Summary
Bu protokol alt birimi yakımının birlikte ve rekombinant proteazom montaj daha kapsamlı bir muayene için karıştırma postlysis alt birimini hem kullanır.
Abstract
Proteazomlar hayatın her alanında bulunur. bunların montajı tam olarak anlaşılamamıştır olmamakla birlikte, Ökaryotlarda hücre içi protein degradasyon ana yol sağlar. Tüm proteazomların iki heptameric α alt birimi halkaları arasında sandviç yapılmış iki heptameric β alt birimi halkalar ihtiva eden bir yapısal korunmuş çekirdek partikülü (CP) ya da 20S proteazomu içerir. Arke 20S proteazomlar kendi ökaryotik muadillerine göre içerik olarak daha basittir, ancak her ikisi de ortak bir montaj mekanizmasını paylaşır. Sonuç olarak, arke 20S proteazomlar ökaryotik proteazom montajı için önemli modeller olmaya devam etmektedir. Özellikle, nondenaturing poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile birleştiğinde arke 20S proteazomların rekombinant ifade proteazom biyogenezi içine birçok önemli bilgiler vermiştir. Burada, arke proteazom a koekspresyonu olağan stratejisi geliştirmek için bir araç tartışmak ve ß alt birimleri önce nondenaturi içinng PAGE. Bu hızlı ve etkili olsa da, tek başına birlikte ekspresyonu yaklaşım, kilit düzeneği ara maddeleri kaçırma olduğunu göstermektedir. proteazom durumunda, birlikte ekspresyonu yarı proteazom saptanmasını bir ara ihtiva eden tam bir α-ring ve bir tam β-halka izin vermeyebilir. Bununla birlikte, bu ara madde hali hazırda lizat karıştırma ile tespit edilebilir. Biz Lizat karıştırma yakımının birlikte birleştirerek takımını analiz daha kapsamlı bir yaklaşım verir, ancak emek nonintensive kaldığını göstermektedir. Bu yaklaşım, diğer rekombinant multiprotein kompleksleri çalışılması için yararlı olabilir.
Introduction
Multiprotein kompleksleri çok sayıda kritik hücresel faaliyetler 1 yürütmek. Bu komplekslerin çoğu için, çok daha fazla kendi montajı 2,3 hakkında daha kendi yapısı ve işlevi hakkında bilinmektedir. proteazom böyle bir kompleks ve hayatın tüm alanlarında bulunur. Ökaryotlarda, bu moleküler makine Ubiquitin / Proteozom Sistemi (UPS) merkezinde yer alır ve hücre içi protein yıkımı 4 ana yol sağlar. Bir 20S proteazomu veya çekirdek parçacığına (BF) 5, bir 19S düzenleyici parçacık (RP), 6 ile bir ya da her iki ucunda başlıklı edilebilir: (26S proteazomu olarak anılacaktır) ökariyotik proteazom iki ana alt montajlar oluşmaktadır.
20S proteazomu büyük bölümlere proteazdır. Bu kuaterner yapı kesinlikle yaşamın her alan boyunca muhafaza ve yapısal olarak ilgili alt-birimlerinin iki türü ihtiva eden dört ila yedi üyeli halkalardan oluşan bir istifin oluşur, α; ve 5,7,8 ß. Ökaryotlarda, iki dış halkalar, her yedi farklı α alt birimlerinden oluşan ve iki iç halkalar, her yedi farklı β alt birimlerinden oluşur; proteolitik aktivitesi β alt birimlerine üç içinde bulunur. Buna karşılık, arke ve bakteri CP halkalar genellikle a sadece bir tip ve β alt birimi bir tür oluşmaktadır. Arke proteazomlar nedeniyle kompozisyon sadelik ve onların kendi ökaryotik meslektaşları 9-13 ortak bir montaj mekanizmasını paylaşan hem proteazom düzeneğini incelemek için önemli bir model sistem sağladı. Kısaca, α alt birimi alt-birimleri monte p olan, üzerine bir iskele olarak hizmet eden birinci α halkalar halinde bir araya getirin. Sebebiyet veren Elde edilen yarı proteazomların (α 7 β 7) dimerize tam CP (α 7 β 7 β 7 α 7) monte etmek. dimerizasyonu sırasında propeptidlerinin ß alt birimler üzerinde mevcutotokatalitik katalitik N-terminal treonin açığa çıkarılır. Montaj model arkeal proteazomların kullanımı sıklıkla Escherichia coli içinde rekombinant arke proteazom proteinlerin üretiminde yararlanır. çeşitli kombinasyonlarda üretilecek alt birimi kendi proteazomların üretmeyen bir konakçı organizmada, WT ve mutant versiyonları gibi, sağlar, bu değerli bir yaklaşımdır.
