Introduction
תכנות מחדש תאים סומטיים אדם בוגרים לתאי גזע מושרים (iPSCs) מספק דרך להשיג אספקה פוטנציאלית בלתי מוגבלת של תאים ספציפיים למטופל ללמוד המחלה 1, 2. משחזר פנוטיפ מחלה במבחנה תעשה את זה מתקבל על דעת לבחון מנגנונים תאיים ומולקולריים הקשורים במחלה, ולשפר גילוי סמי רפואה מותאם אישית 3. בנוסף, iPSCs האדם (hiPSCs) להציע את היכולת להפיק סוגי תאים מסוימים אשר ניתן להשתמש בהם כמשאב ייחודי להחליף תאים מתים או לא מתפקדת ולשחזר פונקציה בהקשר של מספר הפרעות 4, 5.
תנאי חשוב לשימוש iPSCs שמוצג ביישומים לעיל הוא להבטיח כי מדינת pluripotent ו המובחנת שלהם נשמרת במהלך התרחבות בתרבות. בדרך כלל, techniqUES כגון cytometry זרימה, סופג מערבי, תגובת שרשרת פולימראז מבחנים תפקודיים, אשר דורש כמויות גדולות של תאים וציוד מיוחד, משמש לניתוח המפורט של pluripotency 6 iPSC, 7, 8, 9, 10. עם זאת, הערכה שיגרתית של המדינה המובחנת 'iPSCs עשויה להיות מושגת בצורה יעילה באמצעות ההתפשטות המוגבלת של תאים אלה במיוחד עבור immunocytochemistry (ICC), ובכך מעורבים זמן נמוך ומשאבים.
התקדמות שחלה באחרונה לאפשר לצמיחת iPSCs בתנאי סרום ללא מוגדר, וזה שיפור משמעותי על פני מערכות התרבות קונבנציונליות שדורשות שכבות מזין פיברובלסטים murine ומדיה המכיל סרום. אולם, הספרות הנוכחית אינה כוללת פרוטוקולים בשלבים ברורים המתארים כיצד מעבר iPSCs מזיןשכבה למערכות מזינות חינם.
בהקשר זה, בפרוטוקול הנוכחי מפרט באופן שיטתי כיצד hiPSCs גדל על פיברובלסטים מוקרן עכבר עוברי (iMEF) שכבות מזין יכול להיות (1) מותאמת להפיץ במדיום סרום ללא, ו (2) בתרבית על בקנה מידה קטנה במיוחד לתמוך חזק ניתוח immunocytochemical. בסך הכל, מתודולוגיה זו מייצגת הליך בזמן וחסכוני עבור הפצת iPSCs האנושי בתנאים סרום ללא לצורך וידוא pluripotency שלהם על בסיס שגרתי באמצעות immunocytochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs נגזרו פיברובלסטים עורי אדם מבודד ביופסיות אגרוף העור 4 מ"מ ו לתכנות מחדש בבית באמצעות סנדאי וירוס בתיווך תכנות מחדש 11. האוניברסיטה של דירקטוריון סקירה המוסדי אריזונה אשרה את כל הליכי גיוס נושא ואיסוף ביופסיה.
1. הכנת משטח מצופה מטריקס עבור iPSC תרבות
- יום אחד לפני המפגש של תרבויות hiPSC גוברות על iMEFs, להכין תאי מטריקס (Matrigel) צלחות מצופות.
- הפשרה איטית aliquot של תאי מטריקס (הרבה תלוי, על פי הנחיות גיליון המפרט) על קרח 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- במנדף בטיחות ביולוגית, באמצעות טיפים pipet קר (מאוחסן ב -20 ° C), להוסיף 1 aliquot של מטריקס לתערובת הנשר שונה של קר Dulbecco בינוני / מזין F-12 (DMEM / F12 / HEPES) על פי גורם לדילול ספציפי הרבה .
