभा के तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध α और β सब यूनिटों, मिश्रण द्वारा पीछा अलग अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। इस requi हालांकिres Coexpression की तुलना में थोड़ा और अधिक प्रयास, इसके लिए मुआवजा की तुलना में अधिक मध्यवर्ती कि Coexpression के दौरान याद कर रहे हैं पता लगाने की क्षमता से है। साथ में, इन दो तरीकों एंटीबॉडी विधानसभा की एक और पूरी तस्वीर प्रदान कर सकते हैं।

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Protocol

1. बैक्टीरियल अभिव्यक्ति।

नोट: अभिव्यक्ति इस अध्ययन में इस्तेमाल plasmids तालिका 1 में वर्णित हैं। समाधान, मीडिया, और buffers इस अध्ययन में इस्तेमाल तालिका 2 में वर्णित हैं। अर्चेअल एंटीबॉडी सबयूनिट जीन की क्लोनिंग और अभिव्यक्ति plasmids की पीढ़ी कहीं और 18,20 वर्णित हैं। संक्षेप में, सब यूनिटों की पुनः संयोजक Coexpression के लिए plasmids एक bicistronic operon रणनीति है जो अलग-अलग यूनिटों 18,20 के तुलनीय अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने में मदद करता है रोजगार। नीचे सूचीबद्ध अभिव्यक्ति मापदंडों के अनुभव से इस अध्ययन में एंटीबॉडी सब यूनिटों के लिए इष्टतम होने के लिए निर्धारित थे। यह proteasomes अन्य अर्चेअल प्रजातियों से, या अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन परिसरों (चर्चा देखने के लिए) के लिए के लिए अन्य एंटीबॉडी म्यूटेंट के लिए अभिव्यक्ति का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

  1. (रासायनिक सक्षम कोलाई BL21 में ब्याज की अभिव्यक्ति प्लाज्मिड रूपांतरणDE3) कोशिकाओं।
  2. प्लाज्मिड के 2 μL (आमतौर पर 50 - - 100 एनजी) DE3 कोशिकाओं के एक विभाज्य है कि हाल में बर्फ पर thawed थे करने के लिए, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते करने के लिए जारी 1 जोड़ें।
  3. गर्मी झटका 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं और additionl 2 मिनट के लिए बर्फ पर लौटने ट्यूब।
  4. लेग माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और 1 घंटे के लिए मिलाते (150 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. लेग कान प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण के 200 μL (ठोस लेग मीडिया, केनामाइसिन के साथ पूरक युक्त प्लेट (इस एंटीबायोटिक के लिए इस अध्ययन सांकेतिक शब्दों में प्रतिरोध में प्रयुक्त सभी plasmids)) - 100 बिखरा हुआ है। 37 डिग्री सेल्सियस हे / एन प्लेटें सेते हैं।
  6. अगली सुबह, एक गिलास संस्कृति ट्यूब में तरल लेग कान मीडिया के 3 एमएल में लेग कान की थाली से एक भी कॉलोनी टीका लगाना। लगभग 2.5 के लिए मिलाते (150 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं - 3 घंटे, या जब तक मैलापन मनाया जाता है।
  7. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 600 एनएम (600 आयुध डिपो) में संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापने। सेल पंथ पतला6 एमएल के अंतिम मात्रा में 0.4 के एक आयुध डिपो से 600 prewarmed लेग कान मीडिया का एक उचित मात्रा के साथ Ure। 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए फिर से शुरू।
  8. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक शेयर के समाधान से IPTG जोड़कर तरल संस्कृतियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित। 7 h - लगभग 6 के लिए मिलाते (150 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  9. 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में अपनी संपूर्णता में बैक्टीरिया कोशिका संस्कृतियों हार्वेस्ट।
  10. एक संस्कृति के 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जोड़ें। 1 मिनट के लिए 10,000 × छ पर अपकेंद्रित्र।
  11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और गोली के लिए एक ही संस्कृति का एक और 1.5 एमएल जोड़ें। 1 मिनट के लिए 10,000 × छ पर अपकेंद्रित्र।
  12. पूरी संस्कृति जब तक दोहराएँ कदम 1.11 microcentrifuge ट्यूब में काटा जाता है।
  13. -80 डिग्री सेल्सियस तक सेल में प्रेरित छर्रों स्टोर।

2. बैक्टीरियल Lysis और Lysate मिश्रण।

ध्यान दें: (यानी यह पुष्टि है कि प्रोटीन व्यक्त की और घुलनशील गया था) प्रदान करता है। इस प्रकार, हम अत्यधिक शुरू में टीएसपी विश्लेषण सहित सलाह देते हैं। एक बार एक इष्टतम प्रोटोकॉल एक विशेष सबयूनिट संयोजन के लिए हासिल किया गया है, टीएसपी विश्लेषण कड़ाई से जरूरी है यही वजह है कि इसे नीचे वैकल्पिक के रूप में वर्णन किया गया है।

