Summary
このプロトコルは、サブユニットの同時発現および組換えプロテアソームアセンブリのより完全な検査のために混合postlysisサブユニットの両方を使用しています。
Abstract
プロテアソームは、人生のすべてのドメインで発見されています。そのアセンブリが完全に理解されていないけれども彼らは、真核生物では細胞内タンパク質分解の主要な経路を提供します。すべてのプロテアソームは、構造的に保存されたコア粒子（CP）を含む、または20Sプロテアソーム二七量体αサブユニットのリング間に挟まれた2つの七量体のβサブユニットの環を含みます。古細菌の20Sプロテアソームは、彼らの真核生物の対応物と比較して、組成単純であり、まだ彼らの両方が共通の組立機構を共有しています。その結果、古細菌の20Sプロテアソームは、真核生物のプロテアソームのアセンブリのための重要なモデルであり続けます。具体的には、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて結合された古細菌の20Sプロテアソームの組換え発現は、プロテアソーム生合成に多くの重要な洞察をもたらしました。ここでは、nondenaturi前に古細菌のプロテアソームのαおよびβサブユニットの共発現の通常の戦略を改善するための手段を議論しますngのPAGE。我々は、迅速かつ効率的なものの、単独で共発現アプローチはキーアセンブリ中間体を逃すことができることを示しています。プロテアソームの場合には、共発現は、一つの完全なα-リングと一つの完全なβ-リングを含む中間のハーフプロテアソームの検出を許可しない場合があります。しかし、この中間体は、容易に溶解物混合を介して検出されます。私たちは、溶解液の混合と共発現を組み合わせることアセンブリを分析する上で、より徹底したアプローチをもたらす、まだ労働nonintensiveままであることを示唆しています。このアプローチは、他の組み換え多タンパク質複合体の研究に有用であり得ます。
Introduction
多タンパク質複合体は、1多数の重要な細胞活動を行っています。これらの複合体の多くは、はるかに彼らのアセンブリ2,3についてよりも、構造と機能について知られています。プロテアソームは、そのような複雑であり、人生のすべてのドメインに含まれています。真核生物では、この分子機械は、ユビキチン/プロテアソームシステム（UPS）の中核であり、細胞内タンパク質分解4の主要な経路を提供します。 19S調節粒子（RP）6によって一方または両方の端部に蓋をすることができ20Sプロテアソーム、またはコア粒子（CP）5、（26Sプロテアソームと呼ばれる）、真核生物のプロテアソームは、二つの主要なサブアセンブリで構成されています。
20Sプロテアソームは、大区画化プロテアーゼです。その四次構造は、絶対に人生のすべてのドメインにわたって保存されており、構造的に関連したサブユニットの2つのタイプを含む4〜7員環のスタックで構成され、α;そして、5,7,8、β。真核生物では、二つの外側リングはそれぞれ7別個のαサブユニットから構成され、2つの内輪は、それぞれ7個別のβサブユニットから構成されています。タンパク質分解活性は、βサブユニットの3内に存在します。対照的に、古細菌のCPリングは、通常、αの唯一の種類及びβサブユニットの一種で構成されています。古細菌のプロテアソームは、その組成の単純さと彼らのが彼らの真核生物のカウンターパート9-13と共通の組立機構を共有の両方にプロテアソームアセンブリを研究するための重要なモデルシステムを提供しています。簡単に言えば、αサブユニットは、βサブユニットが集合し、その上に足場として機能する、最初のαリングに集合します。完全に組み立てられたCP（α7β7β7α7）を生じさせる結果のハーフプロテアソーム（α7β7）二量体化、。二量体化の間にβサブユニットに、プロペプチドが存在自己触媒触媒N末端スレオニンを露出、除去されます。アセンブリをモデル化するために古細菌プロテアソームの使用は、しばしば、大腸菌における組換え古細菌プロテアソームタンパク質の産生を利用します。それは自身のプロテアソームを産生しない宿主生物において、WT及び変異型の両方の、種々の組み合わせで製造されるサブユニットを可能にするので、これは価値のあるアプローチです。
