Introduction
Reprogrammation cellules somatiques humaines adultes en cellules souches pluripotentes induites (CSPi) fournit un moyen d'obtenir une offre potentiellement illimitée de cellules spécifiques au patient pour étudier les maladies 1, 2. Récapitulant un phénotype de la maladie in vitro , il serait plausible d'examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à la maladie, et d' améliorer la découverte de médicaments et la médecine 3 personnalisé. En outre, CSPi humaines (hiPSCs) offrent la possibilité de dériver des types cellulaires spécifiques qui peuvent être utilisés comme une ressource unique pour remplacer les cellules mortes ou dysfonctionnelles et restaurer la fonction dans le contexte de plusieurs troubles 4, 5.
Une condition préalable importante à l'utilisation de CSPi dans les applications ci-dessus est de veiller à ce que leur état pluripotent et indifférenciée est maintenue lors de l'expansion de la culture. En règle générale, techniques telles que la cytométrie en flux, un transfert de Western, une réaction en chaîne par polymérase et des dosages fonctionnels, qui nécessitent de grandes quantités de cellules et du matériel spécialisé, sont utilisés pour l'analyse détaillée de la pluripotence COPSi 6, 7, 8, 9, 10. Toutefois, l'évaluation systématique de l'état indifférencié des CSPi pourrait effectivement être atteint grâce à la propagation limitée de ces cellules spécifiquement pour immunocytochimie (ICC), impliquant ainsi le temps et les ressources réduites.
Les progrès récents permettent la croissance des CSPi dans des conditions sans sérum définies, ce qui représente une amélioration significative par rapport aux systèmes classiques de culture qui nécessitent murins couches nourricières de fibroblastes et des médias de sérum contenant. Cependant, la littérature actuelle ne comprend pas les protocoles par étapes claires qui décrivent comment faire la transition CSPi de chargeurcouche aux systèmes sans alimentation.
Dans ce contexte, le présent protocole détaille systématiquement comment hiPSCs cultivées sur la souris irradiée fibroblaste embryonnaire (Imef) couches d'alimentation peuvent être (1) apte à se propager dans un milieu sans sérum, et (2) cultivées sur une petite échelle pour soutenir spécifiquement robuste analyse immunocytochimique. Dans l'ensemble, cette méthode représente une procédure rapide et rentable pour la propagation CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour confirmer leur pluripotence sur une base régulière en utilisant immunocytochimie.
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Protocol
hiPSCs ont été obtenues à partir de fibroblastes dermiques humains isolés à partir de 4 mm biopsies de la peau et reprogrammées dans la maison via Sendai virus médiée reprogrammation 11. L'Université de l'Arizona Institutional Review Board a approuvé toutes les procédures pour le sujet du recrutement et de collecte de biopsie.
1. Préparation de la matrice extracellulaire Surface revêtu pour iPSC Culture
- Un jour avant la confluence des cultures hiPSC poussent sur iMEFs, préparer la matrice extracellulaire (Matrigel) des plaques enduites.
- dégel lent une aliquote de la matrice extracellulaire (lot dépendant, suivre les instructions sur la fiche technique) sur la glace à 4 ° C pendant 2 h.
- Dans une hotte de biosécurité, en utilisant les embouts de pipettes à froid (stocké à -20 ° C), ajouter 1 aliquote de matrice extracellulaire à Modified Eagle Medium Mixture / éléments nutritifs de froid Dulbecco F-12 (DMEM / F12 / HEPES) selon spécifique, le facteur de dilution du lot .
- Distribuer ~ 60081; L de la matrice extracellulaire par puits de chaque nouvelle culture cellulaire traitée plaque 12 puits nécessaire.
- Incuber la plaque à température ambiante pendant plusieurs heures. Ici, utiliser un temps d'incubation de 3 h.
REMARQUE: Les plaques peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines.
2. Transfert de hiPSCs Cultivé sur des cellules nourricières Imef sur la matrice extracellulaire pour Propagation
- Le jour de repiquage, retirer la plaque revêtue de la matrice de 4 ° C et laisser la plaque acclimater à la température ambiante pendant 1 h dans la hotte de culture tissulaire.