  1. बैक्टीरियल कोशिकाओं और घुलनशील अंशों की तैयारी के lysis।
    1. 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्रेरित सेल गोली गला लें। lysis बफर के 600 μL में गोली Resuspend।
    2. उद्योग जगत30 मिनट के लिए मिलाते (150 आरपीएम) कुल कच्चे lysate उत्पन्न करने के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन Ubate।
      नोट: निम्न कदम और उपधारा है कि इस प्रकार वैकल्पिक हैं।
    3. अलग 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कुल कच्चे lysate से दो 25 μL aliquots निकालें और इस प्रकार के रूप टीएसपी विश्लेषण के लिए बाहर ले।
      1. दो 25 μL aliquots में से एक के लिए, 1x के अंतिम एकाग्रता के लिए 5X एसडीएस नमूना बफर जोड़ें। "कुल कच्चे lysate" के लिए "टी" के साथ ट्यूब लेबल।
      2. 100 डिग्री सेल्सियस पर "टी" नमूना सेते के लिए 5 मिनट के लिए पूरी तरह से प्रोटीन denature करने के लिए।
      3. इस बीच, दूसरी 25 μL विभाज्य ले और 10 मिनट के लिए 10,000 × छ पर यह अपकेंद्रित्र। ध्यान से छोटे गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटाने, और एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण। इस नए ट्यूब "एस" "घुलनशील अंश" के लिए लेबल।
      4. छोटे गोली छोड़ दिया करने के लिए behiएन डी पिछले चरण में, resuspend करने के लिए lysis बफर और भंवर के 25 μL जोड़ें। "गोली अंश" के लिए इस ट्यूब "पी" लेबल।
      5. "एस" और "पी" ट्यूबों के लिए 6 5X की μL एसडीएस नमूना बफर जोड़ें और ऊपर वर्णित के रूप में 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
        नोट: टीएसपी के नमूने उस दिन से इस्तेमाल नहीं किया जाएगा, तो अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, वे -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है जब तक की जरूरत है। एक बार thawed, वे ऊपर के रूप में एक 12% और / या 15% मानक एसडीएस पृष्ठ जेल पर वर्णित है, तुरंत लोड करने से पहले 100 डिग्री सेल्सियस पर reincubated किया जाना चाहिए।
    4. टीएसपी विश्लेषण किया जाता है, वहीं सेंट्रीफ्यूज कुल कच्चे lysate की शेष 550 μL 10,000 × छ पर 10 मिनट के लिए (या कुल कच्चे lysate के पूरे 600 μL यदि टीएसपी विश्लेषण से बाहर नहीं किया जाता है)। एक ताजा 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए। यह घुलनशील lysate कि शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. Lysate मिश्रण।
    1. कदम 2.1.1 और 2.1.2 ऊपर वर्णित के रूप में सेल बाहर ले।
    2. वांछित β सबयूनिट व्यक्त बैक्टीरिया से कुल कच्चे lysate के 600 μL के साथ वांछित α सबयूनिट व्यक्त बैक्टीरिया से कुल कच्चे lysate के 600 μL मिक्स। धीमी गति से 30 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: यह (चर्चा देखें) lysate मिश्रण के दौरान अधिकतम विधानसभा प्राप्त करने के लिए ऊष्मायन समय का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। समय और यहाँ प्रस्तुत तापमान इस अध्ययन में पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए अधिक उपयोगी हैं और कहीं और 18 निर्धारित किया गया है।
    3. अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 10,000 × छ पर मिश्रित lysate अघुलनशील गोली से घुलनशील सामग्री को अलग करने के लिए। एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। प्रोटीन शुद्धि के लिए इस मिश्रित घुलनशील lysate का प्रयोग करें।