多タンパク質複合体の集合を監視することが生化学的に組み立て中間体および前駆体から完全に組み立てられた複合体を分離分別方法のいくつかの種類を必要とします。その優れた解決能力に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を非変性することは、様々な大規模な多タンパク質複合体14-17の分別に特に有用であることが証明されています。組換え古細菌のプロテアソームの生産と非変性PAGEの組み合わせはdissectinに強力なアプローチとなっていますグラムプロテアソームアセンブリ9,11,12,18。しかし、このアプローチが適用される（ すなわち 、α及びβサブユニットの組換え共発現を介して）通常の方法は重大な欠点を有しています。アセンブリ反応は、協同組合と強く濃度依存性の3です。細胞内部のタンパク質濃度は、アセンブリ反応は、インビボで急速に進んで、排除体積効果により、19非常に高いことを考えます。したがって、αおよびβサブユニットが同時発現させる際に重要なアセンブリ中間体を欠場することが可能です。
ここでは、組換え古細菌のプロテアソームサブユニットを使用して、プロテアソームアセンブリの研究に合わせたアプローチを主張しています。このアプローチでは、両方の同時発現と溶解液の混合方法が使用されます。共発現が少ない労働集約的であるため、前者はアセンブリの迅速な分析を可能にします。後者は、混合したαおよびβサブユニットの別々の発現に依存します。このrequiがけれども共発現よりも解像度もう少し努力が、それは同時発現の際に失われる中間体を検出する能力によって補償以上のものです。一緒に、これらの2つの方法は、プロテアソームのアセンブリのより完全な像を提供することができます。
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Protocol
1.細菌発現。
注：この研究で使用した発現プラスミドを、 表1に記載されています。本研究で用いた溶液、培地、及び緩衝液は、表2に記載されています。古細菌のプロテアソームサブユニット遺伝子のクローニングおよび発現プラスミドの生成は、他の場所18,20に記載されています。簡単に言えば、サブユニットの組換え共発現のためのプラスミドは、個々のサブユニット18,20の同等の発現レベルを得ることに役立つシストロン性オペロンの戦略を採用しています。下記の式のパラメータは、この研究におけるプロテアソームサブユニットのために最適であることが経験的に決定されました。他の古細菌種由来の、または他の組換えタンパク質複合体（考察を参照）プロテアソームのために、他のプロテアソーム変異体のための発現を最適化する必要があるかもしれません。
- （化学的コンピテント大腸菌 BL21に関心の発現プラスミドをトランスフォームDE3）細胞。
- たて氷上で解凍したDE3細胞のアリコートに - （100 ngの典型的には50）、そして20分間氷上でインキュベートし続けプラスミドの2μL - 1を追加します。
- 熱ショック45秒、42℃で細胞とadditionl 2分間氷上にチューブを返します。
- LB培地1mlを加え、1時間（150 rpm）し、振盪しながら37℃でインキュベートします。
- （カナマイシン（すべてのプラスミドは、この抗生物質に本研究エンコード抵抗で使用される）を補充したLB固体培地を含有するプレート、）LB-館プレート上に形質転換混合物の200μL - 100を広げます。 37ºCO / Nでプレートをインキュベートします。
- 次の朝、ガラス培養チューブ内の液体LB館メディアの3ミリリットルにLB-館プレートから単一コロニーを接種します。約2.5（150 rpm）し、振とうしながら37ºCでインキュベート - 3 H、またはまで濁りが観察されます。
- 分光光度計において600nm（OD 600）での培養物の光学密度を測定します。細胞カルトを希釈6 mLの最終容積で0.4のOD 600に予め温めたLB-館メディアの適切な量とURE。 40分間37ºCで振とう再開します。
- 1mMの最終濃度までストック溶液からIPTGを添加することにより、液体培養におけるタンパク質発現を誘導します。 7時間 - 約6のために（150 rpm）し振とうしながら37ºCでインキュベートします。
- 1.5 mLのマイクロチューブに、その全体が細菌細胞培養物を収穫。
- マイクロ遠心チューブに文化の1.5 mLを加え。 1分間10,000×gで遠心分離します。
- 上清を捨て、ペレットに同じ培養の別の1.5 mLを加え。 1分間10,000×gで遠心分離します。
- 全培養は、マイクロ遠心チューブに収穫されるまで、ステップ1.11を繰り返します。
- 溶解するまで-80℃で誘導されたペレットを保管してください。
2.細菌の溶解および溶解物をミキシング。
