Introduction
Reprogrammierung adulter menschlicher Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS - Zellen) bietet eine Möglichkeit , eine potenziell unbegrenzte Versorgung von Patienten-spezifischen Zellen zu erhalten , zu studieren Krankheit 1, 2. Eine Krankheits - Phänotyp in vitro zusammenfassend würde es 3 mit der Krankheit assoziiert zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen und Wirkstoffforschung verbessern und personalisierte Medizin plausibel machen. Darüber hinaus bieten die menschliche iPS - Zellen (hiPSCs) die Möglichkeit , bestimmte Zelltypen ableiten , die als einzigartige Ressource verwendet werden kann , tot oder dysfunktionalen Zellen und Restore - Funktion im Rahmen von mehreren Störungen 4, 5 zu ersetzen.
Eine wichtige Voraussetzung iPSCs in den oben genannten Anwendungen verwendet wird, um sicherzustellen, dass ihre pluripotenten und undifferenzierten Zustand während der Expansion in Kultur gehalten wird. Typischerweise techniques wie Durchflußzytometrie, Western Blotting, Polymerasekettenreaktion und funktionellen Assays, die große Mengen an Zellen und Spezialausrüstung erforderlich ist , werden für die detaillierte Analyse der iPSC Pluripotenz 6, 7, 8, 9, 10 verwendet wird . Allerdings Routine Beurteilung der undifferenzierten Zustand "iPS-Zellen könnte wirksam durch die begrenzte Vermehrung dieser Zellen speziell für Immunzytochemie (ICC) erreicht werden, somit reduziert Zeit und Ressourcen beteiligt sind.
Jüngste Fortschritte ermöglichen das Wachstum von iPSCs in definiertem serumfreien Bedingungen, was eine erhebliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Kultursystemen, die murine Fibroblasten-Feeder-Schichten und serumhaltigen Medien erfordern. Allerdings ist die aktuelle Literatur nicht klar schrittweise Protokolle umfassen, die beschreiben, wie iPSCs von der Zufuhr für den ÜbergangSchicht Feeder freie Systeme.
In diesem Zusammenhang detailliert die vorliegende Protokoll systematisch wie hiPSCs auf bestrahlte embryonalen Maus-Fibroblasten (Imef) Schichten sein Feeder gewachsen können (1), der in Serum-freiem Medium zu verbreiten, und (2) kultiviert auf einem kleinen speziell robust zu unterstützen immunzytochemische Analyse. Insgesamt stellt diese Methode eine zeit- und kostengünstiges Verfahren für den menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen ausbreitende für ihre Pluripotenz auf einer Routinebasis bestätigt Immunzytochemie verwendet wird.
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Protocol
hiPSCs wurden aus humanen dermalen Fibroblasten isoliert von 4 mm Haut Stanzbiopsien und umprogrammiert im Haus über das Sendai - Virus-vermittelte Umprogrammierung 11 abgeleitet. Die University of Arizona Institutional Review Board genehmigt alle Verfahren für die Unterlagen zur Rekrutierung und Biopsie-Sammlung.
1. Herstellung von extrazellulärer Matrix beschichteten Oberfläche für iPSC Kultur
- Einen Tag vor der Einmündung der hiPSC Kulturen auf iMEFs wächst, bereiten extrazellulären Matrix (Matrigel) beschichteten Platten.
- Langsam Tauwetter ein Aliquot der extrazellulären Matrix (Menge abhängig, folgen Sie den Anweisungen auf dem Datenblatt) auf Eis in 4 ° C für 2 h.
- In einer Biosicherheit Kapuze, mit kaltem Pipettenspitzen (bei -20 ° C gelagert), 1 hinzufügen aliquote Menge von extrazellulären Matrix zu kalt Dulbecco modifiziertem Eagle Medium / Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F12 / HEPES) nach dem chargenspezifischen Verdünnungsfaktor .
- Dispense ~ 60081; L der extrazellulären Matrix pro Vertiefung jeder neuen Zellkultur behandelt 12-Well-Platte benötigt.
- Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für mehrere Stunden. Hier verwenden eine 3 Stunden Inkubationszeit.
HINWEIS: Die Platten können sofort oder bis zu zwei Wochen bei 4 ° C gelagert werden.
2. Transfer von hiPSCs Grown auf Imef Feeder-Zellen auf extrazellulären Matrix für die Vermehrung
- Am Tag der Passagierung, entfernen Sie die Matrix-beschichtete Platte von 4 ° C und lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur für 1 h in der Gewebekultur Haube zu akklimatisieren.
- Saugen Sie das Medium von 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte von hiPSC Kultur auf iMEFs wachsen und ersetzen mit 500 & mgr; l Kollagenase Dissoziation Reagenz (1 mg / ml in basalen Kulturmedium).
- bei 37 ° C bebrütet ~ 10 bis 30 min, bis die Ränder der iPSC Kolonien leicht zu heben erscheinen.
Hinweis: Die Inkubationszeit ist Linie abhängig und variiert. Monitor-Dissoziation unter dem Mikroskop. - Autoaspirieren efully die Dissoziation Reagenz und danach vorsichtig waschen 2 mal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4).
- 1 ml Raumtemperatur mTeSR1 Komplettmedium mit 10 ng / ml Rho-assoziiertes Protein-Kinase-Inhibitor (Y-27632 ROCK-Inhibitor) auf den Brunnen.
HINWEIS: Unter Verwendung einer 50:50 Mischung aus Imef-konditioniertes Medium und mTeSR1 während dieses anfänglichen Durchgang wird vorgeschlagen und kann für das Überleben der hiPSCs während dieser Medienübergang von Vorteil sein. - Mit einem kleinen Phasenkontrastmikroskop teilweise im Inneren der Haube platziert, manuell Partitur und Pick 1-2 hiPSC Kolonien (~ 700 - 1000 um im Durchmesser) mit einer Spritze und Nadel (25 G, 1 ½ in). Schieben Sie die Stücke erzielte der Kolonie in das Medium mit einer P200 Pipettenspitze ab.
- Absaugen und entsorgen Sie die Matrix von der neuen Platte, wobei darauf geachtet, die Beschichtung nicht zu stören.
- 1 ml der Zellsuspension aus der alten Brunnen, die erzielte iPSCs in die neue Matrix beschichtete Vertiefung enthält.
- PlaCE , um die Platte in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. Rock the Platte in mehreren schnell, zurück und nach vorne und von Seite zu Seite Bewegungen gleichmäßig die Zellen verteilt. Sie nicht die Platte für 24 h stören.
- Führen Sie täglich vollständige Medienwechsel mit mTeSR1 Vollmedium (Zugabe von Y-27632 ROCK-Inhibitor wird nicht nach dem anfänglichen Plattierung in Schritt erforderlich 2.5).
3. Kleines Passagierung von hiPSCs auf Matrix beschichteten Platten
HINWEIS: In der Regel nach der anfänglichen Übertragung der hiPSCs beschichteten Platten zu Matrix sollten die Zellen erneut in ähnlicher Weise agiert werden alle iMEFs um sicherzustellen, wurden eliminiert, und die Zellen angepasst zufuhrfreien Bedingungen.
- Einen Tag vor der iPSC Konfluenz prepare frisch beschichtete Matrixplatten, wie in Abschnitt 1 diskutiert.
- Am Tag der Passage, entfernen Sie die Matrix-beschichtete Platte von 4 C-Inkubation ° und lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur für 1 h im Gewebe cul akklimatisierenture Kapuze.
- Saugen Sie das Medium von 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte von hiPSCs (ursprünglich vom Anleger bis zur Matrix umgestellt) und ersetzen mit 500 & mgr; l Zelldissoziationspuffer.