3. स्थिर कोबाल्ट आत्मीयता राल के माध्यम से प्रोटीन शुद्धीकरण(आईसीएआर)।

  1. राल संतुलित करना।
    1. अच्छी तरह से बोतल inverting द्वारा राल resuspend और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब घोल के 50 μL हस्तांतरण। पर गोली राल के लिए 2 मिनट के लिए 700 × छ अपकेंद्रित्र। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate।
      नोट: हम एक नीले रंग की 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग तरल के थोक दूर करने के लिए पिपेट आकांक्षा बाहर ले। एक सफेद 2 μL टिप शेष सतह पर तैरनेवाला को हटाने के ठीक नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है, तरल मोती को कवर करने के लिए एक बहुत ही पतली परत को छोड़कर।
    2. 1 बफर ए मिक्स के एमएल जोड़ें धीरे 2 मिनट के लिए 700 × छ राल और सेंट्रीफ्यूज resuspend करने के लिए राल गोली। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
  2. लागू equilibrated राल के लिए खंड 2.1 या 2.2 में पहले से प्राप्त घुलनशील lysate। 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रोटेशन के साथ ट्यूब सेते हैं। 700 × पर ट्यूब अपकेंद्रित्र जी </ Em> 5 मिनट के लिए और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  3. राल धोने के रूप में nonspecifically बाध्य प्रोटीन को हटाने के लिए इस प्रकार है।
    1. बफर के 1 एमएल और साथ Resuspend राल कोमल 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ सेते हैं। 5 मिनट के लिए 700 × छ ट्यूब अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate। इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
    2. बफर बी के 1 एमएल (5 मिमी Imidazole साथ बफर ए) के साथ Resuspend राल और कोमल 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ सेते हैं। 5 मिनट के लिए 700 × छ ट्यूब अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate। इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
    3. बफर सी के 1 एमएल (10 मिमी Imidazole साथ बफर ए) के साथ Resuspend राल और कोमल 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ सेते हैं। 5 मिनट के लिए 700 × छ ट्यूब अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  4. (200 मिमी Imidazole साथ बफर ए) 400 बफर ई के μL जोड़कर प्रोटीन Elute टीओ राल। कोमल 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ सेते हैं। पर 5 मिनट के लिए 700 × छ अपकेंद्रित्र।
  5. एक नया 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब शुद्ध प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  6. इस प्रकार के रूप सीरियल centrifugation द्वारा शुद्ध प्रोटीन फीका बनाना।
    1. शुद्ध प्रोटीन के 400 μL करने के लिए, 100 μL बफर जोड़ने (यह 160 मिमी से 200 मिमी से Imidazole एकाग्रता कम कर देता है)। एक 10 केडीए आणविक वजन कट ऑफ के साथ 0.5 एमएल ultracentrifugal फिल्टर करने के लिए शुद्ध प्रोटीन को लागू करें। पर 5 मिनट के लिए 14,000 × छ अपकेंद्रित्र।
    2. छानना त्यागें और फिर retentate और सेंट्रीफ्यूज को कमजोर करने के लिए 400 μL बफर जोड़ें। centrifugation / कमजोर पड़ने के चक्र जारी रखें जब तक imidazole एकाग्रता नीचे 4 मिमी गिर जाता है। एक उदाहरण के रूप में, यदि प्रत्येक centrifugation ~ 70 μl (या लगभग 7 गुना) करने के लिए नीचे 500 μl केंद्रित है, तो दो चक्र शुरू 160 मिमी imidazole एकाग्रता (7 × 7 = 49 गुना) APPR करने के लिए कम हो जाएगाoximately 3.3 मिमी।
    3. Desalted नमूना बीसीए परख 21 का उपयोग करने का प्रोटीन एकाग्रता उपाय।
      नोट: निर्माता के निर्देशों के रूप में वर्णित Desalting, बीसीए परख के लिए सहिष्णुता सीमा से नीचे Imidazole के स्तर को कम करने के लिए आवश्यक है। हमारी प्रयोगशाला, बीसीए परख पसंद करते हैं क्योंकि यह संवेदनशील है एक बड़ी गतिशील रेंज है, और बहुत कम प्रोटीन के लिए प्रोटीन बदलाव को दर्शाती है। हालांकि, अन्य तरीकों प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए बीसीए परख के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। कुंजी प्रत्येक विधि के फायदे और सीमाओं के बारे में पता किया जा रहा है।
  7. 1x के अंतिम एकाग्रता के लिए 5X मूल निवासी नमूना बफर जोड़ें और वैद्युतकणसंचलन करने के लिए आगे बढ़ें। वैकल्पिक रूप से, बाद में विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान नमूने हैं।

4. Nondenaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ)।

सावधानी: unpolymerized एक्रिलामाइड एक न्यूरोटॉक्सिन है। उचित सुरक्षात्मक GEA पहनेंआर।

  1. इस प्रकार के रूप nondenaturing पृष्ठ जेल तैयार करें।
    1. साफ कांच की प्लेट का उपयोग कर कास्टिंग और कास्टिंग स्टैंड के लिए जेल कैसेट तैयार करें। एक छोटे चुंबकीय उत्तेजक के शीर्ष पर ढाल निर्माता की जगह है और प्रत्येक कक्ष में एक छोटे से हलचल बार जगह है।
    2. 40% का उपयोग (डब्ल्यू / वी) एक्रिलामाइड और 2% (डब्ल्यू / वी) bisacrylamide स्टॉक समाधान, 5% और 10% तैयार (डब्ल्यू / वी) एक देशी हल करने के बफर में acrylamide जेल समाधान। सुनिश्चित करें कि कुल एक्रिलामाइड bisacrylamide के अनुपात 37.5: 1 है। बर्फ पर चिल डालने का कार्य करने से पहले।
      नोट: nondenaturing पृष्ठ यहाँ इस्तेमाल किया प्रणाली को अनिवार्य रूप Laemmli एसडीएस पृष्ठ प्रणाली के समान है, साथ एसडीएस 22 छोड़े गए।
    3. ((W / v) शेयर पानी में तैयार समाधान के लिए एक 10% से) एक्रिलामाइड समाधान करने के लिए अमोनियम persulfate जोड़े polymerization आरंभ करने के लिए। अमोनियम persulfate के अंतिम एकाग्रता 0.1% (w / v)।
    4. ढाल निर्माता के दो कक्षों में एक्रिलामाइड समाधान डालो। आउटलेट ट्यूबिंग डाला बी के साथetween जेल कैसेट की प्लेटें, चुंबकीय उत्तेजक को सक्रिय करने और ढाल निर्माता वाल्व खुला। 10% nondenaturing ढाल जेल - 5 डालो।
    5. एक बार डाला, isopropanol की एक पतली परत के साथ जेल ओवरले और जेल 30 मिनट के लिए भाजन करने के लिए अनुमति देते हैं। इस समय के दौरान, देशी हल करने के बफर में ताजा 5% acrylamide जेल समाधान तैयार है। जेल के डूबने के बाद, isopropanol बंद डालना और एक धार बोतल से विआयनीकृत पानी के साथ जेल के शीर्ष कुल्ला।
    6. 5% जेल से ऊपर तैयार समाधान करने के लिए, अमोनियम persulfate (बिल्कुल के रूप में वर्णित 4.1.3) जोड़ने और polymerized जेल के शीर्ष पर डालना जब तक गिलास प्लेट भरे हुए हैं। जेल कंघी डालें। मढ़ा जेल एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए भाजन करने की अनुमति दें।
    7. एक बार जेल polymerized है, वैद्युतकणसंचलन तंत्र में जेल कैसेट इकट्ठा। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल, उपयोग के लिए तैयार है जब तक सिक्त कागज तौलिए और प्लास्टिक की चादर में लिपटे दुकान।
  2. एक बार जब nondenaturing पृष्ठ जेल चुनाव में इकट्ठा किया हैtrophoresis तंत्र, एक 10X मूल निवासी चल बफर स्टॉक से नए सिरे से तैयार 1X मूल निवासी चल बफर के साथ टैंक को भरने।
  3. लोड 10 माइक्रोग्राम शुद्ध प्रोटीन की धारा 3 के अंत में प्राप्त की, प्रत्येक अच्छी तरह से एक गिलास सिरिंज का उपयोग करने में।
  4. लोड 2 उच्च आणविक भार मूल निवासी प्रोटीन मानक (1X मूल निवासी चल बफर में पतला) कुओं में से एक में की μL।
  5. (- 4.5 ज लगभग 4) 55 वी और 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल चला जब तक डाई सामने जेल से चलाता है।
  6. Nondenaturing जेल के अलावा, मानक एसडीएस पृष्ठ 22 से शुद्ध प्रोटीन की aliquots का विश्लेषण।
    1. 1x के अंतिम एकाग्रता के लिए शुद्ध प्रोटीन के नमूने, धारा 3 के अंत में प्राप्त की, 5X एसडीएस नमूना बफर के साथ की aliquots (10 माइक्रोग्राम) मिक्स।
    2. 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और मानक 12% और / या 15% एसडीएस पृष्ठ जैल 22 पर लोड।
    3. 20 मिनट के लिए 80V पर चलाने के लिए और उसके बाद 120 वी पर जब तक डाई सामने जेल (बंद चलाता है यह लगभग एक ऐड हैitional एक 12% जेल के लिए 75 मिनट, और एक 15% जेल के लिए 120 मिनट)।

