Introduction
La reprogramación de células somáticas adultas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ofrece una manera de obtener un suministro potencialmente ilimitado de células específicos para cada paciente para estudiar la enfermedad 1, 2. Recapitulando un fenotipo de la enfermedad in vitro sería plausible para examinar los mecanismos celulares y moleculares asociados con la enfermedad, y mejorar el descubrimiento de fármacos y la medicina 3 personalizado. Además, iPSCs humanos (hiPSCs) ofrecen la posibilidad de derivar los tipos de células específicas que se pueden usar como un recurso único para reemplazar las células muertas o disfuncionales y restaurar la función en el contexto de varios trastornos 4, 5.
Un requisito previo importante para el uso de células iPS en las aplicaciones anteriores es asegurarse de que su pluripotentes e indiferenciada estado se mantiene durante la expansión de la cultura. Típicamente, techniqUES tales como citometría de flujo, transferencia Western, reacción en cadena de la polimerasa y ensayos funcionales, que requieren grandes cantidades de células y equipo especializado, se utilizan para el análisis detallado de IPSC pluripotencia 6, 7, 8, 9, 10. Sin embargo, la evaluación de rutina del estado indiferenciado de las células iPS 'efectivamente podría lograrse a través de la propagación limitada de estas células específicamente para inmunocitoquímica (CPI), lo que implica una reducción del tiempo y los recursos.
Los avances recientes permiten el crecimiento de iPSCs en condiciones libres de suero definidos, que es una mejora significativa sobre los sistemas de cultivo convencionales que requieren capas alimentadoras de fibroblastos murinos y medio de suero que contiene. Sin embargo, la literatura actual no incluye protocolos claros que describen paso a paso cómo hacer la transición a partir de células iPS alimentadorcapa a sistemas libres de alimentador.
En este contexto, el presente protocolo detalla sistemáticamente cómo hiPSCs cultivados en ratón irradiado de fibroblastos embrionarios (IMEF) capas de alimentación pueden ser (1) adaptado para propagar en un medio libre de suero, y (2) se cultivaron en una pequeña escala para apoyar específicamente robusta inmuno análisis. En general, esta metodología representa un procedimiento oportuno y rentable para la propagación de iPSCs humanos en condiciones libres de suero para la confirmación de su pluripotencia de forma rutinaria usando inmunocitoquímica.
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Protocol
hiPSCs se obtuvieron a partir de fibroblastos dérmicos humanos aislados de 4 mm biopsias por punción de la piel y reprogramadas en casa a través de Sendai reprogramación 11 mediada por virus. La Universidad de Junta de Revisión Institucional de Arizona aprobó todos los procedimientos para la contratación de materia y toma de biopsias.
1. Preparación de la matriz extracelular superficie recubierta de IPSC Cultura
- Un día antes de la confluencia de los cultivos que crecen en hiPSC iMEFs, preparar la matriz extracelular (Matrigel) placas recubiertas.
- descongelación lenta una parte alícuota de la matriz extracelular (lote dependiente, siga las instrucciones en la hoja de especificaciones) en el hielo en 4 ° C durante 2 h.
- En una campana de bioseguridad, usando puntas de pipeta en frío (almacenado a -20 ° C), añadir 1 parte alícuota de la matriz extracelular de Eagle Modificado Medium / Nutrient Mixture de Dulbecco frío F-12 (DMEM / F12 / HEPES) de acuerdo con el factor de dilución específica del lote .
- Prescindir de 600 ~81; L de la matriz extracelular por pocillo de cada nuevo cultivo celular tratado placa de 12 pocillos necesario.
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante varias horas. Aquí, utilizar un tiempo de incubación de 3 h.
NOTA: Las placas se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de dos semanas.
2. Transferencia de hiPSCs Cultivado en células alimentadoras IMEF en la matriz extracelular para la Propagación
- En el día de pases, retire la placa recubierta matriz a partir de 4 ° C y dejar que la placa se adapte a la temperatura ambiente durante 1 h en la campana de cultivo de tejidos.
- Aspirar el medio de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos de la cultura hiPSC creciente en iMEFs y reemplazar con 500 l de reactivo de colagenasa de disociación (1 mg / mL en medio de cultivo basal).