HINWEIS: Die kommerzielle Zellenpuffer Dissoziation verwendet hier (siehe Materialien Tabelle) ist besser geeignet für den Einsatz mit mTeSR1 Medium im Vergleich zu Kollagenase. - Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 bis 7 min, bis die Ränder der iPSC Kolonien leicht zu heben erscheinen. Wie bereits erwähnt, ist die Inkubationszeit Linie abhängig und variabel. Daher überwacht die zelluläre Dissoziation unter einem Mikroskop, die optimale Zeit zu bestimmen.
- aspirieren vorsichtig die Dissoziationspuffers und vorsichtig waschen 2-mal mit PBS.
- In 500 ul Raumtemperatur mTeSR1 komplettes Medium mit 10 ng / ml Y-27632 ROCK-Hemmstoff, um den Brunnen.
- Statt der Scoring-Kolonien wie in Schritt 2.6, drücken Sie die gewünschte Anzahl der Kolonien in den Medien eine P200 Spitze mit und sanft die Zellsuspension 2 mal ag verreiben200 & mgr; m in der Größe - ainst einer Ecke des gut die hiPSC Kolonien in Klumpen von ~ 50 zu brechen. Zum Beispiel für eine 12-Well-Platte, Pick 1-2 Kolonien in jeweils 1 neue gut zu übertragen. Übertragen Sie die Zellsuspension aus dem alten Brunnen in einem einzigen neuen Vertiefung einer 12-Well-Platte.
- Rock the Platte in mehreren schnell, zurück und nach vorne und von Seite zu Seite Bewegungen gleichmäßig die Zellen verteilt, und lassen Sie die Platte Rest für 24 h in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator.
- Führen Sie täglich vollständige Medienwechsel mit mTeSR1 komplettes Medium. Wie bereits erwähnt, ist es nicht notwendig Y-27632 ROCK Inhibitor nach dem anfänglichen Plattieren hinzuzufügen.
HINWEIS: Nicht benutzte iPSC Kolonien aus Schritt 3.7 kann an dieser Stelle leicht kryokonserviert werden.
4. Herstellung von Kammer Folien und Deckgläser für Seeding von hiPSCs für Immunzytochemie
HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet 4-Well-Plastikkammer Dias und 12 mm Glasplättchen mit appropriate Volumina von Medien in den Multi-wells kostengünstiger Immuncytochemie zu unterstützen. Jedoch können Medienvolumen erhöht werden, wenn die Verwendung größerer gut und Deck Größen gewünscht wird.
- Einen Tag vor der hiPSC Einmündung bereiten Kammer gleitet frisch mit der extrazellulären Matrix beschichtet ist, wie in Abschnitt 1. Fügen Sie genug Matrix-Lösung (~ 300 bis 500 & mgr; l pro Vertiefung einer 4-Well-Kammer-Folie) zu voll Mantel jeweils gut ohne Sorge Verdunstung. Alternativ nach dem Platzieren 1 gereinigt und sterilisiert Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, Mantel mit 500 & mgr; l der extrazellulären Matrix und stellen Sie sicher, dass das Deckglas nicht oben auf der Lösung schwimmt.
- Am Tag der Passage, entfernen Sie die beschichtete Kammer Dias / Deckgläser von 4 ° C und erlauben Akklimatisierung auf Raumtemperatur für 1 h in der Gewebekultur Kapuze.
- Saugen Sie das Medium von 1 Vertiefung einer 12-Well-Platte von hiPSCs und ersetzen mit 500 & mgr; l Dissoziationspuffers.
- Inkubieren bei Raum temperature für ~ 3 bis 7 min, bis die Ränder der iPSC Kolonien erscheinen leicht zu heben.
- aspirieren vorsichtig den Dissoziationspuffers und 1 mL Raumtemperatur mTeSR1 komplettes Medium mit 10 ng / ml Y-27632 ROCK-Hemmstoff, um den Brunnen.
- einen kleinen Phasenkontrastmikroskop in der Gewebekultur Haube platziert Unter Verwendung manuell 1 Kolonie / neue Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträger oder ein neues Deckglas zu plattierenden Pick (~ 1000 - 1500 & mgr; m im Durchmesser) eine P200 Pipettenspitze mit durch Drücken es die Plattenoberfläche in das Medium ab.
