Introduction
重新编程人成年体细胞到诱导多能干细胞（iPS细胞）提供了一种方法，以获得患者特异性的细胞的潜在无限供给到研究疾病1,2。扼要体外的疾病表型将使得可信检验与疾病相关的细胞和分子机制，增强药物发现和个性化药物3。此外，人iPS细胞（iPS细胞）提供导出其可以用作唯一的资源来替换死亡或功能失调的细胞，并在几个障碍4的范围内，恢复功能的特定细胞类型的可能性。
以使用上述应用程序的iPSC的重要前提是，确保在培养膨胀过程中他们的多能性和分化状态被维持。通常情况下，techniq的UE，如流式细胞术，Western印迹，聚合酶链反应和功能分析，这需要大量的细胞和专用设备，用于IPSC的多能性6，7，8，9，10的详细的分析。然而，iPS细胞“未分化状态的常规评估可能有效地通过这些细胞的有限传播专门为免疫细胞化学（ICC）来实现，因此，涉及减少时间和资源。
最新进展允许的iPSC的所限定的无血清条件下生长的，它是在需要的鼠成纤维细胞饲养层和含血清介质常规培养系统一个显著改善。然而，目前的文献不包括描述如何尽快过渡馈线iPSCs的逐步明确协议层到无饲养系统。
在此背景下，本协议系统详细说明了如何生长在辐照的小鼠胚胎成纤维细胞人iPS细胞（IMEF）饲养层可以是（1），适于在无血清培养基中传播，和（2）在小规模培养的特别支持稳健免疫细胞化学分析。总体而言，这种方法代表了用于传播在无血清条件人类iPS细胞用于确认使用免疫细胞化学在常规基础上它们的多能及时和成本有效的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
人iPS细胞是从从4毫米皮肤钻取活组织检查分离并通过仙台病毒介导的重编程11在内部重新编程的人真皮成纤维细胞衍生的。亚利桑那州的机构审查委员会的批准大学为对象招募和活检集合中的所有程序。
1. IPSC的文化细胞外基质表面涂层的制备
- hiPSC文化上的iMEFs日益合流前一天，准备外基质（基质胶）涂层板。
- 缓慢解冻的细胞外基质的等分试样（批号相关的，按照该规格表的说明）在冰上在4℃2小时。
- 在生物安全罩，使用冷枪头（储存在-20℃），加入1等份的细胞外基质的冷Dulbecco氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM / F12 / HEPES）根据许多特定稀释因子。
- 免除〜60081;每每个新的细胞培养物井外基质L的处理的12孔板需要的。
- 在室温下孵育该板进行几个小时。在这里，用3小时的培养时间。
注：将板可以立即使用或储存于4℃多达两个星期。
2.将iPS细胞对IMEF饲养细胞生长到细胞外基质的传播
- 关于传代当天，除去从4℃的矩阵涂板，并允许所述板到适应室温在组织培养罩1小时。
- 吸从1井hiPSC培养物的6孔板上的iMEFs生长培养基并用500μL的胶原酶分解试剂代替（1毫克/毫升在基础培养基）。
- 在37℃，10〜 - 30分钟，直到的iPSC菌落边缘出现小幅提升。
注：孵化时间是线依赖性和将变化。显示器在显微镜下分离。 - 汽车efully吸出解离试剂和用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）中洗轻轻2次。
- 添加1毫升室温mTeSR1完全培养基与10毫微克/毫升Rho相关的蛋白激酶抑制剂（Y-27632 ROCK抑制剂）到孔中。
注：此初始通路期间使用IMEF空调介质和mTeSR1的50:50混合物，建议并且可以是用于人iPS细胞的这种媒体转换期间的存活益处。 - 使用部分放置在罩内的小相差显微镜，手动得分并挑选1 - 2 hiPSC菌落（〜700 - 1000微米直径）使用注射器和针（25克，1.5英寸）。蹬殖民地的得分件与P200的枪头的媒介。
- 吸并从新盘基体处置，小心不要去打扰涂层。
- 转移1ml得自老井含有得分的iPSC成涂好新的矩阵的细胞悬浮液。
- 解放军在37℃CE在孵化器的板，5％ 的 CO 2。岩石在几个快，背部的往复板和侧到另一侧的运动，以均匀地分布的细胞。请勿打扰板24小时。
- 执行与mTeSR1完全培养基（除了Y-27632 ROCK抑制剂不需要在步骤2.5初始电镀后），每日完整的媒体的变化。
矩阵涂层钢板iPS细胞3.小型传代
注意：一般来说，人iPS细胞的初始传送到矩阵包被的板后，细胞应再次以类似的方式传代，以确保所有的iMEFs已被淘汰和细胞已适于馈线 - 自由的条件。