- Incubar a 37 ° C durante ~ 10 a 30 min hasta que los bordes de las colonias IPSC parecen levantar ligeramente.
NOTA: El tiempo de incubación es dependiente de la línea y pueden variar. Monitor de disociación bajo un microscopio. - Cocheefully aspirar el reactivo de disociación y lavar suavemente 2 veces con tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4).
- Añadir 1 ml de la temperatura ambiente mTeSR1 medio completo con 10 ng / ml Rho asociada a inhibidor de la proteína quinasa (Y-27632 inhibidor de ROCK) al pozo.
NOTA: El uso de una mezcla 50:50 de medio acondicionado IMEF y mTeSR1 durante este paso inicial se sugiere y puede ser beneficioso para la supervivencia de las hiPSCs durante esta transición medios de comunicación. - Mediante un pequeño microscopio de contraste de fase colocado parcialmente dentro de la campana, la puntuación de forma manual y recoger 1 - 2 colonias hiPSC (~ 700 - 1.000 m de diámetro) usando una jeringa y la aguja (25 g, 1 ½ pulgadas). Empujar los pedazos obtenidos de la colonia en el medio con una punta de pipeta P200.
- Aspirar y disponer de la matriz de la nueva placa, teniendo cuidado de no perturbar el recubrimiento.
- Transferir 1 ml de la suspensión de células de la vieja que contiene bien los iPSCs anotados en la nueva matriz recubierta también.
- Place la placa en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. Rock de la placa en varios, de ida y vuelta rápida, y de lado a lado los movimientos para repartir uniformemente las células. No moleste a la placa durante 24 h.
- Realizar cambios diarios medios completos con mTeSR1 medio completo (adición de Y-27632 ROCA inhibidor no es necesario después del cultivo inicial en el paso 2.5).
3. pases de pequeña escala de hiPSCs en placas recubiertas de Matrix
NOTA: Por lo general, después de la transferencia inicial de las hiPSCs a la matriz placas recubiertas, las células se debe pasó una vez más de una manera similar para asegurar que todos iMEFs se han eliminado y las células se han adaptado al alimentador libres condiciones.
- Un día antes de la confluencia de IPSC preparar planchas de matriz recién recubiertas como se discutió en la sección 1.
- En el día de paso, quitar la placa recubierta con matriz a partir de 4 ° C de incubación y dejar que la placa se adapte a la temperatura ambiente durante 1 h en la calle sin tejidocampana tura.
- Aspirar el medio desde el 1 pocillo de una placa de 6 pocillos de hiPSCs (originalmente de la transición de alimentación a la matriz) y reemplazar con 500 l de tampón de disociación celular.
NOTA: El tampón de disociación celular comercial utilizado aquí (ver Materiales Tabla) es más adecuado para su uso con medio mTeSR1 en comparación con la colagenasa. - Incubar a temperatura ambiente durante 3-7 min hasta que los bordes de las colonias IPSC parecen levantar ligeramente. Como se mencionó antes, el tiempo de incubación es de línea dependiente y variable. Por lo tanto, monitorear la disociación celular bajo un microscopio para determinar el momento óptimo.
- Con cuidado aspirar el tampón de disociación y lavar suavemente 2 veces con PBS.
- Añadir 500 l de temperatura ambiente mTeSR1 medio completo con 10 ng / ml de Y-27632 inhibidor de la roca para el pozo.
- En lugar de colonias de puntuación como en el paso 2.6, empuje el número deseado de colonias en los medios de comunicación usando una punta de P200 y se tritura suavemente la suspensión de células 2 veces against una esquina del pozo para romper las colonias hiPSC en grupos de ~ 50-200 micras de tamaño. Por ejemplo, para una placa de 12 pocillos, recoger 1 - 2 colonias de transferir a cada nuevo pozo 1. Transferir la suspensión celular desde el antiguo pozo en una sola nueva pocillo de una placa de 12 pocillos.
- Rock de la placa en varios de ida y vuelta rápida, y los movimientos de lado a lado para uniformemente repartidas a cabo las células, y dejar que la placa de apoyo durante 24 h en un 37 ° C, 5% de CO2.
