Introduction
유도 된 다 능성 줄기 세포로 인간 성인 체세포 재 프로그래밍 (iPSCs)는 병 (1, 2)를 연구하기 위해 환자의 특정 셀의 잠재적으로 무제한의 전원을 얻을 수있는 방법을 제공한다. 시험 관내에서 질병 표현형을 Recapitulating 것은 그럴듯한 질환과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수 있도록하고, 신약 개발을 강화하고 약 3 개인 것입니다. 또한, 인간 iPSCs (hiPSCs)는 죽은 세포 또는 장애를 바꾼 여러 질환 (4)의 컨텍스트 (5)에 기능을 회복하기위한 고유 자원으로 이용 될 수있는 특정 유형의 세포를 유도 할 가능성을 제공한다.
위의 응용 프로그램에서 iPSCs를 사용하는 중요한 전제 조건은 다 능성 및 미분화 상태가 문화의 확장 동안 유지되는 것을 보장한다. 일반적으로, techniq세포 및 특수 장비를 대량으로 필요로 이러한 유세포, 웨스턴 블롯, 중합 효소 연쇄 반응 분석 및 기능 등의 단말은, IPSC의 능성 6, 7, 8, 9, 10의 상세한 분석을 위해 사용된다. 그러나, iPSCs '미분화 상태의 일상적인 평가를 효과적으로 이렇게 감소 된 시간과 자원을 포함하는, 특히 면역 세포 (ICC) 이러한 세포의 제한된 전파를 통해 달성 될 수 있습니다.
최근 발전은 뮤린 섬유 아세포의 피더 레이어 혈청 함유 배지를 필요 종래 배양 시스템에 비해 상당히 개선 된 정의를 무 혈청 조건 iPSCs의 성장을 허용한다. 그러나, 현재의 문학 공급 장치에서 iPSCs를 전환하는 방법에 대해 설명 명확한 단계적 프로토콜을 포함하지 않는공급 장치가없는 시스템에 층.
이러한 맥락에서, 본 프로토콜은 체계적으로 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포 성장 hiPSCs는 (IMEF) 세포층 (1) 일 무 혈청 배지에서 전파하도록 적응, (2) 소규모 배양 특별히 강력한 지원하는 방법을 자세히 면역 세포 화학 분석. 전반적으로,이 방법은 면역 세포를 이용하여 정기적으로 자신의 분화능을 확인하기위한 무 혈청 조건에서 인간 iPSCs 전파하기위한 신속하고 비용 효과적인 방법을 나타낸다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs는 4mm 피부 펀치 생검에서 분리 센다이 바이러스 매개 재 프로그래밍 (11)를 통해 집에서 재 프로그래밍 인간 피부 섬유 아세포에서 유래되었다. 애리조나 임상 시험 심사위원회의 대학은 대상 모집 및 생검 수집을위한 모든 절차를 승인했다.
IPSC 문화에 대한 세포 외 매트릭스 코팅 표면의 1. 준비
- 어느 날 이전 iMEFs에 성장 hiPSC 문화의 합류로, 세포 외 기질 (마트 리겔) 코팅 된 플레이트를 준비합니다.
- 천천히 해동는 세포 외 기질의 나누어지는 2 시간 동안 4 ° C에서 얼음 (종속 많이는 사양서에 지시 사항을 따르십시오).
- 바이오 안전성 후드에서 차가운 피펫 팁을 사용하여 (DMEM / F12 / HEPES)이 많은 특정 희석 요인에 따라 감기 둘 베코의 변형 이글 중간 / 영양 혼합물 F-12 세포 외 기질의 1 분취 량을 추가 (-20 ° C에서 보관) .
- 분배 ~ 600(81) 각각의 새로운 세포 배양을 잘 당 세포 외 기질의 L은 12 웰 플레이트가 필요로 처리 하였다.
- 실온에서 수 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 여기서, 3 시간의 배양 시간을 사용합니다.
참고 : 접시는 즉시 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
전파에 대한 세포 외 매트릭스에 IMEF 피더 세포에 성장 hiPSCs 2. 전송
- 계대하는 날에, 4 ° C에서 매트릭스 도장 판을 제거하고, 플레이트는 조직 배양 후드에서 1 시간 동안 실온에 적응하도록 허용한다.
- iMEFs에 성장 hiPSC 문화의 6 웰 플레이트의 1도에서 매체를 대기음 500 μL 콜라게나 해리 시약으로 대체 (1 밀리그램 / 기초 배지에서 ㎖).
