Introduction
إعادة برمجة الخلايا الجسدية الكبار الإنسان إلى خلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) يوفر وسيلة للحصول على العرض قد يكون غير محدود من خلايا المريض محددة لدراسة مرض 1، 2. سوف تلخص النمط الظاهري المرض في المختبر جعل من المعقول لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية المرتبطة مع المرض، وتعزيز اكتشاف الأدوية والطب الشخصي 3. وبالإضافة إلى ذلك، iPSCs الإنسان (hiPSCs) توفر إمكانية استنباط أنواع معينة من الخلايا التي يمكن استخدامها بوصفها موردا فريدا لتحل محل الخلايا الميتة أو مختلة واستعادة وظيفة في سياق العديد من الاضطرابات 4، 5.
شرط هام لاستخدام iPSCs في التطبيقات المذكورة أعلاه هو ضمان أن يتم الحفاظ المحفزة وغير متمايزة دولتهم خلال التوسع في الثقافة. عادة، techniqUES مثل التدفق الخلوي، النشاف الغربي، تفاعل البلمرة المتسلسل والمقايسات الفنية، والتي تتطلب كميات كبيرة من الخلايا والمعدات المتخصصة، وتستخدم لتحليل مفصل لIPSC تعدد القدرات 6، 7، 8، 9، 10. ومع ذلك، يمكن تحقيق التقييم الروتيني للحالة غير متمايزة في iPSCs بشكل فعال من خلال نشر محدود من هذه الخلايا على وجه التحديد لمناعية (ICC)، وبالتالي تنطوي على تخفيض الوقت والموارد.
التطورات الحديثة تسمح لنمو iPSCs في ظروف خالية من المصل محددة، وهو تحسن كبير على أنظمة الثقافة التقليدية التي تتطلب الفئران طبقات الخلايا الليفية التغذية وسائل الإعلام مصل يحتوي على. ومع ذلك، فإن الدراسات الحالية لا تتضمن البروتوكولات تدريجي واضحة تصف كيفية الانتقال iPSCs من وحدة التغذيةطبقة لأنظمة خالية المغذية.
في هذا السياق، فإن البروتوكول تفاصيل منهجي كيف hiPSCs نمت على الماوس المشع الليفية الجنينية (iMEF) طبقات المغذية يمكن أن يكون (1) تكييفها لنشر في المصل خالية المتوسطة، و (2) مثقف على نطاق صغير لدعم تحديدا قوية تحليل immunocytochemical. وعموما، تمثل هذه المنهجية إجراء في الوقت المناسب وفعالة من حيث التكلفة لنشر iPSCs الإنسان في ظروف خالية من المصل لتأكيد تعدد القدرات على أساس روتيني باستخدام مناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد استمدت hiPSCs من الخلايا الليفية الجلدية البشرية معزولة عن 4 مم الخزعات لكمة الجلد وبرمجتها في المنزل عن طريق إعادة برمجة سينداي بوساطة فيروس 11. وافقت جامعة أريزونا مجلس المراجعة المؤسسية جميع إجراءات التوظيف الموضوع وجمع الخزعة.
1. إعداد مصفوفة خارج الخلية السطح المطلي لIPSC الثقافة
- قبل يوم واحد لالتقاء الثقافات hiPSC المتزايد على iMEFs، وإعداد المصفوفة خارج الخلية (Matrigel) لوحات المغلفة.
- تحسن بطيء قسامة من المصفوفة خارج الخلية (الكثير يعتمد، اتبع الإرشادات التي تظهر على ورقة مواصفات) على الجليد في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
- في غطاء السلامة الأحيائية، وذلك باستخدام نصائح الماصة الباردة (المخزنة في -20 درجة مئوية)، إضافة 1 قسامة من المصفوفة خارج الخلية للبرد Dulbecco لتعديل النسر متوسطة / المغذيات خليط F-12 (DMEM / F12 / HEPES) وفقا لكثير من عامل التخفيف محدد .
- الاستغناء ~ 60081؛ ل من المصفوفة خارج الخلية لكل بئر من كل خلية ثقافة جديدة تعالج 12 لوحة جيدا اللازمة.
- احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. هنا، استخدم وقت الحضانة 3 ساعات.
ملاحظة: لوحات يمكن استخدامها على الفور أو تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. نقل hiPSCs نمت على خلايا الطاعم iMEF على خارج الخلية مصفوفة للدعوة
- في يوم من الركض، وإزالة لوحة المغلفة مصفوفة من 4 درجات مئوية والسماح لوحة ليتأقلم مع درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في نسيج الثقافة هود.
- نضح في المتوسط من 1 بئر من لوحة 6 جيدا للثقافة hiPSC المتزايد على iMEFs واستبدالها مع 500 ميكرولتر كولاجيناز التفكك كاشف (1 ملغ / مل في مستنبت القاعدية).
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 10-30 دقيقة حتى حواف المستعمرات IPSC يبدو أن رفع قليلا.
ملاحظة: فترة حضانة يعتمد الخط وسوف تختلف. مراقبة التفكك تحت المجهر. - سيارةefully نضح كاشف التفكك وغسل بلطف 2 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4).
- إضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة mTeSR1 المتوسطة كاملة مع 10 نانوغرام / مل المرتبطة رو-بروتين كيناز (Y-27632 ROCK المانع) إلى البئر.
ملاحظة: استخدام 50:50 خليط من مكيفة iMEF المتوسطة وmTeSR1 خلال هذا المقطع الأولي ويقترح ويمكن أن تكون مفيدة للبقاء hiPSCs خلال هذه المرحلة الانتقالية وسائل الإعلام. - باستخدام صغير المجهر النقيض من المرحلة ضعت جزئيا داخل غطاء محرك السيارة، يدويا تسجيل واختيار 1-2 المستعمرات hiPSC (~ 700 - 1000 ميكرون في القطر) استخدام المحاقن والإبر (25 G، 1½ في). دفع قبالة القطع وسجل للمستعمرة في المتوسط مع طرف P200 الماصة.
- نضح والتخلص من مصفوفة من لوحة جديدة، والحرص على عدم تعكير صفو الطلاء.
- نقل 1 مل من تعليق خلية من النظام القديم الذي يحتوي جيدا iPSCs سجل في مصفوفة جديدة مغلفة بشكل جيد.
- جيش التحرير الشعبى الصينىCE لوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. موسيقى الروك لوحة في عدة سريع، ذهابا وإيابا، والحركات جنبا إلى جنب لموزعة بالتساوي على خلايا. لا تخل لوحة لمدة 24 ساعة.
- إجراء تغييرات إعلامية كاملة اليومية مع mTeSR1 المتوسطة كاملة (إضافة Y-27632 ROCK المانع ليست هناك حاجة بعد الطلاء الأولي في الخطوة 2.5).
الركض 3. على نطاق صغير من hiPSCs على لوحات المغلفة مصفوفة
ملاحظة: عموما، بعد نقل الأولي للhiPSCs إلى matrix وحات مغلفة، ينبغي passaged الخلايا مرة أخرى بطريقة مماثلة لضمان تم القضاء على جميع iMEFs وتكيفت الخلايا المغذية خالية من الشروط.
- قبل يوم واحد IPSC confluency باعداد المغلفة حديثا لوحات مصفوفة كما نوقش في القسم 1.
- في يوم المرور، وإزالة لوحة المغلفة مصفوفة من 4 درجات مئوية حضانة والسماح لوحة ليتأقلم مع درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في طريق مسدود الأنسجةالبنية غطاء محرك السيارة.
- نضح في المتوسط من 1 بئر من لوحة 6 جيدا من hiPSCs (انتقلت أصلا من وحدة التغذية إلى المصفوفة) واستبدالها مع 500 ميكرولتر العازلة تفارق الخلية.
ملاحظة: المخزن المؤقت تفارق الخلية التجارية المستخدمة هنا (انظر المواد الجدول) هي أكثر مناسبة للاستخدام مع متوسط mTeSR1 مقارنة كولاجيناز. - يحضن في درجة حرارة الغرفة ل3-7 دقائق حتى تظهر حواف المستعمرات التوجيهية لرفع قليلا. كما ذكرت من قبل، وفترة حضانة يعتمد الخط ومتغير. لذلك، ومراقبة تفكك الخلايا تحت المجهر لتحديد الوقت الأمثل.