- Aspirer le moyen de 1 puits d'une plaque à 6 puits de culture hiPSC croissante sur iMEFs et le remplacer par 500 ul de réactif collagénase de dissociation (1 mg / ml dans un milieu de culture de base).
- Incuber à 37 ° C pendant environ 10-30 min jusqu'à ce que les bords des colonies iPSC semblent soulever légèrement.
NOTE: Le temps d'incubation est en ligne dépendante et varie. Surveiller la dissociation sous un microscope. - Voitureefully Aspirer le réactif de dissociation et lavez doucement 2 fois avec du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4).
- Ajouter 1 mL de la température ambiante mTeSR1 milieu complet avec 10 ng inhibiteur de protéine kinase associée à Rho ml (Y-27632 inhibiteur de ROCK) / du puits.
NOTE: L'utilisation d'un mélange 50:50 de milieu Imef conditionné et mTeSR1 lors de ce passage initial est suggéré et peut être bénéfique pour la survie des hiPSCs au cours de cette transition des médias. - En utilisant un petit microscope à contraste de phase placé partiellement à l'intérieur du capot, le score manuellement et ramasser 1 - 2 colonies de hiPSC (~ 700 - 1000 um de diamètre) en utilisant une seringue et une aiguille (25 g, 1 ½ po). Pousser sur les morceaux marqués de la colonie dans le milieu avec une pointe P200 de la pipette.
- Aspirer et disposer de la matrice à partir de la nouvelle plaque, en faisant attention à ne pas perturber le revêtement.
- Transférer 1 ml de la suspension cellulaire de l'ancien puits contenant les CSPi marqués dans la nouvelle matrice ainsi revêtue.
- PlaCE de la plaque dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2. Roche la plaque dans plusieurs, va-et-vient rapide, et l'autre à l'autre des mouvements pour répandre uniformément les cellules. Ne pas déranger la plaque pendant 24 h.
- Effectuer tous les jours pleins changements de médias avec un milieu complet mTeSR1 (addition de Y-27632 ROCK Inhibitor est pas nécessaire après l'étalement initial à l'étape 2.5).
Repiquage 3. à petite échelle de hiPSCs sur des plaques de matrice revêtu
NOTE: En général, après le transfert initial des hiPSCs à la matrice plaques revêtues, les cellules doivent être repiqué une fois de plus d'une manière similaire pour garantir que tous iMEFs ont été éliminés et les cellules sont adaptées à des conditions exemptes feeder.
- Un jour avant iPSC confluence Préparer fraîchement revêtue de plaques de matrice tel que discuté dans la section 1.
- Le jour de passage, enlever la plaque revêtue de la matrice de 4 ° C, l'incubation et laisser la plaque acclimater à la température ambiante pendant 1 h dans le cul de tissuture capot.
- Aspirer le moyen de 1 puits d'une plaque à 6 puits de hiPSCs (à l'origine la transition du margeur à la matrice) et le remplacer par 500 ul de tampon de dissociation cellulaire.
NOTE: Le tampon de dissociation cellulaire commercial utilisé ici (voir le tableau Matériaux) est plus approprié pour une utilisation avec un milieu mTeSR1 par rapport à la collagénase. - Incuber à température ambiante pendant 3 à 7 min jusqu'à ce que les bords des colonies iPSC semblent soulever légèrement. Comme mentionné précédemment, la durée d'incubation est conduite à charge et variable. Par conséquent, contrôler la dissociation cellulaire au microscope pour déterminer le moment optimal.
- Aspirer soigneusement le tampon de dissociation et laver délicatement 2 fois avec du PBS.
- Ajouter 500 ul de la température ambiante mTeSR1 milieu complet avec 10 ng d'inhibiteur de ROCK / ml Y-27632 dans le puits.
- Au lieu de colonies de marquer comme à l'étape 2.6, appuyez sur le nombre souhaité de colonies dans les médias en utilisant une pointe de P200 et triturer doucement la suspension cellulaire 2 fois against un coin du puits pour briser les colonies hiPSC en amas de ~ 50-200 um. Par exemple, pour une plaque de 12 puits, prendre 1 - 2 colonies à transférer dans chaque 1 nouveau puits. Transférer la suspension cellulaire du vieux puits dans un nouveau single puits d'une plaque de 12 puits.