5. Visualizing गतिविधि और प्रोटीन धुंधला हो जाना।

  1. वैद्युतकणसंचलन, ध्यान से अलग गिलास प्लेट के बाद और विआयनीकृत पानी की 50 एमएल युक्त एक जेल ट्रे को nondenaturing जेल हस्तांतरण। कोमल 5 मिनट के लिए कमाल के साथ जेल कुल्ला। पानी त्यागें और इस धोने कदम तीन बार दोहराएँ।
  2. इस प्रकार के रूप में सब्सट्रेट ओवरले परख प्रदर्शन।
    1. fluorogenic पेप्टाइड सब्सट्रेट Suc-LLVY-ए एम सी युक्त बफर के विकास के 1 एमएल जोड़ें और जेल पर समान रूप से फैला। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: एक गिलास छड़ी या एक जेल releaser (अलग गिलास प्लेट के लिए इस्तेमाल प्लास्टिक के छोटे कील) जेल से अधिक तरल प्रसार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. ध्यान से जेल इमेजिंग प्रणाली की यूवी transilluminator पर जेल हस्तांतरण और cleaved पेप्टाइड सब्सट्रेट के कारण प्रतिदीप्ति निरीक्षण करते हैं। रिकार्ड छवि। ध्यान से जेल बीए हस्तांतरणजेल ट्रे को सीके।
    3. कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के 50 एमएल के साथ दो बार जेल कुल्ला।
    4. कोमल कमाल के साथ 60 मिनट के लिए एक कोलाइडयन coomassie दाग अभिकर्मक के 10 एमएल के साथ जेल दाग। पृष्ठभूमि में जब तक 50 मिलीलीटर पानी Destain जेल स्पष्ट हो जाता है। यह धुंधला कदम मानक एसडीएस पृष्ठ जैल के रूप में अच्छी तरह से लागू होता है।

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Representative Results

Proteasome विधानसभा (चित्रा 1) शुरू होती है जब अल्फा सब यूनिटों प्रपत्र छल्ले 9 के लिए गठबंधन। यह जब archaeon Methanococcus maripaludis S2 से अल्फा सब यूनिटों ई कोलाई में व्यक्त कर रहे हैं के रूप में सी टर्मिनली hexahistidine टैग किए गए (उनकी टैग) डेरिवेटिव (तालिका 1) सचित्र जा सकता है। जब पुनः संयोजक α-उसकी प्रोटीन आईसीएआर द्वारा शुद्ध और पृष्ठ nondenaturing द्वारा विश्लेषण किया गया था, दो बैंड (2A चित्रा, लेन 1) मनाया गया। हम पहले से दिखा दिया है कि इन एकल α छल्ले (एसआर) और डबल α-छल्ले (डीआर) 18 के अनुरूप हैं। डॉ एक मरा हुआ अंत प्रजाति है कि बाद में विधानसभा 9,18 के लिए उत्पादक नहीं है।