- IPSC 식민지의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지 30 분 - 10 ~ 37 ° C에서 품어.
참고 : 배양 시간이 줄 의존과 다를 수 있습니다. 현미경 분리를 모니터링합니다. - 차efully 해리 시약을 기음과 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, pH를 7.4)으로 가볍게 두 번 씻는다.
- 잘 10 NG / ㎖의 Rho 관련 단백질 키나제 억제제 (Y-27632 ROCK 저해제) 실온 mTeSR1 전체 매체의 1 ML을 추가합니다.
참고 :이 초기 통과하는 동안 IMEF 에어컨 매체와 mTeSR1의 50:50 혼합물을 사용하여 제안하고,이 미디어 전환시 hiPSCs의 생존에 도움이 될 수 있습니다. - 수동으로 점수 1 선택, 후드 내부에 부분적으로 배치 된 작은 위상차 현미경을 사용하여 - 2 hiPSC 식민지를 (~ 700 - 직경 1000 μm의) 주사기와 바늘 (25 G, 1.5에서)를 사용. P200 피펫 팁을 가진 매체로 식민지의 득점 조각을 밀어 넣습니다.
- 대기음은 코팅을 방해하지 않도록주의, 새로운 판에서 매트릭스를 처리합니다.
- 이전 잘 잘 코팅 된 새로운 행렬로 득점 iPSCs를 포함한에서 세포 현탁액의 양도 1 mL를.
- 놀이터37 ° C의 배양기에서 플레이트 CE, 5 % CO 2. 여러 빠른, 전후에 판 바위, 그리고 좌우로 움직임이 고르게 세포를 확산한다. 24 시간 동안 접시를 방해하지 마십시오.
- mTeSR1 완전 배지 (Y-27632 ROCK 억제제를 첨가 단계 2.5의 초기 도금 후 필요하지 않습니다)와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다.
매트릭스 코팅 된 플레이트에 hiPSCs 3. 작은 규모과 Passaging
주 : 일반적으로, 코팅 된 플레이트를 매트릭스 할 hiPSCs 초기 전송 한 후, 세포를 모두 iMEFs가 제거 된 세포는 조건없이 공급기하도록 보장하기 위하여 유사한 방식으로 한 번 계대한다.
- 섹션 1에서 설명한 바와 같이 이전 IPSC의 포화 상태에 어느 날 갓 매트릭스 판을 코팅 준비합니다.
- 통로의 날에, 39 ° C의 항온에서 매트릭스 도장 판을 제거하고, 판 조직 막힌 1 시간 동안 실온에 적응하도록 허용진짜야 후드.
- (원래 매트릭스 공급 장치에서 전환) hiPSCs의 6 웰 플레이트의 1도에서 매체를 대기음 500 μL 세포 분리 버퍼로 교체합니다.
주 : 여기에서 사용되는 상업용 세포 해리 완충액 (재료 표 참조)에 비해 콜라게나 mTeSR1 매체와 함께 사용하기에보다 적합하다. - IPSC 콜로니의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지 7 분 - 3 시간 동안 실온에서 인큐베이션. 앞서 언급 한 바와 같이, 인큐베이션 타임 라인 종속 변수이다. 따라서, 최적의 시간을 결정하기 위해 현미경으로 세포 분해를 감시한다.
- 조심스럽게 분리 버퍼를 대기음하고 PBS로 부드럽게하는 과정을 2 회 반복한다.
- 잘 10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 저해제 실온 mTeSR1 전체 매체의 500 μL를 추가합니다.
- 대신, 단계 260에서와 같이 득점 콜로니하는 P200 팁을 사용하여 미디어에 콜로니의 수를 밀어 부드럽게 세포 현탁액을 2 회 AG를 씹다크기 200 μm의 - 우물의 한 구석에 ~ (50)의 덩어리로 hiPSC 식민지를 깰 ainst. 각 1 개의 새 우물에 전송하는 2 식민지 - 예를 들어, 12 웰 플레이트를 들어, 1을 선택합니다. 물론 12 웰 플레이트의 하나의 새로운 우물에 기존의 세포 현탁액을 전송합니다.
- 여러 빠른 전후에 판 암, 및 좌우 운동은 균일하게 세포를 확산하고, 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 24 시간 동안 접시 나머지하자.