- iPSC的汇合前一天准备新涂矩阵板在第1节的讨论。
- 上通道的当天，除去从4℃孵育基质涂层板，并允许所述板到适应室温1小时在组织尽头TURE罩。
- 从吸1井iPS细胞的6孔板（最初是从进纸器矩阵转换）的媒介和500μL细胞分离缓冲液进行更换。
注：此处使用的商业细胞解离缓冲液（见材料表）更适合用相比胶原酶mTeSR1介质使用。 - 在室温下孵育3 - 7分钟，直到的iPSC集落的边缘出现稍微抬起。如前所述，培养时间是线依赖性和可变的。因此，监视在显微镜下的细胞解离，以确定的最佳时间。
- 小心吸出解离缓冲液，并用PBS轻轻洗2次。
- 添加500μL室温mTeSR1完全培养基用10ng / mL的Y-27632 ROCK抑制剂到孔中。
- 代替如步骤2.6的得分菌落，用P200尖端推菌落所需数量到媒体并轻轻磨碎细胞悬液的2倍股份ainst井的一个角落，打破hiPSC殖民地变成〜50团块 - 尺寸200微米。例如，对于一个12孔板接送1 - 2菌落转移到每个1新井。传送从老的细胞悬浮液以及成12孔板的单个新井。
- 摇动平板在几个快，背部的往复，并且边对边动作来均匀地分布所述细胞，并让24小时的板其余在37℃，5％CO 2培养箱。
- 执行与mTeSR1完全培养基每日完整的媒体的变化。如前面提到的，这是没有必要的初始镀覆后添加Y-27632 ROCK抑制剂。
注：来自步骤3.7未使用的iPSC集落可以是在这一点上容易冻存。
4.制备室载玻片和盖玻片为iPS细胞的免疫细胞化学播种
注：以下协议采用4孔塑料玻片，用都是适宜12毫米盖玻片在多井的培养基E卷来支持经济有效的免疫。但是，如果使用较大的井和盖玻片大小的期望能够提高介质的卷。
- 一天前hiPSC汇合，准备室玻片新涂与细胞外基质的第1节中讨论补充足够的基质溶液（〜300 - 每4井室幻灯片以及500微升），充分大衣每良好，没有任何忧虑蒸发。可替代地，将1清洁和灭菌盖玻片到24孔板的每个孔中，涂层用500微升的细胞外基质，并确保盖玻片不漂浮在溶液的顶部之后。
- 上通道的一天，从4℃除去涂覆室载玻片/盖玻片并允许驯化至室温在组织培养罩1小时。
- 从1井人iPS细胞的12孔板的吸出培养基并用500μL的解离缓冲液替换。
- 孵育在室温坦佩叉涂抹了〜3 - 7分钟，直到的iPSC菌落边缘出现小幅提升。
- 小心吸出解离缓冲液，并用10纳克/毫升Y-27632 ROCK抑制剂添加室温mTeSR1完全培养基的1毫升到孔中。
- 使用放置在组织培养罩内的小相差显微镜，手动选择一个4孔腔式载玻片或1新盖玻片1集落/新井待镀（〜1000 - 1500微米的直径），使用P200的吸管尖通过推它从板表面到培养基中。
- 从新室幻灯片/盖玻片吸矩阵，小心不要去打扰涂层。
- 针对很好地打破了hiPSC殖民地的一个角落2次轻轻磨碎细胞悬液成〜50团块 - 尺寸200微米。转移的细胞悬液250μL的从旧井到4孔腔式载玻片/盖玻片的每个新井。
- 带来每一个新的容量以及高达500μL与mTeSR1续癌宁10毫微克/毫升Y-27632 ROCK抑制剂。
- 放置在孵化室滑动/盖玻片，在37℃，5％ 的 CO 2。
- 24小时之后，用mTeSR1完全培养基每日完整的媒体的变化。再次如前面提到的，添加Y-27632 ROCK抑制剂的初始镀覆后是没有必要的。
5.准备为iPS细胞的免疫细胞化学
- 一旦汇合，通过从孔中除去培养基并加入预热小心 4％低聚甲醛保留通过固定的hiPSC菌落（〜300微升/孔的4孔腔式载玻片/盖玻片）。在室温下孵育20分钟。
- 适当地根据机构生物危害和化学安全指引弃多聚甲醛。
- 洗涤细胞3次，每次5分钟，在用PBS台式摇床。
注：在腔室玻片细胞/盖玻片可以在4℃无限期在这个阶段存储有充足的PBS。可替代地，它们可以立即用于IC卡。
6.免疫染色用多能标记iPS细胞的
注意：免疫显iPS细胞具有多能性标准的抗体。作为一个例子，在这里细胞是双染色的抗体针对一种1表面和以顺序方式1的细胞内抗原如下：抗阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA4）用抗八聚体结合蛋白4（OCT- 4）和抗TRA-1-60具有抗SRY相关HMG盒基因2（SOX2）（请参阅抗体细节材料表）。
- 从孔中吸出PBS并在500微升/孔封闭溶液添加不含Triton-X-100。孵育在室温下1小时。
- 准备预先确定的浓度（这里，用1：200）的表面的抗体，无论是SSEA4或TRA-1-60，通过在封闭液不含Triton X-100的稀释。
