Introduction
Перепрограммирование взрослого человека соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) обеспечивает способ получить потенциально неограниченный запас клеток конкретного пациента для изучения болезнью 1, 2. Резюмируя фенотипа заболевания в пробирке бы сделать его правдоподобным , чтобы исследовать клеточные и молекулярные механизмы , связанные с болезнью, а также улучшить обнаружение наркотиков и персонализированной медицины 3. Кроме того, человеческие иПСК (hiPSCs) обеспечивают возможность получения специфических типов клеток , которые могут быть использованы в качестве уникального ресурса для замены мертвых или дисфункциональные клеток и восстановления функции в контексте нескольких расстройств 4, 5.
Важной предпосылкой к использованию ИПСК в вышеупомянутых приложений гарантирует, что их плюрипотентные и недифференцированное состояние сохраняется в процессе расширения в культуре. Как правило, Techniqжает , такие как проточной цитометрии, вестерн - блоттинга, полимеразной цепной реакции и функциональных анализов, которые требуют большого количества клеток и специализированного оборудования, используются для детального анализа иПСК плюрипотентности 6, 7, 8, 9, 10. Тем не менее, процедура оценки недифференцированном состоянии по ИПСК "эффективно может быть достигнуто за счет ограниченного распространения этих клеток специально для иммуногистохимии (МУС), тем самым привлекая сокращение времени и ресурсов.
Последние достижения позволяют для роста ИПСК в определенных бессывороточной условиях, что является существенным улучшением по сравнению с традиционными системами культуры, которые требуют мышиные слоев фидерных фибробласты и сывороточных средах. Тем не менее, современная литература не включает в себя четкие протоколы скачкообразные, которые описывают, как переход ИПСК из фидераслой фидерными свободных систем.
В этом контексте настоящее протокол систематически подробно описано, как hiPSCs выращенные на облученный мышиных эмбриональных фибробластов (КПКО), фидерные слои могут быть (1), предназначенный для распространения в бессывороточной среде, и (2), культивировали на мелкосерийном специально для поддержки надежной иммуноцитохимическое анализ. В целом, эта методология представляет собой своевременную и экономически эффективную процедуру для размножения человека ИПСК в бессывороточной условиях для подтверждения их плюрипотентности на регулярной основе с использованием иммуноцитохимии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs были получены из фибробластов человека , выделенных из дермы 4 мм перфоратор кожи биопсий и перепрограммировать в доме с помощью вируса Сендай-опосредованной перепрограммирования 11. Университет штата Аризона совета по рассмотрению Institutional одобрил все процедуры при условии набора и сбора биопсии.
1. Приготовление внеклеточного матрикса Coated поверхность для иПСК культуры
- За один день до впадения hiPSC культур, растущих на iMEFs, готовят внеклеточный матрикс (Матригель) пластины с покрытием.
- Медленное таяние аликвоту внеклеточного матрикса (много зависит, следуйте инструкциям на листе спецификации) на льду в 4 ° С в течение 2 ч.
- В вытяжном шкафу биологической безопасности, используя холодные кончики пипеткой (хранили при -20 ° С), добавляют 1 аликвоты внеклеточного матрикса в модифицированную по Дульбекко / питательной смеси холодной Дульбекко F-12 (DMEM / F12 / HEPES) в соответствии с партии значений коэффициента разбавления ,
- Разлить ~ 60081, L внеклеточного матрикса на лунку каждой новой клеточной культуре, лечение требуется 12-луночный планшет.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение нескольких часов. Здесь используют 3 часа времени инкубации.
Примечание: Пластины могут быть использованы непосредственно или хранили при 4 ° С в течение до двух недель.
2. Передача hiPSCs Выращенный на КПКО фидерных клеток на внеклеточной матрицы для распространения
- В день пассирования, удалите матричную пластину, покрытую от 4 ° С и позволяют пластины акклиматизироваться до комнатной температуры в течение 1 ч в культуре ткани капюшоном.