- לוותר ~ 60081; L של מטריקס לכל טוב של כל תרבית תאים חדשה שטופל צורך צלחת 12-היטב.
- דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. הנה, להשתמש זמן דגירה 3 שעות.
הערה: ניתן להשתמש צלחות מיד או לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
העברת 2. hiPSCs גדלה על תאי מזין iMEF על תאי מטריקס עבור רבייה
- ביום passaging, להסיר את צלחת מצופה מטריצה מ 4 ° C ולאפשר הצלחת להסתגל לטמפרטורת החדר 1 ח ב למכסה המנוע בתרבית רקמה.
- לשאוב את המדיום 1 גם צלחת 6-גם של התרבות hiPSC גוברת על iMEFs ולהחליף מגיב דיסוציאציה collagenase 500 μL (1 מ"ג / מ"ל במדיום תרבות הבזליים).
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 10 - 30 דקות עד הקצוות של מושבות iPSC להופיע להרים מעט.
הערה: זמן דגירה הוא קו תלוי ישתנה. צג דיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. - אוטוefully לשאוב מגיב דיסוציאציה ולשטוף בעדינות 2 פעמים עם בופר פוספט (PBS, pH 7.4).
- הוסף 1 מ"ל של מדיום מלאה בטמפרטורת החדר mTeSR1 עם 10 ng / mL מעכב קינאז חלבון Rho-משויך (מעכב ROCK Y-27632) אל הבאר.
הערה: שימוש 50:50 תערובת של מדיום iMEF ממוזג mTeSR1 במהלך המעבר הראשוני הזה הוא הציע ויכולה להועיל להישרדותו של hiPSCs במהלך מעבר המדיה הזו. - באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב קטן המאוחסן חלקית בתוך מכסה המנוע, באופן ידני להבקיע ולאסוף 1 - 2 מושבות hiPSC (~ 700 - 1,000 מיקרומטר קוטר) באמצעות מזרק ומחט (25 G, ½ 1 ב). לדחוף את חתיכות כבש של המושבה לתוך המדיום עם קצה P200 pipet.
- לשאוב ולהיפטר המטריצה מהצלחת החדשה, נזהר שלא להפריע את הציפוי.
- העברת 1 מ"ל של השעיה התא מן הישן היטב המכיל את iPSCs מקועקעות המטריצה החדשה מצופה היטב.
- PlaCe הצליח בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. רוק הצליח בכמה מהיר, גב ו-ושוב, וצד אל צד תנועות להתפשט באופן שווה את התאים. נא לא להפריע את הצלחת למשך 24 שעות.
- בצע שינויי תקשורת מלאים יומיים עם בינוני מלא mTeSR1 (תוספת של מונעי Y-27632 ROCK אינו נחוצה לאחר הציפוי הראשוני בשלב 2.5).
3. בקנה מידה קטנה Passaging של hiPSCs על צלחות מצופות מטריקס
הערה: באופן כללי, לאחר ההעברה הראשונית של hiPSCs כדי מטריקס צלחות מצופות, תאים צריכים להיות passaged שוב באופן דומה על מנת להבטיח את כל iMEFs בוטל ותאים שהסתגלו מזין ללא תנאים.
- יום אחד לפני confluency iPSC להכין מצופה טרי צלחות מטריקס כפי שפורט בסעיף 1.
- ביום המעבר, להסיר את צלחת מצופה המטריצה מ דגירת 4 ° C. ולאפשר הצליח להסתגל לטמפרטורת חדר 1 ח במבוי הרקמותמכסה מנוע ture.
- לשאוב את המדיום 1 גם צלחת 6-גם של hiPSCs (המעבר במקור מזין כדי מטריקס) ולהחליפו 500 חיץ ניתוק התא μL.