- 对于玻片，准备了4孔腔式滑动300微升/孔通过混合封闭液上方和抗SSEA4或TRA-1-60一抗的1.5微升的298.5微升。
- 为盖玻片，通过混合封闭液和抗SSEA4或TRA-1-60一抗的1微升199微升制备40微升/盖玻片。
- 吸从玻片封闭液和分配的主要抗体为适当的井。对盖玻片将一块封口膜牢牢培养皿内并分配在上面作为一个液滴的主抗体的40微升。使用弯曲的注射器针头和镊子小心抬起盖玻片出培养的井，并放置电池侧向下到抗体上的封口膜的压降。在4℃孵育过夜。
- 第二天早上，洗细胞3次，5 - 每10分钟，通过从腔室滑动除去抗体并在PBS中加入。对于盖玻片，抬起一次性封口膜，并把它早在24孔板，细胞面朝上的好。小心加入PBS。
- 在封闭液500：1，准备适当的二级抗体。
- 对于腔室玻片，准备300μL/孔的4孔室载玻片通过混合499微升封闭液和1微升的山羊抗小鼠IgG3的的Alexa Fluor 488（为SSEA4）或1微升的山羊抗小鼠IgM的Alexa Fluor 488（用于TRA-1-60）。
- 为盖玻片，通过混合封闭液499微升制备40微升/盖玻片和1微升的山羊抗小鼠IgG3的的Alexa Fluor 488（为SSEA4）或1山羊μL的抗小鼠IgM的Alexa Fluor 488（为TRA-1-60 ）。
- 从室滑动吸出PBS中并分配所述第二抗体为适当的孔中。为盖玻片，下列步骤6.2，翻转的盖玻片上，在室温下放置在封口膜2小时抗体溶液。
注意：如果使用荧光标记的二级抗体，该细胞必须避光保存。放置玻片和盖玻片在黑暗的ENV孵育和洗涤过程中ironment。 - 洗涤细胞3次，每次5 - 10分钟各由从腔室滑动除去抗体并在PBS中加入。为盖玻片，从封口膜小心地每一个和放回一个24孔板，电池侧上的孔中。轻轻洗涤过程中添加PBS。
- 之前探测第二抗原，细胞内的OCT-4或在此情况下SOX2，在阻断用透试剂（的Triton-X-100）在室温下1小时制成溶液再次孵育。
- 免疫染色为OCT-4或SOX2，只要按照在步骤6.1-6.6用于施加第一和第二抗体描述的方法。对于此协议的目的，使用OCT-4和SOX2以1:1的浓度：200和二级抗体的山羊抗兔IgG的Alexa Fluor 594以1：500。
- 上述主要和次要抗体治疗后，洗细胞3次，每次5 - 10分钟各用PBS并用4染液'，6'-二脒基-2--phenylindole，二盐酸盐（DAPI）如果核可视化需要按照标准协议。
7.准备查看
- 对于腔室玻片，小心地从滑动除去上室，按照制造商的说明进行操作。然后，漂洗在蒸馏水中，添加封固剂和盖玻片启用显微镜。
- 为盖玻片，反转上的安装件中置于玻璃显微镜载玻片一滴盖玻片。
- 标准或共聚焦荧光显微镜下的图像。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这个协议提供的iPSCs的人类如何可以从饲养层转移至无饲养条件下，并随后传播以有限的方式来具体实现，用于确认多能性维持成本效益的免疫细胞化学的逐步描述。 图1显示了该协议的示意图。 图2A示出hiPSC菌落在6孔板的iMEFs生长。这些殖民地表现出有确定的边界和密相明亮的中心典型形态。 如图2B所示，在12孔板的iPSC移交后馈线-自由的条件下，菌落形态出现较少鲜明边缘有些混乱。此外，某些的iMEFs可在此阶段保持在培养。 图2C显示，在无饲养系统的附加通道之后，的iPSC集落显示具有高核经典单层的形态，以CYtoplasm比例。在这个阶段，可以看出，的iMEFs已经实际上从培养消除。
菌落无饲养条件下生长的机械采摘并镀上小多井室幻灯片或盖玻片，并探讨通过特定的免疫抗原的多能性。 图3显示了代表殖民地，它们免疫阳性SSEA4或TRA-1-60（3B，3F，表面抗原多能性）和Oct-4或Sox2的（3 A，3E，细胞内多能性抗原 ）。
图1：协议的示意图。用于转换从IMEF馈线人类iPS细胞所描述的方法的总体架构馈线 - 自由培养和随后的与多潜能标志物的细胞的探测。 IMEF：irradia特德小鼠胚胎成纤维细胞; IPSC的：诱导多能干细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. IPSC的殖民地从IMEF馈线过渡到无饲养层培养条件的代表图像。 A）密集IPSC的殖民地（白色箭头）生长在IMEF饲养细胞（黑色箭头）。 B）上，以无血清培养基中涂覆基质12孔板的初始传代后，少数的iMEFs仍然可以在培养物（黑色箭头观察到的）。 C）单层的典型形态的iPSC菌落生长无饲养。没有的iMEFs在这个阶段保持在培养。刻度条（交流）= 100微米。>点击此处查看该图的放大版本。