注意： すなわち、それはタンパク質が発現し、可溶性れたことを確認）重要な制御を提供します。したがって、我々は非常に最初にTSP分析などをお勧めします。最適なプロトコルは、特定のサブユニットの組み合わせのために達成されると、TSP分析は、厳密にそれが以下にオプションとして記載されている理由である必要はありません。
- 細菌細胞および可溶性画分の準備の溶解。
- 5分間氷上で誘導された細胞ペレットを解凍します。溶解緩衝液600μLにペレットを再懸濁。
- 株式会社総粗溶解物を生成するために30分間（150 rpm）し振とうしながら30ºCでサスペンションをubate。
注：次の手順と次のサブセクションはオプションです。 - 独立した1.5 mLのマイクロ遠心チューブに総粗溶解物から2 25μLアリコートを削除し、次のようにTSPの分析を行います。
- 2 25μLアリコートのいずれかに、1×の最終濃度に5×SDS試料緩衝液を加えます。 「総粗溶解物」の「T」とのチューブにラベルを付けます。
- 完全にタンパク質を変性させるために5分間100ºCで「T」のサンプルをインキュベートします。
- 一方、10分間、10,000×gで第25μLを遠心それを取ります。慎重に小さなペレットを乱すことなく、上清を除去し、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。 「可溶性画分」のために、この新しいチューブ「S」をラベルを付けます。
- behi左の小さなペレットにndは前のステップで、再懸濁するために溶解バッファーとボルテックスの25μLを追加します。 「ペレット画分 "のための" P "このチューブにラベルを付けます。
- 「S」および「P」のチューブに5×SDSサンプル緩衝液の6μLを加え、上記のように100ºCでインキュベートします。
注：TSPサンプルは発現を分析し、その日に使用しない場合に必要になるまで、彼らは-20ºCで凍結することができます。 12％および/または15％の標準的なSDS-PAGEゲル上ですぐにロードする前に、上記のように解凍したら、それらは、100ºCで再びインキュベートしなければなりません。
- TSP解析が行われている間、遠心分離機総粗溶解物の残りの550μLを10分間10,000×gで（または合計粗溶解物の全体の600μLTSP分析が行われていない場合）。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を収集します。これは、精製のために使用される水溶性の溶解物です。
- 溶解物の混合。
- ステップ2.1.1および上記2.1.2で説明したように溶解を行います。
- 希望のβサブユニットを発現する細菌からの総粗溶解物の600μLで所望のαサブユニットを発現する細菌からの総粗溶解物の600μLを混ぜます。ゆっくりと30分間振盪しながら37ºCでインキュベートします。
注：（説明を参照）を混合溶解物中の最大アセンブリを達成するために、インキュベーション時間を最適化する必要があるかもしれません。ここに提示された時間と温度は、この研究における組換えタンパク質のために最適であり、他の場所18を決定しました。 - 遠心分離機10分間10,000×gで混合溶解物を不溶性ペレットからの可溶性物質を分離します。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。タンパク質精製のために、この混合可溶性溶解液を使用してください。
固定化コバルト親和性樹脂を介して3.タンパク質精製（ICAR）。
- 樹脂を平衡化します。
- 徹底的に瓶を反転させることにより、樹脂を再懸濁し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブにスラリーの50μLを移します。ペレット樹脂に2分間700×gで遠心分離します。注意深く上清を吸引。
注：私たちは、液体の大部分を除去するために、青色1 mLのピペットチップを使用してピペット吸引を行います。白い2μLチップビーズを覆う液体の非常に薄い層を残し、残りの上清の除去の微調整のために使用されます。 - 優しく樹脂をペレットに2分間700×gで樹脂と遠心分離機を再懸濁するために1 mLの緩衝液Aミックスの追加。注意深く上清を吸引し、この洗浄ステップをもう一度繰り返します。
- 徹底的に瓶を反転させることにより、樹脂を再懸濁し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブにスラリーの50μLを移します。ペレット樹脂に2分間700×gで遠心分離します。注意深く上清を吸引。