- Аспирируйте среды от 1 лунку 6-луночного планшета с культурой hiPSC растущей на iMEFs и заменить 500 мкл коллагеназа диссоциации реагента (1 мг / мл в основной культуральной среде).
- Инкубируют при 37 ° С в течение ~ 10 - 30 мин, пока края колоний Ipsc появляются слегка приподнять.
ПРИМЕЧАНИЕ: время Инкубационный линия зависит и будет меняться. Монитор диссоциации под микроскопом. - Автомобильefully аспирата реагент диссоциации и мыть осторожно 2 раза фосфатным буферным солевым раствором (PBS, рН 7,4).
- Добавить 1 мл комнатной температуры mTeSR1 полной среде с 10 нг / мл Rho-ассоциированный ингибитор протеинкиназы (Y-27632 ингибитором ROCK) в скважину.
Примечание: Использование смеси 50:50 КПКО-кондиционированной среды и mTeSR1 в течение этого начального прохода предлагается и может быть полезным для выживания hiPSCs во время этого перехода СМИ. - С помощью небольшой фазово-контрастного микроскопа помещен частично внутрь капота, вручную набрать и выбрать 1 - 2 hiPSC колонии (~ 700 - 1000 мкм в диаметре) с помощью шприца и иглы (25 г, 1 ½ дюйма). Нажимаем от забитых части колонии в среду с наконечником P200 пипетки.
- Отберите и распоряжаться матрицы из новой пластинки, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить покрытие.
- Передача 1 мл клеточной суспензии из старой лунке, содержащей забитые ИПСК в новую матрицу хорошо покрытием.
- Пласе пластину в инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2. Рок пластины в несколько быстрых, назад и вперед, и стороны в сторону движения, чтобы равномерно разложить клетки. Не беспокоить пластину в течение 24 ч.
- Выполнять ежедневные полные изменения медиа с mTeSR1 полной средой (добавление Y-27632 ROCK Ингибитор не нужен после первоначального посева на стадии 2.5).
3. Малый пассажи hiPSCs на матричных пластинок, покрытых
Примечание: Как правило, после того, как начальный передаче hiPSCs Матричное пластин, покрытых оболочкой, клетки должны быть пассировать еще раз таким же образом, чтобы гарантировать, что все iMEFs были устранены, и клетки адаптировались к питатель безупречных условий.
- За один день до иПСК сплошности подготовка свеже покрытием матрицы пластин, как описано в разделе 1.
- В день прохождения, удалите матричную пластину, покрытую от 4 ° C Инкубационный и позволяют пластины акклиматизироваться до комнатной температуры в течение 1 ч в куль тканиратура капот.
- Аспирируйте среды от 1 лунку 6-луночного планшета из hiPSCs (первоначально преобразованным из подающего лотка к матрице) и заменить 500 мкл буфера для диссоциации клеток.
Примечание: Коммерческий буфер для диссоциации клеток использовали здесь (см Материалы таблицу) является более подходящим для использования с mTeSR1 среды по сравнению с коллагеназой. - Выдержите при комнатной температуре в течение 3 - 7 мин, пока края колоний IPSC появляются слегка приподнять. Как упоминалось ранее, время инкубации линии зависит и переменной. Таким образом, контролировать клеточную диссоциацию под микроскопом, чтобы определить оптимальное время.
- Тщательно аспирата буфер диссоциации и мыть осторожно 2 раза PBS.
- Добавить 500 мкл комнатной температуры mTeSR1 полной среде с 10 нг / мл Y-27632 ингибитора ROCK в скважину.
- Вместо того, чтобы забивать колоний, как в шаге 2.6, нажмите нужное количество колоний в средствах массовой информации с использованием наконечника P200 и осторожно растирают суспензии клеток в 2 раза AGainst один угол колодца, чтобы сломать колонии hiPSC в сгустки ~ 50 - 200 мкм. Например, для 12-луночного планшета, выбрать 1 - 2 колонии для передачи в каждую 1 новой скважины. Передача клеточной суспензии из старого колодца в одну новую лунку 12-луночного планшета.