- mTeSR1 완전한 매체와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 초기 도금 후 Y-27632의 ROCK 억제제를 추가 할 필요가 없다.
참고 : 단계 3.7에서 사용되지 않는 IPSC 식민지가이 시점에서 쉽게 냉동 보관 할 수있다.
면역 세포 화학에 대한 hiPSCs의 시드 대한 상공 회의소 슬라이드 및 Coverslips는 4. 준비
참고 : 다음 프로토콜은 4 웰 플라스틱 챔버 슬라이드와 appropriat와 12mm 커버 글라스를 사용한다멀티 웰 미디어의 전자 볼륨은 비용 효과적인 면역 세포를 지원한다. 더 잘 커버 슬립 크기의 사용이 요구되는 경우, 매체 볼륨이 증가 될 수있다.
- 어느 날 hiPSC 합류하기 전에 충분히 매트릭스 솔루션 부 (1)에서 설명한 바와 같이 갓 세포 외 기질로 코팅 챔버 슬라이드를 준비 추가 (~ 300 - 4 잘 챔버 슬라이드의 잘 당 500 μL)의 우려없이 잘 완전히 코트 각 증발. 또한, 500 μL 각 24 웰 플레이트의 웰 코트에 세포 외 기질을 1 청소 및 소독 커버 슬립을 배치하고 coverslip에이 솔루션의 상단에 떠 있지 않은지 확인 후.
- 통로의 날, 4 ° C에서 코팅 된 챔버 슬라이드 / 커버 슬립을 제거하고 조직 배양 후드에서 1 시간 동안 실온에 적응을 허용한다.
- hiPSCs의 12 웰 플레이트의 한 우물에서 매체를 대기음 500 μL 해리 버퍼로 교체합니다.
- 객실 템피에 품어~ 3 rature - 7 분은 IPSC 식민지의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지.
- 조심스럽게 분리 버퍼를 기음과 우물에 10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 저해제 실온 mTeSR1 완전 배지 1 ㎖를 추가합니다.
- 수동으로 4 웰 챔버 슬라이드 또는 1 새 coverslip에의 한 식민지 / 새로운 잘 선택, 조직 문화 후드 내부에 배치 작은 위상차 현미경을 사용하여 도금 될 (~ 1000 - 직경 1,500 μm의)를 추진하여 P200 피펫 팁을 사용하여 그것은 오프 매체에 플레이트 표면.
- 코팅을 방해하지 않도록주의, 새로운 챔버 슬라이드 / 커버 슬립에서 행렬을 대기음.
- 크기 200 μm의 - 부드럽게 ~ 50의 덩어리로 세포 현탁액에게 hiPSC 식민지를 깰 우물의 한 구석에 대하여 2 번 씹다. 잘 4 잘 챔버 슬라이드 / 커버 슬립의 새 우물에 이전에서 세포 현탁액 250 μL를 전송합니다.
- 잘 mTeSR1의 계속 500 μL까지 새로운 각의 볼륨을 가져와10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 억제제를 aining.
- 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에서 챔버 슬라이드 / 커버 슬립을 놓습니다.
- 24 시간 후, mTeSR1 완전한 매체와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 언급 한 바와 같이 다시, Y-27632 ROCK 억제제의 첨가는 초기 도금 후 불필요하다.
면역 세포 화학에 대한 iPSCs 5. 준비
- 합류 후, 미리 예열주의 4 % 파라 포름 알데히드를 우물에서 미디어를 제거하고 추가하여 고정을 통해 hiPSC 식민지를 유지 (~ 300 μL / 웰의 4 웰 챔버 슬라이드 / 커버 슬립). 실온에서 20 분 동안 인큐베이션.
- 적절하게 기관 생물 및 화학 안전 지침에 따라 파라 포름 알데히드를 폐기하십시오.
- PBS와 벤치 탑 진탕 기에서 5 분마다 세포를 3 회 반복한다.
참고 : 챔버 슬라이드에 세포 / 커버 슬립이 단계에서 무한정 4 ° C에서 충분한 PBS로 저장할 수 있습니다.대안 적으로, 그들은 즉시 ICC를 위해 사용될 수있다.