- 平衡化した樹脂に2.1または2.2で以前に得られた可溶性溶解液を適用します。 60分間、4ºCで穏やかに回転させながらチューブをインキュベートします。 グラム<700×でチューブを遠心/ em>の5分間、注意深く上清を吸引除去します。
- 非特異的に結合したタンパク質を除去するために、次のように樹脂を洗浄します。
- 再懸濁バッファーAを1mLと樹脂と10分間、4ºCで穏やかに振動でインキュベートします。 5分間700×gでチューブを遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。
- 緩衝液B（5 mMのイミダゾールとの緩衝液A）1mlで再懸濁樹脂と5分間4ºCで穏やかに振動でインキュベートします。 5分間700×gでチューブを遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。
- 緩衝液C（10mMのイミダゾールとの緩衝液A）1mlで再懸濁樹脂と5分間4ºCで穏やかに振動でインキュベートします。 5分間700×gでチューブを遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。
- 緩衝液Eの400μL（200 mMのイミダゾールとの緩衝液A）トンを追加することによってタンパク質を溶出樹脂O。穏やかに5分間4ºCで揺動させながらインキュベートします。 5分間700×gで遠心分離します。
- 新しい1.5 mLの遠心分離管に精製されたタンパク質を含む上清を移します。
- 次のようにシリアル遠心分離により精製したタンパク質を脱塩します。
- 精製タンパク質の400μLに、100μLの緩衝液Aを（これは200 mMのから160 mmのイミダゾール濃度を低下させる）を追加します。 10kDaの分子量カットオフで0.5 mLの超遠心フィルターに精製したタンパク質を適用します。 5分間14,000×gで遠心分離します。
- ろ液を捨て、再び濃縮液と遠心分離を希釈するために400μlのBuffer Aを追加します。イミダゾール濃度は4 mMのを下回るまで、遠心分離/希釈のサイクルを続けます。各遠心分離〜70μlの（または約7倍）までの500μLを集中した場合の例としては、2つのサイクルがAPPRし始めて160 mMのイミダゾール濃度（7×7 = 49倍）を削減しますoximately 3.3 mMの。
- BCAアッセイ21を使用して脱塩試料のタンパク質濃度を測定します。
注：製造業者の使用説明書に記載のように脱塩は、BCAアッセイの許容限界以下イミダゾールレベルを低減することが要求されます。我々の研究室では、それは敏感であるため、BCAアッセイを好む大きなダイナミックレンジを有しており、はるかに少ないタンパク質間変動を示します。しかし、タンパク質濃度を決定するための他の方法は、BCAアッセイのために置換することができます。キーは、各方法の利点と限界を認識することです。
- 1Xの最終濃度に5Xネイティブサンプルバッファーを追加し、電気泳動に進みます。また、後の分析のために-20ºCで保存サンプル。
4.非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）。
注意：未重合アクリルアミドは神経毒です。適切な保護GEAを着用rを。
- 次のように非変性PAGEゲルを準備します。
- 清浄なガラス板を使用して鋳造し、スタンドを鋳造するためのゲルカセットを準備します。小さな磁気撹拌機の上に勾配メーカーを置き、各チャンバー内に小さな撹拌棒を配置します。
- （w / v）のアクリルアミドおよび2％（w / v）の40％を使用して、ビスアクリルアミドストック溶液、ネイティブ解決バッファにおけるアクリルアミドゲル溶液（w / v）の5％から10％に調製。 1：ビスアクリルアミドする総アクリルアミドの比は37.5であることを確認してください。氷上でチル注ぐ前に。
注：SDS 22を省略して、ここで使用される非変性PAGEシステムは、LaemmliのSDS-PAGEシステムと本質的に同一です。 - 重合を開始し（水で調製し、10％（w / v）のストック溶液から）アクリルアミド溶液にアンモニウム過硫酸塩を加えます。アンモニウム過硫酸塩の最終濃度は0.1％（W / V）。
- 勾配メーカーの2室にアクリルアミドのソリューションを注ぎます。出口チューブ挿入とbetweenゲルカセットのプレートは、磁気撹拌機を活性化し、勾配メーカーのバルブを開きます。 10％非変性勾配ゲル - 5を注ぎます。
