Summary
Denne protokollen bruker både subenhet koekspresjon og postlysis subenheten blande for en mer grundig undersøkelse av rekombinant proteasome montering.
Abstract
Proteasomer finnes i alle områder av livet. De gir den viktigste ruten for intracellulær protein nedbrytning i eukaryoter, selv om deres forsamlingen ikke helt forstått. Alle proteasomer inneholde en strukturelt konservert kjernepartikkel (CP), eller 20S-proteosomet inneholder to heptameric p-subenhet-ringer klemt mellom to heptameric α subenhet ringer. Archaeal 20S proteasomer er sammensetnings enklere i forhold til sine eukaryote kolleger, men de begge deler en felles montering mekanisme. Derfor archaeal 20S proteasomer fortsette å være viktige modeller for eukaryote proteasome montering. Nærmere bestemt har rekombinant uttrykk for archaeal 20S proteasomer kombinert med nondenaturing polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) ga mange viktige innsikt i proteasome biogenesis. Her diskuterer vi et middel til å forbedre den vanlige strategien for koekspresjon av archaeal proteasomer α og p-subenheter før nondenaturing SIDE. Vi viser at selv om rask og effektiv, kan en koekspresjon tilnærming alene savner sentrale monteringsmellomprodukter. I tilfelle av proteosomet, kan koekspresjon ikke tillate påvisning av den halv-proteosomet, et mellomprodukt inneholdende en komplett α-ring og en fullstendig β-ring. Men dette mellomproduktet kan lett detekteres via lysat blanding. Vi foreslår at å kombinere koekspresjon med lysat blanding gir en tilnærming som er mer grundig i å analysere montering, men fortsatt arbeid nonintensive. Denne fremgangsmåten kan være nyttig for studier av andre rekombinante multiprotein komplekser.
Introduction
Multiprotein komplekser utføre en rekke kritiske cellulære aktiviteter 1. For mange av disse kompleksene, er mye mer kjent om deres struktur og funksjon enn om deres montering 2,3. Proteasome er en slik kompleks og finnes i alle områder av livet. I eukaryoter, er denne molekylære maskinen i kjernen av ubiquitin / Proteasome system (UPS) og gir den store rute for intracellulær proteindegradering 4. Den eukaryote proteasomet (også omtalt som den 26S-proteasomet) består av to store sub-sammenstillinger: en 20S-proteosomet, eller Core Particle (CP) 5, som kan bli avkortet på den ene eller begge ender av en 19S Regulatory partikkel (RP) 6.
Den 20S proteasomet er et stort compartmentalized protease. Dets kvaternære struktur er fullstendig konservert i alle områder av liv, og består av en stabel av fire syv-leddede ringer inneholdende to typer av strukturelt beslektede subenheter, α; og p 5,7,8. I eukaryoter, er de to ytre ringer hver består av syv forskjellige a-subenheter og to indre ringer er hver består av syv forskjellige p-underenheter; proteolytisk aktivitet ligger innenfor de tre p-underenheter. I motsetning til dette blir de CP ringer av archaea og bakterier vanligvis består av bare en type α og en type β subenheten. Archaeal proteasomer har gitt en viktig modellsystem for å studere proteasome montering både på grunn av sin kompositoriske enkelhet og deres deler en felles montering mekanisme med sine eukaryote kolleger 9-13. I korte trekk, a-subenheter montere inn a ringer først, som tjener som et stillas hvorpå p-subenheter montere. De resulterende halv proteasomer (α 7 β 7) dimerisere, gir opphav til ferdig montert CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Under dimerization, propeptidene presentere på p-subenheterer autocatalytically fjernet, utsette de katalytiske N-terminale treoniner. Bruken av archaeal proteasomer for å modellere montering finner ofte fordel av produksjon av rekombinante archaeal proteasomer proteiner i Escherichia coli. Dette er en verdig tilnærming fordi det muliggjør at underenheter som skal produseres i forskjellige kombinasjoner, som både WT og muterte versjoner, i en vertsorganisme som ikke produserer sin egen proteasomer.