הערה: מאגר תא דיסוציאציה המסחרי משמש כאן (ראה טבלת חומרים) הוא מתאימה יותר לשימוש עם מדיום mTeSR1 לעומת collagenase. - דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 - 7 דקות עד הקצוות של מושבות iPSC להופיע להרים מעט. כפי שהוזכר קודם לכן, זמן הדגירה הוא קו תלוי ומשתנה. לכן, לפקח על דיסוציאציה הסלולר תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את הזמן האופטימלי.
- בזהירות לשאוב למאגר דיסוציאציה ולשטוף 2 פעמים בעדינות עם PBS.
- הוספת 500 μL של בינוני מלא בטמפרטורת החדר mTeSR1 עם 10 ng / mL Y-27632 ROCK מעכב אל הבאר.
- במקום מושבות הבקיע כמו בשלב 2.6, לדחוף את המספר הרצוי של מושבות לתוך התקשורת באמצעות קצה P200 בעדינות triturate את AG 2 פעמים התא ההשעיהainst בפינה אחת של הבאר לשבור המושבות hiPSC לגושים של ~ 50 - 200 מיקרומטר בגודל. לדוגמה, עבור צלחת 12-היטב, לקחת 1 - 2 מושבות להעביר לתוך 1 כל באר חדשה. מעבירים את ההשעיה תא הבאר הישנה לתוך באר הסינגל החדש של צלחת 12-היטב.
- הרוק הצליח בכמה מהיר, גב ו-ושוב, וצד אל צד תנועות להתפשט באופן שווה את התאים, ולתת לשאר צלחת למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור.
- בצע שינויי תקשורת מלאים יומיים עם בינוני מלא mTeSR1. כפי שהוזכר קודם לכן, אין זה הכרחי להוסיף מונעי ROCK Y-27632 לאחר הציפוי הראשוני.
הערה: מושבות iPSC בשימוש משלב 3.7 עשויות להיות cryopreserved בקלות בשלב זה.
4. הכנת לשכת שקופיות Coverslips עבור זריעה של hiPSCs עבור Immunocytochemistry
הערה: הפרוטוקול הבא מנצלת 4-גם שקופיות קאמריות פלסטיק 12 מ"מ זכוכית coverslips עם appropriatכרכי דואר של תקשורת-בארות הרבות לתמוך immunocytochemistry חסכונית. עם זאת, כרכי תקשורת יכולים להיות מוגברים אם השימוש גדל היטב coverslip גדול הוא רצוי.
- יום אחד לפני המפגש hiPSC, להכין שקופיות קאמרית מצופה טרי עם מטריקס כפי שפורט בסעיף 1. הוסף פתרון מטריקס מספיק (~ 300 - 500 μL לכל טוב של שקופית קאמרית 4-היטב) כדי מעיל מלא כל טוב, ללא כל חשש של אידוי. לחלופין, לאחר הצבת 1 לנקות ולחטא היטב coverslip לבאר כל צלחת 24 גם, מעיל עם 500 μL מטריקס וודא coverslip אינו צף על גבי הפתרון.
- ביום המעבר, הוצא את השקופיות קאמרית מצופה / coverslips מ 4 ° C ולאפשר הסתגלות לטמפרטורת החדר 1 ח ב למכסה המנוע בתרבית רקמה.
- לשאוב את המדיום 1 גם צלחת 12-היטב של hiPSCs ולהחליף עם חיץ דיסוציאציה 500 μL.
- לדגור בחדר בטמפהrature עבור ~ 3 - 7 דקות עד הקצוות של מושבות iPSC להופיע להרים מעט.
- בזהירות לשאוב למאגר דיסוציאציה ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום מלא בטמפרטורת חדר mTeSR1 עם 10 ng / mL Y-27632 ROCK מונע אל הבאר.
- באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב קטן שהונח בתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה, ידני לאסוף 1 המושבה / באר חדשה של שקופית קאמרית 4-היטב או 1 coverslip חדש להיות מצופה (בערך 1000 - 1,500 מיקרומטר קוטר) באמצעות קצה P200 pipet ידי דחיפת אותו מעל פני הצלחת לתוך המדיום.