- 一度注ぎ、イソプロパノールの薄層でゲルをオーバーレイし、ゲルを30分間重合を可能にします。この間、ネイティブ解決バッファ内の新鮮な5％アクリルアミドゲル溶液を調製。ゲルセットした後、イソプロパノールをオフに注ぎ、噴霧ボトルからの脱イオン水でゲルの上部をすすぎます。
- 上記で調製した5％ゲル溶液に、ガラス板がいっぱいになるまでアンモニウム過硫酸塩を追加（4.1.3で説明したとおりに）、重合ゲルの上に注ぎます。ゲルコームを挿入します。オーバーレイされたゲルは、さらに30分間重合させました。
- ゲルが重合されると、電気泳動装置にゲルカセットを組み立てます。また、使用するための準備ができるまで、湿らせたペーパータオルやプラスチックラップに包まれた4ºCでゲルを、格納します。
- 非変性PAGEゲルはELECに組み立てられると泳動装置は、10Xネイティブランニング緩衝在庫から新たに調製1Xネイティブランニング緩衝液でタンクを埋めます。
- 各ウェルガラスシリンジを使用してに、区間3の終わりに得られた精製タンパク質の負荷は10μg。
- ウェルの1つに（1Xネイティブランニングバッファー中に希釈）、高分子量天然のタンパク質標準の負荷2μL。
- （ - 4.5時間約4）色素の先端がゲルをオフに実行されるまで55 Vおよび4ºCでゲルを実行します。
- 非変性ゲルに加えて、標準的なSDS-PAGE 22により精製タンパク質のアリコートを分析します。
- 1Xの最終濃度の5×SDSサンプル緩衝液で、区間3の終わりに得られた精製タンパク質試料のアリコート（10μgの）を混合します。
- 22標準12％および/または15％SDS-PAGEゲル上に5分と負荷のために100ºCでインキュベートします。
- 色素の先端がゲルをオフに実行するまで、これは約アドオンである（120 Vで、その後20分間、80Vで動作し、itional 12％ゲルを75分間、15％ゲル、120分）。
5.活動およびタンパク質染色を可視化。
- 電気泳動に続いて、慎重に別のガラス板と、脱イオン水50mLを含むゲルトレイに非変性ゲルを移します。穏やかに5分間揺らしながらゲルをすすぎます。水を捨て、この洗浄工程を3回繰り返します。
- 次のように基板オーバーレイアッセイを行います。
- 蛍光性ペプチド基質のSuc-LLVY-AMCを含有する現像緩衝液の1 mLを加え、ゲル全体に均一に広がります。 30分間、37ºCでインキュベートします。
注：ガラスロッドまたはゲルリリーサー（別のガラスプレートに使用されるプラスチックの小さなくさび）をゲル上に液体を広げるために使用することができます。 - 慎重にゲルイメージングシステムのUVトランスイルミネーターにゲルを転送し、切断されたペプチド基質に起因する蛍光を観察します。記録画像。慎重にゲルBAを転送ゲルトレイにCK。
- 穏やかに揺り動かしながら5分間脱イオン水50mlで2回ゲルを洗浄します。
- 穏やかに揺り動かしながら60分間、コロイド状クーマシー染色試薬10mlでゲルを染色。 50 mLの水で脱染ゲル背景が透明になるまで。この染色工程は、同様に、標準的なSDS-PAGEゲルに適用されます。
- 蛍光性ペプチド基質のSuc-LLVY-AMCを含有する現像緩衝液の1 mLを加え、ゲル全体に均一に広がります。 30分間、37ºCでインキュベートします。
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Representative Results
αサブユニットはリング9を形成するために結合するとき、プロテアソームアセンブリ（ 図1）が開始されます。 C末端ヘキサヒスチジンは、（彼のタグ）誘導体（ 表1）のタグを付けたように古細菌Methanococcus maripaludis S2からのαサブユニットは、大腸菌で発現されるときに示すことができます。組換えα-Hisタンパク質はICARにより精製し、PAGEを非変性により分析したとき、2つのバンドは、（ 図2A、レーン1）が観察されました。我々は以前、これらはシングルαリング（SR）とダブルα-リング（DR）18に対応することが実証されています。 DRは、その後の組み立て9,18のための生産的ではないデッドエンドの種です。
α-彼のサブユニットは、組換え古細菌プロテアソームのアセンブリがアッセイされる通常の方法を表す、βサブユニットと共発現した場合には、新たな種は670 kDaのサイズのスタンドの近くの移行が観察されましたARD（ 図2A、レーン3）。この種は、タンパク質分解的に活性であった（ 図2B、レーン3）、そのプロペプチド（ 図2C、レーン3）削除されているだけで、完全に成熟したβサブユニット（Mβ）を含有していました。この種は完全に成熟したCPです。このサンプルはまた、SRは中間既知の集合体であるため、期待されたいくつかのSR種、、ないDR種を含んでいました。 α-彼とβサブユニットが同時発現させるDRの欠如は、正しいアセンブリが（より詳細な分析のために18を参照）βサブユニットの組み込みがDRの非生産的形成を負かすことができたことは、このような十分に速く起こっていたことを示唆しています。