Overvåking av sammenstillingen av multiproteinkomplekser biokjemisk krever noen form for fraksjoneringsmetode som skiller ferdig montert komplekser fra monteringsmellomprodukter og forløpere. På grunn av sin overlegne løse kapasitet, nondenaturing polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE) har vist seg å være spesielt nyttige ved fraksjonering av forskjellige store multiprotein komplekser 14-17. Kombinasjonen av rekombinant archaeal proteasome produksjon og nondenaturing siden har blitt en kraftig tilnærming i dissecting proteasome montering 9,11,12,18. Men den vanlige metode ved hvilken denne metoden anvendes (f.eks. Via det rekombinante koekspresjon av a- og p-subenheter) har en viktig ulempe. Monterings reaksjoner er samarbeidsvillig og sterkt konsentrasjonsavhengig tre. Gitt at proteinkonsentrasjonen inne i cellene er meget høy 19, på grunn av utelukkede volumeffekter, montering reaksjoner forløper hurtig in vivo. Derfor er det mulig å gå glipp av viktige monteringsmellom når a og p subenheter er koekspresjon.
Her argumenterer vi for en kombinert tilnærming i studiet av proteasome settet med rekombinante archaeal proteasomer subenheter. I denne fremgangsmåten, blir begge koekspresjon og lysat blandemetoder anvendes. Den tidligere muliggjør rask analyse av forsamlingen fordi koekspresjon er mindre arbeidskrevende. Sistnevnte er avhengig av egen ekspresjon av a og p-underenheter, etterfulgt av blanding. Selv om dette krav som stillesres litt mer innsats enn koekspresjon, er det mer enn kompensert for ved evnen til å oppdage mellom som er savnet under koekspresjon. Til sammen kan disse to metodene gir et mer fullstendig bilde av proteasome montering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriell Expression.
Merk: Ekspresjonsplasmider brukt i denne undersøkelsen er beskrevet i tabell 1. Løsninger, media og buffere som brukes i denne undersøkelsen er beskrevet i tabell 2. Kloningen av archaeal proteasome subenhetgenene og generering av ekspresjonsplasmider som er beskrevet andre steder 18,20. I korte trekk, plasmider for rekombinant koekspresjon av subenheter ansette en bicistronisk operon strategi som hjelper i å få sammenlignbare uttrykk nivåer av enkelte subenheter 18,20. Uttrykket parametre oppført nedenfor var empirisk bestemt å være optimal for proteasomer underenhetene i denne studien. Det kan være nødvendig for å optimalisere uttrykk for andre proteasomer mutanter, for proteasomer fra andre archaeal arter, eller for andre rekombinant protein komplekser (se diskusjon).
- Transform uttrykk plasmid av interesse i kjemisk kompetente E.coli BL21 (DE3) celler.
- Legg 1 - 2 ul plasmid (typisk 50 - 100 ng) til en alikvot av DE3 celler som ble nylig tint på is, og fortsetter å inkubere på is i 20 min.
- Varmesjokk cellene ved 42 ° C i 45 s og tilbake til rør is for additionl 2 min.
- Tilsett 1 ml LB-medium og inkuber ved 37 ° C med risting (150 rpm) i 1 time.
- Spre 100-200 pl av transformasjonsblandingen på LB-kan plater (plater inneholdende fast LB-medium, supplert med kanamycin (alle plasmider brukt i denne studien koder for resistens mot dette antibiotikum)). Inkuber skålene ved 37 ºC O / N.
- Neste morgen, inokulere en enkelt koloni fra LB-kan platen i 3 ml flytende LB-kan media i et glasskulturrør. Inkuber ved 37 ° C med risting (150 rpm) i ca. 2,5 til 3 timer, eller inntil turbiditet observeres.
- Måle den optiske tetthet av kulturen ved 600 nm (OD 600) i et spektrofotometer. Fortynn cellekulture med en passende mengde av forvarmet LB-kan mediet til en OD 600 på 0,4 i et sluttvolum på 6 ml. Gjenoppta risting ved 37 ºC i 40 min.
- Indusere proteinekspresjon i væskekulturer ved å tilsette IPTG fra en stamoppløsning til en endelig konsentrasjon på 1 mM. Inkuber ved 37 ° C med risting (150 rpm) i ca. 6 - 7 h.
- Høste bakteriecellekulturer i sin helhet inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 1,5 ml av en kultur inn i mikrosentrifugerør. Sentrifuger ved 10000 x g i 1 min.
- Kast supernatanten og tilsett ytterligere 1,5 ml av den samme kultur til pelleten. Sentrifuger ved 10000 x g i 1 min.
- Gjenta trinn 1,11 til hele kulturen høstes inn i mikrosentrifugerør.