Çok protein komplekslerinin birleşmesini İzleme biyokimyasal montaj ara ve öncüleri tamamen monte kompleksleri ayıran bölme yönteminin çeşit gerektirir. Bağlı poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) nondenaturing üstün çözme kapasitesi, çeşitli büyük multiprotein kompleksleri 14-17 fraksiyonlanması, özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır. rekombinant arke proteazom üretimi ve nondenaturing PAGE kombinasyonu disseksiyonu güçlü bir yaklaşım haline gelmiştirg proteozom düzeneği 9,11,12,18. Bununla birlikte, bu yaklaşım, tatbik edildiği (yani. Α ve β alt birimlerine rekombinant ekspresyonuna ile) normal bir yöntem önemli bir dezavantaja sahiptir. Meclis reaksiyonları kooperatif ve güçlü konsantrasyon bağımlı 3 vardır. Hücre içinde protein konsantrasyonu nedeniyle dışlanmış hacim etkileri, 19 çok yüksek olduğu göz önüne alındığında, montaj reaksiyonları in vivo hızla devam edin. Dolayısıyla α ve β alt birimi eksprese olduğunda önemli düzeneği ara maddeleri kaçırmak mümkündür.
Burada, rekombinant arke proteazom alt birimlerini kullanarak proteazom montaj çalışmasında bir kombine yaklaşım savunuyorlar. Bu yaklaşımda, hem birlikte ekspresyonu ve lizat karıştırma yöntemleri kullanılmaktadır. Koekspresyon daha az emek yoğun olması nedeniyle eski meclis hızlı analiz sağlar. ikinci karıştırma ardından α ve β alt ünitelerle birlikte, ayrı ayrı ifade bağlıdır. Bu requi olsakoekspresyonu daha res biraz daha çaba, bu koekspresyonu sırasında kaçırılan ara maddelerin tespit etme yeteneğine tarafından telafi daha fazladır. Birlikte, bu iki yöntem proteazom düzeneğinin daha eksiksiz bir resim sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriyel ifadesi.
Not: Bu çalışmada kullanılan ifade plazmidleri Tablo 1 'de tarif edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan çözümler, medya ve tamponlar Tablo 2'de açıklanmıştır. Arke proteazom alt-birim genlerinin klonlanması ve ifadesi plazmid üretimi başka 18,20 açıklanmaktadır. Kısaca, alt birimlerin rekombinant koekspresyonu için plazmidler bireysel alt birimden 18,20 karşılaştırılabilir ifade seviyelerini elde yardımcı olan bir bicistronic operon stratejisini kullanır. Aşağıda listelenen sentezleme parametreler Bu çalışmada, proteazom alt birimleri için en uygun olduğu deneysel olarak tespit edilmiştir. Diğer arke türlerden ya da diğer rekombinant protein kompleksleri (tartışma) için proteazomların gibi diğer proteazom mutantlar için sentezlenmesini optimize etmek üzere gerekli olabilir.
- (Kimyasal yetkili E.coli BL21 ilgi ifadesidir plazmid DönüşümüDE3) hücreleri.
- Taze buz üzerinde eritildi DE3 hücrelerinin bir kısım göre - (100 ng, tipik olarak 50), ve 20 dakika buz üzerinde inkübe devam plazmid 2 uL - 1 eklenir.
- Isı şoku 45 sn 42 ° C 'de hücreleri ve additionl 2 dakika süreyle buza tüp döner.
- LB ortamı, 1 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca (150 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
- ((Kanamisin ile takviye katı LB ortamı içeren plakalar bu antibiyotiğe karşı bu çalışma kodlamak direnci kullanılan tüm plazmidler)) LB-kan plakalar üzerine dönüşüm karışımı 200 mcL - 100 yayıldı. 37 ºC O / N plakaları inkübe edin.
- Sonraki sabah, camdan yapılmış bir kültür tüpü içinde sıvı LB-kan ortam 3 ml LB-kan plaka tek bir koloni inoküle. Yaklaşık 2.5 (150 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin - 3 saat veya kadar bulanıklık görülmüştür.
- Spektrofotometrede 600 nm'de (OD600) kültürün optik yoğunluğu ölçmek. Hücre kült seyreltin6 mL bir son hacim içinde, 0.4 OD 600 önceden ısıtılmış LB-kan ortamın uygun bir miktarda ure. 40 dakika boyunca 37 ºC'de sallayarak devam edin.
- 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar bir stok çözeltiden IPTG eklenerek sıvı kültürlerde proteinin ifadesini teşvik eder. 7 saat - yaklaşık 6 için (150 rpm) sallayarak ile 37 ºC'de inkübe edin.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine bütün olarak bakteriyel hücre kültürleri hasat.
- mikrosantrifüj tüpü içine bir kültürün 1.5 mL ekleyin. 1 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve pelet aynı kültürün başka bir 1.5 mL ekleyin. 1 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin.
- tüm kültür dek adımı yineleyin 1.11 mikrosantrifüj tüp içine hasat edilir.
- liziz kadar -80 ° C 'de neden pelet saklayın.