共発現法の制限を実証し、そして合わせたアプローチの有用性を主張するために、α-彼とβサブユニットは、 大腸菌内で別々に発現させました。溶解後、可溶性画分を混合し、タンパク質は、前ICARにより精製しました非変性PAGEによる分析。完全に機能的なプロテアソームはまた、（ 図2Aおよび図2B、レーン2）のアプローチを混合溶解物を介して生成された、及び予想通りSR種も観察されました。溶解液の混合試料中のDR種の再出現は、一旦形成され、βサブユニットが可逆的にそれを分解することができないことを示しています。これは、DRのデッドエンドの性質を強調しています。興味深いことに、新しい種はまた、単に（「半分」と呼ばれる）CPの下に移行し、サンプルを混合溶解液に登場しました。最近、我々は、この種の半プロテアソーム（α7β7）18に対応することを示しました。ここでこれを説明するために、βサブユニット突然変異体（R166W）を用いました。この変異は損なわハーフプロテアソーム二量化18につながる、β-βリング相互作用を破壊します。ハーフプロテアソームはCPへの即時の前駆体であるので、R166W変異は、ハーフプロテアソームのANの両方の蓄積につながるはずCPの形成にダ減少。溶解物は、α-Hisおよびβと混合した場合（R166W）サブユニットを行い、CPの低いレベルと「半」種のレベルの増加は、（ 図2A、レーン4）が観察されました。これは、これらの二つのバンドのための前駆体 - 生成物の関係と一致して、半プロテアソームとして「半分」の種のアイデンティティーを確認します。変異体サンプル（レーン2対レーン4）におけるハーフプロテアソームのわずかに速い移行が原因でβサブユニットの質量電荷比を変更することR166W変異に起因する可能性が高いです。
溶解液の混合中にハーフプロテアソームを視覚化する能力は、主に細胞内で高濃度のタンパク質と比較して溶解液中のはるかに低いタンパク質濃度に起因しています。より低い濃度は、より多くの人口ので、検出可能になるために、中間体を可能にする効率の低い（ すなわち遅い）アセンブリをもたらします。ハーフプロテアソームの外観に加えて、そのプロペプチドを保持する未処理のβサブユニットは、検出可能になる（proβ）：追加の観察は溶解液の混合中に減少した組立性を強調しています。プロペプチド処理は半分プロテアソームの二量体化するまで発生しないので、未熟proβフォームの外観は、ハーフプロテアソームの蓄積のレベル（ 図2C、レーン4対レーン2対レーン3を比較）と相関します。 R166W変異体の場合には、溶解物の混合中にプロ処理障害はCP少量の形をしていても絶対的です。プロペプチド処理だけでなく、ハーフプロテアソーム二量体化を必要とするだけでなく、R166W変異が適切に形成されたβ-βのリングインタフェース23余裕がないためです。溶解液の混合対共発現のより詳細な物語、それが組換えプロテアソームアセンブリに関連した、ここでは18見つけることができます。
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図1：コア粒子（CP）アセンブリの簡略回路図。
αサブユニットは、βサブユニットの取り込みのための鋳型となるシングルα-リング最初の（SR）に組み立てることができます。これはすぐに二量化し、ハーフプロテアソームの中間（半分）の生成につながります。二量体化と同時に、図示しないβサブユニットプロペプチドは、自己触媒的に完全に機能するコア粒子（CP）を生じさせるに除去されます。ダブルα-リング（DR）は、SRから生じ、CPへの組立のために有能ではありませんすることができます。その形成は、生産アセンブリイベント（実線の矢印）とは対照的に、非生産組立経路（破線矢印）を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：アッセイするプロテアソームアセンブリのための複合的アプローチ。