- לשאוב המטריצה משקופית / coverslip לתא החדש, נזהר שלא להפריע את הציפוי.
- בעדינות triturate את ההשעיה תא 2 פעמים נגד בפינה אחת של הבאר לשבור המושבות hiPSC לגושים של ~ 50 - 200 מיקרומטר בגודל. העבר 250 μL של ההשעיה תא מן הישן גם לבאר כל חדש לע / coverslip שקופיות קאמרית 4-היטב.
- תביאו את עוצמת הקול של כל חדש היטב עד 500 μL עם המשך mTeSR1aining 10 ng / mL Y-27632 ROCK מונע.
- הנח את תא שקופיות / coverslips בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר 24 שעות, לבצע שינויי תקשורת מלאים יומיים עם בינוני מלא mTeSR1. שוב כאמור, התוספת של Y-27632 ROCK מונע אין צורך לאחר הציפוי הראשוני.
5. הכנת iPSCs עבור Immunocytochemistry
- לאחר ומחוברות, לשמר את מושבות hiPSC באמצעות קיבוע על ידי הסרת התקשורת מבארות והוספת paraformaldehyde% מחומם מראש זהירות 4 (~ 300 μL / גם של 4-היטב קאמרית שקופיות / coverslip). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
- מחק את paraformaldehyde כראוי פי Biohazard המוסדי והנחיות בטיחות כימיות.
- שוטפים את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד על שייקר הספסל העליון עם PBS.
הערה: תאים בשקופיות קאמרית / ניתן לאחסן coverslips עם PBS מספיק ב 4 ° C ללא הגבלת זמן בשלב זה.לחלופין, הם יכולים לשמש מיד ICC.
6. Immunostaining של hiPSCs עם סמנים pluripotency
הערה: immunostain hiPSCs עם נוגדני pluripotency סטנדרטיים. כדוגמא, כאן תאים פעמים מוכתמים נוגדני מיקוד משטח אחד 1 ו -1 אנטיגן תאי באופן סדרתי כדלקמן: Antigen-4 העוברי אנטי-שלב-סגולי (SSEA4) עם אנטי-Octamer מחייב חלבון 4 (OCT- 4) ואנטי-Tra-1-60 עם 2 גני BOX HMG הקשורים אנטי sry (Sox2) (עיין בטבלת חומרים לפרטי נוגדנים).
- לשאוב PBS המבארת ומוסיף 500 μL / גם פתרון חסימה ללא Triton-X-100. דגירה של 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- הכן ריכוז קבוע מראש (כאן, השתמש 1: 200) של נוגדנים השטח, או SSEA4 או Tra-1-60, על ידי דילול בחסימת פתרון ללא טריטון X-100.
- עבור שקופיות קאמריות, להכין 300 μL / טוב של שקופית קאמרית 4-היטבעל ידי ערבוב 298.5 μL של פתרון חסימת לעיל 1.5 μL של נוגדן ראשוני נגד SSEA4 או Tra-1-60.
- עבור coverslips, להכין 40 μL / coverslip ידי ערבוב 199 μL של פתרון חסימת 1 μL של SSEA4 אנטי או נוגדן ראשוני Tra-1-60.
- לשאוב את הפתרון החוסם משקופית הקאמרית לוותר הנוגדן הראשוני לתוך בארות מתאימות. עבור coverslips, במקום חתיכת parafilm בתקיפות בתוך צלחת פטרי לוותר 40 μL של הנוגדן הראשוני על גבי כמו טיפה. באמצעות מחט מלקחי מזרק כפוף, בזהירות להרים את coverslip מתוך ההתרבות היטב ומניח אותו בצד תא כלפי מטה על הירידה של נוגדן על parafilm. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- למחרת בבוקר, לשטוף את התאים 3 פעמים, 5 - 10 דקות כל אחד, על ידי הסרת נוגדן משקופית הקאמרית והוספה ב PBS. עבור coverslips, להרים כל אחד את parafilm ולמקם אותו בחזרה בתוך באר של עד 24 גם צלחת, תא בצד. בזהירות להוסיף PBS.