2. Bakteriyel Lizis ve Lizat Karıştırma.
Not: (yani protein ifade ve çözülebilir olduğunu doğrular) önemli bir kontrol sağlar. Böylece, son derece başlangıçta TSP analizi de dahil olmak üzere tavsiye ederiz. optimal bir protokol özel bir alt-birim kombinasyonu için elde edildikten sonra, TSP analizi katı aşağıda istemli olarak neden olan gerekli değildir.
- bakteriyel hücrelerin ve çözülebilir fraksiyonları hazırlanması Lizis.
- 5 dakika buz üzerinde uyarılan hücre pelletini çözülme. liziz tamponu 600 uL pelletini.
- inctoplam ham lizat oluşturmak için 30 dakika boyunca (150 rpm) çalkalama ile 30 ° C 'de süspansiyon Ubate.
Not: Aşağıdaki adım ve aşağıdaki alt bölüm isteğe bağlıdır. - Ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler içine toplam ham lizat iki 25 uL'lik çıkarın ve aşağıdaki gibi TSP analizini yürütmek.
- İki 25 uL alikot biri için, 1X bir son konsantrasyon elde etmek için 5X SDS örnek tamponu ilave edin. "Toplam ham lizat" için "T" ile tüp etiketleyin.
- 5 dk tamamen proteinleri denatüre etmek için 100 ° C'de "T" örnek inkübe edin.
- Bu arada, ikinci 25 uL kısım alın ve 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj o. Dikkatle küçük pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. "Çözünür fraksiyon" bu yeni tüpü "S" etiketleyin.
- minik pelet sol behi içinND, önceki adımda, tekrar süspansiyon liziz tamponu ve vorteks 25 uL ekleyin. "Pelet fraksiyonu" için bu tüp "P" etiketleyin.
- "S" ve "P" tüplerine 6 uL 5X SDS örnek tamponu ilave edin ve yukarıda tarif edildiği gibi 100 ° C 'de inkübe edilir.
Not: TSP örnekleri ifadesini analiz etmek için o gün kullanılmayacak ise ihtiyaç duyulana kadar, onlar -20 ° C'de donmuş olabilir. % 12 ve / veya% 15 standart SDS-PAGE jeli üzerinde hemen önce yükleme, yukarıda tarif edildiği gibi bir kez çözündürüldü, bunlar, 100 ° C'de yeniden inkübe olması gerekir.
- TSP analizi yapılır iken, santrifüj toplam ham lizat kalan 550 uL 10 dakika 10.000 x g'de (veya toplam ham lizat tüm 600 uL TSP analizi yürütülen değilse). yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde supernatant toplamak. Bu saflaştırma için kullanılacak Çözünür lizat olduğu.
- Lizat karıştırma.
- adımlar 2.1.1 ve üzeri 2.1.2'de anlatıldığı gibi lizis yürütmek.
- İstenilen β alt birimini ifade bakterilerden toplam ham lizat 600 uL istenen α alt birimini ifade bakterilerden toplam ham lizat 600 mcL karıştırın. Yavaş, 30 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
Not: (Tartışma) karıştırma lizat sırasında maksimum derleme elde etmek için kuluçka süresini optimize etmek için gerekli olabilir. Zaman ve burada verilen sıcaklık bu çalışmada yeniden birleştirici protein için en uygun olan ve başka bir yerde, 18 tespit edilmiştir. - Santrifüj 10 dakika için 10,000 x g'de karışık lisatı çözünmeyen topak çözünür malzemeyi ayırmak için. yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın. protein saflaştırma için bu karma Çözünür lizat kullanın.
İmmobilize Kobalt Affinity Reçine üzeri 3. Protein Saflaştırma(ICAR).
- reçine dengelenmesi.
- İyice şişe ters çevirerek reçine tekrar süspansiyon ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bulamacın 50 uL aktarın. Pelet reçine 2 dakika süreyle 700 x g'de santrifüj. Dikkatle süpernatant aspire.
Not: Biz sıvının toplu kaldırmak için mavi 1 ml pipet kullanarak pipet aspirasyon yürütmek. Beyaz bir 2 uL ucu boncuklar içeren sıvının çok ince bir tabaka bırakarak geri kalan süpernatan uzaklaştırılması iyi kontrol etmek için kullanılır. - Yumuşak reçine pelet 2 dakika boyunca 700 x g 'de reçine ve santrifüj tekrar süspansiyon 1 ml tampon maddesi A Karışım ekleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire ve bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
- İyice şişe ters çevirerek reçine tekrar süspansiyon ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bulamacın 50 uL aktarın. Pelet reçine 2 dakika süreyle 700 x g'de santrifüj. Dikkatle süpernatant aspire.
- dengelenmiş reçineye bölüm 2.1 veya 2.2 daha önce elde edilen çözünebilir lizat uygulayın. 60 dakika boyunca 4 ° C'de nazik bir dönme ile tüp inkübe edin. G <700 × tüp santrifüj/ 5 dakika boyunca em> ve dikkatli süpernatant aspire.