जब अल्फा-अपने यूनिटों β सब यूनिटों के साथ coexpressed थे, सामान्य विधि है जिसके द्वारा पुनः संयोजक अर्चेअल proteasomes की विधानसभा यत्न किया है 670 केडीए आकार स्टैंड के पास पलायन, एक उपन्यास प्रजातियों का प्रतिनिधित्व मनाया गयाअर्द (चित्रा 2A, 3 लेन)। इस प्रजाति proteolytically सक्रिय था (चित्रा 2 बी, 3 लेन) और केवल पूरी तरह से परिपक्व β सब यूनिटों (mβ) जिसका propeptides हटा दिया गया है (चित्रा -2, 3 लेन) निहित। इस प्रजाति पूरी तरह से परिपक्व सी.पी. है। यह नमूना भी कुछ एसआर प्रजाति है, जो उम्मीद थी, क्योंकि एसआर एक ज्ञात विधानसभा मध्यवर्ती है, लेकिन कोई डीआर प्रजातियों निहित। जब अल्फा-अपने डीआर की कमी और बीटा सब यूनिटों coexpressed कर रहे हैं पता चलता है कि सही विधानसभा तेजी से पर्याप्त है कि इस तरह β सब यूनिटों के समावेश डॉ अनुत्पादक गठन outcompete करने में सक्षम था होने वाली थी (एक अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए 18 देखें)।

Coexpression विधि की सीमा को प्रदर्शित करने के लिए, और एक संयुक्त दृष्टिकोण की उपयोगिता के लिए बहस, α-अपने और बीटा सब यूनिटों को अलग से ई कोलाई में व्यक्त किया गया। सेल के बाद, घुलनशील अंशों मिश्रित थे और प्रोटीन से पहले आईसीएआर द्वारा शुद्ध कर रहे थेnondenaturing पृष्ठ से विश्लेषण। पूरी तरह कार्यात्मक proteasomes भी lysate मिश्रण दृष्टिकोण (चित्रा 2A और 2 बी, 2 लेन) के माध्यम से उत्पन्न किया गया है, और उम्मीद के रूप में एसआर प्रजातियां भी मनाया गया। lysate मिश्रण नमूने में डॉ प्रजातियों की फिर से बाहर निकलना इंगित करता है कि एक बार का गठन, β सब यूनिटों reversibly इसे अलग करने में असमर्थ हैं; इस डॉ गतिरोध का प्रकृति को रेखांकित करता है। दिलचस्प है, एक नई प्रजाति भी lysate मिश्रण नमूने में दिखाई दिया, बस सीपी (करार दिया "आधा") नीचे की ओर पलायन। हाल ही में, हम पता चला है कि इस प्रजाति आधा एंटीबॉडी 18 (7 β 7 अल्फा) से मेल खाती है। यहाँ इस उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, एक β सबयूनिट उत्परिवर्ती (R166W) नियुक्त किया गया था। इस उत्परिवर्तन β-β रिंग बातचीत बाधित, बिगड़ा आधा proteasomes dimerization 18 के लिए अग्रणी। चूंकि आधा proteasomes सी.पी. के लिए तत्काल व्यापारियों रहे हैं, R166W उत्परिवर्तन आधा proteasomes एक के दोनों संचय के लिए नेतृत्व चाहिएसीपी गठन में डा कमी। Α-अपने और β (R166W) सब यूनिटों के साथ lysate मिश्रण जब बाहर किया गया था, सीपी के निचले स्तर और "आधा" प्रजाति के स्तर में वृद्धि मनाया गया (चित्रा 2A, 4 लेन)। यह इन दो बैंड के लिए एक अग्रदूत-उत्पाद रिश्ते के साथ संगत है, और आधा एंटीबॉडी के रूप में "आधा" प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करता है। उत्परिवर्ती नमूना (2 लेन बनाम 4 लेन) में आधा एंटीबॉडी का थोड़ा तेजी से पलायन R166W उत्परिवर्तन β सबयूनिट की बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी अनुपात में फेरबदल के कारण होने की संभावना है।

कोशिकाओं के अंदर उच्च प्रोटीन सांद्रता की तुलना में lysate मिश्रण के दौरान आधा एंटीबॉडी कल्पना करने की क्षमता काफी कम lysate में प्रोटीन सांद्रता के लिए मुख्य कारण है। कम सांद्रता कम कुशल (यानी धीमी) विधानसभा, जो मध्यवर्ती अधिक आबादी है और इस तरह से detectable बनने के लिए सक्षम बनाता है में परिणाम। आधा एंटीबॉडी की उपस्थिति के अलावा, एक अतिरिक्त अवलोकन पर प्रकाश डाला गया lysate मिश्रण के दौरान कमी आई विधानसभा दक्षता: असंसाधित β सब यूनिटों, जो उनके propeptides बनाए रखने, detectable (proβ) हो जाते हैं। चूंकि propeptide प्रसंस्करण जब तक आधा proteasomes dimerize नहीं होती है, अपरिपक्व proβ फार्म की उपस्थिति आधे एंटीबॉडी संचय का स्तर (चित्रा -2 सी, 2 लेन 4 लेन बनाम बनाम 3 लेन तुलना) के साथ संबद्ध। R166W उत्परिवर्ती के मामले में, lysate मिश्रण के दौरान propeptide प्रसंस्करण विफलता भले ही सीपी की एक छोटी राशि के रूप में करता निरपेक्ष है। इसका कारण यह है propeptide प्रसंस्करण न केवल आधा एंटीबॉडी dimerization की आवश्यकता है, लेकिन यह भी एक अच्छी तरह से बनाई β-β रिंग इंटरफेस 23 जो R166W उत्परिवर्तन बर्दाश्त नहीं करता है। Coexpression बनाम lysate मिश्रण की एक अधिक विस्तृत कथा, के रूप में यह पुनः संयोजक एंटीबॉडी विधानसभा से संबंधित है, यहां 18 पाया जा सकता है।