- כן נוגדנים משני מתאימים ב 1: 500 הפתרון החוסם.
- עבור שקופיות קאמרית, להכין 300 μL / טוב של שקופית קאמרית 4-היטב על ידי ערבוב 499 μL של פתרון חסימה 1 μL של עז אנטי עכבר IgG3 אלקסה פלואוריד 488 (עבור SSEA4) או 1 μL של עיזים אנטי עכבר IgM אלקסה פלואוריד 488 (עבור Tra-1-60).
- עבור coverslips, להכין 40 μL / coverslip ידי ערבוב 499 μL של פתרון חסימת 1 μL של עז אנטי עכבר IgG3 אלקסה פלואוריד 488 (עבור SSEA4) או 1 μL של עיזים אנטי עכבר IgM אלקסה פלואוריד 488 (עבור Tra-1-60 ).
- לשאוב PBS משקופית הקאמרית לוותר על הנוגדנים משני לתוך בארות מתאימות. עבור coverslips, לאחר שלב 6.2, להפוך את coverslips על הפתרון נוגדן דגש על parafilm בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
הערה: אם ניאון באמצעות מתויג נוגדנים משני, התאים חייבים להיות מוגנים מפני אור. מניח את השקופיות הקאמריות ואת coverslips בתוך env כההironment במהלך incubations ושוטף. - שוטף את התאים 3 פעמים במשך 5 - 10 דקות כל אחד על ידי הסרת נוגדן משקופית הקאמרית והוספה ב PBS. עבור coverslips, להרים כל אחד בקפידה מתוך parafilm ומכניסים בטוב של עד 24 גם צלחת, תא בצד. בעדינות להוסיף PBS במהלך שוטף.
- לפני חותר אל אנטיגן השני, תאיים אוק-4 או Sox2 במקרה זה, דגירה שוב בחסימת פתרון עשה עם מגיב permeabilization (Triton-X-100) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- כדי immunostain עבור אוקטובר-4 או Sox2, פעל לפי המתודולוגיה המתוארת שלבים 6.1-6.6 להחלת נוגדנים ראשוניים ומשניים. למטרות פרוטוקול זה, השתמש אוק-4 ו Sox2 בריכוז של 1: 200 והעז נוגדנים משני ארנבת אנטי IgG Alexa פלואוריד 594 ב 1: 500.
- לאחר טיפולים נוגדנים ראשוניים ומשניים הנ"ל, לשטוף את התאים 3 פעמים במשך 5 - 10 דקות כל אחד עם PBS ו counterstain עם 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים אם הוא רצוי להדמיה גרעינית.
הכנת 7. לצפייה
- עבור שקופיות קאמריות, להסיר את החדר העליון בזהירות משקופית, בעקבות הוראות היצרן. לאחר מכן, לשטוף במים מזוקקים, ולהוסיף הרכבה בינונית וכן coverglass לאפשר מיקרוסקופיה.