- Rock the plaque dans plusieurs va-et-vient rapide, et d'un côté à côté des mouvements pour répandre uniformément les cellules, et que la plaque reste pendant 24 h dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Effectuer tous les jours pleins changements de médias avec mTeSR1 milieu complet. Comme mentionné précédemment, il est nécessaire d'ajouter des inhibiteurs de ROCK Y-27632 après le plaquage initial.
NOTE: colonies iPSC inutilisées de l'étape 3.7 peuvent être facilement cryoconservés à ce stade.
4. Préparation de la Chambre Diapositives et Lamelles pour Ensemencement des hiPSCs pour Immunocytochimie
NOTE: Le protocole suivant utilise 4 puits diapositives de chambre en plastique et 12 mm lamelles de verre avec appropriatvolumes e des médias dans les multi-puits pour soutenir immunocytochimie rentable. Cependant, les volumes des médias peut être augmenté si l'utilisation des puits et des tailles plus grandes lamelle est souhaitée.
- Un jour avant hiPSC confluence, préparer des lames de chambre fraîchement enduites de matrice extracellulaire tel que discuté dans la section 1. Ajouter suffisamment de solution de matrice (~ 300 - 500 pl par puits d'une lame de chambre 4 puits) pour pleinement bien enrober chacune sans aucun souci de évaporation. Alternativement, après avoir placé 1 lamelle nettoyé et stérilisé dans chaque puits d'une plaque de 24 puits, manteau avec 500 uL matrice extracellulaire et assurez-vous que la lamelle ne flotte pas au-dessus de la solution.
- Le jour de passage, retirez les diapositives de chambre / lamelles recouvertes de 4 ° C et de permettre l'acclimatation à la température ambiante pendant 1 h dans la hotte de culture de tissus.
- Aspirer le moyen de 1 puits d'une plaque de 12 puits de hiPSCs et le remplacer par 500 pi de tampon de dissociation.
- Incuber à la chambre Tempe~ rature pendant 3 à 7 min jusqu'à ce que les bords des colonies iPSC semblent soulever légèrement.
- Aspirer soigneusement le tampon de dissociation et ajouter 1 ml de la température ambiante mTeSR1 milieu complet avec 10 ng / mL Y-27632 Inhibitor ROCK au bien.
- En utilisant un microscope à contraste faible de phase placé à l'intérieur de la hotte de culture de tissus, choisir manuellement 1 colonie / nouveau puits d'une lame de chambre 4 puits ou 1 nouvelle lamelle à plaquer (~ 1000 - 1500 m de diamètre) en utilisant une pointe P200 de pipette en appuyant elle hors de la surface de la plaque dans le milieu.
- Aspirer la matrice de la nouvelle chambre slide / lamelle, en faisant attention à ne pas perturber le revêtement.
- triturer doucement la suspension cellulaire 2 fois contre un coin du puits pour briser les colonies hiPSC en amas de ~ 50-200 um. Transférer 250 ul de la suspension cellulaire du vieux puits dans chaque nouveau puits d'une 4 puits chambre coulissant / lamelle.
- Apportez le volume de chaque nouveau puits jusqu'à 500 pi avec mTeSR1 suiteaining 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibiteur.
- Placez les diapositives chambre / lamelles dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Après 24 h, effectuer des changements quotidiens complets des médias avec mTeSR1 milieu complet. Là encore, comme mentionné précédemment, l'addition de Y-27632 ROCK Inhibiteur ne sont pas nécessaires après le plaquage initial.
5. Préparation de CSPi pour Immunocytochimie
- Une fois confluentes, préserver les colonies hiPSC via la fixation en enlevant les médias à partir des puits et en ajoutant préchauffé ATTENTION paraformaldéhyde 4% (~ 300 pl / puits d'une lame de chambre 4 puits / lamelle). Incuber à température ambiante pendant 20 min.
- Jeter la paraformaldéhyde appropriée selon biohazard institutionnel et des lignes directrices sur la sécurité chimique.
- Laver les cellules 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois sur un agitateur de paillasse avec du PBS.
NOTE: Les cellules sur des lames de chambre / lamelles peuvent être stockés avec un grand PBS à 4 ° C indéfiniment à ce stade.Alternativement, ils peuvent être immédiatement utilisés pour la CPI.