- بعناية نضح المخزن المؤقت التفكك وغسل بلطف 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة mTeSR1 المتوسطة كاملة مع 10 نانوغرام / مل Y-27632 ROCK المانع إلى البئر.
- بدلا من المستعمرات التهديف كما في الخطوة 2.6، ودفع العدد المطلوب من المستعمرات في وسائل الإعلام باستخدام طرف P200 ويسحن بلطف تعليق الخلية 2 مرات AGainst زاوية واحدة من البئر لكسر المستعمرات hiPSC إلى كتل من ~ 50-200 ميكرون في الحجم. على سبيل المثال، لوحة 12-جيدا، واختيار 1-2 المستعمرات لنقل في كل بئر جديد 1. نقل تعليق خلية من البئر القديمة في بئر واحد جديد من لوحة 12-جيدا.
- موسيقى الروك لوحة في عدة سريع، ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب الحركات موزعة بالتساوي على الخلايا، وترك بقية لوحة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
- إجراء تغييرات إعلامية كاملة اليومية مع mTeSR1 المتوسطة كاملة. كما ذكرت من قبل، فإنه ليس من الضروري إضافة Y-27632 ROCK المانع بعد الطلاء الأولي.
ملاحظة: مستعمرات IPSC غير المستخدمة من الخطوة 3.7 قد تكون cryopreserved بسهولة في هذه المرحلة.
4. إعداد غرفة الشرائح وCoverslips لبذر hiPSCs لسيتولوجية مناعية
ملاحظة: بروتوكول التالية يستخدم 4 جيدا الشرائح غرفة البلاستيكية و 12 coverslips ملم الزجاج مع appropriatمجلدات البريد وسائل الإعلام في الآبار متعددة لدعم مناعية فعالة من حيث التكلفة. ومع ذلك، وأحجام وسائل الإعلام يمكن زيادة إذا كان المطلوب استخدام أكبر جيدا وساترة الأحجام.
- يوم واحد قبل hiPSC التقاء، وإعداد الشرائح غرفة مطلية حديثا مع المصفوفة خارج الخلية كما نوقش في القسم 1. إضافة ما يكفي من حل مصفوفة (~ 300-500 ميكرولتر لكل بئر من شريحة غرفة 4 أيضا) بشكل كامل معطف كل بئر من دون أي قلق تبخر. بدلا من ذلك، بعد وضع 1 ساترة تنظيفها وتعقيمها في كل بئر من 24 لوحة جيدا، ومعطف مع 500 ميكرولتر المصفوفة خارج الخلية، وتأكد من ساترة لا تطفو على أعلى من الحل.
- في يوم المرور، وإزالة الشرائح المغلفة غرفة / coverslips من 4 درجات مئوية، والسماح للتأقلم على درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في نسيج الثقافة هود.
- نضح في المتوسط من 1 بئر من لوحة ال 12 أيضا من hiPSCs واستبدالها مع 500 العازلة ميكرولتر التفكك.
- يحضن في تيمبي الغرفةrature ل~ 3-7 دقائق حتى حواف المستعمرات IPSC يبدو أن رفع قليلا.
- بعناية نضح المخزن المؤقت التفكك وإضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة mTeSR1 المتوسطة كاملة مع 10 نانوغرام / مل Y-27632 ROCK المانع إلى البئر.
- باستخدام النقيض المجهر مرحلة صغيرة توضع داخل نسيج الثقافة هود، يدويا اختيار 1 مستعمرة / بئر جديد من شريحة غرفة 4 جيدا أو 1 ساترة جديدة لتكون مطلية (~ 1000 - 1500 ميكرون في القطر) باستخدام طرف P200 الماصة عن طريق دفع من على سطح لوحة في المتوسط.
- نضح مصفوفة من غرفة الشرائح / ساترة جديدة، والحرص على عدم تعكير صفو الطلاء.