- Рок пластины в несколько быстрых, назад и вперед, и из стороны в сторону движения , чтобы равномерно разложить клетки, и пусть пластины покоя в течение 24 ч при 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора.
- Выполнять ежедневные полные изменения медиа с mTeSR1 полной средой. Как упоминалось ранее, нет необходимости добавлять Y-27632 ROCK Ингибитор после первоначального посева.
Примечание: Неиспользуемые IPSC колонии из шага 3.7 может быть легко криоконсервации в этой точке.
4. Подготовка палаты Слайды и покровные для высева hiPSCs для иммуноцитохимию
Примечание: Следующий протокол использует 4-луночные пластиковые камеры слайды и 12 мм покровные стекла с appropriatобъемы электронных средств массовой информации в многоканальном скважин для поддержки рентабельную иммуноцитохимии. Тем не менее, объемы средств массовой информации может быть увеличена, если использование больших скважин и покровное размеров желательно.
- За один день до hiPSC слияния, подготовить слайды камеры свеже покрытые внеклеточного матрикса, как описано в разделе 1. Добавьте достаточно раствора матрицы (~ 300 - 500 мкл на лунку 4-луночного камеры горкой), чтобы полностью пальто каждую лунку без какого-либо озабоченности испарение. В качестве альтернативы, после размещения 1 чистую и стерильную покровное в каждую лунку 24-луночного планшета, пальто с 500 мкл внеклеточный матрикс и убедитесь, что покровное не плавающим на поверхности раствора.
- В день прохождения, удалите покрытые камерные слайды / покровные от 4 ° С и позволяют акклиматизации до комнатной температуры в течение 1 ч в культуре ткани капюшоном.
- Аспирируйте среды от 1 лунку 12-луночного планшета из hiPSCs и заменить 500 мкл буфера диссоциации.
- Выдержите при комнатной Температура в течение ~ 3 - 7 мин, пока края колоний IPSC появляются слегка приподнять.
- Тщательно аспирата буфер диссоциации и добавить 1 мл комнатной температуры mTeSR1 полной среде с 10 нг / мл Y-27632 ROCK ингибиторной к колодцу.
- С помощью контрастного микроскопа малый фазовый помещенный внутри капот культуры ткани, вручную выбрать 1 колонии / новый лунку 4-луночного камеры горкой или 1 новый покровным металлизируемые (~ 1000 - 1500 мкм в диаметре) с использованием наконечника Р200 пипеткой нажатием это от поверхности пластины в среду.
- Аспирируйте матрицу из новой камеры салазки / покровное, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить покрытие.
- Осторожно растереть клеточную суспензию 2 раза против одного угла скважины сломать колонии hiPSC в сгустки ~ 50 - 200 мкм. Перенести 250 мкл клеточной суспензии из старого колодца в каждую новую лунку 4-луночного камера слайд / покровное.
- Довести объем каждой новой скважины до 500 мкл с mTeSR1 продAining 10 нг / мл Y-27632 ROCK Ингибитор.
- Поместите камеру салазки / покровные в инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2.
- Через 24 часа ежедневно выполнять полное изменения медиа с mTeSR1 полной средой. Опять же, как упоминалось ранее, добавление Y-27632 ROCK Ингибитор нет необходимости после первоначального посева.
5. Приготовление ИПСК для иммуноцитохимию
- После того, как сливающиеся, сохранить колонии hiPSC через фиксации путем удаления носителя из лунок и добавление предварительно нагретую ВНИМАНИЕ 4% параформальдегида (~ 300 мкл / лунку 4-хорошо камера салазки / покровное). Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Откажитесь параформальдегида надлежащим образом в соответствии с институциональной Biohazard и химических принципов безопасности.
- Промыть клетки 3 раза в течение 5 мин каждый на настольном шейкере с PBS.
Примечание: Клетки на камерные слайды / покровные могут быть сохранены с достаточным количеством PBS при 4 ° С до бесконечности, на данном этапе.В качестве альтернативы, они могут быть немедленно использованы для ICC.