- spesifik olmayan bağ proteinlerini ortadan kaldırmak için aşağıdaki şekilde reçine yıkayın.
- Tampon A 1 ml ile yeniden süspanse reçinesi yumuşak, 10 dakika boyunca 4 ° C'de sallanarak inkübe edin. 5 dakika boyunca 700 x g'de tüp Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Süspanse Tampon B 1 mL (5 mM imidazol ile tampon A) reçine ve yumuşak, 5 dakika boyunca 4 ° C'de sallanarak inkübe edin. 5 dakika boyunca 700 x g'de tüp Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Süspanse Tampon C 1 mL (10 mM imidazol ile tampon A) reçine ve yumuşak, 5 dakika boyunca 4 ° C'de sallanarak inkübe edin. 5 dakika boyunca 700 x g'de tüp Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire.
- t (200 mM imidazol ile tampon A) 400 Tampon E ul ekleyerek proteinini ayrıştırmakreçine o. nazik 5 dakika boyunca 4 ° C'de sallanan ile kuluçkaya yatmaktadır. 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
- yeni bir 1.5 ml santrifüj tüpüne saflaştırılmış proteini ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
- aşağıdaki gibi seri santrifüj ile saflaştırılmış protein desalt.
- Saflaştırılmış proteinin 400 uL (bu 160 mM, 200 mM ila imidazol konsantrasyonunu azaltır) 100 uL Tampon A ilave edin. 10 kDa molekül ağırlığı kesmesi olan 0.5 mL ultrasentrifugal filtrelere saflaştırılmış protein uygulanır. 5 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin.
- süzüntü atın ve tekrar bakiyenin ve santrifüj sulandırmak için 400 uL Tampon A ekleyin. imidazol konsantrasyonu aşağıda 4 mM düşene kadar santrifüj / seyreltme döngüleri devam edin. Her bir santrifüj ~ 70 ul (ya da yaklaşık 7 kat) aşağı 500 ul konsantre Örnek olarak, daha sonra, iki döngü Yaklaşık başlayan 160 mM imidazol konsantrasyonu (7 x 7 = 49-kat) azaltacaktıroximately 3.3 mM.
- BCA deneyi 21 kullanılarak tuzu giderildikten numunenin protein konsantrasyonu ölçümü.
Not: üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi Tuzdan arındırma, BCA tahlil için tolerans sınırının altında imidazol düzeylerini düşürmek için gereklidir. Bizim laboratuvar hassas olduğundan, BCA deneyi tercih geniş bir dinamik aralığı vardır ve daha az protein için protein varyasyon sergiler. Bununla birlikte, protein konsantrasyonu belirlemek için diğer yöntemler BCA deneyi için ikame edilebilir. Anahtar, her yöntemin avantaj ve sınırlamaları farkında olmaktır.
- 1X bir son konsantrasyon elde etmek için 5X yerel numune tamponu ilave edin ve elektroforez geçin. Alternatif olarak, mağaza örnekleri daha sonra analiz için -20 ° C'de.
4. Nondenaturing Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE).
Dikkat: unpolymerized akrilamid bir nörotoksin. Uygun koruyucu gea giyinr.
- şöyle nondenaturing PAGE jel hazırlayın.
- temiz bir cam plakalar kullanılarak döküm ve standı döküm için jel kasetini hazırlayın. küçük bir manyetik karıştırıcı üzerine gradyan yapıcı yerleştirin ve her bir bölme içine küçük bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
- (Ağırlık / hacim) akrilamid ve% 2 (a / h) bisakrilamid stok çözeltileri,% 5 ve% 10 hazırlama% 40 kullanılarak (a / h) bir yerli çözme tamponu içinde akrilamid jeli çözümler. bisakrilamid toplam akrilamid oranı 37.5 olduğundan emin olun: 1. Buz üzerinde soğutma dökülmesinden önce.
Not: Burada kullanılan nondenaturing PAGE sistemi Laemmli SDS-Page sistemi esas olarak aynı olan, SDS 22 atlanmış. - Polimerizasyonun başlatılması için akrilamid çözümleri (su içinde hazırlanmış / hac) stok çözeltisi (w% 10 arasında), amonyum persülfat ekleme. Amonyum persülfat nihai konsantrasyonu% 0.1 (ağırlık / hacim).
- degrade yapımcısı iki odalarına akrilamid çözümleri dökün. çıkış boru takılı between jel kaset plakaları, manyetik karıştırıcı etkinleştirmek ve degrade yapımcısı vanalarını açın. % 10 nondenaturing gradyan jel - 5 dökün.
- Bir kez döküldü izopropanol ince bir tabaka ile kaplamak jel ve jel, 30 dakika süreyle polimerize izin verir. Bu süre boyunca, doğal çözme tamponu taze% 5 akrilamid jel solüsyon hazırlanır. Jel setleri sonra, izopropanol kapalı dökün ve bir bücür şişe deiyonize su ile jel üst durulayın.