- يسحن بلطف تعليق الخلية 2 مرات ضد زاوية واحدة من البئر لكسر المستعمرات hiPSC إلى كتل من ~ 50-200 ميكرون في الحجم. نقل 250 ميكرولتر من تعليق خلية من البئر القديمة في كل بئر جديد من 4 جيدا غرفة الشرائح / ساترة.
- تبرزي حجم كل بئر جديد يصل إلى 500 ميكرولتر مع mTeSR1 تابعaining 10 نانوغرام / مل Y-27632 ROCK المانع.
- وضع غرفة الشرائح / coverslips في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- بعد 24 ساعة، وإجراء تغييرات إعلامية كاملة اليومية مع mTeSR1 المتوسطة كاملة. مرة أخرى كما ذكرنا سابقا، إضافة Y-27632 ROCK المانع ليست ضرورية بعد الطلاء الأولي.
5. إعداد iPSCs لسيتولوجية مناعية
- مرة واحدة متموجة، والحفاظ على المستعمرات hiPSC عبر التثبيت عن طريق إزالة وسائل الإعلام من الآبار وإضافة قبل حرارة تنبيه 4٪ امتصاص العرق (~ 300 ميكرولتر / بئر 4-جيدا شريحة الغرفة / ساترة). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- تجاهل امتصاص العرق بشكل مناسب وفقا لاقية المؤسسي وإرشادات السلامة الكيميائية.
- غسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما على شاكر المقعد العلوي مع برنامج تلفزيوني.
/ coverslips يمكن تخزين الخلايا على الشرائح غرفة مع وافرة برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى في هذه المرحلة: ملاحظة.بدلا من ذلك، يمكن استخدامها على الفور لمحكمة الجنايات الدولية.
6. المناعية من hiPSCs مع تعدد القدرات علامات
ملاحظة: hiPSCs Immunostain مع الأجسام المضادة تعدد القدرات القياسية. وكمثال على ذلك، وهنا الخلايا المزدوج الملون مع الأجسام المضادة التي تستهدف واحدة 1 السطحية و1 مستضد الخلايا بطريقة متسلسلة على النحو التالي: مكافحة مسارح محددة الجنينية مستضد 4 (SSEA4) مع بروتين 4 (OCT- مكافحة Octamer ملزم 4) ومكافحة ترا-1-60 مع مكافحة SRY المتعلقة HMG BOX الجين 2 (SOX2) (يرجى الاطلاع على الجدول المواد للحصول على تفاصيل الأجسام المضادة).
- نضح في برنامج تلفزيوني من الآبار وإضافة في 500 ميكرولتر / حجب جيدا الحل دون تريتون-X-100. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد تركيز محدد مسبقا (هنا، استخدم 1: 200) من الأجسام المضادة السطحية، إما SSEA4 أو ترا-1-60، عن طريق تمييع في عرقلة الحل دون تريتون X-100.
- الشرائح للغرفة، وإعداد 300 ميكرولتر / بئر شريحة غرفة 4-جيداعن طريق خلط 298.5 ميكرولتر من عرقلة الحل فوق و 1.5 ميكرولتر من معاداة SSEA4 أو ترا-1-60 الأجسام المضادة الأولية.
- لcoverslips، وإعداد 40 ميكرولتر / ساترة عن طريق خلط 199 ميكرولتر من عرقلة الحل و1 ميكرولتر من معاداة SSEA4 أو ترا-1-60 الأجسام المضادة الأولية.
- نضح عرقلة الحل من الشريحة الغرفة والاستغناء عن الأجسام المضادة الأولية في آبار المناسبة. لcoverslips، ضع قطعة من بارافيلم بقوة داخل طبق بتري والاستغناء عن 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية على رأس بمثابة قطرة. باستخدام إبرة حقنة عازمة وملقط، ورفع بعناية ساترة للخروج من ثقافة جيدا ووضعه الجانب الخلية أسفل على انخفاض الأجسام المضادة على بارافيلم. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- في صباح اليوم التالي، وغسل الخلايا 3 مرات، 5-10 دقيقة لكل منهما، عن طريق إزالة الأجسام المضادة من الشريحة غرفة واضاف في برنامج تلفزيوني. لcoverslips، ورفع كل واحد قبالة بارافيلم وضعه مرة أخرى في بئر من 24 لوحة جيدا، جنبا خلية يصل. بعناية إضافة PBS.