- Absaugen die Matrix aus dem neuen Kammer Schiebe- / Deckglas, darauf achten, daß die Beschichtung zu stören.
- verreiben sanft die Zellsuspension 2 mal gegen eine Ecke des gut die hiPSC Kolonien in Klumpen von ~ 50 zu brechen - 200 & mgr; m groß. Übertragen Sie 250 ul der Zellsuspension aus dem alten Brunnen in jede neue Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträger / Deckglas.
- Bringen Sie die Lautstärke der einzelnen neuen und bis zu 500 & mgr; l mit mTeSR1 containing 10 ng / ml Y-27632 ROCK-Inhibitor.
- Platzieren Sie die Kammer Schiebe- / Deckgläser in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Nach 24 h führen täglich volle Medienwechsel mit mTeSR1 komplettes Medium. Wiederum, wie zuvor erwähnt, ist die Zugabe von Y-27632 ROCK Inhibitor nicht notwendig, nach dem anfänglichen Plattieren.
5. Herstellung von iPS-Zellen für Immunzytochemie
- Sobald konfluent, bewahren die hiPSC Kolonien über Fixierung durch die Medien aus den Vertiefungen Entfernen und Hinzufügen von vorgewärmten VORSICHT 4% Paraformaldehyd (~ 300 & mgr; l / Vertiefung einer 4-Well - Kammerobjektträger / Deckglas). für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entsorgen Sie die Paraformaldehyd in geeigneter Weise entsprechend institutionellen Biohazard und chemischen Sicherheitsrichtlinien.
- Waschen Sie die Zellen 3-mal für jeweils 5 Minuten auf einem Tischschüttler mit PBS.
Hinweis: Zellen auf chamber slides / Deckgläser können auf unbestimmte Zeit in diesem Stadium mit reichlich PBS bei 4 ° C gelagert werden.Alternativ können sie sofort für die ICC verwendet werden.
6. Immunostaining von hiPSCs mit Pluripotenz Marker
HINWEIS: immunostain hiPSCs mit Standard Pluripotenz Antikörpern. Als Beispiel sind hier Zellen doppelt gefärbt mit Antikörpern Targeting eine 1 Oberfläche und 1 intrazelluläres Antigen in einer sequentiellen Weise wie folgt: Anti-stadienspezifische Embryonic Antigen-4 (SSEA4) mit Anti-Octamer-bindendes Protein 4 (oct- 4) und Anti-Tra-1-60 mit anti-SRY Zusammenhang HMG-Box-Gen 2 (SOX2) (Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für die Antikörper-Details).
- Saugen Sie das PBS aus den Vertiefungen und fügen Sie in 500 & mgr; l / Vertiefung Blocking-Lösung ohne Triton-X-100. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie eine vorgegebene Konzentration (hier verwenden 1: 200) der Oberfläche Antikörper, entweder SSEA4 oder Tra-1-60, durch Verdünnung in Blockierungslösung ohne Triton X-100.
- Für Kammer gleitet, bereiten 300 & mgr; l / Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträgerdurch Mischen von 298,5 ul Blocking Solution oben und 1,5 ul anti-SSEA4 oder Tra-1-60 primären Antikörper.
- Für Deck, bereiten 40 & mgr; l / Deckglas durch Mischen von 199 & mgr; l Blockierungslösung und 1 & mgr; l anti-SSEA4 oder Tra-1-60 primären Antikörper.
