Introduction
Herprogrammeren van menselijke volwassen somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) biedt een manier om een potentieel onbeperkt aanbod van patiënt-specifieke cellen te krijgen om te studeren en vaatziekten 1, 2. Recapitulerend een ziekte fenotype in vitro zou het aannemelijk cellulaire en moleculaire mechanismen van ziekte en versterken en geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde 3. Bovendien humane iPSCs (hiPSCs) bieden de mogelijkheid het afleiden specifieke celtypen die als unieke bron kan worden gebruikt om dode cellen te vervangen of disfunctioneel en herstelfunctie in de context van diverse aandoeningen 4, 5.
Een belangrijke voorwaarde voor het gebruik van iPSCs in de bovengenoemde toepassingen is ervoor te zorgen dat hun pluripotente en ongedifferentieerde staat tijdens de expansie in de cultuur in stand wordt gehouden. Typisch, techniqUES zoals flowcytometrie, Western blotting, polymerasekettingreactie en functionele testen die grote hoeveelheden cellen en gespecialiseerde apparatuur nodig, worden gebruikt voor een gedetailleerde analyse van iPSC pluripotentie 6, 7, 8, 9, 10. Echter, routine evaluatie van ongedifferentieerde staat de iPSCs 'kan effectief worden bereikt door de beperkte verspreiding van deze cellen specifiek voor immunocytochemie (ICC), dus met betrekking tot verminderde tijd en middelen.
Recente ontwikkelingen zorgen voor de groei van iPSCs in gedefinieerde serumvrije omstandigheden, hetgeen een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele kweeksystemen die murine fibroblast feeder lagen en serum bevattende media vereisen. Echter, de huidige literatuur niet bevatten duidelijke stapsgewijze protocollen die beschrijven hoe iPSCs van feeder overganglaag op voedingsvrije systemen.
In dit verband systematisch beschrijft de onderhavige protocol hoe hiPSCs gekweekt op bestraalde muis embryonale fibroblasten (iMEF) feeder lagen kan (1) ingericht voor het propageren in serumvrij medium, en (2) gekweekt op kleine schaal specifiek ondersteunen robuuste immunocytochemische analyse. Kortom, dit methode is een tijdige en kosteneffectieve procedure voor het vermeerderen van menselijke iPSCs in serum-vrije omstandigheden ter bevestiging van hun pluripotentie op een routine-basis met behulp van immunocytochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs werden afgeleid uit menselijke huidfibroblasten geïsoleerd van 4 mm huid punch biopsieën en opnieuw geprogrammeerd in huis via Sendai-virus bemiddelde herprogrammering 11. De universiteit van Arizona Institutional Review Board goedgekeurd alle procedures voor de werving van deelnemers en biopsie collectie.
1. Voorbereiding van de extracellulaire matrix gecoate oppervlak voor iPSC Cultuur
- Op een dag voorafgaand aan de samenvloeiing van iPSC culturen groeien op iMEFs, bereiden extracellulaire matrix (Matrigel) beklede platen.
- Langzame dooi een hoeveelheid van de extracellulaire matrix (lot afhankelijk is de instructies in de beschrijving) op ijs in 4 ° C gedurende 2 uur.
- In een bio kap, met koud pipetpunten (bewaard bij -20 ° C), voeg 1 portie van extracellulaire matrix koude Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12 / HEPES) volgens de partijspecifieke verdunningsfactor .
- Verdeel ~ 60081, L extracellulaire matrix per putje van elke nieuwe celcultuur behandeld 12-well plaat nodig.
- Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende verscheidene uren. Hier, gebruik dan een 3 uur incubatietijd.
OPMERKING: Platen kunnen direct worden gebruikt of voor maximaal twee weken opgeslagen bij 4 ° C.
2. Overdracht van hiPSCs Grown op iMEF Feeder cellen op extracellulaire matrix voor de voortplanting
- Op de dag van passage, verwijder de matrix beklede plaat bij 4 ° C en laat de verdichter acclimatiseren tot kamertemperatuur gedurende 1 uur in de weefselkweek kap.