6. Immunomarquage de hiPSCs avec pluripotence Marqueurs
NOTE: hiPSCs immunocoloration avec des anticorps de pluripotence standard. A titre d'exemple, voici les cellules sont en double-colorées avec des anticorps ciblant un 1 surface et 1 antigène intracellulaire de manière séquentielle comme suit: Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA4) avec des protéines 4 (OCT- anti-octamère liaison 4) et anti-Tra-1-60 avec anti-SRY BOX HMG lié au gène 2 (SOX2) (S'il vous plaît voir le tableau des matériaux pour les détails d'anticorps).
- Aspirer le PBS des puits et ajouter 500 pi / Solution bien Blocage sans Triton-X-100. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Préparer une concentration pré-déterminée (ici, utiliser 1: 200) des anticorps de surface, soit SSEA4 ou Tra-1-60, par dilution dans la solution de blocage sans Triton X-100.
- Pour les diapositives de chambre, préparer 300 pl / puits d'une lame de chambre 4 puitsen mélangeant 298,5 ul de solution de blocage ci-dessus et 1,5 pi d'anti-SSEA4 ou Tra-1-60 anticorps primaire.
- Pour lamelles, préparer 40 pl / lamelle en mélangeant 199 ul de solution de blocage et 1 pi d'anti-SSEA4 ou Tra-1-60 anticorps primaire.
- Aspirer la solution de blocage de la lame de la chambre et distribuer l'anticorps primaire dans les puits appropriés. Pour lamelles, placez un morceau de parafilm fermement à l'intérieur d'une boîte de Pétri et distribuer 40 ul de l'anticorps primaire sur le dessus comme une gouttelette. En utilisant une aiguille et une pince de seringue fléchis, soulevez délicatement la lamelle sur la culture bien et placez-le côté de la cellule vers le bas sur la chute de l'anticorps sur le parafilm. Incuber une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain matin, laver les cellules 3 fois, 5 - 10 minutes à chaque fois, en retirant l'anticorps à partir de la lame de la chambre et en ajoutant du PBS. Pour lamelles, soulevez chacun hors du parafilm et placez-le dans un puits d'une plaque de 24 puits, côté cellule vers le haut. Ajouter délicatement PBS.
- Préparer des anticorps secondaires appropriés à 1: 500 dans la solution de blocage.
- Pour les diapositives de chambre, préparer 300 pl / puits d'une lame de chambre 4 puits en mélangeant 499 ul de solution de blocage et 1 pi de chèvre anti-souris IgG3 Alexa Fluor 488 (pour SSEA4) ou 1 pi de chèvre anti-souris IgM Alexa Fluor 488 (pour Tra-1-60).
- Pour les lamelles couvre-objet, préparer 40 ul / lamelle couvre-objet en mélangeant 499 ul de solution de blocage et 1 pi de chèvre anti-souris IgG3 Alexa Fluor 488 (pour SSEA4) ou 1 pi d'anticorps de chèvre anti-IgM de souris Alexa Fluor 488 (pour Tra-1-60 ).
- Aspirer le PBS de la glissière de chambre et distribuer l'anticorps secondaire dans les puits appropriés. Pour les lamelles couvre-objet, après l'étape 6.2, inverser les lamelles couvre-objet sur la solution d'anticorps placé sur un parafilm à la température ambiante pendant 2 h.
NOTE: Si vous utilisez fluorescent marqué des anticorps secondaires, les cellules doivent être protégées de la lumière. Placer les lames de la chambre et les lamelles dans un env sombreironnement pendant incubations et lavages. - Laver les cellules 3 fois pendant 5 à 10 min à chaque fois en supprimant l'anticorps de la glissière de la chambre et en ajoutant du PBS. Pour lamelles, soulevez chacun soigneusement du parafilm et replacer dans un puits d'une plaque de 24 puits, côté cellule vers le haut. Ajouter délicatement PBS pendant les lavages.
- Avant de sonder pour le second antigène, intracellulaire OCT-4 ou SOX2 dans ce cas, incuber à nouveau dans la solution de blocage faite avec le réactif de perméabilisation (Triton-X-100) pendant 1 h à température ambiante.