- Absaugen Die Blockierungslösung aus der Kammer Rutsche und verzichtet den primären Antikörper in die entsprechenden Wells. Für Deck, legen Sie ein Stück Parafilm fest in einer Petrischale und verzichtet werden 40 ul des primären Antikörpers auf der Oberseite als ein Tröpfchen. Mit Hilfe eines gebogenen Spritzennadel und Zange, heben Sie vorsichtig das Deckglas aus der Kultur gut und legen Sie es Zellenseite nach unten auf den Tropfen Antikörper auf dem Parafilm. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
- Am nächsten Morgen, waschen Sie die Zellen 3 mal 5 - 10 min jeweils, durch den Antikörper aus der Kammer Dia Entfernen und Hinzufügen von in PBS. Für Deckgläser, heben sich ein aus dem Parafilm und setzen Sie ihn wieder in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, Zellseite nach oben. Sorgfältig P hinzufügenBS.
- Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörper bei 1: 500 in der Blockierungslösung.
- Für Kammer gleitet, bereiten 300 & mgr; l / Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträger von 499 & mgr; l Blockierlösung und 1 ul Ziege-anti-Maus-IgG3 Alexa Fluor 488 (zum SSEA4) oder 1 & mgr; l Ziegen-anti-Maus-IgM-Alexa Fluor Misch 488 (für Tra-1-60).
- 40 & mgr; l / Deck Für Deck, bereiten durch Mischen von 499 & mgr; l Blockierlösung und 1 ul Ziege-anti-Maus-IgG3 Alexa Fluor 488 (zum SSEA4) oder 1 & mgr; l Ziegen-anti-Maus-IgM-Alexa Fluor 488 (zum Tra-1-60 ).
- Saugen Sie das PBS aus der Kammer Rutsche und verzichtet die sekundären Antikörper in die entsprechenden Wells. Für Deckgläser, folgenden Schritt 6.2, invertieren die Deckgläser auf die Antikörperlösung auf Parafilm bei Raumtemperatur für 2 h gegeben.
HINWEIS: Bei der Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper markiert, müssen die Zellen vor Licht geschützt werden. Legen Sie die Kammer gleitet und die Deckgläser in einem dunklen environment während Inkubationen und Waschungen. - Waschen Sie die Zellen 3-mal 5 - 10 min jeweils durch den Antikörper aus der Kammer slide Entfernen und Hinzufügen von in PBS. Für Deckgläser, heben sich diese sorgfältig aus dem Parafilm und legen Sie zurück in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, Zellseite nach oben. fügen Sie vorsichtig PBS während Wäschen.
- Stand der für das zweite Antigen Sondieren, intrazellulärem Oct-4 oder SOX2 in diesem Fall erneut inkubieren in Blocking-Lösung mit Permeabilisations-Reagenz (Triton-X-100) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Um Immunfärbung für die OCT-4 oder SOX2, folgen Sie einfach die Methodik in den Schritten beschrieben 6,1-6,6 für die primären und sekundären Antikörper anwenden. Für die Zwecke dieses Protokoll verwenden, Oct-4 und SOX2 bei einer Konzentration von 1: 200 und der sekundäre Antikörper Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Alexa Fluor 594 bei 1: 500.
- Nach den oben genannten Antikörper-Behandlungen primären und sekundären, waschen Sie die Zellen 3 mal 5 - 10 min jeweils mit PBS und Gegenfärbung mit 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI) nach Standardprotokollen, wenn die Kern Visualisierung gewünscht wird.
7. Vorbereitung für Viewing
- Für Kammer gleitet, entfernen Sie vorsichtig die obere Kammer von der Folie, nach den Anweisungen des Herstellers. Dann spülen in destilliertem Wasser, und fügen Sie Medium und ein Abdeckglas Montage Mikroskopie zu ermöglichen.
- Für Deck, kehren Sie die Deckgläser auf einem Tropfen auf einem Glasobjektträger Medium platziert Montage.