- עבור coverslips, להפוך את coverslips על ירידה של הרכבה להציב בינוני בשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
- תמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי או confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מספק תיאור צעד חכם של איך iPSCs אדם ניתן להעביר שכבת מזין מזין ללא תנאים, ולאחר מכן מופץ באופן מוגבל כדי לאפשר במיוחד immunocytochemistry החסכונית לצורך וידוא תחזוקת pluripotency. איור 1 מציג ייצוג סכמטי של פרוטוקול זה. איור 2 א מראה מושבות hiPSC גוברת על iMEFs 6 צלחות היטב. מושבות אלה מפגינים מורפולוגיה טיפוסית בעלת גבולות מוגדרים ומרכזיים בהירים בשלב צפוף. כפי שניתן לראות בתרשים 2B, לאחר העברת iPSCs לתנאים מזינות חופשיים 12 גם צלחות, מורפולוגיה מושבה נראית קצת כאוטית עם פחות קצוות ברורים. כמו כן, כמה iMEFs עשוי להישאר בתרבות בשלב זה. איור 2C מראה כי לאחר מעבר נוסף במערכת המזין ללא, מושבות iPSC להציג מורפולוגיה בשכבה קלסית עם גרעין גבוה לסייחס toplasm. בשלב זה, הוא ראה כי iMEFs בוטל כמעט המתרבות.
מושבות גדלו בתנאים ללא מזין נקטפים מכאניים מצופות על שקופיות או coverslips זכוכית תא רב גם קטן, ומששו עבור אנטיגנים pluripotency ספציפיים באמצעות immunocytochemistry. איור 3 מראה מושבות נציג כי הם immunopositive עבור SSEA4 או Tra-1-60 (3B, 3F, אנטיגנים pluripotency השטח) ואוקטובר-4 או Sox2 (3, 3E, אנטיגנים pluripotency תאיים).
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. סכימה כוללת של השיטה המתוארת נהג מעבר iPSCs אדם מן ניזונים iMEF מזין ללא תרבות ולאחר חיטוט של תאים עם סמני pluripotency. iMEF: irradia טד עכבר עוברי פיברובלסטים; iPSC: מושרת תאי גזע פלוריפוטנטיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. נציג תמונות של המושבות iPSC מעבר ממנוע מזיני iMEF מזין ללא תנאי התרבות. א) מושבה הצפופה iPSC (חץ לבן) גדלה על תאי מזין iMEF (חץ שחור). B) חלפו הראשוני על צלחת 12 גם מצופה מטריצה במדיום סרום ללא, כמה iMEFs עדיין עשוי להיות שנצפה בתרבות (חץ שחור). C) מורפולוגיה אופיינית של בשכבת מושבת iPSC גדלה ללא מזין. אין iMEFs להישאר בתרבות בשלב זה. בר סולם (AC) = 100 מיקרומטר. > אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אפיון Immunocytochemical של האדם iPSCs מצופה קטנים ובכן צלחות. תמונות immunofluorescence נציג iPSCs, שהושג באמצעות מיקרוסקופ confocal, מראה את הביטוי החיובי של סמנים pluripotency א) אוק-4 (אדום) ו- B) SSEA4 (ירוק) עם ג) DAPI גרעיני כתם (כחול), ו- E) Sox2 ( אדום) ו- F) Tra-1-60 (ירוק) עם G) DAPI (כחול). D ו- H להראות תמונות כיסוי הנוגעים AC ו EG. סרגל קנה מידה (AH) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מדיה hiPSC לתחזוקה על האכלה | ||
| רְכִיב | ריכוז מניות | ריכוז סופי |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| החלפת סרום נוק | 100% | 20% |
| L-Glutamine | 200 מ"מ | 1 מ"מ |
| MEM-NEAA | 10 מ"מ | 0.1 מ"מ |
| 2-mercaptoethanol | 55 מ"מ | 0.1 מ"מ |
| FGF-יסוד אנושי רקומביננטי | 10 מיקרוגרם / מ"ל | 10 ng / mL |
| Y-27632 ROCK מונע | 10 מיקרומטר | |
| ציפוי Matrigel עבור תרבויות מזין-חינם | ||
| רְכִיב | ||
| מטריקס Matrigel hESC מוסמך | דילול פקטור 269 μL | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 מ"ל | |
| הערה: גורם לדילול הוא הרבה תלוי וצריך הוברר מן תעודת ניתוח | ||
| mTeSR1 מדיה מלאה עבור תרבויות מזין-חינם | ||
| רְכִיב | כמות | |
| mTeSR1 בסל בינוני | 400 מ"ל | |
| מוסף 5x mTeSR1 | 100 מ"ל | |
| הערה: לאחר מעורב, מדיה מלאה mTeSR1 ניתן קפוא aliquots והשתמשה עד תאריך תפוגת רכיב | ||
| הערה: התקשורת להשלים mTeSR1 חייב להיות מחומם בטמפרטורת החדר בלבד. אל תניחו באמבט מים | ||
טבלה 1: iPSC תרבות מדיה מתכוני ציפוי פלייט.