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चित्रा 1: कोर कण (सीपी) विधानसभा का एक सरल योजनाबद्ध।
α सब यूनिटों एक भी α-रिंग पहले (एसआर) जो β सब यूनिटों के समावेश के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है में इकट्ठा कर सकते हैं। यह आधे एंटीबॉडी मध्यवर्ती (आधा) की पीढ़ी जो जल्दी dimerizes की ओर जाता है। dimerization के साथ समवर्ती, β सबयूनिट propeptides (नहीं दिखाया गया है) autocatalytically पूरी तरह कार्यात्मक कोर कण (सीपी) को जन्म दे रही हटा रहे हैं। डबल α-छल्ले (डीआर) एसआर से पैदा होती है और सीपी में विधानसभा के लिए सक्षम नहीं हो सकता है। अपने गठन उत्पादक विधानसभा घटनाओं (ठोस तीर) के विपरीत एक अनुत्पादक विधानसभा मार्ग (धराशायी तीर) का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2 चित्रा 2: परख Proteasome विधानसभा के लिए एक संयुक्त दृष्टिकोण।
Coexpression (सी) और lysate मिश्रण (एल) archaeon एम maripaludis से पुनः संयोजक proteasomes की विधानसभा अध्ययन करने के लिए कार्यरत थे। प्रोटीन स्थिर कोबाल्ट आत्मीयता राल (आईसीएआर) द्वारा शुद्ध किया गया। 10% ढाल जैल - (ए, बी) शुद्ध प्रोटीन (10 माइक्रोग्राम) गैर denaturing 5 पर लोड कर रहे थे। वैद्युतकणसंचलन के बाद, पेप्टिडेज़ गतिविधि बफर fluorogenic पेप्टाइड सब्सट्रेट युक्त समाधान के साथ जेल overlaying द्वारा कल्पना की गई थी Suc-LLVY-एएमसी (बी) कोलाइडयन coomassie दाग अभिकर्मक (ए) के साथ जेल धुंधला करने से पहले। काला तीर इकट्ठे 20S कोर कण (सीपी), आधा एंटीबॉडी मध्यवर्ती (आधा), डबल α-अंगूठी (डीआर) और एकल α-अंगूठी (एसआर) के पदों को निरूपित। (केडीए) में कई आणविक आकार मानकों के प्रवास के अधिकार पर संकेत दिया है। (सी) एक से छ> शुद्ध प्रोटीन (10 माइक्रोग्राम) ने भी 15% एसडीएस पृष्ठ जैल पर लोड कर रहे थे। वैद्युतकणसंचलन के बाद, जैल एक कोलाइडयन coomassie दाग अभिकर्मक के साथ दाग रहे थे। α-अपने सबयूनिट और पूरी तरह से परिपक्व (mβ) की और अपरिपक्व (proβ) β सब यूनिटों के प्रवासन संकेत दिया है। 25 केडीए आणविक आकार के मानक की स्थिति को सही में दिखाया गया है। Asterisk एक छोटा α-अपने सबयूनिट सेल के दौरान अविशिष्ट प्रोटियोलिसिस से उत्पन्न टुकड़ा इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्लाज्मिड जीनोटाइप स्रोत
AKB191 pET42 PSMA-अपने Kusmierczyk एट अल।, (2011)
AKB464 pET42 PSMA-अपने psmB Kusmierczyk एट अल।, (2011)
AKB946 pET42 psmB Panfair एट अल।, (2015)
AKB952 pET42 psmB (R166W) Panfair एट अल।, (2015)

तालिका 1: बैक्टीरियल इस अध्ययन में इस्तेमाल प्लास्मिड। PSMA अर्चेअल α सबयूनिट जीन है और psmB अर्चेअल β सबयूनिट जीन है।

बफर 50 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 300 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl। बफ़र बी, सी और ई, बफर युक्त Imidazole के डेरिवेटिव हैं। यह एक 2 एम स्टॉक पानी में तैयार किया है और अंधेरे में संग्रहित से Imidazole जोड़ने के लिए उपयोगी है।
मूल निवासी के समाधान के बफर 375 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.8, 0.1% (वी / वी) tetramethylethylenediamine (TEMED) और 0.1% (w / v) अमोनियम Perulfate (ए पी)। कोई और अधिक तैयार ताजा एक घंटे से पहले जेल polymerized और बर्फ पर रखा जा रहा है। जब देशी हल करने के बफर में acrylamide जेल समाधान की तैयारी कर रहा है, यह एक 4X शेयर (1.5 एम Tris एचसीएल, पीएच 8.8) से Tris एचसीएल जोड़ने के लिए उपयोगी है। ए पी तुरंत polymerization से पहले जोड़ा जाता है।
मूल निवासी चल बफर 10X शेयर 250 मिमी Tris, 1.92 एम ग्लाइसिन, पीएच को समायोजित नहीं है।
5X मूल निवासी नमूना बफर 0.5 एम Tris एचसीएल, पीएच 8.8, 50% (वी / वी) ग्लिसरॉल, bromophenol नीले रंग के निशान। निशान एक बहुत छोटी राशि है, आम तौर पर कुछ अनाज रंग के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए संदर्भित करता है।
5X एसडीएस नमूना बफर 0.3 एम Tris एचसीएल, पीएच 6.8, 600 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 10% (w / v) एसडीएस, 50% (वी / वी) ग्लिसरॉल और bromophenol नीले रंग के निशान। निशान एक बहुत छोटी राशि है, आम तौर पर कुछ अनाज रंग के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए संदर्भित करता है।
विकासशील बफर 50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी एटीपी, 50 मिमी Suc-LLVY-एएमसी। सफलता-LLVY-एएमसी एक fluorogenic पेप्टाइड एंटीबॉडी गतिविधि परख के लिए इस्तेमाल किया सब्सट्रेट है।