- Bild unter einem Standard-oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Dieses Protokoll stellt eine schrittweise Beschreibung, wie die menschliche iPS-Zellen können von Feeder-Schicht übertragen werden, um Bedingungen zu Zubringer frei und anschließend in einer begrenzten Art und Weise vermehrt speziell kosteneffektive Immunzytochemie zu ermöglichen Pluripotenz Wartung für die Bestätigung. Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung dieses Protokolls. 2A zeigt hiPSC Kolonien wachsen auf iMEFs in 6-Well - Platten. Diese Kolonien zeigen typische Morphologie mit definierten Grenzen und dichte Phase hellen Zentren. Wie in 2B gezeigt, nach der Übertragung der iPSCs chaotisch zufuhrfreien Bedingungen in 12-Well - Platten, erscheint Koloniemorphologie mit etwas weniger deutliche Kanten. Auch einige iMEFs kann in diesem Stadium in der Kultur bleiben. 2C zeigt , dass nach einer zusätzlichen Stelle in der Feeder - freies System, iPSC Kolonien eine klassische einschichtige Morphologie mit einem hohen Kern zeigen Cytoplasm Verhältnis. In diesem Stadium ist es ersichtlich, dass iMEFs haben praktisch aus der Kultur eliminiert.
Die Kolonien wachsen unter Feeder freien Bedingungen mechanisch gepflückt und plattiert auf kleine Multi-Well-Kammer-Dias oder Glasplättchen, und für spezifische Pluripotenz Antigene über Immunzytochemie sondiert. Abbildung 3 zeigt repräsentative Kolonien , die immunopositive sind für SSEA4 oder Tra-1-60 (3B, 3F, Oberflächen Pluripotenz Antigene) und Oct-4 oder Sox2 (3 A, 3E, intrazelluläre Pluripotenz Antigene).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. Insgesamt Schema der beschriebenen Methode verwendet, um menschliche iPS-Zellen aus Imef Zubringer für den Übergang zu Feeder-freie Kultur und anschließender von Zellen mit Pluripotenz Marker Sondieren. Imef: IRRADIA ted embryonalen Maus-Fibroblasten; iPSC: pluripotente Stammzelle induziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Bilder von iPS Kolonien Übergang von Imef Feeders zu Feeder freie Kulturbedingungen. A) Dense iPSC Kolonie (weißer Pfeil) aufgewachsen auf Imef Feeder - Zellen (schwarzer Pfeil). B) Nach dem ersten Durchgang an einer Matrix beschichteten 12-Well - Platte in einem serumfreien Medium, wenige iMEFs noch kann in Kultur (schwarzer Pfeil beobachtet werden). C) Typische Morphologie einer einschichtigen iPSC Kolonie Feeder frei gewachsen. Keine iMEFs bleiben in der Kultur in diesem Stadium. Maßstabsleiste (AC) = 100 & mgr; m.> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Immunzytochemische Charakterisierung humaner iPS - Zellen plattiert in Klein Well Platten. Repräsentative Immunofluoreszenz Bilder von iPS - Zellen über ein Konfokalmikroskop erhalten, die positive Expression von Pluripotenz Marker zeigt A) Oct-4 (rot) und B) SSEA4 (grün) mit C) die Kernfärbung DAPI (blau), und E) Sox2 ( rot) und F) Tra-1-60 (grün) mit G) DAPI (blau). D und H zeigen die Overlay - Bilder im Zusammenhang mit AC und EG. Maßstabsbalken (AH) = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| hiPSC Medien für die Wartung auf Feeders | ||
| Komponente | Auf Konzentration | Endkonzentration |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Knockout Serum Ersatz | 100% | 20% |
| L-Glutamin | 200 mM | 1 mM |
| MEM-NEAA | 10 mM | 0,1 mM |
| 2-Mercaptoethanol | 55 mM | 0,1 mM |
| Recombinant Human FGF-Basic | 10 ug / ml | 10 ng / ml |
| Y-27632 ROCK-Inhibitor | 10 & mgr; M | |
| Matrigel Beschichtung für Feeder-Free Kulturen | ||
| Komponente | ||
| Matrigel hESC-qualifizierte Matrix | Verdünnungsfaktor 269 & mgr; l | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 ml | |
| Hinweis: Verdünnungsfaktor Menge abhängig und muss von Analysenzertifikat ermittelt werden | ||
| mTeSR1 komplette Medien für Feeder-Free Kulturen | ||
| Komponente | Menge | |
| mTeSR1 Basal Medium | 400 ml | |
| mTeSR1 5x Supplement | 100 ml | |
| Hinweis: Nach dem Mischen mTeSR1 komplette Medien in Aliquots und verwendet werden eingefroren, bis Komponente Ablaufdatum | ||
| Hinweis: mTeSR1 komplette Medien dürfen nur bei Raumtemperatur erwärmt werden. Wasserbad Nicht in | ||
Tabelle 1: iPSC Kultur Medien Rezepte und Plattenbeschichtungen.