- Zuig het medium van 1 putje van een 6-well plaat van iPSC cultuur groeien op iMEFs en te vervangen door 500 ul collagenase dissociatie reagens (1 mg / ml in de basale kweekmedium).
- Incubeer bij 37 ° C gedurende ~ 10 - 30 minuten tot de randen van de iPSC kolonies lijken iets omhoog.
LET OP: Incubatietijd is lijn afhankelijk en zal variëren. Monitor dissociatie onder een microscoop. - Autoefully zuig het dissociatie reagens en was voorzichtig 2 maal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4).
- Voeg 1 ml kamertemperatuur mTeSR1 compleet medium met 10 ng / ml Rho-geassocieerde proteïne kinase inhibitor (Y-27632 ROCK inhibitor) aan de put.
LET OP: Het gebruik van een 50:50 mengsel van iMEF-geconditioneerd medium en mTeSR1 tijdens deze eerste passage wordt voorgesteld en kan nuttig zijn voor het voortbestaan van de hiPSCs tijdens deze media overgang. - Met behulp van een kleine fasecontrastmicroscoop gedeeltelijk aan de binnenkant van de kap, met de hand scoren en pick 1-2 iPSC kolonies (~ 700 - 1000 micrometer in diameter) met behulp van een injectiespuit en naald (25 G, 1½ in). Duwen de scoorden stukken van de kolonie in het medium met een P200 pipet tip.
- Aspireren en afvoeren van de matrix van de nieuwe plaat, zorg dat u de coating niet te verstoren.
- Breng 1 ml van de celsuspensie uit de oude putje met de ingesneden iPSCs in de nieuwe matrix goed bedekt.
- Place de plaat in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2. Rock de plaat in een aantal snelle, heen-en-weer, en side-to-side bewegingen gelijkmatig verspreid de cellen. Raak de plaat niet storen gedurende 24 uur.
- Voer dagelijkse full media verandert met mTeSR1 compleet medium (toevoeging van Y-27632 ROCK Inhibitor is niet nodig na de eerste plating in stap 2.5).
3. Kleinschalig Passage van hiPSCs on-matrix gecoate platen
OPMERKING: algemeen, na de eerste overdracht van de hiPSCs op beklede platen matrix, de cellen worden opnieuw aan passage op dezelfde wijze te waarborgen dat alle iMEFs zijn geëlimineerd en cellen aangepast feeder-vrije omstandigheden.
- Eén dag voor iPSC samenvloeiing bereiden vers beklede matrix platen zoals besproken in paragraaf 1.
- Op de dag van de passage, verwijder de matrix gecoate plaat uit 4 ° C incubatie en laat de plaat te acclimatiseren op kamertemperatuur gedurende 1 uur in het weefsel cultuur capuchon.
- Zuig het medium van 1 putje van een 6-wells plaat van hiPSCs (oorspronkelijk overgegaan van feeder naar matrix) en vervang met 500 ul cel dissociatie buffer.
OPMERKING: De commerciële celdissociatiebuffer hier gebruikt (zie Materialen Table) is geschikt voor mTeSR1 medium vergeleken met collagenase. - Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-7 min tot de randen van de iPSC kolonies lijken iets omhoog. Zoals eerder vermeld, de incubatietijd lijn en afhankelijke variabele. Daarom volgen de cellulaire dissociatie onder een microscoop om het optimale tijdstip te bepalen.
- Zorgvuldig aspireren de dissociatie buffer en was voorzichtig 2 keer met PBS.
- Voeg 500 ul van kamertemperatuur mTeSR1 compleet medium met 10 ng / ml Y-27632 ROCK inhibitor aan de put.
- In plaats van scoren kolonies als in stap 2.6, druk op de gewenste aantal kolonies in de media met behulp van een P200 tip en voorzichtig vermaal de celsuspensie 2 keer against een hoek van de put om de iPSC kolonies breken in groepjes ~ 50-200 urn in grootte. Bijvoorbeeld, voor een 12-well plaat, pick 1-2 kolonies te dragen in elk 1 nieuwe put. Breng de celsuspensie uit de oude put tot één nieuw putje van een 12-wells plaat.