만능 마커와 hiPSCs 6. 면역 염색
참고 : 표준 만능의 항체 발현 사이의 hiPSCs. 예를 들어, 여기 세포 더블 스테인드 다음과 같이 항체가 하나의 1면과 순차적으로 1 세포 내 항원을 대상으로 다음과 같습니다과 안티 무대 특정 배아 항원-4 (SSEA4) 단백질 4 (옥트을 방지 옥타 결합 4) 및 안티 트라-1-60 반 SRY 관련 HMG 상자 유전자 2 (SOX2)와 () 항체 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 우물에서 PBS를 기음과 트리톤 X-100없이 500 μL / 잘 차단 솔루션에 추가 할 수 있습니다. 실온에서 1 시간 동안 배양.
- 트리톤 X-100 않고 차단 용액으로 희석하여 표면 항체, SSEA4 또는 트라-1-60 중 하나로서, 미리 결정된 농도를 준비 (200 여기서, 1을 사용).
- 챔버 슬라이드를 들어, 4 잘 챔버 슬라이드의 300 μL / 잘 준비위의 솔루션 및 안티 SSEA4 또는 트라-1-60 일차 항체의 1.5 μL를 차단의 298.5 μL를 혼합하여.
- 된 커버를 들어, 솔루션 및 안티 SSEA4 또는 트라-1-60 일차 항체의 1 μL 차단의 199 μL를 혼합하여 40 μL / 커버 슬립을 준비합니다.
- 챔버 슬라이드에서 차단 솔루션을 기음하고 적절한 우물에 차 항체를 분배. 된 커버를 들어, 단단히 페트리 접시 안에 파라 필름의 조각을 놓고 방울로 위에 차 항체의 40 μL를 분배. 구부러진 주사기 바늘과 집게를 사용하여 조심스럽게 아니라 문화의 밖으로 커버 슬립을 들어 올려 파라 필름에 대한 항체의 드롭에 아래로 셀 측면을 배치합니다. 4 ℃에서 밤새 품어.
- 챔버 슬라이드에서 항체를 제거하고 PBS에 추가하여 10 분마다, - 다음날 아침, 세포 3 번, 5 씻는다. 된 커버를 들어, 파라 필름 오프 각을 들어 올려 24 웰 플레이트, 세포면이 위로의 잘에 다시 배치합니다. 조심스럽게 P를 추가BS.
- 1 적절한 보조 항체를 준비 : (500)를 차단 솔루션에.
- 챔버 슬라이드를 들어, 준비 300 μL / 웰 4 잘 챔버 슬라이드의 항 - 마우스 IgM의 알렉사 플 루어 염소의 항 - 마우스 IgG3 알렉사 플 루어 488 (SSEA4) 또는 1 μL 염소의 μL를 차단 솔루션의 499 μL를 혼합 1로 488 (트라-1-60)입니다.
- 커버 슬립을 위해 솔루션을 차단의 499 μL를 혼합하여 40 μL / 커버 슬립을 준비하고 염소의 1 μL 항 - 마우스 IgG3 알렉사 플 루어 488 염소의 μL 항 - 마우스 IgM의 알렉사 플 루어 488 (SSEA4) 또는 1 (대한 트라-1-60 ).
- 챔버 슬라이드에서 PBS를 대기음하고 적절한 우물에 차 항체를 분배. 커버 슬립 들어, 스텝 6.2 다음, 실온에서 2 시간 동안 파라 필름 상에 배치 된 항체 용액 위에 커버 슬립을 반전.
참고 : 사용하는 형광 이차 항체를 태그하면, 세포가 빛으로부터 보호해야합니다. 어두운 ENV에 챔버 슬라이드와 커버 슬립을 배치배양 및 세척시 ironment. - 챔버 슬라이드에서 항체를 제거하고 PBS에 추가하여 10 분마다 - 5 세포를 3 회 반복한다. 된 커버를 들어, 파라 필름에서 조심스럽게 하나 하나를 들어 올려 24 웰 플레이트, 세포면이 위로의 잘 다시 배치합니다. 부드럽게 세척하는 동안 PBS를 추가합니다.
- 제 항원 프로빙에 앞서, 세포 옥트 4이 경우 SOX2 실온에서 1 시간 동안 permeabilization 시약 (트리톤 X-100)로 이루어진 차단 용액으로 다시 배양한다.
- 옥트 4 SOX2위한 발현 사이하려면 일차 및 이차 항체를 가하는 단계 6.1-6.6에서 설명 된 방법을 따른다. 1 (200) 및 이차 항체를 염소 항 - 토끼 IgG를 렉 형석 594 :이 프로토콜의 목적을 위해, 하나의 농도 옥트 4 SOX2를 사용하여 500.