6. Иммуноокрашивание hiPSCs с плюрипотентности Маркеры
Примечание: Immunostain hiPSCs со стандартными плюрипотентности антителами. В качестве примера, здесь клетки дважды окрашивались антителами нацеливание один1 поверхность и 1 внутриклеточный антиген последовательным способом следующим образом: Анти-стадиеспецифический эмбриональный антиген-4 (SSEA4) с анти-октамером-связывающий белок 4 (OCT- 4) и анти-TRA-1-60 с анти-SRY связанных с HMG BOX гена 2 (SOX2) (Пожалуйста, смотрите таблицу материалы для антител деталей).
- Аспирируйте PBS из лунок и добавляют в 500 мкл / лунку блокирующего раствора без Triton-X-100. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Приготовьте заранее определенной концентрации (здесь используется 1: 200) поверхности антител, либо SSEA4 или TRA-1-60, путем разбавления в блокирующем растворе без Triton X-100.
- Для камеры слайдов, подготовить 300 мкл / лунку 4-луночного камеры слайдпутем смешивания 298,5 мкл блокирующего раствора выше и 1,5 мкл анти-SSEA4 или TRA-1-60 первичным антителом.
- Для покровные, готовят 40 мкл / покровное путем смешивания 199 мкл блокирующего раствора и 1 мкл анти-SSEA4 или TRA-1-60 первичного антитела.
- Аспирируйте блокирующего раствора из камеры горкой и отказаться от первичного антитела в соответствующие лунки. Для покровные, место кусок парафином плотно внутри чашки Петри и обойтись 40 мкл первичного антитела на вершине в качестве капельке. Используя согнутую иглу шприца и пинцет, осторожно поднимите покровное из культуры хорошо и поместить его боковую ячейку вниз на каплю антитела на парафином. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
- На следующее утро, мыть клетки 3 раза, 5 - 10 мин каждый, путем удаления антитела из камеры слайда и добавление в PBS. Для покровные, поднимите каждый одно с парафином и поместить его обратно в лунку 24-луночного планшета, боковой ячейки вверх. Осторожно добавьте PBS.
- Подготовить соответствующие вторичные антитела в соотношении 1: 500 в блокирующем растворе.
- Для камеры слайдов, подготовить 300 мкл / лунку 4-луночные камеры ползуна путем смешивания 499 мкл блокирующего раствора и 1 мкл козьего антитела против мышиного IgG 3 Alexa Fluor 488 (для SSEA4) или 1 мкл козьего анти-мышиных IgM-Alexa Fluor 488 (для TRA-1-60).
- Для покровных стеклах, подготовить 40 мкл / покровное путем смешивания 499 мкл блокирующего раствора и 1 мкл козьего антитела против мышиного IgG 3 Alexa Fluor 488 (для SSEA4) или 1 мкл козьего анти-мышиных IgM-Alexa Fluor 488 (для TRA-1-60 ).
- Аспирируйте PBS из камеры горкой и отказаться от вторичного антитела в соответствующие лунки. Для покровных стеклах, после ступенчатого 6.2, инвертировать покровные на раствор антител размещенную на парафином при комнатной температуре в течение 2 ч.
Примечание: При использовании флуоресцентной меченый вторичных антител, клетки должны быть защищены от воздействия света. Поместите камеру слайды и покровные в темном окрironment во время инкубирования и моет. - Промыть клетки 3 раза в течение 5 - 10 мин каждый раз путем удаления антитела из камеры горкой и добавление в PBS. Для покровные, поднимите каждый из них тщательно от парафином и поместить обратно в лунку 24-луночного планшета, боковой ячейки вверх. Осторожно добавьте PBS во время мытья.
- Перед зондированием для второго антигена, внутриклеточный ОСТ-4 или SOX2 в этом случае, инкубировать еще раз в блокирующем растворе, сделанное с пермеабилизации реагентом (Тритон-Х-100) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Для immunostain для ОКТ-4 или SOX2, просто следовать методике, описанной в шагах 6.1-6.6 для применения первичных и вторичных антител. Для целей настоящего протокола, используют OCT-4 и SOX2 в концентрации 1: 200 и вторичного козьего антитела против IgG кролика Alexa Fluor 594 в соотношении 1: 500.