तालिका 2: समाधान, मीडिया, और बफ़र इस अध्ययन में इस्तेमाल किया।

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Discussion

हम पुनः संयोजक अर्चेअल proteasomes का उपयोग कर पृष्ठ nondenaturing द्वारा एंटीबॉडी विधानसभा का विश्लेषण करने के लिए एक संयुक्त दृष्टिकोण का लाभ प्रदर्शित करता है। एंटीबॉडी सब यूनिटों के जीवाणु Coexpression की सामान्य विधि 9,11 तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, लेकिन कुंजी विधानसभा मध्यवर्ती का खुलासा नहीं कर सकता है। हम विधानसभा घटनाओं की एक व्यापक तस्वीर को विकसित करने के लिए मिश्रण lysate साथ Coexpression संयोजन सुझाव देते हैं।

इस संयुक्त दृष्टिकोण का लाभ यह है कि α के अलग अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है और lysate मिश्रण के लिए सब यूनिटों बीटा के बावजूद, यह अभी भी अपेक्षाकृत श्रम के अनुकूल है। परिणाम यह भी semiquantitative हो सकता है अगर एक व्यक्ति प्रोटीन के तुलनीय और सुसंगत अभिव्यक्ति के स्तर को सुनिश्चित करता है। यह अंत करने के लिए, हम पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के सामान्य अनुकूलन बाहर ले जाने की सिफारिश की स्थिति है कि lysate मिश्रण से पहले व्यक्त प्रोटीन की तुलना स्तर निर्धारित करने के लिए अनुमति देते हैं। अनुकूलन बदलती प्रेरण टिम शामिल कर सकते हैंई, प्रेरण तापमान, प्रेरण, बैक्टीरियल अभिव्यक्ति तनाव पर ऑप्टिकल घनत्व, और इतने पर, घुलनशील प्रोटीन के वांछित स्तर को प्राप्त कर रहे हैं जब तक। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एक प्रोटीन की WT और उत्परिवर्ती संस्करणों की तुलना क्योंकि कभी कभी उत्परिवर्ती तुलनीय अभिव्यक्ति के स्तर प्रदर्शन कर सकते हैं, लेकिन घुलनशीलता में कमी आई है। हम भी पहले की nondenaturing पेज लोड करने के लिए आईसीएआर शुद्ध नमूनों की प्रोटीन सांद्रता का निर्धारण करने के महत्व पर प्रकाश डाला। यहाँ तक कि जगह में अभिव्यक्ति अनुकूलन के साथ, और सबसे अच्छी देखभाल सुनिश्चित करने के लिए है कि समानांतर नमूने एक ही रास्ते में शुद्धि कदम के माध्यम से कार्रवाई कर रहे हैं लिया साथ विचरण अभी भी अनजाने में पेश किया जा सकता है। एक एकाग्रता माप सुनिश्चित करता है कि कुल प्रोटीन का एक ही राशि नमूना प्रति अच्छी तरह से भरी हुई है। यह एक दिया प्रजातियों अधिक सार्थक पलायन के लिए लेन-टु-लेन बैंड तीव्रता की तुलना में आता है।

प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलनीय है और लगातार स्तरों Lysa के लिए प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तोते मिश्रण, एक हमेशा पहले से सभी घटकों को शुद्ध और शुद्ध प्रोटीन के साथ प्रयोगों मिश्रण बाहर ले जा सकता है। यह और अधिक सटीक प्रोटीन निर्धारण की अनुमति का लाभ है और इस तरह के दृष्टिकोण मात्रात्मक बनाता है। हालांकि, पूर्ण शुद्धि का दोष यह है कि इस प्रक्रिया में काफी अधिक श्रम गहन है, जो कई म्यूटेंट एक साथ 18 के तेजी से विश्लेषण छीन कर सकते हो जाता है। उल्लेख के लायक एक अंतिम चेतावनी है कभी कभी α की अभिव्यक्ति को अलग किया और बीटा सब यूनिटों संभव नहीं हो सकता है। यह हो सकता है यदि एक उत्परिवर्तन एक सबयूनिट का कारण बनता है जब अपने आप ही व्यक्त ई कोलाई में अघुलनशील हो, लेकिन जब उत्परिवर्ती अपने बंधन साथी के साथ व्यक्त किया है घुलनशीलता आ जा करने के लिए अनुमति देता है। यदि ऐसा होता है, यह केवल Coexpression करने के लिए विश्लेषण सीमित कर देगा। बहरहाल, यह एक चेतावनी है कि सामान्य रूप से पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के दौरान पैदा कर सकता है, और अर्चेअल एंटीबॉडी सब यूनिटों 24,25 के लिए विशिष्ट नहीं है।