- Rock de plaat in een aantal snelle, heen-en-weer, en side-to-side bewegingen gelijkmatig verspreid de cellen, en laat de plaat rusten gedurende 24 uur in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
- Voer dagelijkse full media verandert met mTeSR1 compleet medium. Zoals eerder vermeld, is het niet nodig om Y-27632 ROCK inhibitor toe na de eerste plating.
OPMERKING: Ongebruikte iPSC kolonies van stap 3,7 gemakkelijk gecryopreserveerde op dit punt.
4. Voorbereiding van de Kamer Slides en Coverslips voor het zaaien van hiPSCs voor Immunocytochemie
LET OP: Het volgende protocol maakt gebruik van 4-well plastic kamer dia's en 12 mm dekglaasjes met appropriate volumes van de media in de multi-wells kosteneffectieve immunocytochemie ondersteunen. Echter kan mediavolumes worden verhoogd indien het gebruik van grotere goed dekglaasje en maten gewenst.
- Eén dag voor iPSC samenvloeiing, voorbereiding van dia's kamer vers bekleed met extracellulaire matrix zoals besproken in deel 1. Voeg genoeg matrix-oplossing (~ 300-500 ul per putje van een 4-well kamer dia) om volledig vacht goed elke zonder enige zorg van verdamping. Als alternatief, na het plaatsen van 1 gereinigd en gesteriliseerd dekglaasje in elk putje van een 24-wells plaat, jas met 500 pi extracellulaire matrix en zorg ervoor dat het dekglaasje is niet drijven op de top van de oplossing.
- Op de dag van passage, verwijder de beklede objectglaasjes kamer / dekglaasjes van 4 ° C en laat acclimatiseren tot kamertemperatuur gedurende 1 uur in de weefselkweek kap.
- Zuig het medium van 1 putje van een 12-well plaat hiPSCs en vervangen door 500 pl dissociatie buffer.
- Incubeer bij kamertemperatuur temperatuur voor ~ 3-7 min tot de randen van de iPSC kolonies lijken iets omhoog.
- Zorgvuldig aspireren de dissociatie buffer en voeg 1 ml kamertemperatuur mTeSR1 compleet medium met 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibitor naar de bron.
- Met behulp van een kleine fasecontrastmicroscoop geplaatst in de weefselkweek kap, handmatig 1 kolonie / nieuwe putje van een 4-well kamer dia of 1 nieuw dekglaasje pick worden verzilverd (~ 1000 - 1500 micrometer in diameter) met behulp van een P200 pipet tip door te drukken het uit het plaatoppervlak in het medium.
- Zuig de matrix van de nieuwe kamer slide / dekglaasje, zorg dat u de coating niet te verstoren.
- Zachtjes vermaal de celsuspensie 2 keer tegen een hoek van de put om de iPSC kolonies breken in groepjes ~ 50-200 urn in grootte. Transfer 250 pi van de celsuspensie uit de oude put in elke nieuwe putje van een 4-well kamer slide / dekglaasje.
- Breng het volume van iedere nieuwe put tot 500 pL met mTeSR1 containing 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibitor.
- Plaats de kamer schuif- / dekglaasjes in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2.
- Na 24 uur, uit te voeren dagelijkse full media verandert met mTeSR1 compleet medium. Opnieuw zoals eerder vermeld, de toevoeging van Y-27632 ROCK Inhibitor hoeft na de eerste plating.
5. Voorbereiding van de iPSC voor Immunocytochemie
- Eenmaal samenvloeiing, het behoud van de iPSC kolonies via fixatie door het verwijderen van het materiaal uit de putten en het toevoegen van voorverwarmde LET OP 4% paraformaldehyde (~ 300 ul / putje van een 4-well kamer slide / dekglaasje). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Gooi de paraformaldehyde adequaat volgens de institutionele biologisch en chemische veiligheidsrichtlijnen.
- Was de cellen 3 maal gedurende 5 minuten elk op een bench-top shaker met PBS.
OPMERKING: Cellen op kamer dia / dekglaasjes kan worden opgeslagen met ruime PBS bij 4 ° C oneindig in dit stadium.Als alternatief kunnen zij direct worden gebruikt voor ICC.