- После вышеуказанных процедур первичного и вторичного антитела, промыть клетки 3 раза в течение 5 - 10 мин каждый с PBS и контрастное с 4 ', 6'-диамидино-2-phenylindole, дигидрохлорид (DAPI) в соответствии со стандартными протоколами, если ядерная визуализация желательно.
7. Подготовка к Viewing
- Для камеры горками, осторожно снимите верхнюю камеру с горкой, следуя инструкциям производителя. Затем промыть в дистиллированной воде, и добавить монтажа среду и покровным стеклом, чтобы позволить микроскопию.
- Для покровные, инвертировать покровные на каплю монтажа среды, помещенной на предметное стекло микроскопа.
- Изображение под стандартным или конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол обеспечивает ступенчатое описание того, как иПСК человек может быть переведен из фидерного слоя фидерных свободных условиях, а затем распространяются в ограниченном порядке, специально включить рентабельный иммуноцитохимии для подтверждения технического обслуживания плюрипотентности. На рисунке 1 показано схематическое представление этого протокола. Рисунок 2А показывает hiPSC колонии , растущие на iMEFs в 6-луночные планшеты. Эти колонии демонстрируют типичную морфологию с определенными границами и плотной фазы ярких центров. Как показано на рисунке 2B, после передачи ИПСК фидерными безупречных условий в 12-луночные планшеты, морфология колонии выглядит несколько хаотичным с меньшим количеством различных ребер. Кроме того, некоторые iMEFs могут оставаться в культуре на данном этапе. Рисунок 2C показывает , что после дополнительного прохода в фидерной свободной системе IPSC колонии отображения классической морфологии монослоя с высоким ядра к Cytoplasm отношение. На данном этапе, то видно, что iMEFs были практически исключены из культуры.
Колонии, растущие под фидерных условиях без механически собирают и высевают на небольшой многоскважинных камерные слайды или покровные стекла и зондируют для специфических антигенов плюрипотентности через иммуноцитохимию. Рисунок 3 показывает типичные колонии, которые иммунопозитивные для SSEA4 или TRA-1-60 (3B, 3F, поверхность плюрипотентности антигены) и Oct-4 или Sox2 (3 A, 3E, внутриклеточные плюрипотентности антигены).
Рисунок 1: Схематическое представление протокола. Общая схема описанного метода, используемого для перехода человека из ИПСК КПКО фидеров фидерных свободной культуры и последующее зондирование клеток с маркерами плюрипотентности. КПКО: irradia Ted мышиных эмбриональных фибробластов; IPSC: индуцированные стволовые клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель Изображения IPSC Колонии переходящих из КПКО кормушки для фидерной свободной культуры условиях. А) Плотные IPSC колонии (белая стрелка) , выращенных на КПКО клеток фидерных (черная стрелка). Б) После первоначального прохода по матричному покрытием 12-луночный планшет в среде без сыворотки, несколько iMEFs все еще могут наблюдаться в культуре (черная стрелка). C) Типичная морфология монослоя IPSC колонии выращивают фидерных бесплатно. Нет iMEFs остаются в культуре на данном этапе. Scale Bar (AC) = 100 мкм.> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Характеристика Иммуноцитохимическая гальванопокрытием человека ИПСК в виде пластин небольшой колодец. Представитель иммунофлуоресценции изображения ИПСК, полученные с помощью конфокальной микроскопии, показывающие положительную экспрессию плюрипотентности маркеров A) Oct-4 (красный) и B) SSEA4 (зеленый) с C) пятно DAPI ядерной (синий) и Е) Sox2 ( красный) и F) TRA-1-60 (зеленый) с G) DAPI (синий). D и H показывают наложения изображений , относящихся к сети переменного тока и EG. Шкала бар (AH) = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| hiPSC СМИ для поддержания на Кормушки | ||
| Компонент | Концентрация со | Конечная концентрация |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Нокаут Сыворотка Замена | 100% | 20% |