- Lagre de induserte pellets ved -80 ° C inntil lyse.
2. Bakteriell Lysis og Lysate Blanding.
notat: (dvs. det bekrefter at proteinet ble uttrykt og løselig). Derfor anbefaler vi inkludert TSP analyse i utgangspunktet. Når en optimal protokoll er oppnådd for et bestemt subenhet kombinasjon, er TSP analyse ikke er strengt nødvendig og det er derfor det er beskrevet som valgfritt nedenfor.
- Lysering av bakterieceller og fremstilling av oppløselige fraksjoner.
- Tine den induserte cellepellet på is i 5 min. Resuspender pelleten i 600 pl av lyseringsbuffer.
- IncUbaté suspensjonen ved 30 ° C med risting (150 rpm) i 30 min for å generere totale urene lysat.
Merk: Følgende trinn, og avsnittet som følger er valgfrie. - Fjern de to 25 ul alikvoter fra den totale rå lysatet i separate 1,5 ml mikrosentrifugerør og gjennomføre TSP-analyse som følger.
- Til en av de to 25 pl porsjoner, tilsett 5X SDS-prøvebuffer til en sluttkonsentrasjon på 1 x. Merk røret med "T" for "total råolje lysat".
- Inkuber "T" prøven ved 100 ºC i 5 min til helt denaturere proteiner.
- Samtidig tar den andre 25 pl prøve og sentrifuge det ved 10000 x g i 10 min. Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre den lille pellet, og overføre den til en ny 1,5 ml mikrosentrifugerør. Merk dette nye røret "S" for "løselige fraksjonen".
- Til liten pellet venstre Behind i det foregående trinn, tilsett 25 pl av lyseringsbuffer og vortex å resuspendere. Merk dette røret "P" for "pellet brøkdel".
- Tilsett 6 pl 5X SDS prøvebuffer til "S" og "P" rørene og inkuber ved 100 ° C som beskrevet ovenfor.
Merk: Hvis TSP prøvene ikke vil bli brukt den dagen til å analysere uttrykk, kan de fryses ved -20 ºC inntil nødvendig. Straks etter tining må de reinkubert ved 100 ° C, som beskrevet ovenfor, umiddelbart før lasting på en 12% og / eller 15% standard SDS-PAGE-gel.
- Mens TSP analysen utføres, sentrifuger resterende 550 ul av den totale urene lysat (eller hele 600 ul total rått lysat hvis TSP-analyse ikke utført) ved 10.000 x g i 10 min. Samle supernatanten i en frisk 1,5 ml mikrosentrifugerør. Dette er den oppløselige lysat som skal brukes for rensing.
- Lysat blanding.
- Utføre lysering som beskrevet i trinn 2.1.1 og 2.1.2 ovenfor.
- Bland 600 mL av total råolje lysat fra bakterier som uttrykker ønsket α-subenheten med 600 mL av total råolje lysat fra bakterier som uttrykker ønsket β-subenheten. Inkuber ved 37 ° C med langsom risting i 30 min.
Merk: Det kan være nødvendig for å optimalisere inkubasjonstid for å oppnå maksimal sammenstillingen i løpet av lysat blanding (se diskusjon). Tiden og temperaturen presenteres her er optimal for de rekombinante proteiner i denne studien, og var fast bestemt på andre steder 18. - Sentrifuger den blandede løsningen ved 10.000 x g i 10 min for å separere løselige materiale fra uløselig pellet. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Bruk denne blandet oppløselig lysat for protein rensing.
3. Protein Rensing via immobilisert Cobalt Affinity Resin(ICAR).
- Likevekt harpiksen.
- Grundig suspendere harpiksen ved å snu flasken og overføre 50 ul av slurryen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger ved 700 x g i 2 min for å pellet harpiks. aspirer nøye supernatant.
Merk: Vi utfører pipette aspirasjon ved hjelp av en blå 1 ml pipette for å fjerne mesteparten av væsken. En hvit 2 mL spiss benyttes for fin kontroll av fjernelse av den gjenværende supernatant, og etterlater et meget tynt lag av væske som dekker kulene. - Tilsett 1 ml av buffer A. Bland forsiktig for å resuspendere harpiks og sentrifuger ved 700 x g i 2 min for å pelletere harpiks. aspirer supernatanten forsiktig og gjenta dette vasketrinn en gang til.