6. Immunokleuring van hiPSCs met Pluripotentie Markers
LET OP: Immunostain hiPSCs met standaard pluripotentie antilichamen. Als voorbeeld, hier cellen dubbel gekleurd met antilichamen gericht op één oppervlak en 1 1 intracellulair antigeen in een sequentiële wijze als volgt: Anti-Stage-Specific Antigen Embryonale-4 (SSEA4) met anti-octameer-bindend eiwit 4 (OCT- 4) en anti-Tra-1-60 met anti-SRY verwante HMG BOX gen 2 (SOX2) (zie de Materialen Tafel voor antilichaam details).
- Zuig het PBS uit de putjes en voeg 500 ul / putje blokkeeroplossing zonder Triton-X-100. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Bereid een vooraf bepaalde concentratie (hier gebruikt 1: 200) van het oppervlak antilichamen, hetzij SSEA4 of Tra-1-60, door verdunning in blokkeeroplossing zonder Triton X-100.
- Voor kamer dia's, voor te bereiden 300 ul / putje van een 4-well kamer diadoor het mengen van 298,5 ul van blokkeeroplossing hierboven en 1,5 pl anti-SSEA4 of Tra-1-60 primair antilichaam.
- Voor dekglaasjes bereiden 40 ul / dekglaasje door het mengen van 199 pl blokkeeroplossing en 1 pl anti-SSEA4 of Tra-1-60 primair antilichaam.
- Zuig het blokkeren oplossing uit de kamer glijbaan en afzien van het primaire antilichaam in geschikte putjes. Voor dekglaasjes, plaats een stukje parafilm stevig in een petrischaal en afzien 40 pl van het primaire antilichaam op de top als een druppel. Met behulp van een gebogen injectienaald en een tang, til de dekglaasje uit de cultuur goed en plaats deze cel kant naar beneden op de daling van het antilichaam op de parafilm. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- De volgende ochtend, 3 keer, 5 was de cellen - 10 minuten elk, door het verwijderen van het antilichaam uit de kamer glijbaan en toevoegen van PBS. Voor dekglaasjes Til elk van de parafilm en plaats het terug in een putje van een 24-well plaat, cel kant naar boven. Voeg voorzichtig PBS.
- Bereid passende secundaire antilichamen 1: 500 in de Blocking Solution.
- Voor Kamer slides Bereid 300 ul / putje van een 4-well kamer dia door het mengen van 499 pl blokkeeroplossing en 1 pl geit anti-muis IgG3 Alexa Fluor 488 (voor SSEA4) of 1 pl geit anti-muis IgM Alexa Fluor 488 (voor Tra-1-60).
- Voor dekglaasjes bereiden 40 ul / dekglaasje door het mengen van 499 pl blokkeeroplossing en 1 pl geit anti-muis IgG3 Alexa Fluor 488 (voor SSEA4) of 1 pl geit anti-muis IgM Alexa Fluor 488 (voor Tra-1-60 ).
- Zuig het PBS uit de kamer glijbaan en afzien van het secundaire antilichaam in geschikte putjes. Voor dekglaasjes, volgende stap 6,2, keer de dekglaasjes op de antilichaamoplossing parafilm geplaatst bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
LET OP: Bij gebruik van fluorescerende gelabeld secundaire antilichamen, moet de cellen worden beschermd tegen het licht. Plaats de kamer dia's en de dekglaasjes in een donkere environment tijdens incubaties en wast. - Was de cellen 3 maal gedurende 5-10 minuten elk door verwijdering van het antilichaam uit de kamer glijbaan en toevoegen van PBS. Voor dekglaasjes Til elk voorzichtig uit de parafilm en plaats opnieuw in een putje van een 24-wells plaat, cel naar boven. Voorzichtig PBS toe te voegen tijdens wasbeurten.
- Vóór peilen naar de tweede antigeen intracellulair oktober-4 of SOX2 in casu incuberen in blokkeeroplossing opnieuw gemaakt met permeabilisatie reagens (Triton-X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Om immunostain voor oktober-4 of SOX2, volgt u de in de stappen 6,1-6,6 beschreven voor het aanbrengen van de primaire en secundaire antilichamen methodologie. Voor de toepassing van dit protocol gebruikt oktober-4 en SOX2 bij een concentratie van 1: 200 en het secundaire antilichaam geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 594 op 1: 500.