| מקבע paraformaldehyde 4% | |
| רְכִיב | כמות |
| 0.1 M PO 4 חוצץ | 2 L |
| Paraformaldehyde, prill | 80 גרם |
| פתרון חסימת ICC ללא Triton-X-100 | |
| רְכִיב | כמות |
| 1x בופר פוספט | 49 מ"ל |
| סרום עיזים רגיל | 1 מ"ל |
| שור סרום אלבומין | 0.5 גרם |
| פתרון חסימת ICC עם טריטון-X-100 | |
| רְכִיב | כמות |
| 1x בופר פוספט | 49 מ"ל |
| סרום עיזים רגיל | 1 מ"ל |
| שור סרום אלבומין | 0.5 גרם |
| Triton-X-100 | 200 μL |
טבלה 2: מקבע Immunocytochemistry מתכונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול השיטתי שהוצג כאן מציע timesaving ושיטה חסכונית, בצורת טכניקת תרבות מוקטנת, שתוכנן במיוחד כדי לתמוך ניתוח pluripotency יעיל באמצעות immunocytochemistry.
היתרונות העיקריים של המתודולוגיה שתוארה הם כדלקמן. באופן מסורתי יותר 3 עד 4 קטעים נדרשים לעבור iPSCs משכבות מזין מזין ללא תנאי התרבות כדי לחסל iMEFs שיורי שנותר לאחר השימוש בטכניקות דיסוציאציה בתפזורת עבור מורפולוגיה בשכבה טיפוסית להופיע 12, 13. לעומת זאת, השיטה המוצגת כאן כרוך ציר זמן מתקצר, המאפשר העברה המהירה יחסית של iPSCs לתנאי סרום ללא דרך לקטיף הידני של מושבות iPSC. IPSCs גדל בכמויות מוגבלות בשקופיות קאמריות קטנות או coverslips תורמת immunocytochemistry. למעשה, voluלי של מדיום תרבות צורך לכל טוב הוא רק 0.5 מ"ל והיקף פתרון נוגדן מדולל הנדרשים coverslip יחיד הוא כמו הנומינלי החל 40 μL או 300 μL לכל תא היטב, בעת שימוש בפרוטוקול זה.
אנו מוצאים כי התוספת של חלקים שווים iMEF מותנה תקשורת אל mTeSR1 במהלך המעבר הראשוני (שלב 2.5) היא צעד חשוב המסייע להישרדות והתחזוקה של המורפולוגיה פלוריפוטנטיים של iPSC. בנוסף, אם הדבקות סלולרית אינה אופטימלית לאחר passaging (שלבי 2.2, 3.3 ו -4.3), פתרון בעיות יכולות להתבצע עוד יותר על ידי אופטימיזציה של הפעמים דיסוציאציה בשימוש.
לבסוף, מגבלה של השיטה בקנה מידה קטן הציג, כאשר לעומת טכניקות אחרות כגון cytometry זרימה משמש גם כדי לוודא pluripotency, היא שזה לא לאפשר את התפשטות המשך התאים ניתח עבור יישומים במורד הזרם. התועלת של השיטה שלנו נובעת העיצוב הספציפי שלה תומך cost-יעיל ותרבות היעילה של hiPSCs לצורך וידוא pluripotency באמצעות immunocytochemistry השגרתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