- إعداد الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 1: 500 في عرقلة الحل.
- الشرائح للغرفة، وإعداد 300 ميكرولتر / بئر شريحة غرفة 4-جيدا عن طريق خلط 499 ميكرولتر من عرقلة الحل و1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس IgG3 اليكسا فلور 488 (لSSEA4) أو 1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي اليكسا فلور 488 (لترا-1-60).
- لcoverslips، وإعداد 40 ميكرولتر / ساترة عن طريق خلط 499 ميكرولتر من عرقلة الحل و1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس IgG3 اليكسا فلور 488 (لSSEA4) أو 1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي اليكسا فلور 488 (لترا-1-60 ).
- نضح في برنامج تلفزيوني من الشريحة الغرفة والاستغناء عن الأجسام المضادة الثانوية في آبار المناسبة. لcoverslips بعد الخطوة 6.2، عكس لل coverslips على حل الأجسام المضادة وضعت على بارافيلم في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم فلوري الموسومة الأجسام المضادة الثانوية، يجب حماية الخلايا من الضوء. وضع الشرائح غرفة ولل coverslips في الحياة الفطرية الظلامironment خلال حضانات ويغسل. - غسل الخلايا 3 مرات لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما عن طريق إزالة الأجسام المضادة من الشريحة غرفة واضاف في برنامج تلفزيوني. لcoverslips، ورفع كل واحد بعناية من بارافيلم والمكان مرة أخرى في بئر من 24 لوحة جيدا، جنبا خلية يصل. إضافة بلطف PBS خلال يغسل.
- قبل التحقيق للمستضد الثاني، الخلايا أكتوبر-4 أو SOX2 في هذه الحالة، واحتضان مرة أخرى في عرقلة الحل المصنوع من كاشف permeabilization (تريتون-X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- لimmunostain للأكتوبر-4 أو SOX2، ببساطة اتباع منهجية وصفها في خطوات 6،1-6،6 لتطبيق الأجسام المضادة الأولية والثانوية. لأغراض هذا البروتوكول، واستخدام OCT-4 و SOX2 بتركيز 1: 200 والثانوي الأجسام المضادة الماعز المضادة للأرنب مفتش فلور اليكسا 594 في 1: 500.
- بعد العلاج الأجسام المضادة الأولية والثانوية المذكورة أعلاه، وغسل الخلايا 3 مرات لمدة 5-10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني ومباين مع 4 "، 6'-diamidino-2-phenylindole، هيدروكلوريد (دابي) التالية البروتوكولات القياسية إذا كان المطلوب التصور النووي.
7. التحضير للعرض
- الشرائح للغرفة، وإزالة بعناية الغرفة العليا من الشريحة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ثم، وشطف في الماء المقطر، وإضافة تصاعد المتوسطة وساترة لتمكين المجهري.
- لcoverslips، عكس لل coverslips إلى قطرة من تصاعد وضعت المتوسطة على شريحة المجهر والزجاج.
- صورة تحت المجهر مضان القياسية أو متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر هذا البروتوكول وصفا خطوة حكيمة لكيفية iPSCs البشرية يمكن نقلها من الطبقة المغذية لتحرير المغذية الشروط، ونشر في وقت لاحق بطريقة محدودة لتمكين تحديدا مناعية فعالة من حيث التكلفة لتأكيد صيانة تعدد القدرات. ويبين الشكل 1 التمثيل التخطيطي من هذا البروتوكول. ويبين الشكل 2A المستعمرات hiPSC المتزايد على iMEFs في 6 لوحات جيدا. هذه المستعمرات يحمل مورفولوجيا نموذجية مع حدود محددة ومراكز مشرقة المرحلة الكثيفة. كما هو مبين في الشكل 2B، وظروف خالية من الطاعم بعد نقل iPSCs لفي لوحات 12-جيدا، يظهر مستعمرة التشكل الفوضى الى حد ما مع حواف واضحة أقل. أيضا، قد تبقى بعض iMEFs في الثقافة في هذه المرحلة. ويبين الشكل 2C أن بعد مرور إضافي في نظام خالية المغذية، المستعمرات IPSC عرض التشكل أحادي الطبقة الكلاسيكية مع نواة عالية لقبرصينسبة toplasm. في هذه المرحلة، يعتبر أن iMEFs تم القضاء تقريبا من الثقافة.