- elke 10 min met PBS en tegenkleuring met 4 ', 6'-diamidino-2 - Na de bovengenoemde primaire en secundaire antilichaam behandelingen, was de cellen 3 keer voor 5-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) volgende standaard protocollen als nucleaire visualisatie is gewenst.
7. Voorbereiding voor Viewing
- Voor kamer dia's, verwijder voorzichtig de bovenste kamer van de glijbaan, volgens de instructies van de fabrikant. Dan afspoelen in gedestilleerd water en voeg montage medium en een dekglaasje te microscopie mogelijk te maken.
- Voor dekglaasjes, keren de dekglaasjes naar een druppel montage medium op een microscoopglaasje geplaatst.
- Afbeelding onder een standaard of confocale fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol verschaft een stapsgewijze beschrijving van hoe menselijke iPSCs kan worden overgedragen van voedingslaag feeder-vrije omstandigheden, en vervolgens vermeerderd in beperkte mate in staat om specifiek kosteneffectieve immunocytochemie te bevestigen pluripotentie onderhoud. Figuur 1 toont een schematische weergave van dit protocol. Figuur 2A toont iPSC kolonies groeien op iMEFs in 6-well platen. Deze kolonies vertonen typische morfologie met gedefinieerde grenzen en dichte fase helder centra. Zoals getoond in figuur 2B, na de overdracht van iPSCs feeder-vrije omstandigheden in 12-well platen, kolonie morfologie lijkt enigszins chaotisch minder uitgesproken randen. Ook kunnen sommige iMEFs in de cultuur blijven in dit stadium. Figuur 2C toont aan dat na een extra passage in de feeder-free-systeem, iPSC kolonies vertonen een klassieke monolaag morfologie met een hoge kern naar cytoplasm ratio. In dit stadium wordt gezien dat iMEFs vrijwel geëlimineerd uit de kweek.
Kolonies groeien onder feeder-vrije omstandigheden zijn mechanisch geplukt en uitgeplaat op kleine multi-well kamer dia's of dekglaasjes, en onderzocht voor specifieke pluripotentie antigenen via immunocytochemie. Figuur 3 toont representatieve kolonies die immunopositive voor SSEA4 en Tra-1-60 (3B, 3F, oppervlakte pluripotentie antigenen) en Oct-4 of Sox2 (3 A, 3E, pluripotentie intracellulaire antigenen) zijn.
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol. Over het algemeen schema van de beschreven methode die wordt gebruikt voor de menselijke iPSCs van iMEF feeders overgang naar feeder-vrije cultuur en de daaropvolgende sonderen van cellen met pluripotentie markers. iMEF: irradia ted muis embryonale fibroblast; iPSC: geïnduceerde pluripotente stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger Beelden van iPSC Colonies overgang van iMEF Voeders feeder-vrije cultuur voorwaarden. A) Dichte iPSC kolonie (witte pijl) zijn gekweekt op iMEF feeder-cellen (zwarte pijl). B) na de eerste passage over een matrix gecoate 12-well plaat in serumvrij medium, een paar iMEFs kan nog worden waargenomen in kweek (zwarte pijl). C) Typische morfologie van een monolaag iPSC kolonie gegroeid feeder-vrij. Geen iMEFs blijven in de cultuur in dit stadium. Schaalbalk (AC) = 100 urn.> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Immunocytochemische karakterisering van menselijke iPSCs Plated in Small Well Platen. Representatieve immunofluorescentie beelden van iPSCs, verkregen via een confocale microscoop, tonen de positieve expressie van pluripotentie markers A) oktober-4 (rood) en B) SSEA4 (groen) met C), de nucleaire DAPI vlek (blauw) en E) Sox2 ( rood) en F) Tra-1-60 (groen) met G) DAPI (blauw). D en H tonen de overlay afbeeldingen met betrekking tot AC en EG. Schaal bar (AH) = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| iPSC Media voor onderhoud aan Voeders | ||
| bestanddeel | Stock Concentratie | eindconcentratie |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Knockout Serum Vervanging | 100% | 20% |
| L-Glutamine | 200 mM | 1 mM |
| MEM-NEAA | 10 mM | 0,1 mM |
| 2-mercaptoethanol | 55 mm | 0,1 mM |
| Recombinant humaan FGF-Basic | 10 ug / ml | 10 ng / mL |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | 10 uM | |
| Matrigel coating voor Feeder-Free culturen | ||
| bestanddeel | ||
| Matrigel hESC gekwalificeerde Matrix | Verdunningfactor 269 ul | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 mL | |
| Opmerking: Verdunningfactor is veel afhankelijk is en moet worden afgeleid uit het certificaat van de analyse | ||
| mTeSR1 compleet media voor Feeder-Free culturen | ||
| bestanddeel | Bedrag | |
| mTeSR1 Basal Medium | 400 ml | |
| mTeSR1 5x Supplement | 100 ml | |
| Let op: Eenmaal gemengd, kan mTeSR1 compleet media in porties worden bevroren en worden gebruikt tot component vervaldatum | ||
| Opmerking: mTeSR1 volledige media moeten worden opgewarmd alleen op kamertemperatuur. Niet in een waterbad | ||
Tabel 1: iPSC Culture Media Recepten en Plate Coatings.