图3.人类iPS细胞的镀免疫细胞化学特性在小井板。 iPS细胞的代表性免疫荧光图像，通过共聚焦显微镜获得的，显示出多能标记A）的Oct-4（红色）和B）SSEA4（绿色）与C）的核染色DAPI（蓝色）的阳性表达，E）Sox2的（红色）和F）TRA-1-60（绿色）以G）DAPI（蓝色）。 D和H示出与交流和EG的叠加图像。比例尺（AH）= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
| hiPSC媒体上料机维修 | ||
| 零件 | 股权集中度 | 终浓度 |
| DMEM-F12 / HEPES | 100％ | 80％ |
| 淘汰赛血清替代品 | 100％ | 20％ |
| L-谷氨酰胺 | 200毫米 | 1毫米 |
| MEM-NEAA | 10毫 | 0.1毫米 |
| 2-巯基乙醇 | 55毫米 | 0.1毫米 |
| 重组人FGF-基本 | 10微克/毫升 | 10毫微克/毫升 |
| Y-27632 ROCK抑制剂 | 10μM | |
| 基质胶涂层馈线自由的文化 | ||
| 零件 | ||
| 人类胚胎干细胞基底膜合格矩阵 | 稀释因子269微升 | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25毫升 | |
| 注：稀释因子很多相关的，必须从分析的证明书确定 | ||
| 对于无饲养文化mTeSR1完整的媒体 | ||
| 零件 | 量 | |
| mTeSR1基础培养基 | 400毫升 | |
| mTeSR1补充5倍 | 100毫升 | |
| 注意：一旦混合，mTeSR1完整的媒体可能等分被冻结，并一直使用到组件失效日期 | ||
| 注意：mTeSR1完全培养基必须在只室温下温热。不要在水浴中放置 | ||
表1：IPSC 的文化传媒配方和涂料板。
| 4％多聚甲醛固定液 | |
| 零件 | 量 |
| 0.1M的PO 4缓冲 | 2升 |
| 多聚甲醛，颗粒状 | 80克 |
| 不含Triton-X-100的IC卡封闭液 | |
| 零件 | 量 |
| 1X磷酸盐缓冲液 | 49毫升 |
| 正常山羊血清 | 1毫升 |
| 牛血清白蛋白 | 0.5克 |
| 用Triton-X-100的IC卡封闭液 | |
| 零件 | 量 |
| 1X磷酸盐缓冲液 | 49毫升 |
| 正常山羊血清 | 1毫升 |
| 牛血清白蛋白 | 0.5克 |
| 的Triton-X-100的 | 200μL |
表2： 固色剂和免疫细胞化学配方。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里介绍的系统协议提供了一个节省时间和成本效益的方法，在一个按比例缩小的培养技术的形式，专门通过免疫组化来支持有效的多能性的分析。
是所描述的方法的主要优点如下。需要传统上超过3至4个通道，以过渡从饲养层的iPSC馈线-自由培养条件，以消除使用散装解离技术后剩余的残余的iMEFs和典型单层形态出现12,13。与此相反，这里提出的方法涉及一个缩短的时间表，其允许的iPSC的通过的iPSC集落的手工采摘的相对快速传递至无血清条件。该iPS细胞生长在小玻片或盖玻片利于免疫细胞数量有限。事实上，VOLU我每孔所需培养基仅仅是0.5 mL和用于单个盖玻片需要稀释的抗体溶液的体积是作为标称为40微升或每室300微升很好，使用这种协议时。
我们发现，加入等份IMEF初始通道中的条件培养基的mTeSR1（步骤2.5）的是一个重要的步骤，在生存和的iPSC的多能形态学的维持助剂。另外，如果细胞粘附是不传代后最佳（步骤2.2，3.3和4.3），故障排除，可通过进一步优化所使用的解离时间进行。
最后，所提出的小规模的方法的限制，相对于其他技术，如流式细胞仪时也用于验证多能性是，它不允许分析细胞用于下游应用的继续传播。我们的方法的有用性来自于支持余弦其具体设计T-有效和iPS细胞通过常规免疫细胞多能性确认有效的文化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