共発現（C）及び溶解液混合（L）は、古細菌M. maripaludisから組換えプロテアソームのアセンブリを研究するために使用しました。タンパク質は、固定化コバルト親和性樹脂（ICAR）によって精製しました。 10％の勾配ゲル- （A、B）精製されたタンパク質（10μg）を非変性5にロードしました。電気泳動後、ペプチダーゼ活性は、蛍光発生ペプチド基質を含む緩衝液でゲルを重ねることによって可視化したのSuc-LLVY-AMC（B）、コロイド状クーマシー染色試薬（A）を用いてゲルを染色する前に。黒矢じりは、組み立てられた20Sコア粒子（CP）、ハーフプロテアソームの中間（半分）、二重α-リング（DR）とシングルα-リング（SR）の位置を示します。 （kDaの中で）いくつかの分子サイズ規格の移行が右側に表示されています。 （C） AからG>精製タンパク質（10μg）を、また、15％SDS-PAGEゲルにロードしました。電気泳動後、ゲルをコロイド状クーマシー染色試薬で染色しました。 α-彼のサブユニットと完全に成熟した（Mβ）のおよび未成熟（proβ）βサブユニットの移行が示されています。 25kDaの分子サイズの標準の位置が右に示されています。アスタリスクは、溶解中に非特異的なタンパク質分解から生じる短縮型α-彼のサブユニットの断片を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| プラスミド | 遺伝子型 | ソース |
| AKB191 | pET42 PSMA-彼 | Kusmierczykら、（2011） |
| AKB464 | pET42 PSMA-彼psmB | Kusmierczykら、（2011） |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfairら、（2015） |
| AKB952 | pET42 psmB（R166W） | Panfairら、（2015） |
表1： 本研究で用いた細菌プラスミド。 PSMAは、古細菌のαサブユニット遺伝子であるとpsmBは、古細菌のβサブユニット遺伝子です。
| 緩衝液A | 50mMのHEPES-NaOHを、pHが7.5、300mMのNaCl、5mMのMgCl 2。 | 緩衝液B、C、およびEは、イミダゾールを含有する緩衝液Aの誘導体です。 2 M入荷水で調製し、暗所に保存されているからイミダゾールを追加するのに便利です。 |
| ネイティブ解決バッファ | 375 mMトリス塩酸、pHを8.8、0.1％（v / v）のテトラエチレンジアミン（TEMED）および0.1％（W / V）アンモニウムPerulfate（APS）。 | ゲルを重合し、氷上に保持される前の時間よりも新鮮なこれ以上を用意していません。ネイティブ解決バッファ中のアクリルアミドゲル溶液を調製する場合には、4Xストック（1.5 Mトリス-HCl、pHが8.8）からのTris-HClを添加することが有用です。 APSは、重合の直前に追加されます。 |
| ネイティブランニングバッファ10Xストック | 250 mMトリスは、1.92 Mグリシン、pHを調整しないでください。 | |
| 5Xネイティブサンプルバッファー | 0.5 Mトリス-HCl、pHが8.8、50％（v / v）のグリセロール、ブロモフェノールブルーの痕跡。 | トレースは、通常、いくつかの粒子が、スパチュラを介して転送され、非常に少量を指します。 |
| 5X SDS試料緩衝液 | 0.3 Mトリス-HCl、pHが6.8、600 mMのジチオスレイトール（DTT）、10％（W / V）SDS、50％（v / v）のグリセロール及びブロモフェノールブルーの痕跡。 | トレースは、スパチュラを介して転送通常は数粒、非常に少ない量を意味します。 |
| 開発バッファ | 50mMのトリス-HCl、pH7.5で、5mMのMgCl 2、1mMのATP、50mMのあるSuc-LLVY-AMC。 | SUC-LLVY-AMCは、プロテアソーム活性をアッセイするために使用される蛍光発生ペプチド基質です。 |
表2：本研究で使用される溶液、培地、及び緩衝液。
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Discussion
私たちは、組換え古細菌のプロテアソームを使用してページを非変性することによりプロテアソームアセンブリを分析する組み合わせアプローチの利点を実証します。プロテアソームサブユニットの細菌共発現する通常の方法9,11は、迅速な分析を可能にしますが、キーアセンブリ中間体を明らかにしないことがあります。私たちは、アセンブリイベントの広い画像を開発するために混合溶解物と共発現を組み合わせることをお勧めします。