- Yukarıda hazırlanan% 5 jel çözeltiye, (tam olarak 4.1.3'de tarif edilmiştir), amonyum persülfat ekleme ve cam levha tam kadar polimerize jel üstünde dökülür. Jel tarağı yerleştirin. Kaplanmış jel ilave bir 30 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın.
- Jel polimerize sonra, elektroforez cihazının içine jel kasetini monte edin. Alternatif olarak, kullanıma hazır olana kadar nemli kağıt havlu ve plastik wrap sarılı 4 ° C'de jel depolamak.
- Bir kez nondenaturing PAGE jel elec içine monte edilirtrophoresis aparatı, 10X yerli çalışan tampon stok taze hazırlanmış 1X yerli çalışan tamponu ile deposunu doldurun.
- her bir cam şırınga kullanılarak içine bölüm 3 sonunda elde edilen saflaştırılmış protein Yük 10 ug.
- kuyu içine (1X ana çalışma tamponu içinde seyreltilmiş), yüksek molekül ağırlıklı doğal protein standart yüklenebilir 2 uL.
- (- 4.5 saat yaklaşık 4) 55 V ve 4 ºC de jel çalıştırın boya ön jel kapalı bitene kadar.
- Nondenaturing jel ek olarak, standart bir SDS-PAGE 22 ile saflaştırılmış proteinin alikotları analiz eder.
- 1X bir son konsantrasyon elde etmek için 5X SDS-numune tampon maddesi ile bölüm 3 sonunda elde edilen saflaştırılmış protein örnekleri, alikotları (10 ug) karıştırın.
- 5 dakika boyunca 100 ° C 'de kuluçkaya bırakılır ve 12 standart% ve / veya% 15 SDS-PAGE jelleri 22 üzerine yüklenir.
- 20 dakika boyunca 80V çalıştırmak ve boya ön jel (kapalı bitene kadar sonra 120 V bu yaklaşık bir eklenti olduğunuitional% 12 jel 75 dakika ve% 15 jel 120 dakika).
5. görselleştirme Aktivite ve Protein Boyama.
- Elektroforez, dikkatli bir şekilde, ayrı cam plakalar izlenerek ve iyonu giderilmiş su 50 mL içeren bir jel tepsiye nondenaturing jel aktarın. nazik 5 dakika boyunca sallanan ile jel durulayın. su atın ve bu yıkama adımı üç kez tekrarlayın.
- şu şekilde alt-tabaka Kaplama Testi gerçekleştirmek.
- florojenik peptit substratı Suc-LLVY-AMC içeren tampon geliştirme 1 ml ilave edilir ve jel üzerinde eşit olarak yayıldı. 30 dakika 37 ° C'de inkübe edin.
Not: bir cam çubuk veya jel serbest bırakıcı (ayrı cam levhalar için kullanılan küçük plastik takoz) jel üzerinde sıvıyı dağıtmak için kullanılabilir. - Dikkatle nedeniyle parçalanmış peptid alt tabakaya jel görüntüleme sistemi, UV transilluminator'de üzerine jel aktarmak ve floresan gözlemleyin. Kayıt görüntüsü. Dikkatle jel ba transferiJel tepsisine ck.
- hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su 50 mL ile iki kez jel durulayın.
- hafifçe çalkalanarak 60 dakika boyunca Coomassie leke reaktifi 10 mL jel leke. arka olana kadar 50 mL su ile destain jeli açık hale gelir. Bu boyama aşaması de bir standart SDS-PAGE jelleri için de geçerlidir.
- florojenik peptit substratı Suc-LLVY-AMC içeren tampon geliştirme 1 ml ilave edilir ve jel üzerinde eşit olarak yayıldı. 30 dakika 37 ° C'de inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A alt birimleri formu halkaları 9 birleşerek zaman proteazom düzeneği (Şekil 1) başlar. C-terminal ile hekzahistidin (His-etiketli) türevleri (Tablo 1) etiketlenmiş olarak arke Methanococcus maripaludis S2 a alt birimi, E. coli içinde ifade edilmiştir, bu gösterilebilir. Rekombinant α-His proteini PAGE nondenaturing ile ICAR ile arıtılmış ve analiz edildi, iki bant (Şekil 2A, şerit 1) tespit edilmiştir. Biz daha önce bu tek α Yüzüklerin (SR) ve Çift α-Yüzüklerin (DR) 18 uygun göstermiştir. DR sonraki montaj 9,18 için verimli olmayan bir çıkmaz türdür.
a-onun zaman alt birimleri rekombinant arke proteazomların montaj 670 kDa boyutu standı yakınında göç, yeni bir tür gözlendi tahlil edildiği zamanki yöntemini temsil eden, β alt birimleri ile birlikte eksprese edildiard (Şekil 2A, kuşak 3). Bu tür (Şekil 2B, kuşak 3) proteolitik olarak aktif olan ve propeptidlerinin (Şekil 2C, kuşak 3) kaldırıldı, sadece erginlerde β alt birimleri (mβ) ihtiva etmiştir. Bu tür tam olgun CP olduğunu. Bu örnek, ayrıca SR ara bilinen bir derleme olduğu için beklenen bazı SR türler, ancak hiçbir DR türleri içeriyordu. DR eksikliği a-onun zaman ve ß alt birimleri olarak birlikte açığa vurulur doğru montaj β alt birimlerinin birleştirilmesi DR nonprodüktif oluşumunu becerileri sayesinde mümkün olduğunu yeterince hızlı gibi ortaya çıkan (daha detaylı bir analiz için 18 bakınız) olduğunu göstermektedir.