- Grundig suspendere harpiksen ved å snu flasken og overføre 50 ul av slurryen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger ved 700 x g i 2 min for å pellet harpiks. aspirer nøye supernatant.
- Påfør oppløselig lysat oppnådd tidligere i avsnitt 2.1 eller 2.2 til likevekt harpiks. Inkuber røret med forsiktig rotasjon ved 4 ° C i 60 min. Sentrifuger røret ved 700 x g </ Em> i 5 minutter og forsiktig aspirer supernatanten.
- Vask harpiksen som følger for å fjerne ikke-spesifikt bundne proteiner.
- Resuspender resinet med 1 ml av buffer A og inkubert med forsiktig gynging ved 4 ° C i 10 min. Sentrifuger røret ved 700 x g i 5 minutter og forsiktig aspirer supernatanten. Gjenta dette vasketrinn en gang til.
- Resuspender harpiks med 1 ml av buffer B (buffer A med 5 mM imidazol) og inkuber med forsiktig gynging ved 4 ° C i 5 min. Sentrifuger røret ved 700 x g i 5 minutter og forsiktig aspirer supernatanten. Gjenta dette vasketrinn en gang til.
- Resuspender harpiks med 1 ml av buffer C (buffer A med 10 mM imidazol) og inkuber med forsiktig gynging ved 4 ° C i 5 min. Sentrifuger røret ved 700 x g i 5 minutter og forsiktig aspirer supernatanten.
- Eluere proteinet ved tilsetning av 400 ul av buffer E (buffer A med 200 mM imidazol) to harpiksen. Inkuber med milde rocking ved 4 ºC i 5 min. Sentrifuger ved 700 x g i 5 min.
- Overfør supernatanten inneholdende renset protein til et nytt 1,5 ml sentrifugerør.
- Avsalte det rensede protein ved seriesentrifugering som følger.
- Til 400 mL av renset protein, tilsett 100 ul Buffer A (dette reduserer Imidazol-konsentrasjonen fra 200 mM til 160 mM). Anvende rensede protein til 0,5 ml ultracentrifugal filtre med et 10 kDa molekylvekt cut-off. Sentrifuger ved 14000 x g i 5 min.
- Kast filtratet og tilsett 400 mL buffer A for å fortynne retentat og sentrifuger igjen. Fortsett sykluser av sentrifugering / fortynning før imidazol konsentrasjonen faller under 4 mm. Som et eksempel, hvis hver sentrifugering konsentrerer til 500 mL ned til ~ 70 ul (eller omtrent syv ganger), deretter to sykluser vil redusere utgangs 160 mM imidazol konsentrasjon (7 x 7 = 49 ganger) til ca.oximately 3,3 mm.
- Måle proteinkonsentrasjonen av den avsaltede prøven ved hjelp av BCA-analyse 21.
Merk: Avsalting er nødvendig for å redusere imidazol nivåer under toleransegrensen for BCA analysen, som beskrevet i produsentens instruksjoner. Vårt laboratorium foretrekker BCA-analyse, fordi det er følsomt, har et stort dynamisk område, og utviser mye mindre protein-til-protein variasjon. Imidlertid kan andre metoder for å bestemme proteinkonsentrasjonen være substituert for BCA-analyse. Nøkkelen er å være klar over hver metodens fordeler og begrensninger.
- Legg 5X opprinnelige prøvebuffer til en endelig konsentrasjon på 1X og videre til elektroforese. Alternativt, lagre prøvene ved -20 ºC for senere analyse.
4. Nondenaturing polyakrylamidgelelektroforese (PAGE).
Forsiktig: Upolymerisert akrylamid er en nervegift. Bruk beskyttende gear.
- Klargjør nondenaturing PAGE gel som følger.
- Forbered gel kassett for støping ved hjelp av rene glassplater og støping stand. Plasser gradient maker på toppen av en liten magnetrører og plassere en liten rørepinne i hvert kammer.
- Ved anvendelse av 40% (w / v) akrylamid og 2% (w / v) bisakrylamid stamløsninger, forberede 5% og 10% (w / v) akrylamid gel-løsninger i et opprinnelig løse buffer. Sørg for at forholdet mellom total akrylamid til bisacrylamid er 37,5: 1. Chill på is før strømme.