हम जनरल के लिए चुनाशुद्धि और आईसीएआर राल की खरीदने की क्षमता में आसानी के कारण हमारे proteasomal प्रोटीन की उनकी टैग डेरिवेटिव erate। अन्य मिलान टैग संभव हो रहे हैं, एंटीबॉडी आधारित शुद्धि के लिए उन सहित, और हम सफलतापूर्वक व्यक्त की है और हमारे एंटीबॉडी सब यूनिटों का शुद्ध करें टैग संस्करणों (नहीं दिखाया गया है)। हालांकि, अगर एकरूपता (या उत्पादन का स्तर बढ़ रही है) के लिए शुद्धि आवश्यक है, उनकी टैग संस्करणों ऐसा करने का सबसे तेज और सबसे अधिक लागत प्रभावी साधन उपलब्ध कराते हैं।

यह एक दिया जाता है कि परिणाम पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ प्राप्त की है, वे अर्चेअल या यूकेरियोटिक बैक्टीरिया में उत्पादित प्रोटीन हो सकता है, जिसका अर्थ है जब इन विवो टिप्पणियों के साथ पीछा किया और आगे लाभ होगा। हालांकि, एक विवो दृष्टिकोण नहीं हमेशा तुरंत सुलभ प्रयोगात्मक हो सकता है। यह विशेष रूप से सच है जब अध्ययन का विषय एक बड़ी है, इस तरह के एंटीबॉडी के रूप में जटिल multisubunit। पुनः संयोजक प्रोटीन futu के लिए एक महत्वपूर्ण लांच बिंदु प्रदान दृष्टिकोणप्रयोगों रहे हैं। एंटीबॉडी के मामले में, nondenaturing पेज के साथ पुनः संयोजक अर्चेअल एंटीबॉडी उत्पादन बाँधना एंटीबॉडी विधानसभा, जो अर्चेअल और यूकेरियोटिक प्रजातियों 9,11,12,18 के बीच साझा कर रहे हैं की प्रमुख विशेषताओं का वर्णन करने में बहुत प्रभावी होना करने के लिए जारी रहेगा। इस तरह के एक दृष्टिकोण के रूप में अच्छी तरह से अन्य बड़े multiprotein परिसरों की विधानसभा के अध्ययन के लिए उपयोगी होने की संभावना है। हाल ही में, हम को दिखाना है कि अर्चेअल proteasomes एक से अधिक मार्ग के माध्यम से इकट्ठा कर सकते हैं, और यह कि α-छल्ले विधानसभा के दौरान लाचार मध्यवर्ती है कि वे 18 होने लगा रहे थे नहीं हैं इस रणनीति का प्रयोग किया। यह निर्धारित किया जा करने के लिए एक ही यूकेरियोटिक proteasomes के लिए सच है, तो बनी हुई है।

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Acknowledgments

इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 14GRNT20390154 से एक पुरस्कार से एक अनुसंधान सहायता निधि अनुदान (RSFG) इंडियाना विश्वविद्यालय, पर्ड्यू विश्वविद्यालय, इंडियानापोलिस से द्वारा समर्थित किया गया था, और भाग में, सन्दूक के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide (40%) solution Biorad 1610104 Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear
Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters EMDMillipore UFC501024
Ammonium Persulfate Sigma A3678
ATP Sigma A7699
BCA assay kit Pierce 23225
Bisacrylamide (2%) solution Biorad 1610142
Bromophenol blue Sigma B8026
DNaseI Sigma DN25
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher BP172
E. coli BL21 competent cells EMD Millipore 69450
GelCode Blue Thermo Fisher 24592 Colloidal coomassie stain reagent for gels
Gel doc EZ system Biorad 1708270 Gel documentation system
Gel releasers Biorad 1653320 Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.
Glass rod Thermo Fisher 11-380B
Glycerol Sigma 49767
Glycine Thermo Fisher BP3865
Hamilton syringe Thermo Fisher 14-813-38 Glass syringe for loading gels
HEPES US Biologicals H2010
HMW Native calibration kit GE Healthcare 170445-01 High molecular weight protein standards
Hoefer SG30 Thermo Fisher 03-500-277 Gradient maker
Imidazole US Biologicals 280671
IPTG US Biologicals I8500 For induction of protein expression
Isopropanol Thermo Fisher BP26181
Kanamycin sulfate US Biologicals K0010
Lysozyme Sigma L6876
MgCl2 Fluka analytical 630680
Mini Protean Tetra Cell Biorad 1658002EDU Gel electrophoresis apparatus
NaCl Thermo Fisher S640-3
NaOH Thermo Fisher S318-1
Pefabloc SC Roche 11429876001 Protease inhibitor
pET42 EMD Millipore 70562 Expression plasmid
Precision plus all blue standard Biorad 1610373 Molecular protein standard for SDS-PAGE
Quickchange mutagenesis kit Agilent technologies 200521
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Thermo Fisher BP166
Suc-LLVY-AMC Enzo lifesciences BML P802-0005 Fluorogenic substrate
Talon Metal Affinity Resin Clontech 635502 Immobilized Cobalt Affinity Resin
TEMED Sigma T7024
Tris US Biologicals T8600
Triton-X100 Sigma 93426
Tryptone Bacto BD 211699
UV sample tray Biorad 1708271 For UV imaging of gels
Yeast extract Bacto BD 212720

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References

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एक संयुक्त दृष्टिकोण के लिए प्रकरण: संयोजक अर्चेअल Proteasomes और Nondenaturing पेज के साथ Proteasome विधानसभा की जांच
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Panfair, D., Kusmierczyk, A. R. Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE: The Case for a Combined Approach. J. Vis. Exp. (118), e54860, doi:10.3791/54860 (2016).

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