المستعمرات المتزايد في ظل ظروف خالية المغذية يتم اختيار ميكانيكيا ومطلي على الشرائح غرفة أو coverslips الزجاج الصغيرة متعددة أيضا، وسبر لمستضدات تعدد القدرات محددة عبر مناعية. ويبين الشكل 3 مستعمرات التمثيلية التي immunopositive لSSEA4 أو ترا-1-60 (3B، 3F، مستضدات تعدد القدرات السطح) وأكتوبر-4 أو Sox2 (3 A، 3E، مستضدات تعدد القدرات داخل الخلايا).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي من البروتوكول. مخطط شامل للطريقة وصفها تستخدم للانتقال iPSCs الإنسان من مغذيات iMEF للثقافة وبعدها مجانا الطاعم-تحقق من الخلايا التي تحتوي على علامات تعدد القدرات. iMEF: irradia تيد الفأر الجنينية الخلايا الليفية. IPSC: المستحث المحفزة الخلايا الجذعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الصور التمثيلية للالمستعمرات IPSC الانتقال من iMEF المغذية لتحرير الطاعم-شروط الثقافة. أ) مستعمرة الكثيفة التوجيهية (السهم الأبيض) نمت على الخلايا المغذية iMEF (السهم الأسود). ب) بعد مرور الأولي إلى لوحة 12-جيدا المغلفة مصفوفة في المتوسط خالية من المصل، وعدد قليل iMEFs قد لا يزال يتعين مراعاتها في الثقافة (السهم الأسود). C) التشكل نموذجي أحادي الطبقة IPSC مستعمرة نمت خالية المغذية. تبقى لا iMEFs في الثقافة في هذه المرحلة. مقياس بار (AC) = 100 ميكرون. > الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. Immunocytochemical توصيف iPSCs مطلي الإنسان في لوحات حسنا الصغيرة. صور الممثل المناعي من iPSCs، التي تم الحصول عليها عن طريق المجهر متحد البؤر، والتي تبين التعبير الإيجابي من علامات تعدد القدرات أ) أكتوبر-4 (الحمراء) و (ب)) SSEA4 (الأخضر) مع C) ودابي وصمة عار النووي (الأزرق)، وE) Sox2 ( أحمر) و F) ترا-1-60 (الأخضر) مع G) دابي (الأزرق). D و H اظهار الصور تراكب المتعلقة AC وEG. شريط النطاق (ه) = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| hiPSC وسائل الإعلام للصيانة على مغذيات | ||
| مكون | الأسهم تركيز | تركيز النهائي |
| DMEM-F12 / HEPES | 100٪ | 80٪ |
| خروج المغلوب استبدال المصل | 100٪ | 20٪ |
| L-الجلوتامين | 200 ملي | 1 ملم |
| MEM-NEAA | 10 ملي | 0.1 ملم |
| 2-المركابتويثانول | 55 ملي | 0.1 ملم |
| المؤتلف جمعية جيل المستقبل-الإنسانية الأساسية | 10 ميكروغرام / مل | 10 نانوغرام / مل |
| Y-27632 ROCK المانع | 10 ميكرومتر | |
| طلاء Matrigel للثقافات الطاعم الحرة | ||
| مكون | ||
| مصفوفة Matrigel HESC المؤهلين | تخفيف عامل 269 ميكرولتر | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 مل | |
| ملاحظة: عامل التخفيف والكثير يتوقف، ويجب التأكد من شهادة التحليل | ||
| mTeSR1 وسائل الإعلام كاملة لثقافات الطاعم الحرة | ||
| مكون | كمية | |
| mTeSR1 متوسطة بصل | 400 مل | |
| mTeSR1 5X الملحق | 100 مل | |
| ملاحظة: مرة واحدة مختلطة، يمكن تجميد mTeSR1 سائل الإعلام كاملة في قسامات واستخدامها حتى تاريخ انتهاء الصلاحية مكون | ||
| ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة mTeSR1 سائل الإعلام كاملة في درجة حرارة الغرفة فقط. لا مكان في حمام مائي | ||
الجدول 1: IPSC الثقافة وسائل الإعلام وصفات وطلاءات اللوحة.