- 6'-diamidino-2 'PBS로 각각 10 분 및 4 Counterstain과 - 상기의 일차 및 이차 항체 치료 후 5 세포를 3 회 세척-phenylindole 핵 시각화가 요구되는 경우 표준 프로토콜에 따라 디 히드로 클로라이드 (DAPI).
보기 7. 준비
- 챔버 슬라이드를 들어, 조심스럽게 제조업체의 지침에 따라, 슬라이드에서 상부 챔버를 제거합니다. 그런 다음, 증류수로 세척하고, 현미경을 사용하려면 매체와 커브 글라스를 장착 추가합니다.
- 커버 슬립 들어, 중간 유리 현미경 슬라이드에 위치 장착 하락에 커버 슬립을 반전.
- 표준 또는 공 초점 형광 현미경 이미지.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜은 특별히 능성 유지를 확인하기위한 비용 효율적인 면역 세포를 활성화하는 제한된 방식 피더 확보 조건 세포층으로부터 전송하고,이어서 전달되는 방법 인간 iPSCs의 단계적인 설명을 제공한다. 도 1은이 프로토콜의 개략도를 도시한다. 도 2a는 6 웰 플레이트에 iMEFs에 성장 hiPSC 식민지를 보여줍니다. 이러한 식민지 정의 테두리와 조밀 한 단계 밝은 센터와 전형적인 형태를 나타낸다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 12- 웰 플레이트에서 iPSCs의 전송이 끝날 공급기없는 조건, 콜로니 형태는 덜 뚜렷한 가장자리 다소 혼란 나타난다. 또한, 일부 iMEFs이 단계에서 문화에 남아있을 수 있습니다. 도 2c는 공급 장치가없는 시스템의 추가 통과 한 후, IPSC 식민지가 CY에 높은 핵을 가진 고전적인 단층 형태를 표시하는 것을 보여줍니다toplasm 비율. 이 단계에서, iMEFs 사실상 배양 물로부터 제거 된 것을 알 수있다.
공급 장치가없는 상태에서 성장 식민지 기계적으로 포착하고 챔버 슬라이드 나 커버 글라스 작은 멀티 웰에 도금 및 면역 세포를 통해 특정 능성 항원에 대한 탐색 할 수 있습니다. 그림 3은 SSEA4 또는 트라-1-60 (3B, 3 층, 표면 능성 항원)과 10 월 4, Sox2이 (3 A, 3E, 세포 내 능성 항원)에 대한 면역 양성있는 대표적인 식민지를 보여줍니다.
그림 1 : 프로토콜의 도식 표현. IMEF 피더에서 인간 iPSCs를 전환하는 데 사용 된 방법의 전체 스키마는 피더 무료로하는 문화와 후속를 다 능성 마커와 세포의 프로빙. IMEF : irradia 테드 마우스 배아 섬유 아세포; IPSC : 다 능성 줄기 세포를 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
피더 무료로 문화 조건을 IMEF 공급기에서 전환 중 IPSC의 식민지 그림 2. 대표 이미지. IMEF 피더 세포 (검은 색 화살표)에서 재배 A) 밀도 IPSC 식민지 (흰색 화살표). B) 혈청 배지에서 매트릭스 - 코팅 12- 웰 플레이트의 최초 통과 후 몇 iMEFs 여전히) 배양 (검은 화살표에서 관찰 될 수있다. C) 단층의 전형적인 형태 IPSC 식민지 공급 장치가없는 성장. 어떤 iMEFs이 단계에서 문화에 남아 없습니다. 스케일 바 (AC)는 100 μm의 =.>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 작은 웰 플레이트에서 인간 iPSCs 도금의 면역 세포 화학 특성. 대표 C와 만능 마커 A) 10 월 4 (빨간색) 및 B) SSEA4 (녹색)) 핵 얼룩 DAPI (파란색)의 긍정적 인 표현을 나타내는 공 초점 현미경을 통해 얻은 iPSCs의 면역 형광 이미지, 및 E) Sox2이 ( 빨간색) 및 F G)와 트라-1-60 (녹색)) DAPI (파란색). D와 H는 AC 및 EG에 관한 오버레이 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 (AH) = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 공급기에 유지 보수를 위해 hiPSC 미디어 | ||
| 구성 요소 | 주식 농도 | 최종 농도 |