Merk: nondenaturing SIDE systemet som brukes her er i hovedsak identisk med Laemmli SDS-PAGE-system, med SDS utelatt 22. - Legg ammoniumpersulfat (fra en 10% (w / v) stamløsning fremstilt i vann) for å akrylamid løsninger for å initiere polymerisering. Sluttkonsentrasjonen av ammoniumpersulfat er 0,1% (w / v).
- Hell akrylamidløsninger i de to kamrene i gradient maker. Med uttaket rør inn between platene av gelen kassetten, aktivere magnetrører og åpne gradient maker ventiler. Hell 5-10% nondenaturing gradient gel.
- Når helles, overlappe gel med et tynt lag av isopropanol og tillate gel å polymerisere i 30 minutter. I løpet av denne tiden, forberede frisk 5% akrylamid gel løsning i native løse buffer. Etter at gelen etableres, hell av Isopropanol og skyll toppen av gelen med deionisert vann fra en sprut flaske.
- Til 5% gel oppløsning fremstilt ovenfor, tilsett ammoniumpersulfat (nøyaktig som beskrevet i 4.1.3) og hell oppå den polymeriserte gel inntil glassplater er fulle. Sett gel kam. Tillat den kledde gel å polymerisere i ytterligere 30 min.
- Når gelen er polymerisert, montere gel kassetten inn i elektroforese apparat. Alternativt lagre gelen ved 4 ºC, innpakket i fuktet tørkepapir og plastfolie til alt er klart til bruk.
- Når nondenaturing PAGE gel er satt sammen til electrophoresis apparat, fylle tanken med 1X innfødte kjører buffer forberedt frisk fra en 10X innfødte kjører buffer lager.
- Belastning 10 ug renset protein, oppnådd ved slutten av avsnittet 3, i hver brønn ved anvendelse av en glassprøyte.
- Belastning 2 mL av høy molekylvekt native protein-standard (fortynnet i 1 x innfødt løpebuffer) inn i en av brønnene.
- Kjør gelen ved 55 V og 4 ° C inntil fargestoffet fram renner av gelen (ca. 4 til 4,5 timer).
- I tillegg til den nondenaturing gel, analysere prøver av det rensede protein ved standard SDS-PAGE 22.
- Blande aliquoter (10 ug) av de rensede proteinprøver, oppnådd ved utgangen av seksjon 3, med 5X SDS-prøvebuffer til en sluttkonsentrasjon på 1 x.
- Inkuber ved 100 ° C i 5 minutter og laster inn på standard 12% og / eller 15% SDS-PAGE-geler 22.
- Kjør på 80V i 20 minutter og deretter ved 120 V til fargestoff fronten går utenfor gel (dette er omtrent en additional 75 min for en 12% gel, og 120 min for en 15% gel).
5. Visualisering Aktivitet og Protein flekker.
- Etter elektroforese nøye separate glassplater og overføre nondenaturing gel til en gel brett inneholdende 50 ml avionisert vann. Skyll gel med milde rocking i 5 min. Kast vann og gjenta dette vasketrinn tre ganger.
- Utføre substrat overlagsanalysen som følger.
- Tilsett 1 ml buffer inneholdende utvikling av det fluorogene peptidsubstratet Suc-LLVY-AMC og spredt jevnt over gelen. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
Merk: En glass-stav eller en gel utløser (liten kile av plast brukes til å separere glassplatene) kan brukes for å spre væsken over gelen. - overføre nøye gelen på UV-transilluminator av gelen avbildningssystemet og observere fluorescensen på grunn av det spaltede peptid-substratet. Record bilde. overføre nøye gel back til gelen skuffen.
- Skyll gelen to ganger med 50 ml deionisert vann i 5 min med forsiktig vugging.
- Flekk gelen med 10 ml av en kolloidal Coomassie flekk-reagens i 60 minutter med forsiktig vugging. Destain gel med 50 ml vann inntil bakgrunnen blir klar. Denne fargingen trinnet gjelder for standard SDS-PAGE-geler i tillegg.
- Tilsett 1 ml buffer inneholdende utvikling av det fluorogene peptidsubstratet Suc-LLVY-AMC og spredt jevnt over gelen. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteasomet sammenstillingen (figur 1) begynner når a-underenheter kombineres for å danne ringer 9. Dette kan illustreres ved a subenheter fra archaeon Methanococcus maripaludis S2 er uttrykt i E. coli som C-terminalt hexahistidine tagget (hans-merket) derivater (tabell 1). Når det rekombinante α-his-protein ble renset ved ICAR og analysert ved nondenaturing PAGE, ble to bånd observert (Figur 2A, spor 1). Vi har tidligere vist at disse svarer til Enkelt a Rings (SR) og dobbel a-Rings (DR) 18. DR er en dead-end arter som ikke er produktiv for senere montering 9,18.