- Pour immunocoloration pour OCT-4 ou SOX2, il suffit de suivre la méthodologie décrite dans les étapes 6.1-6.6 pour appliquer les anticorps primaires et secondaires. Aux fins de ce protocole, utiliser OCT-4 et SOX2 à une concentration de 1: 200 et l'anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin Alexa Fluor 594 à 1: 500.
- Après les traitements primaires et secondaires mentionnées ci-dessus d'anticorps, laver les cellules 3 fois pendant 5 à 10 minutes à chaque fois avec du PBS et contre-colorer avec 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole, dichlorhydrate (DAPI) suivant les protocoles standard si la visualisation nucléaire est souhaitée.
7. Préparation pour le visionnement
- Pour les diapositives de chambre, retirez soigneusement la chambre supérieure de la diapositive, en suivant les instructions du fabricant. Puis, rincer à l'eau distillée et ajouter du milieu et d'une lamelle de montage pour permettre à la microscopie.
- Pour les lamelles couvre-objet, inverser les lamelles sur une goutte de milieu de montage placé sur une lame de microscope en verre.
- Image sous un microscope à fluorescence standard ou confocale.
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Representative Results
Ce protocole fournit une description étape par étape de la façon dont CSPi humaine peut être transférée de la couche d'alimentation à des conditions feeder-libre, et par la suite propagée de façon limitée pour permettre spécifiquement immunocytochimie rentable pour confirmer le maintien de la pluripotence. La figure 1 montre une représentation schématique de ce protocole. La figure 2A montre des colonies poussant sur hiPSC iMEFs dans des plaques 6 puits. Ces colonies présentent une morphologie typique avec des frontières définies et la phase dense des centres lumineux. Comme le montre la figure 2B, les conditions après le transfert de CSPi à chargeur-libres dans des plaques à 12 puits, la morphologie des colonies apparaît quelque peu chaotique avec des bords moins distincts. En outre, certains iMEFs peuvent rester dans la culture à ce stade. La figure 2C montre que , après un passage supplémentaire dans le système sans feeder, les colonies iPSC présentent une morphologie monocouche classique avec un haut noyau pour cyrapport toplasm. A ce stade, on voit que iMEFs ont été pratiquement éliminés de la culture.
Colonies de croissance dans des conditions sans nourricières sont mécaniquement prélevées et étalées sur des petits puits multiples diapositives de chambre ou des lamelles de verre, et sondés pour des antigènes spécifiques de pluripotence par immunocytochimie. La figure 3 montre les colonies qui sont représentatives immunopositif pour SSEA4 ou de Tra-1-60 (3B, 3F, les antigènes de surface de pluripotence) et Oct-4 et Sox2 (3a, 3e, les antigènes de pluripotence intracellulaire).
Figure 1: Représentation schématique du protocole. schéma global de la méthode décrite utilisée pour la transition CSPi humaines de mangeoires Imef à Feeder sans culture et à la suite de sondage des cellules avec des marqueurs de pluripotence. Imef: IRRADIA ted souris embryonnaires fibroblaste; iPSC: Induced cellules souches pluripotentes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Images représentatives des colonies iPSC transition de Imef Feeders à Feeder sans conditions de culture. A) colonie Dense iPSC (flèche blanche) cultivés sur des cellules nourricières Imef (flèche noire). B) Après le passage initial sur une plaque de 12 puits matrice revêtue dans un milieu sans sérum, quelques iMEFs peuvent encore être observées dans la culture (flèche noire). C) La morphologie caractéristique d'une monocouche iPSC colonie cultivée sans alimentation. Aucun iMEFs restent dans la culture à ce stade. Barre d'échelle (AC) = 100 um.> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. immunocytochimique Caractérisation des CSPi humaines Plaqué dans les petits puits Plaques. Des images représentatives d'immunofluorescence de CSPi, obtenus au moyen d' un microscope confocal, montrant l'expression positive de marqueurs de pluripotence A) Oct-4 (rouge) et B) SSEA4 (vert) avec C) le DAPI de colorant nucléaire (bleu), et E) Sox2 ( rouge) et F) Tra-1-60 (vert) avec G) DAPI (bleu). D et H montrent les images de recouvrement relatives à l' AC et EG. Barre d'échelle (AH) = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| hiPSC médias pour la maintenance sur Feeders | ||