| 4٪ لامتصاص العرق تثبيتي | |
| مكون | كمية |
| 0.1 M ص 4 العازلة | 2 L |
| امتصاص العرق، prill | 80 ز |
| ICC عرقلة الحل دون تريتون-X-100 | |
| مكون | كمية |
| 1X الفوسفات مخزنة المالحة | 49 مل |
| مصل الماعز العادي | 1 مل |
| الأبقار مصل الزلال | 0.5 غرام |
| ICC عرقلة الحل مع تريتون-X-100 | |
| مكون | كمية |
| 1X الفوسفات مخزنة المالحة | 49 مل |
| مصل الماعز العادي | 1 مل |
| الأبقار مصل الزلال | 0.5 غرام |
| تريتون-X-100 | 200 ميكرولتر |
الجدول 2: تثبيتي وسيتولوجية مناعية وصفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول منهجية المعروضة هنا يقدم للوقت وطريقة فعالة من حيث التكلفة، في شكل تقنية ثقافة تحجيم، والمصممة خصيصا لدعم تحليل تعدد القدرات الفعالة عبر مناعية.
المزايا الرئيسية للمنهجية وصفها على النحو التالي. وهناك حاجة عادة أكثر من 3-4 الممرات للانتقال iPSCs من طبقات المغذية لالمغذية خالية من الظروف والثقافة من أجل القضاء على iMEFs المتبقية المتبقية بعد استخدام تقنيات التفكك السائبة والتشكل أحادي الطبقة نموذجي للمثول 12 و 13. في المقابل، فإن الطريقة المعروضة هنا يشمل جدول زمني تقصير، والذي يسمح لنقل سريع نسبيا من iPSCs لظروف خالية من المصل عن طريق قطف اليدوي للمستعمرات التوجيهية. تزرع iPSCs بكميات محدودة في الشرائح غرفة صغيرة أو coverslips مواتية للمناعية. في الواقع، فإن voluلي من مستنبت اللازمة لكل بئر هو فقط 0.5 مل وحجم محلول الأجسام المضادة المخفف المطلوبة لساترة واحدة كما اسمية 40 ميكرولتر أو 300 ميكرولتر في غرفة البئر، عند استخدام هذا البروتوكول.
نجد أن إضافة أجزاء متساوية iMEF مكيفة وسائل الإعلام إلى mTeSR1 أثناء مرور الأولي (الخطوة 2.5) خطوة مهمة أن يساعد في بقاء والحفاظ على التشكل المحفزة والتوجيهية ل. وبالإضافة إلى ذلك، إذا تمسك خلية ليس الأمثل بعد الركض (الخطوات 2.2 و 3.3 و 4.3)، استكشاف الأخطاء وإصلاحها لا يمكن أن يؤديها من خلال زيادة تحسين الأوقات التفكك المستخدمة.
وأخيرا، وجود قيود على طريقة الصغيرة الحجم المقدمة، بالمقارنة مع غيرها من التقنيات مثل التدفق الخلوي تستخدم أيضا للتحقق من تعدد القدرات، هو أنه لا يسمح لنشر المستمر للخلايا تحليلها لتطبيقات المصب. فائدة أسلوبنا تنشأ من تصميم معين والتي تدعم كوستي فعالة وثقافة فعالة للhiPSCs لتأكيد تعدد القدرات عبر مناعية الروتيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