Når a-hans subenheter ble koekspresjon med p-subenheter, som representerer den vanlige metoden ved hvilken oppstilling av rekombinante archaeal proteasomer blir analysert, ble det observert en ny art migrerer nær 670 kDa størrelse stativard (Figur 2A, spor 3). Denne arten var proteolytisk aktiv (figur 2B, spor 3), og inneholdt bare helt modne p-subenheter (mβ) som propeptider har blitt fjernet (figur 2C, spor 3). Denne arten er helt moden CP. Denne prøven inneholdt også noen SR arter, noe som var forventet fordi SR er et kjent montering middels, men ingen DR arter. Den manglende DR når a-sin og p-subenheter er koekspresjon tyder på at korrekt montering ble forekommende hurtig nok slik at inkorporering av p-underenheter var i stand til å utkonkurrere de uproduktiv dannelsen av DR (for en mer detaljert analyse se 18).
For å demonstrere begrensning av koekspresjonen metode, og argumentere for nytten av en kombinert metode, α-sin og p-subenheter ble uttrykt hver for seg i E. coli. Etter en oppløsning, de løselige fraksjoner ble blandet og proteiner ble renset ved ICAR føranalyse av nondenaturing PAGE. Fullt ut funksjonell proteasomer ble også samlet inn via lysatet blandemetoden (figur 2A og 2B, kolonne 2), og SR arten ble også observert som forventet. Tilsynekomsten av DR arter i lysat blande prøven viser at en gang dannet, p-subenheter ikke klarer å reversibelt demontere den; Dette understreker blindvei natur DR. Interessant, en ny art også dukket opp i lysat blande prøven, migrerer like under CP (kalt "halv"). Nylig viste vi at denne arten tilsvarer halv-proteasomet (a 7 β 7) 18. For å illustrere dette her, ble en β-subenheten mutant (R166W) ansatt. Denne mutasjonen forstyrrer β-β ring interaksjon, som fører til nedsatt halv-proteasomer dimerisering 18. Siden halv proteasomer er de umiddelbare forløpere til CP, bør R166W mutasjonen fører til begge opphopning av halv-proteasomer enda reduksjon i CP formasjon. Når lysat blanding med a-hans og p (R166W) underenhetene har utført, lavere nivåer av CP og økte nivåer av "halve" arter ble observert (Figur 2A, spor 4). Dette er konsistent med et forløper-produktforhold for disse to bånd, og bekrefter identiteten av "halve" arter som halv-proteasomet. Den litt hurtigere migrering av den halv-proteasomet i den mutante prøve (felt 4 i forhold til kolonne 2) er sannsynligvis på grunn av den R166W mutasjon endrer den masse-til-ladning-forhold på den β subenheten.
Evnen til å visualisere den halv-proteasomet i løpet av lysat blanding er hovedsakelig på grunn av mye lavere proteinkonsentrasjoner i lysatet i forhold til de høye proteinkonsentrasjoner inne i cellene. Lavere konsentrasjoner resultere i mindre effektiv (dvs. saktere) montering, noe som gjør det mulig for mellomprodukter for å bli mer befolket og således påvisbar. Foruten utseendet på halv-proteosomet, en ekstra observasjon streker redusert montering effektivitet under lysat blanding: ubehandlet betaunderenheter, som beholder sine propeptider, blir påvisbar (proβ). Siden propeptid behandling ikke forekommer før halv proteasomer dimerisere, utseendet av den umodne proβ formen korrelerer med graden av halv-proteasom-akkumulering (sammenlign figur 2C, kolonne 3 i forhold til spor 2 i forhold til spor 4). I tilfellet med den R166W mutant, propeptidet behandling svikt i løpet av lysat blanding er absolutt selv om en liten mengde av CP gjør form. Dette er fordi propeptid behandling krever ikke bare halv-proteasom-dimerisering, men også en skikkelig formet β-β ring grensesnitt 23 som den R166W mutasjonen ikke har råd. En mer detaljert fortelling av koekspresjon versus lysat blanding, som det gjelder rekombinant proteasome montering, finner du her 18.
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg "/>
Figur 1: En forenklet Skjematisk av Kjernepartikkel (CP) Assembly.