| DMEM-F12 / HEPES | 100 % | 80 % |
| 녹아웃 세럼 교체 | 100 % | 20 % |
| L 글루타민 | 200 밀리미터 | 1 ㎜ |
| MEM-NEAA | 10 mM의 | 0.1 mM의 |
| 2- 머 캅토 에탄올 | 55 mM의 | 0.1 mM의 |
| 재조합 인간 FGF-기본 | 10 μg의 / mL의 | 10 NG / mL로 |
| Y-27632의 ROCK 저해제 | 10 μM | |
| 피더없는 문화에 대한 마트 리겔 코팅 | ||
| 구성 요소 | ||
| 마트 리겔 hESC의 자격을 갖춘 매트릭스 | 희석 배수 269 μL | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 ㎖ | |
| 참고 : 희석 요인이 많이 의존하고 분석 증명서에서 확인해야합니다 | ||
| 피더없는 문화에 대한 mTeSR1 전체 미디어 | ||
| 구성 요소 | 양 | |
| mTeSR1 기초 배지 | 400 mL의 | |
| mTeSR1 5 배 보충 | 100 ㎖ | |
| 참고 : 혼합되면, mTeSR1 전체 미디어 분량 씩 냉동 될 수 있으며, 구성 요소 유효 기간까지 사용 | ||
| 참고 : mTeSR1 전체 미디어 실온 만에 예열해야합니다. 수조에 두지 마십시오 | ||
표 1 : IPSC 문화 미디어 조리법 및 플레이트 코팅.
| 4 % 파라 포름 알데히드 고정액 | |
| 구성 요소 | 양 |
| 0.1 M PO 4 버퍼 | 2 L |
| 파라 포름 알데히드, 프릴 | 80g |
| 트리톤 X-100없이 ICC 차단 솔루션 | |
| 구성 요소 | 양 |
| 1 배 인산염 완충 생리 식염수 | 49 mL의 |
| 정상 염소 혈청 | 1 mL의 |
| 소 혈청 알부민 | 0.5 g |
| 트리톤 X-100과 ICC 차단 솔루션 | |
| 구성 요소 | 양 |
| 1 배 인산염 완충 생리 식염수 | 49 mL의 |
| 정상 염소 혈청 | 1 mL의 |
| 소 혈청 알부민 | 0.5 g |
| 트리톤 X-100 | 200 μL |
표 2 : 정착액 및 면역 세포 화학 조리법.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 제시된 프로토콜 체계 특히 면역 세포를 통해 효과적인 능성 분석을 지원하기위한 축소 된 배양 기술의 형태로 시간을 절약하고 비용 효율적인 방법을 제공한다.
다음과 같이 설명 된 방법의 주요 장점이다. 전통적 이상의 3~4 통로 12, 13을 표시 대량 분리 기술의 사용 후에 잔존 iMEFs을 제거하기 위해 전형적인 단층 형태를위한 배양 조건 부담을 피더 세포층으로부터 iPSCs를 전환 할 필요가있다. 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 IPSC 콜로니의 수동 따기 통해 무 혈청 조건 iPSCs 비교적 빠른 전송을 가능하게 단축 타임 라인을 포함한다. iPSCs 작은 챔버 슬라이드 나 면역 세포에 대한 도움이 된 커버에 제한된 양으로 성장하고 있습니다. 사실, volu웰 당 필요한 배지 내 단지 0.5 mL로하고이 프로토콜을 사용할 때 하나의 커버 슬립에 필요한 희석 항체 용액의 부피가 아니라 공칭 40 μL 또는 챔버 300 μL이다.
우리는 IMEF 초기 통과하는 동안 mTeSR1에 미디어를 조절 동일 부품 (2.5 단계)의 추가가 중요한 단계입니다 찾기가 생존하고 IPSC의 만능 형태의 유지 보수 보조. 세포 접착은 (2.2, 3.3 및 4.3 단계) 계대 후 최적없는 경우에는, 상기 문제는 사용되는 해리 시간을 최적화함으로써 실시 할 수있다.
마지막으로, 유동 세포 계측법과 같은 다른 기술들에 비교했을 때 표시 소규모 방법의 제한, 또한 다 능성을 확인하는 데 사용되는 다운 스트림 애플리케이션 분석 세포의 계속적인 증식을 허용하지 않는다는 것이다. 우리의 방법의 유용성은 COS를 지원하는 자사의 특정 설계에서 발생t-효과적이고 일상적인 면역 세포를 통해 능성을 확인하기위한 hiPSCs의 효율적인 문화.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