Koekspresyon yönteminin sınırlama göstermek ve kombine yaklaşım yarar savunmak, α-onun ve ß alt birimleri E. coli içinde ayrı ayrı ifade edildi. liziz sonra, çözünebilir fraksiyonlar karıştırılmış ve proteinler önce ICAR ile saflaştırılmıştırnondenaturing PAGE ile analizi. Tamamen işlevsel proteazomların da lisat karıştırma yaklaşımı (Şekil 2A ve 2B, şerit 2) ile elde edildi ve beklendiği gibi SR türleri de gözlenmiştir. örnek karıştırma lizat DR türlerinin yeniden ortaya çıkma, β alt birimden geri dönüşümlü olarak onu sökmeye edemiyoruz kez oluşturduğunu belirtir; Bu DR çıkmaz doğasını vurgular. İlginçtir, yeni bir tür de sadece ( "yarım" olarak adlandırılır) CP altında göç, lizat karıştırma numunede çıktı. Son zamanlarda, bu tür 18 (7 β 7 a) yarı-proteazomdan karşılık geldiğini göstermiştir. burada tasvir etmek için, β alt birimi mutantı (R166W) kullanılmıştır. Bu mutasyon engelli yarı proteazomlar dimerization 18 lider, β-β halka etkileşimi bozar. Yarım proteazomlar CP anında öncüleri olduklarından, R166W mutasyonu yarım proteazomlar An hem birikimine yol açması gerekirCP oluşumunda da azalır. Lizat α-his ve β (R166W) alt birimleri ile karıştırılırken CP alt seviyeleri ve "yarım" türlerin yüksek seviyeleri (Şekil 2A, kuşak 4) gözlendi, gerçekleştirilmiştir. Bu durum, bu iki grup için bir öncül-ürün ilişkisi ile tutarlıdır ve yarı-proteazom olarak "yarım" türlerin kimliğini doğruluyor. Mutant örnek (şerit 2 karşı kuşak 4) yarı-proteazom biraz daha hızlı göç nedeniyle β alt biriminin seri-şarj oranının değiştirilmesiyle R166W mutasyon muhtemeldir.
hücre içinde yüksek protein konsantrasyonlarına kıyasla lizat karıştırma sırasında yarı proteozom görselleştirmek yeteneği lizat çok daha düşük protein konsantrasyonlarında kaynaklanmaktadır. Düşük konsantrasyonlar daha kalabalık ve böylece tespit olmak için ara maddeleri sağlar az etkili (yani daha yavaş) montaj ile sonuçlanır. Yarım proteazom görünümünü yanı sıra, Ek bir gözlem lizat karıştırma sırasında azalmış montaj verimliliği vurgular: kendi propeptidlerinin korumak işlenmemiş β alt birimleri, (proβ) saptanabilir hale gelir. Propeptid işleme yarısı proteazomların dimerize kadar oluşmaz için, olgunlaşmamış proβ formunun görünümü yarı proteazom birikimi seviyesinin (Şekil 2C, şerit 4 karşı şerit 2 karşı şerit 3 ile karşılaştırın) ile ilişkilidir. R166W mutant durumunda, lizat karıştırma sırasında propeptid işleme hatası CP küçük bir miktar formu yok olsa bile mutlaktır. Propeptid işlem sadece yarı proteazom dimerizasyonunu gerektirir, ancak, aynı zamanda R166W mutasyon uygun bir şekilde oluşturulmuş bir β-β halkası arabirimi 23 elde olmadığı olmasıdır. Rekombinant proteazom montaj ile ilgilidir olarak lizat karıştırma karşı koekspresyonu daha detaylı anlatım, burada 18 bulunabilir.
şekil 1 "src =" / files / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg "/>
Şekil 1: Çekirdek Parçacık (SP) Meclis Basitleştirilmiş Bir şematik.
α alt birimleri β alt birimlerin eklenmesi için bir şablon olarak hizmet veren tek bir α-ring ilk (SR) içine monte edebilirsiniz. Bu hızlı bir şekilde dimerleşir yarı proteazom ara madde (yarım) oluşmasına yol açar. dimerizasyonu ile eş zamanlı olarak, (gösterilmemiş) β alt birimi propeptidlerinin otokatalitik tam olarak işlevsel çekirdek partikülü (BF) sebebiyet veren kaldırılır. Çift α-halkalar (DR) SR kaynaklanan ve CP içine montajı için yetkili değildirler. Onların oluşum üretken montaj olaylar (katı oklar) aksine bir nonprodüktif montaj yolu (kesikli ok) temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Assaying Proteozom Meclis için bir kombine Yaklaşım.