- Realizar cambios diarios medios completos con mTeSR1 medio completo. Como se mencionó antes, no es necesario añadir Y-27632 ROCA inhibidor después de la placa inicial.
NOTA: no utilizados colonias IPSC desde el paso 3.7 pueden ser fácilmente criopreservados en este punto.
4. Preparación de la Cámara portaobjetos y cubreobjetos para la siembra de hiPSCs para inmunocitoquímica
NOTA: El siguiente protocolo utiliza 4-así la cámara de diapositivas de plástico y 12 mm cubreobjetos de vidrio con appropriatlos volúmenes de correos de los medios de comunicación en los múltiples pozos para apoyar inmunocitoquímica rentable. Sin embargo, los volúmenes de los medios de comunicación se puede aumentar si se desea el uso de pocillos y cubreobjetos más grandes tamaños.
- Un día antes de la confluencia hiPSC, preparar la cámara de diapositivas recién recubiertas con matriz extracelular como se discutió en la sección 1. Añadir solución de matriz suficiente (~ 300 - 500 l por pocillo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillos) para cubrir totalmente cada pocillo sin ninguna preocupación de evaporación. Por otra parte, después de colocar 1 cubreobjetos limpio y esterilizado en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, capa con 500 l de matriz extracelular y asegúrese de que el cubreobjetos no está flotando en la parte superior de la solución.
- En el día de paso, eliminar los portaobjetos de cámara / cubreobjetos recubiertos de 4 ° C y permitir la aclimatación a temperatura ambiente durante 1 h en la campana de cultivo de tejidos.
- Aspirar el medio desde el 1 pocillo de una placa de 12 pocillos de hiPSCs y reemplazar con 500 l de tampón de disociación.
- Se incuba a tempe habitaciónrature para ~ 3-7 min hasta que los bordes de las colonias IPSC aparece para levantar ligeramente.
- Con cuidado aspirar el tampón de disociación y añadir 1 ml de la temperatura ambiente mTeSR1 medio completo con 10 ng / mL Y-27632 ROCA inhibidor para el pozo.
- El uso de un microscopio de contraste de pequeña fase colocado dentro de la campana de cultivo de tejidos, recoger manualmente 1 colonia / nuevo pozo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillos o 1 nuevo cubreobjetos a ser plateado (~ 1.000 - 1.500 m de diámetro) usando una punta P200 pipeta empujando fuera de la superficie de la placa en el medio.
- Aspirar la matriz de la nueva cámara de diapositivas / cubreobjetos, teniendo cuidado de no perturbar el recubrimiento.
- tritura suavemente la suspensión de células 2 veces contra una esquina de la bien romper las colonias hiPSC en grupos de ~ 50-200 micras de tamaño. Transferir 250 l de la suspensión de células de la vieja bien en cada nuevo pocillo de una 4-bien cámara de diapositiva / cubreobjetos.
- Llevar el volumen de cada nuevo pozo hasta 500 l con mTeSR1 containing 10 ng / mL Y-27632 ROCA inhibidor.
- Coloque la cámara de diapositivas / cubreobjetos en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Después de 24 h, realice los cambios diarios de los medios completos con mTeSR1 medio completo. De nuevo, como se ha mencionado anteriormente, la adición de Y-27632 ROCA inhibidor no es necesario después de la placa inicial.
5. Preparación de células iPS para inmunocitoquímica
- Una vez confluentes, preservar las colonias hiPSC a través de la fijación mediante la eliminación de los medios de los pocillos y añadiendo pre-calentado% paraformaldehído al 4 PRECAUCIÓN (~ 300 l / pocillo de una 4-así diapositivas cámara / cubreobjetos). Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
- Desechar el paraformaldehído debidamente en función de riesgo biológico institucional y directrices de seguridad química.
- Se lavan las células 3 veces durante 5 minutos cada uno en un agitador de sobremesa con PBS.
Nota: Las celdas en la cámara de diapositivas / cubreobjetos se pueden almacenar con un amplio PBS a 4 ° C indefinidamente en esta etapa.Alternativamente, pueden utilizarse inmediatamente para la ICC.