| Composant | Stock Concentration | La concentration finale |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Knockout Sérum remplacement | 100% | 20% |
| L-Glutamine | 200 mM | 1 mM |
| MEM-NEAA | 10 mM, | 0,1 mM |
| 2-mercaptoéthanol | 55 mM | 0,1 mM |
| Recombinant FGF-Basic Human | 10 pg / ml | 10 ng / ml |
| Inhibiteur ROCK Y-27632 | 10 pm | |
| revêtement Matrigel pour les cultures nourricières-Free | ||
| Composant | ||
| Matrice Matrigel CSEh qualifié | Facteur de dilution 269 pi | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 ml | |
| Remarque: Facteur de dilution est beaucoup dépendant et doit être établie à partir certificat d'analyse | ||
| mTeSR1 milieu complet pour les cultures nourricières-Free | ||
| Composant | Montant | |
| mTeSR1 Basal Medium | 400 ml | |
| Supplément mTeSR1 5x | 100 ml | |
| Note: Une fois mélangé, mTeSR1 médias complets peuvent être congelés en aliquotes et utilisés jusqu'à ce que le composant date d'expiration | ||
| Note: mTeSR1 médias complets doivent être réchauffés à la température ambiante seulement. Ne pas placer dans un bain d'eau | ||
Tableau 1: iPSC Culture médias Recettes et revêtements en plaques.
| 4% paraformaldéhyde fixateur | |
| Composant | Montant |
| 0,1 M PO 4 Buffer | 2 L |
| Paraformaldéhyde, prill | 80 g |
| ICC Solution de blocage sans Triton-X-100 | |
| Composant | Montant |
| 1x Phosphate Buffered Saline | 49 mL |
| Normal Goat Serum | 1 ml |
| Albumine de sérum bovin | 0,5 g |
| ICC solution de blocage avec du Triton-X-100 | |
| Composant | Montant |
| 1x Phosphate Buffered Saline | 49 mL |
| Normal Goat Serum | 1 ml |
| Albumine de sérum bovin | 0,5 g |
| Triton-X-100 | 200 ul |
Tableau 2: fixatif et immunocytochimie Recettes.
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Discussion
Le protocole systématique présenté ici offre un gain de temps et la méthode rentable, sous la forme d'une technique de culture à échelle réduite, spécifiquement conçu pour soutenir une analyse efficace de la pluripotence via immunocytochimie.
Les principaux avantages de la méthode décrite sont les suivantes. Traditionnellement plus de 3 à 4 passages sont nécessaires pour la transition CSPi de couches nourricières de feeder-libres conditions de culture afin d'éliminer les iMEFs résiduels restant après l'utilisation de techniques de dissociation en vrac et pour la morphologie monocouche typique à apparaître 12, 13. En revanche, la méthode présentée ici implique un échéancier raccourci, ce qui permet le transfert relativement rapide de CSPi à des conditions sans sérum par la cueillette manuelle des colonies iPSC. Les CSPi sont cultivées en quantités limitées dans les petites diapositives de chambre ou des lamelles propices à immunocytochimie. En fait, le volumoi de milieu de culture nécessaire par puits est juste 0,5 ml et le volume de solution d'anticorps diluée nécessaire pour une seule lamelle est aussi nominale que 40 pi ou 300 pi par chambre et, lors de l'utilisation de ce protocole.
Nous constatons que l'ajout de parties égales Imef milieux conditionnés à l'mTeSR1 lors du passage initial (étape 2.5) est une étape importante qui aide à la survie et le maintien de la morphologie pluripotentes du iPSC. En outre, si l'adhérence des cellules ne sont pas optimales après repiquage (étapes 2.2, 3.3 et 4.3), le dépannage peut être effectuée en optimisant davantage les temps de dissociation utilisés.
Enfin, une limitation de la méthode présentée à petite échelle, par rapport à d'autres techniques telles que la cytométrie de flux également utilisé pour vérifier la pluripotence, est qu'il ne permet pas la poursuite de la propagation des cellules analysées pour des applications en aval. L'utilité de notre méthode découle de sa conception spécifique qui prend en charge les cost-efficacité et de la culture efficace des hiPSCs pour confirmer la pluripotence par immunocytochimie de routine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
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