Koekspresyon (C) ve lizat karıştırma (L) arke M. maripaludis rekombinant proteazomların montaj çalışma için kullanılmıştır. Proteinler İmmobilize Kobalt-afınite reçine (ICAR) ile saflaştırılmıştır. % 10 gradyan jelleri - (A, B) ile engellenmesi Arıtılmış proteinler (10 ug), denatüre edici olmayan 5 üzerine yüklendi. Elektroforezi takiben, peptidaz aktivitesi fluorojenik peptid alt yapısı içeren bir tampon solüsyonu ile jel çakıştırılarak görselleştirildi Suc-LLVY-AMC (B) kolloidal Coomassie ayıraç (A) ile jel boyanmadan önce. Siyah ok uçları bir araya 20S çekirdek parçacık (CP), yarı-proteazom ara (yarım), çift α-ring (DR) ve tek α-ring (SR) pozisyonlarını ifade etmektedir. (KDa cinsinden) birçok moleküler boyut standartları, göç sağda gösterilmiştir. (C) A g> Saflaştırılmış proteinler (10 ug), aynı zamanda% 15 SDS-PAGE jelleri üzerine yüklenmiştir. Elektroforezi takiben, jeller Coomassie boyası maddesi ile boyanmıştır. α-onun alt birimi ve tam olgun (mβ) ve olgunlaşmamış (proβ) β alt birimlerinin Göç gösterilir. 25 kDa molekül boyutu standart konumu sağda gösterilir. Asterisk liziz sırasında spesifik olmayan proteolizinden elde edilen kesilmiş bir α-onun alt birim fragmanını belirtir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| plazmid | Genotip | Kaynak |
| AKB191 | pET42 PSMA-His | Kusmierczyk ve diğ., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA onun psmB | Kusmierczyk ve diğ., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair ve diğ., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair ve diğ., (2015) |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan bakteri plasmidleri. PSMA arke α alt birimi geni ve psmB arke β alt birimi genidir.
| Tampon A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 300 mM NaCI, 5 mM MgCI2. | Tamponlar, B, C ve E, tampon A ihtiva eden imidazol türevleridir. Bir 2 M stoktan su içinde hazırlanmış ve karanlıkta saklandı imidazol eklemek için yararlıdır. |
| Yerli çözme tampon | 375 mM Tris-HCI, pH 8.8,% 0.1 (h / h) tetrametiletilendiamin (TEMED) ve% 0.1 (ağırlık / hacim) amonyum Perulfate (APS). | polimerize ve buz üzerinde tutulmalıdır jel bir saat önce daha fazla taze hazırlandı. Yerel çözme tamponu içinde akrilamid jeli çözeltilerin hazırlanması, bir 4X stok (1.5 M Tris-HCI, pH 8.8) arasında Tris-HCl eklemek için yararlıdır. APS polimerizasyondan hemen önce ilave edilir. |
| Yerli çalışan tampon 10X stok | 250 mM Tris, 1.92 M glisin, pH ayarı yoktur. | |
| 5X yerli numune tamponu | 0.5 M Tris-HCI, pH 8.8,% 50 (h / h) gliserol, bromofenol mavi izleri. | İzler genellikle birkaç tane spatula ile transfer çok küçük bir miktarını ifade eder. |
| 5X SDS-numune tampon maddesi | 0.3 M Tris-HCI, pH 6.8, 600 mM ditiyotreitol (DTT),% 10 (a / h) SDS,% 50 (h / h) gliserol ve bromofenol mavi izleri. | İzler genellikle birkaç tane spatula ile transfer çok az miktarda, değinmektedir. |
| Geliştirme tamponu | 50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC proteazom etkinliğini analiz etmek için kullanılan bir fluorogenik peptid substrattır. |
Tablo 2: Çözeltiler, medya ve tamponlar, bu çalışmada kullanılan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz rekombinant arke proteazomlar kullanarak PAGE nondenaturing ile proteazom düzeneğini analiz için kombine yaklaşımın yararını göstermektedir. Proteazom alt birimlerin bakteri koekspresyonu olağan yöntem 9,11 hızlı analiz sağlar ancak anahtar montaj ara maddeleri açığa olmayabilir. Biz montaj olayları daha geniş bir resim geliştirmek için karıştırma lizat ile yakımının birlikte birleştirerek öneririz.