6. La inmunotinción de hiPSCs con marcadores de pluripotencia
NOTA: hiPSCs inmunotinción con anticuerpos pluripotencia estándar. A modo de ejemplo, aquí las células son de doble teñido con anticuerpos dirigidos a una superficie 1 y 1 antígeno intracelular en una manera secuencial como sigue: Anti-Etapa-Specific Embryonic antígeno-4 (SSEA4) con la proteína 4 (OCT-anti-Octamer vinculante 4) y anti-Tra-1-60 con anti-SRY inhibidor de la HMG CAJA gen 2 (Sox2) (por favor, véase la Tabla de Materiales para obtener detalles de anticuerpos).
- Aspirar el PBS de los pocillos y añadir 500 l de solución / pocillo de bloqueo sin Triton-X-100. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Preparar una concentración pre-determinado (aquí, usar 1: 200) de los anticuerpos de superficie, ya sea SSEA4 o Tra-1-60, diluyendo en solución de bloqueo sin Triton X-100.
- Para la cámara de diapositivas, preparar 300 l / pocillo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillosmediante la mezcla de 298,5 l de bloqueo solución anterior y 1,5 l de anti-SSEA4 o Tra-1-60 anticuerpo primario.
- Para cubreobjetos, preparar 40 l / cubreobjetos mediante la mezcla de 199 l de bloqueo de la solución y 1 l de anti-SSEA4 o Tra-1-60 anticuerpo primario.
- Aspirar la solución de bloqueo de la corredera de cámara y dispensar el anticuerpo primario en los pozos apropiados. Para cubreobjetos, colocar un trozo de Parafilm firmemente dentro de una caja de Petri y dispensar 40 l de anticuerpo primario en la parte superior como una gotita. Usando una jeringa con aguja doblada y fórceps, levante con cuidado el cubreobjetos de la cultura bien y colocarlo células hacia abajo sobre la gota de anticuerpos en la parafina. Incubar toda la noche a 4 ° C.
- A la mañana siguiente, se lavan las células 3 veces, 5 a 10 min cada uno, mediante la eliminación del anticuerpo de la diapositiva cámara y la adición de PBS. Para cubreobjetos, levantar cada uno de la parafina y colocarlo de nuevo en un pocillo de una placa de 24 pocillos, lado celda hacia arriba. Añadir cuidadosamente PBS.
- Preparar anticuerpos secundarios apropiados en 1: 500 en la solución de bloqueo.
- Para la cámara de diapositivas, preparar 300 l / pocillo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillos mezclando 499 l de solución de bloqueo y 1 l de cabra anti-ratón IgG3 Alexa Fluor 488 (por SSEA4) o 1 l de anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón Alexa Fluor 488 (por Tra-1-60).
- Para cubreobjetos, preparar 40 l / cubreobjetos mediante la mezcla de 499 l de bloqueo de la solución y 1 l de cabra anti-ratón IgG3 Alexa Fluor 488 (por SSEA4) o 1 l de anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón Alexa Fluor 488 (por Tra-1-60 ).
- Aspirar el PBS de la cámara de diapositivas y dispensar el anticuerpo secundario en los pozos apropiados. Para cubreobjetos, siguiendo el Paso 6.2, invertir los cubreobjetos sobre la solución de anticuerpo colocado en Parafilm a temperatura ambiente durante 2 h.
NOTA: Si se utiliza fluorescente marcado con anticuerpos secundarios, las células deben estar protegidos de la luz. Colocar los portaobjetos de cámara y los cubreobjetos en un env oscuraironment durante las incubaciones y lavados. - Lavar las células 3 veces durante 5 a 10 minutos cada uno mediante la eliminación del anticuerpo de la diapositiva cámara y la adición de PBS. Para cubreobjetos, levantar cada uno con cuidado desde el parafilm y se coloque de nuevo en un pocillo de una placa de 24 pocillos, lado celda hacia arriba. añadir con cuidado PBS durante el lavado.
- Antes de sondeo para el segundo antígeno, intracelular OCT-4 o SOX2 en este caso, se incuba de nuevo en solución de bloqueo hecho con el reactivo de permeabilización (Triton-X-100) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Para inmunotinción para OCT-4 o Sox2, basta con seguir la metodología descrita en los pasos 6.1-6.6 para la aplicación de los anticuerpos primarios y secundarios. Para los fines de este protocolo, usar OCT-4 y Sox2 a una concentración de 1: 200 y el secundario anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo Alexa Fluor 594 a 1: 500.