A-subenheter kan montere inn en enkelt α-ring først (SR) som tjener som en mal for inkorporering av p-subenheter. Dette fører til generering av halv proteasome mellom (halv) som raskt dimerizes. Samtidig med dimerisering, blir β subenhet propeptidene (ikke vist) autocatalytically fjernet, hvilket ga opphav til en fullt funksjonell kjernepartikkel (CP). Doble a-ringer (DR) kan oppstå fra SR og er ikke kompetent til montering i CP. Deres formasjons representerer en uproduktiv montering pathway (stiplet pil) i motsetning til produktive monterings hendelser (heltrukne piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En kombinert tilnærming for å analysere Proteasome forsamlingen.
Koekspresjon (C) og lysat blanding (L) ble anvendt for å studere oppstilling av rekombinante proteasomer fra archaeon M. maripaludis. Proteiner ble renset ved immobilisert Kobolt Affinity Resin (ICAR). (A, B) Purified proteiner (10 mikrogram) ble lastet på ikke-denaturerende 5-10% stigning gels. Etter elektroforese ble peptidase aktivitet visualisert ved å legge gelen med bufferløsning inneholdende det fluorogene peptidsubstratet Suc-LLVY-AMC (B) før farging av gelen med kolloidal Coomassie flekk reagens (A). Svarte pilspisser angir posisjonene av den sammensatte 20S kjernepartikkel (CP), halv-proteasom-mellomprodukt (halv), dobbelt α-ring (DR) og enkelt α-ring (SR). Migreringen av flere molekylære størrelse standarder (i kDa) er angitt til høyre. (C) A ble også lastet opp på 15% SDS-PAGE-geler. Etter elektroforese ble gelene farget med en kolloidal Coomassie flekk reagens. Migrasjon av α-hans subenhet og helt moden (mβ) og umodne (proβ) p-subenheter er indikert. Posisjonen til 25 kDa molekylstørrelse standarden er vist til høyre. Stjerne indikerer en avkortet α-hans underenhet fragment skyldes uspesifikk proteolyse under lyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| plasmid | genotype | Kilde |
| AKB191 | pET42 PSMA-hans | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA-hans psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabell 1: bakterielle plasmider anvendt i denne studien. PSMA er archaeal α-subenheten genet og psmB er archaeal β-subenheten genet.
| buffer A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2. | Buffere B, C og E, er derivater av buffer A inneholdende imidazol. Det er nyttig å legge Imidazol fra en 2 M stam fremstilt i vann og lagret i mørke. |
| Native løse buffer | 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetrametyletylendiamin (TEMED) og 0,1% (w / v) Ammonium Perulfate (APS). | Forberedt frisk ikke mer enn en time før gelen skal polymerisert og holdt på is. Når du forbereder akrylamid gel løsninger i native løse buffer, er det nyttig å legge til Tris-HCl fra en 4X lager (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8). APS tilsettes umiddelbart før polymerisasjonen. |
| Native kjører buffer 10X lager | 250 mM Tris, 1,92 M glycin, ikke justerer pH. | |
| 5X innfødt prøvebuffer | 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) glycerol, spor av bromfenolblått. | Traser refererer til en meget liten mengde, som regel noen få korn overføres via spatel. |
| 5X SDS-prøvebuffer | 0,3 M Tris-HCl, pH 6,8, 600 mM ditiotreitol (DTT), 10% (vekt / volum) SDS, 50% (v / v) glycerol og spor av bromfenolblått. | Traser refererer til en meget liten mengde, som regel noen få korn overføres via spatel. |
| Utvikling buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC er et fluorogent peptidsubstrat anvendes for å bestemme proteasomet aktivitet. |
Tabell 2: Solutions, Media og buffere som brukes i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viser til fordel for en kombinert tilnærming til å analysere proteasome montering av nondenaturing PAGE ved anvendelse av rekombinante archaeal proteasomer. Den vanlige metoden for bakteriell 9,11 koekspresjon av proteasomer underenhetene gjør det mulig for hurtig analyse, men kan ikke avsløre nøkkelmontasjemellomprodukter. Vi foreslår å kombinere koekspresjon med lysat blanding for å utvikle et bredere bilde av monterings hendelser.