Bu kombine yaklaşımın avantajı a ayrı ifadesini gerektiren ve lizat karıştırma için alt birimlerini ß rağmen, hala nispeten emek dostu olmasıdır. tek bir kişi proteinlerin karşılaştırılabilir ve tutarlı ifade seviyelerini garanti eğer sonuçları yarısayısaldır olabilir. Bu amaçla, lizat karıştırma öncesinde ifade edilen proteinlerin karşılaştırılabilir düzeyde izin koşulları belirlemek için yeniden birleştirici protein ekspresyonu normal optimizasyonu yapmak tavsiye edilir. Optimizasyon indüksiyonu tim değişen içerebilirE, indüksiyon sıcaklığı, indüksiyon, bakteriyel ekspresyon suşu optik yoğunluk, ve böylece, çözünür proteinin istenen seviyeleri elde edilene kadar. Bazen mutan benzer sentezleme seviyelerine sahip olurlar, çünkü bir proteinin WT ve mutant sürümleri karşılaştırarak ancak çözünürlüğe azalma, bu durum özellikle önemlidir. Biz de önce nondenaturing SAYFASI yüklemeden ICAR-saflaştırılmış örneklerin protein konsantrasyonlarını belirleme önemini vurgulamaktadır. Hatta bir yerde ifade optimizasyonu ile ve paralel numuneler aynı şekilde arıtma adımlarında işlenir olmasını sağlamak için alınan en iyi bakım, varyans hala yanlışlıkla sokulabilir. Bir konsantrasyon ölçüm toplam proteinin, aynı miktar, numune başına yüklemesi yapılır. Bu tür daha anlamlı göç verilen bir band şiddetlerinin şeritli-to-şeritli karşılaştırmalar yapar.
Protein ekspresyonu karşılaştırılabilir ve tutarlı seviyeleri Lysa için elde edilemezsete karıştırma, bir zaman önceden tüm bileşenleri arındırmak ve saf proteinlerle deneyler karıştırma yapabilir. Bu daha doğru bir Protein saptamaları izin verme avantajına sahiptir ve bu nedenle bir yaklaşım nicel hale getirir. Ancak, tam arınma dezavantajı süreci birden mutantların aynı anda 18 hızlı analizini engel olabilir yoğun ölçüde daha fazla emek, hale gelmesidir. bahsetmemiz son bir uyarı, bazen a ifadesini ayırmak ve ß alt birimleri mümkün olmayabilir olmasıdır. Bir mutasyonun kendi başına ifade edildiğinde, E. coli içinde çözünmeyen için bir alt birimini neden olur, ancak, mutant bağlanma ortağı ile ifade edildiği zaman çözünürlük çıktı sağlar oluşabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, sadece Koekspresyon için analiz sınırlayacaktır. Ancak, bu genel olarak rekombinant protein ifade sırasında ortaya çıkabilecek bir ihtar ve arke proteazom alt birimlerinin 24,25 özgü değildir.
Biz gen seçtiICAR reçine saflaştırılması ve uygun fiyatta kolaylığı nedeniyle bizim proteozomal proteinlerin onun etiketli türevleri çalıştırmaya yetebilir. Diğer epitop takıları antikor bazlı saflaştırılması için de dahil olmak üzere, mümkün, ve başarılı bir şekilde eksprese olan ve proteazom alt birimlerin saflaştırılmış Flag-işaretli versiyonlar (gösterilmemiştir). Homojenite (ya da üretim ölçeği artarak) ile saflaştırılması gereklidir, ancak, bir His-etiketli versiyonları Böylece en hızlı ve en düşük maliyetli bir araç sağlamaktadır.
Sonuçlar rekombinant proteinleri ile elde edilen bir verilir, in vivo gözlemler ile takip zaman anlam daha kazanacaktır, onlar arke veya bakteriler üretilen ökaryotik proteinler olmak. Ancak, in vivo yaklaşımı her zaman deneysel hemen erişilebilir olmayabilir. Çalışmanın konusu büyük olduğunda, bu, böyle bir proteazom gibi karmaşık birden fazla alt özellikle doğrudur. Rekombinant protein futu için önemli bir başlatma noktası sağlar yaklaşımlarDeneylerde yeniden. Proteazomdan durumunda, nondenaturing PAGE ile rekombinant arke proteazom üretimini eşleştirme arke ve ökaryot türler 9,11,12,18 arasında paylaşılan proteazom montaj, temel özellikleri durulaştırmada çok etkili olmaya devam edecektir. Böyle bir yaklaşım, hem de diğer büyük multiprotein kompleksleri montaj çalışmaları için yararlı olması beklenmektedir. Son zamanlarda, arke proteazomlar birden fazla yolu aracılığıyla monte edebilirsiniz ve bu α-halkaları da 18 olduğu düşünülen montaj sırasında zorunlu ara olmadığını göstermek için bu stratejiyi kullandı. Aynı ökaryotik proteazomlar için de geçerlidir eğer belirlenecek kalır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma ARK, Amerikan Kalp Derneği 14GRNT20390154 bir ödül ile, ve kısmen Indiana Üniversitesi-Purdue Üniversitesi, Indianapolis bir Araştırma Destek Fonu Grant (RSFG) tarafından kısmen desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