この組み合わせたアプローチの利点は、αの別々の発現を必要と溶解液の混合にβサブユニットにもかかわらず、それはまだ比較的労働フレンドリーれているということです。一つは、個々のタンパク質の同等と一貫した発現レベルを保証する場合、結果はまた、半定量的であることができます。この目的のために、我々は、溶解物の混合の前に発現されるタンパク質の同等のレベルを可能にする条件を決定するために、組換えタンパク質発現の通常の最適化を行うことをお勧めします。最適化は、様々な誘導ティムを含むことができ、E、誘導温度、誘導、細菌発現株での光学密度など、可溶性タンパク質の所望のレベルが達成されるまで。時々変異体が同等の発現レベルを示すことができるので、タンパク質のWTおよび変異バージョンを比較するが、溶解性が減少するとき、これは特に重要です。また、前の非変性PAGEをロードするICAR精製サンプルのタンパク質濃度を決定することの重要性を強調しています。でも場所における発現の最適化と、並列サンプルが同じ方法で精製工程を介して処理されることを保証するために取ら最善の注意を払って、分散はまだ不注意に導入することができます。濃度測定は、総タンパク質の同量もサンプル毎にロードされることを保証します。これは、指定された移行の種のためのバンド強度のレーン・ツー・レーンの比較がより有意義になります。
タンパク質発現の比較可能かつ一貫したレベルがリサのために達成することができない場合teの混合は、1は常に、事前にすべてのコンポーネントを浄化し、純粋なタンパク質との混合実験に行うことができます。これは、より正確なタンパク質決定を可能にするという利点を有し、従って、接近定量を行います。しかし、完全な精製の欠点は、プロセスが迅速に複数の変異体の解析を同時に18を排除することができ、かなり多くの労働集約的、なることです。言及する価値が最終的な注意点は、αおよびβサブユニットの、時には別々の発現が可能ではないかもしれないということです。突然変異が独自に発現された場合、大腸菌中で不溶性であるサブユニットを引き起こすが、変異体は、その結合パートナーで表現されたときに溶解度が回復することを可能にする場合に発生します。この問題が発生した場合、それが唯一の共発現に分析を制限します。しかし、これは一般的に、組換えタンパク質の発現の際に発生する可能性が警告され、古細菌のプロテアソームサブユニット24,25に固有のものではありません。
私たちは、世代に選びましたICAR樹脂の精製と手頃な価格の容易さに起因する当社のプロテアソームタンパク質のヒスチジンタグ付加誘導体がERATE。他のエピトープタグは、抗体ベースの精製用のものを含め、可能であり、我々が正常に表明していると私たちのプロテアソームサブユニットの精製したFlagタグ付きバージョンは（図示せず）。均質性（または生産の規模を増大させる）に精製が必要とされる場合には、彼のタグ付きバージョンは、そうすることの最速かつ最も費用対効果の高い手段を提供します。
in vivoでの観察とフォローアップ時の組換えタンパク質を用いて得られた結果、彼らは古さや細菌中で産生さ真核生物のタンパク質は、さらに意味を獲得することが与えられています。しかし、in vivoでのアプローチは、常に実験的にすぐにアクセスできないことがあります。研究の対象が大きい場合には、そのようなプロテアソームのような複雑な多サブ特に当てはまります。組換えタンパク質のアプローチはじだ重要な出発点を提供します実験の再。プロテアソームの場合には、非変性PAGEとペアリングする組換え古細菌のプロテアソームの生産は、古細菌と真核生物種9,11,12,18の間で共有されているプロテアソームアセンブリの主要な機能を、解明するのに非常に有効であり続けるだろう。このようなアプローチは、他の大きな多タンパク質複合体のアセンブリを研究するために有用である可能性があります。最近、我々は、古細菌のプロテアソームは、複数の経路を介して組み立てることができることを実証するために、この戦略を使用し、そのα-リングは、それらが18であると考えられていた組み立て中に絶対的な中間体ではありません。同様に、真核生物のプロテアソームのために当てはまるかどうかが決定されていません。
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Acknowledgments
この作品はARKに、米国心臓協会14GRNT20390154からの受賞によって、部分的にはインディアナ大学 - パデュー大学、インディアナポリスからの研究支援基金助成金（RSFG）によって部分的にサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