- Después de los tratamientos con anticuerpos primarios y secundarios mencionados anteriormente, se lavan las células 3 veces durante 5 a 10 minutos cada uno con PBS y contratinción con 4 ', 6'-diamino-2-phenylindole, dihidrocloruro (DAPI) siguiendo protocolos estándar si se desea la visualización nuclear.
7. Preparación para la visión
- Para portaobjetos de cámara, retire con cuidado la cámara superior de la diapositiva, siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, enjuague en agua destilada, y añadir medio y un cubreobjetos de montaje para permitir la microscopía.
- Para cubreobjetos, invertir los cubreobjetos a una gota de medio de montaje se coloca en un portaobjetos de microscopio de vidrio.
- Imagen bajo un microscopio de fluorescencia estándar o confocal.
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Representative Results
Este protocolo proporciona una descripción paso a paso de cómo iPSCs humano puede ser transferido de capa de alimentación al alimentador de libre condiciones, y posteriormente se propagó de manera limitada específicamente habilitar inmunocitoquímica rentable para confirmar el mantenimiento pluripotencia. La figura 1 muestra una representación esquemática de este protocolo. La figura 2A muestra colonias que crecen en hiPSC iMEFs en placas de 6 pocillos. Estas colonias exhiben morfología típica con bordes definidos y brillantes centros de fase densa. Como se muestra en la Figura 2B, las condiciones después de la transferencia de células iPS en Alimentador-libres en placas de 12 pocillos, morfología de la colonia parece un poco caótico, con bordes menos definidos. Además, algunos iMEFs pueden permanecer en la cultura en esta etapa. La Figura 2C muestra que después de un paso adicional en el sistema libre de alimentador, colonias IPSC muestran una morfología monocapa clásico con un núcleo de alta a cytoplasm relación. En esta etapa, se ve que iMEFs han sido prácticamente eliminada de la cultura.
Las colonias que crecen en condiciones libres de alimentador se recogen mecánicamente y se sembraron en pequeños pocillos múltiples portaobjetos de cámara o portaobjetos de vidrio, y se sondearon para antígenos específicos a través de pluripotencia inmunocitoquímica. La Figura 3 muestra colonias representativas que son immunopositive para SSEA4 o Tra-1-60 (3B, 3F, los antígenos de superficie de pluripotencia) Octubre-4 y Sox2 o (3 A, 3E, antígenos intracelulares de pluripotencia).
Figura 1: Representación esquemática del protocolo. esquema general del método descrito se utiliza para hacer la transición de células iPS humanas alimentadores IMEF a los enlaces de la cultura libre y la posterior sondeo de las células con marcadores de pluripotencia. IMEF: Irradia Ted fibroblastos de embriones de ratón; IPSC: célula madre pluripotente inducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes representativas de las colonias IPSC la transición de IMEF Alimentadores en Alimentador de libre condiciones de cultivo. A) Densa colonia IPSC (flecha blanca) cultivados en células alimentadoras IMEF (flecha negro). B) Tras el paso inicial a una placa de 12 pocillos recubiertas con matriz en un medio libre de suero, unos iMEFs todavía pueden ser observados en la cultura (flecha negro). C) la morfología típica de una monocapa de IPSC colonia crecida sin alimentador. No hay iMEFs se mantienen en cultivo en esta etapa. Barra de escala (AC) = 100 m.> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Caracterización inmunocitoquímica de células iPS humano en placas de pequeño pozo. Imágenes representativas de inmunofluorescencia de células iPS, obtenidos a través de un microscopio confocal, que muestran la expresión positiva de los marcadores de pluripotencia A) Oct-4 (rojo) y B) SSEA4 (verde) con C) la tinción DAPI nuclear (azul), y E) Sox2 ( rojo) y F) Tra-1-60 (verde) con G) DAPI (azul). D y H muestran las imágenes superpuestas relativas a AC y EG. La barra de escala (AH) = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| hiPSC medios para el mantenimiento de alimentadores | ||