| 4% Paraformaldehyd Fixiermittel | |
| Komponente | Menge |
| 0,1 M PO 4 Puffer | 2 L |
| Paraformaldehyd, Prill | 80 g |
| ICC Blocking Solution ohne Triton-X-100 | |
| Komponente | Menge |
| 1x Phosphate Buffered Saline | 49 ml |
| Normales Ziegenserum | 1 ml |
| Rinderserumalbumin | 0,5 g |
| ICC Blocking Solution mit Triton-X-100 | |
| Komponente | Menge |
| 1x Phosphate Buffered Saline | 49 ml |
| Normales Ziegenserum | 1 ml |
| Rinderserumalbumin | 0,5 g |
| Triton-X-100 | 200 ul |
Tabelle 2: Fixativ und Immunzytochemie Rezepte.
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Discussion
Die systematische Protokoll präsentiert hier bietet eine zeitsparendes und kostengünstiges Verfahren, in Form einer abgespeckte Kulturtechnik, die speziell zur Unterstützung der wirksamen Pluripotenz Analyse über Immunzytochemie gestaltet.
Die Hauptvorteile der beschriebenen Methode sind wie folgt. Traditionell mehr als 3 bis 4 Durchgänge benötigt iPSCs von Feeder - Schichten , um den Übergang zu Feeder freien Kulturbedingungen, um Rest iMEFs , die nach der Verwendung von Bulk - Dissoziation Techniken und die typische einschichtigen Morphologie zu beseitigen 12 erscheinen, 13. Im Gegensatz dazu stellte das Verfahren hier beinhaltet eine verkürzte Zeitleiste, die für die relativ schnelle Übertragung von iPS - Zellen an serumfreie Bedingungen über die manuelle Kommissionierung von iPS - Kolonien ermöglicht. Die iPS-Zellen werden in begrenzten Mengen in kleinen Kammer Dias oder Deck förderlich für Immunzytochemie gewachsen. In der Tat, das Volumich von Kulturmedium pro Vertiefung benötigt nur 0,5 ml und das Volumen der verdünnten Antikörperlösung für einen einzelnen Deck erforderlich ist als nominal als 40 & mgr; l oder 300 & mgr; l pro Kammer gut, wenn dieses Protokoll verwenden.
Wir finden, dass die Zugabe von gleichen Teilen Imef zum mTeSR1 während des anfänglichen Durchgangs konditionierten Medien (Schritt 2.5) ist ein wichtiger Schritt, der Hilfsmittel in das Überleben und die Aufrechterhaltung der Morphologie der pluripotenten iPSC. Darüber hinaus, wenn die Zellhaftung nach Passagierung nicht optimal ist (Schritte 2.2, 3.3 und 4.3), können Problemlösungen durch weitere Optimierung der Dissoziation Zeiten verwendet durchgeführt werden.
Schließlich wird eine Begrenzung der dargebotenen kleinräumige Verfahren kann, wenn auch auf andere Techniken wie Durchflusszytometrie Vergleich verwendet Pluripotenz zu überprüfen, besteht darin, dass es nicht für die weitere Ausbreitung von analysierten Zellen für Downstream-Anwendungen erlaubt. Der Nutzen unserer Methode ergibt sich aus seiner spezifischen Konstruktion, die die cos unterstütztt und effiziente Kultur der hiPSCs für Pluripotenz über Routine Immunzytochemie bestätigt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
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