Fordelen med denne kombinerte fremgangsmåten er at til tross for å kreve separate uttrykk for α og p-subenheter for lysat blanding, er det fortsatt er relativt arbeidsvennlig. Resultatene kan også være semikvantitativ hvis man sørger for sammenlign og konsistente ekspresjonsnivåene for de enkelte proteiner. For dette formål anbefales vi å utføre den vanlige optimalisering av rekombinant proteinekspresjon for å bestemme tilstander som lar sammenlignbare nivåer av uttrykte proteiner før lysatet blanding. Optimalisering kan inneholde varierende induksjon time, induksjon temperatur, optisk densitet ved induksjon, bakteriell ekspresjon belastning, og så videre, inntil de ønskede nivåer av oppløselig protein blir oppnådd. Dette er spesielt viktig når man sammenligner WT og muterte versjoner av et protein fordi noen ganger mutanten kan oppvise lignende ekspresjonsnivåer, men nedsatt løselighet. Vi markerer også viktigheten av å bestemme protein konsentrasjoner av ICAR-renset prøver før lasting av nondenaturing SIDE. Selv med uttrykk optimalisering på plass, og med den beste pleie tatt for å sikre at parallelle prøver behandles gjennom rensetrinnene på samme måte, varians kan fortsatt bli utilsiktet innført. En konsentrasjonsmåling sørger for at den samme mengde av totalt protein er lastet pr prøvebrønnen. Dette gjør lane-til-lane sammenligninger av band intensitet for en gitt trekkende arter mer meningsfylt.
Hvis sammenlignbare og konsistente nivåer av protein uttrykk ikke kan oppnås for Lysate blanding, kan man alltid rense alle komponenter på forhånd og gjennomføre blande eksperimenter med rene proteiner. Dette har den fordelen at mer nøyaktige protein bestemmelser og dermed gjør tilnærmingen kvantitative. Imidlertid er ulempen med fullstendig rensing er at prosessen blir betydelig mer arbeidskrevende, noe som kan være til hinder for hurtig analyse av flere mutanter samtidig 18. En siste påminnelse verdt å nevne er at noen ganger skille uttrykk for α og p-subenheter kan ikke være mulig. Dette kan forekomme hvis en mutasjon fører til en underenhet for å være uoppløselig i E. coli når det uttrykkes på egen hånd, men tillater løselighet for å bli gjenvunnet når mutanten er uttrykt med dets bindingspartner. Hvis dette skjer, vil det begrense analysen til koekspresjon bare. Men dette er en påminnelse som kan oppstå i løpet av rekombinant protein uttrykk generelt, og er ikke spesielt for archaeal proteasomer subenheter 24,25.
Vi valgte å genErate hans-merket derivater av våre proteasomal proteiner grunn til enkel rensing og kostnader i ICAR harpiks. Andre epitop kodene er mulig, inkludert de for antistoffbasert rensing, og vi har nå uttrykt og renset Flag-merket versjoner av våre proteasomer underenheter (ikke vist). Men hvis rensing til homogenitet (eller øke omfanget av produksjonen) er nødvendig, hans-merkede versjonene gir de raskeste og mest kostnadseffektive måtene å gjøre det.
Det er en selvfølge at resultater oppnådd med rekombinante proteiner, enten de archaeal eller eukaryote proteiner som produseres i bakterier, vil få ytterligere betydning når fulgt opp med in vivo observasjoner. Imidlertid kan en in vivo metode ikke alltid være umiddelbart tilgjengelig eksperimentelt. Dette gjelder spesielt når motivet for studien er en stor, multisubunit kompleks som proteasome. Rekombinant protein tilnærminger gir et viktig startpunkt for Future eksperimenter. I tilfelle av proteasome vil sammenkobling rekombinant archaeal proteasome produksjon med nondenaturing PAGE fortsette å være svært effektiv i å belyse viktige trekk ved proteasome montering, som er delt mellom archaeal og eukaryote arter 9,11,12,18. En slik tilnærming er sannsynlig å være nyttige for å studere montering av andre store multiprotein komplekser i tillegg. Nylig har vi brukt denne strategien for å vise at archaeal proteasomer kan montere via mer enn én vei, og at a-ringene er ikke de obligate mellom under montering at de ble antatt å være 18. Det gjenstår å fastslå om det samme gjelder for eukaryote proteasomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av en forsknings Support Funds Grant (RSFG) fra Indiana University-Purdue University, Indianapolis, og delvis av en pris fra American Heart Association 14GRNT20390154, til ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