| Componente | de la Concentración | concentración final |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Knockout reemplazo Suero | 100% | 20% |
| L-Glutamina | 200 mM | 1 mM |
| MEM-AANE | 10 mM | 0.1 mM |
| 2-mercaptoetanol | 55 mM | 0.1 mM |
| Recombinante FGF-humanas básicas | 10 mg / ml | 10 ng / mL |
| Y-27632 Inhibidor ROCA | 10 micras | |
| recubrimiento de Matrigel por las culturas-Feeder gratuito | ||
| Componente | ||
| Matriz de Matrigel células madre cualificado | Factor de dilución 269 l | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 ml | |
| Nota: Factor de dilución es mucho dependiente y debe determinarse a partir de certificado de análisis | ||
| mTeSR1 medio completo para cultivos-Feeder gratuito | ||
| Componente | Cantidad | |
| mTeSR1 Basal Medium | 400 ml | |
| Suplemento mTeSR1 5x | 100 ml | |
| Nota: Una vez mezclado, mTeSR1 medios completos se pueden congelar en alícuotas y se utilizan hasta la fecha de caducidad componente | ||
| Nota: mTeSR1 medios completos deben calentarse a temperatura ambiente solamente. No coloque en el baño de agua | ||
Tabla 1: IPSC Medios de Cultivo Recetas y recubrimientos de placas.
| 4% paraformaldehído fijador | |
| Componente | Cantidad |
| 0,1 M PO 4 Buffer | 2 L |
| Paraformaldehído, pepita | 80 g |
| ICC solución de bloqueo sin Triton-X-100 | |
| Componente | Cantidad |
| 1x Tampón fosfato salino | 49 ml |
| Normal suero de cabra | 1 ml |
| Albúmina de suero bovino | 0,5 g |
| ICC solución de bloqueo con Triton-X-100 | |
| Componente | Cantidad |
| 1x Tampón fosfato salino | 49 ml |
| Normal suero de cabra | 1 ml |
| Albúmina de suero bovino | 0,5 g |
| Triton-X-100 | 200 l |
Tabla 2: Fijador e inmunocitoquímica Recetas.
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Discussion
El protocolo sistemático que aquí se presenta ofrece un ahorro de tiempo y un método rentable, en forma de una técnica de cultivo a escala reducida, diseñado específicamente para apoyar el análisis de pluripotencia efectiva mediante inmunocitoquímica.
Las principales ventajas de la metodología descrita son los siguientes. Tradicionalmente se necesitan más de 3 a 4 pasos a la transición iPSCs de capas de alimentación al alimentador libres de condiciones de cultivo con el fin de eliminar iMEFs residuales que quedan después de la utilización de técnicas de disociación a granel y para la morfología típica monocapa a aparecer 12, 13. En contraste, el método que aquí se presenta implica una línea de tiempo acortado, que permite la transferencia relativamente rápida de iPSCs a condiciones libres de suero a través de la recolección manual de las colonias IPSC. Las células iPS se cultivan en pequeñas cantidades limitadas en la cámara de diapositivas o cubreobjetos propicias para inmunocitoquímica. De hecho, el volume de medio de cultivo por pocillo necesaria es sólo 0,5 ml y el volumen de solución diluida de anticuerpo requerida para una sola cubreobjetos es tan nominal como 40 l o 300 l por cámara bien, al utilizar este protocolo.
Nos encontramos con que la adición de partes iguales IMEF medios condicionados a la mTeSR1 durante el paso inicial (paso 2.5) es un paso importante que contribuye a la supervivencia y el mantenimiento de la morfología pluripotentes de la IPSC. Además, si la adhesión celular no es óptima después de pases (pasos 2.2, 3.3 y 4.3), la solución de problemas se puede realizar mediante la optimización de los tiempos más de disociación utilizados.
Por último, una limitación del método de pequeña escala presentada, si se compara con otras técnicas tales como la citometría de flujo también se utiliza para verificar la pluripotencia, es que no permite la propagación continua de células analizadas para aplicaciones posteriores. La utilidad de la aplicación de este método se debe a su diseño específico que soporta el cost-efectiva y eficiente la cultura de los hiPSCs para confirmar la pluripotencia a través de inmunocitoquímica rutina.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
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