| L-Глютамин | 200 мМ | 1 мМ |
| MEM-NEAA | 10 мМ | 0,1 мМ |
| 2-меркаптоэтанол | 55 мМ | 0,1 мМ |
| Рекомбинантного человеческого FGF-Basic | 10 мкг / мл | 10 нг / мл |
| Y-27632 ROCK Ингибитор | 10 мкМ | |
| Матригель покрытие для фидерных-Free культур | ||
| Компонент | ||
| Матригель чЭСК квалифицированных Матрица | Коэффициент разбавления 269 мкл | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 мл | |
| Примечание: коэффициент разведения много зависит и должны быть определены на основании акта о проведении анализа | ||
| mTeSR1 полную среду для фидерных-Free культур | ||
| Компонент | Количество | |
| mTeSR1 базальной среды | 400 мл | |
| mTeSR1 5x Дополнение | 100 мл | |
| Примечание: После смешивания, mTeSR1 полные носители могут быть заморожены в аликвоты и используется до истечения срока годности компонентов | ||
| Примечание: mTeSR1 полные средства массовой информации должны быть нагреты при только комнатной температуре. Не оставляйте в водяной бане | ||
Таблица 1: IPSC медиакультуры Рецепты и пластинчатые покрытия.
| 4% параформальдегид фиксатив | |
| Компонент | Количество |
| 0,1 M PO 4 буфера | 2 L |
| Параформальдегид, гранулированная | 80 г |
| ICC блокировании решения без Triton-X-100 | |
| Компонент | Количество |
| 1x фосфатно-солевом буферном | 49 мл |
| Нормальная козья сыворотка | 1 мл |
| Бычьим сывороточным альбумином | 0,5 г |
| МТП блокирующего раствора с Triton-X-100 | |
| Компонент | Количество |
| 1x фосфатно-солевом буферном | 49 мл |
| Нормальная козья сыворотка | 1 мл |
| Бычьим сывороточным альбумином | 0,5 г |
| Тритон-Х-100 | 200 мкл |
Таблица 2: Фиксирующий и иммуноцитохимию Рецепты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Систематическое протокол, представленный здесь предлагает Timesaving и экономически эффективный метод, в виде уменьшенную техники культуры, специально разработан для поддержки эффективного анализа плюрипотентности с помощью иммуногистохимии.
Основные преимущества описанной методики заключаются в следующем. Традиционно более 3 -х до 4 проходов, необходимых для перехода ИПСК из фидерных слоев фидерных свободных условий культивирования с целью устранения остаточных iMEFs оставшиеся после использования объемных методов диссоциации и для типичных монослоя морфологии появляются 12, 13. В противоположность этому , метод , представленный здесь , включает в себя сокращенный график, который позволяет для относительно быстрой передачи ИПСК в бессывороточной условиях с помощью ручного сбора из IPSC колоний. В иПСК выращивают в ограниченных количествах в небольших горок камере или покровные, способствующих иммуноцитохимию. На самом деле, Voluмне культуральной среды, необходимой на лунку всего 0,5 мл и объем разведенного раствора антител, необходимый для одного покровное номинальными как 40 мкл или 300 мкл на камеру и, при использовании этого протокола.
Мы считаем, что добавление равных частей КПКО кондиционированной среды к mTeSR1 во время начального прохода (Шаг 2.5) представляет собой важный шаг, который помогает в выживания и поддержания плюрипотентных морфологии IPSC в. Кроме того, если присоединение клеток не является оптимальным после пересева (шаги 2.2, 3.3 и 4.3), процедура поиска неисправностей может быть выполнено путем дальнейшего оптимизации времени диссоциации используемых.
И, наконец, ограничение предложенного метода малого, по сравнению с другими методами, такими как проточной цитометрии также используется для проверки плюрипотентности, является то, что оно не допускает дальнейшего распространения проанализированных клеток для последующих применений. Полезность нашего метода вытекает из его специфической конструкции, который поддерживает созтрет-эффективной и действенной культура hiPSCs для подтверждения плюрипотентности с помощью обычного иммуноцитохимию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