| 4% paraformaldehyde fixeermiddel | |
| bestanddeel | Bedrag |
| 0,1 M PO 4 Buffer | 2 L |
| Paraformaldehyde prill | 80 g |
| ICC blokkeeroplossing zonder Triton-X-100 | |
| bestanddeel | Bedrag |
| 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing | 49 ml |
| Normaal Geit Serum | 1 mL |
| Runderserumalbumine | 0,5 g |
| ICC blokkeeroplossing met Triton-X-100 | |
| bestanddeel | Bedrag |
| 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing | 49 ml |
| Normaal Geit Serum | 1 mL |
| Runderserumalbumine | 0,5 g |
| Triton-X-100 | 200 pl |
Tabel 2: Fixatief en Immunocytochemie recepten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De systematische protocol hier gepresenteerde een tijdbesparende en kosteneffectieve methode, in de vorm van een verkleinde kweektechniek, speciaal ontworpen om effectieve pluripotentie analyse ondersteunen via immunocytochemie.
De belangrijkste voordelen van de beschreven werkwijze zijn als volgt. Traditioneel meer dan 3-4 passages nodig zijn iPSCs van voedingslagen overgang naar voedingsvrije kweekomstandigheden om resterende iMEFs resteert na de toepassing van bulk dissociatie technieken elimineren en voor typische monolaag morfologie verschijnen 12, 13. In tegenstelling, de hier gepresenteerde methode omvat een verkorte tijdlijn, waardoor de relatief snelle overdracht van iPSC serum-vrije omstandigheden via de manuele picking van iPSC kolonies. De iPSCs worden gekweekt in beperkte hoeveelheden in kleine kamer dia's of dekglaasjes bevorderlijk voor immunocytochemie. In feite is de volume kweekmedium nodig per well is slechts 0,5 ml en het volume van de verdunde antilichaam-oplossing die nodig is voor een enkele dekglaasje is zo nominale als 40 ul of 300 ul per kamer goed, bij het gebruik van dit protocol.
We zien dat de toevoeging van gelijke delen iMEF geconditioneerde medium het mTeSR1 tijdens de eerste doorgang (stap 2,5) is een belangrijke stap die helpt bij de overleving en het onderhoud van de pluripotente morfologie iPSC's. Bovendien, als celhechting niet optimaal na passage (stappen 2,2, 3,3 en 4,3), oplossen kan worden uitgevoerd door het verder optimaliseren van de dissociatie keer gebruikt.
Tenslotte beperking van de gepresenteerde kleinschalige werkwijze, in vergelijking met andere technieken zoals flowcytometrie ook gebruikt om pluripotentie controleren, is dat het niet mogelijk voor de verdere propagatie geanalyseerde cellen voor verdere toepassingen. Het nut van onze methode komt voort uit zijn specifieke ontwerp dat de cos ondersteuntt-effectieve en efficiënte kweek van de hiPSCs ter bevestiging pluripotentie via routine immunocytochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
