Introduction
Omprogrammering humane voksne somatiske celler i inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) tilvejebringer en måde at opnå en potentielt ubegrænset forsyning af patient-specifikke celler for at studere sygdom 1, 2. Den gentog en sygdom fænotype in vitro ville gøre det plausibelt at undersøge cellulære og molekylære mekanismer, der er forbundet med sygdommen, og forbedre lægemiddelforskning og personlig medicin 3. Desuden humane iPSCs (hiPSCs) giver mulighed for at udlede specifikke celletyper, der kan anvendes som en unik ressource at erstatte døde eller dysfunktionelle celler og genoprette funktionen i forbindelse med flere lidelser 4, 5.
En vigtig forudsætning for anvendelse af iPSCs i ovennævnte anvendelser er at sikre, at deres pluripotent og udifferentieret tilstand opretholdes under ekspansion i kultur. Typisk Techniqdier såsom flowcytometri, western blotting, polymerasekædereaktion og funktionelle assays, som kræver store mængder af celler og specialiseret udstyr, anvendes til detaljeret analyse af iPSC pluripotens 6, 7, 8, 9, 10. Dog kan effektivt opnås rutinemæssige vurdering af iPSCs 'udifferentieret tilstand gennem den begrænsede udbredelse af disse celler specielt til immuncytokemi (ICC), hvilket indebærer reduceret tid og ressourcer.
Nylige fremskridt muliggør væksten af iPSCs i definerede serumfrie betingelser, hvilket er en væsentlig forbedring i forhold til konventionelle dyrkningssystemer, der kræver murine fibroblast fødelag og serum indeholdende medier. Men den nuværende litteratur ikke omfatte klare trinvise protokoller, der beskriver, hvordan man overgangen iPSCs fra feederlag til fødefri systemer.
I denne sammenhæng er den foreliggende protokol systematisk detaljer hvordan hiPSCs dyrket på bestrålede mus embryonale fibroblast (iMEF) feeder lag kan være (1) tilpasset til at udbrede sig i serum-frit medium, og (2) dyrket på en lille skala til specifikt at støtte robust immuncytokemisk analyse. Samlet set denne metode repræsenterer en rettidig og omkostningseffektiv procedure for formerings menneskelige iPSCs i serum-fri betingelser for bekræfter deres pluripotens rutinemæssigt ved hjælp immuncytokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs blev afledt fra humane dermale fibroblaster isoleret fra 4 mm hud Hulning biopsier og omprogrammeres i huset via Sendai virus-medieret omprogrammering 11. The University of Arizona Institutional Review Board godkendte alle procedurer for emnet rekruttering og biopsi kollektion.
1. Udarbejdelse af ekstracellulær matrix overflade for iPSC Kultur
- En dag før sammenløbet af hiPSC kulturer vokser på iMEFs, forberede ekstracellulære matrix (Matrigel) coatede plader.
- Langsom tø en portion af den ekstracellulære matrix (meget afhængig, følg vejledningen på specifikationen ark) på is i 4 ° C i 2 timer.
- I et bio hætte, tilsluttet koldt pipettespidser (opbevaret ved -20 ° C), tilsættes 1 aliquot af ekstracellulær matrix for kulde Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12 / HEPES) ifølge den partispecifikke fortyndingsfaktor .
- Dispenser ~ 60081; L af ekstracellulær matrix pr brønd af hver ny cellekultur behandlet 12-brønds plade nødvendig.
- Inkubér pladen ved stuetemperatur i flere timer. Her skal du bruge en 3 h inkubationstid.
BEMÆRK: Plader kan anvendes straks eller opbevares ved 4 ° C i op til to uger.
2. Overførsel af hiPSCs Grown på iMEF Feeder celler på ekstracellulære matrix for Formering
- På dagen for passage, fjerne matrix overtrukket plade fra 4 ° C og så pladen akklimatisere sig til stuetemperatur i 1 time i vævskultur hætte.
- Aspirer mediet fra 1 brønd af en 6-brønds plade af hiPSC kultur vokser på iMEFs og erstat med 500 pi collagenase dissociation reagens (1 mg / ml i naeringsoploesning).
- Der inkuberes ved 37 ° C i ~ 10 - 30 min, indtil kanterne af IPSC kolonier synes at løfte en smule.
BEMÆRK: Inkubationstiden er line afhængige og vil variere. Overvåg dissociation under et mikroskop. - Bilefully aspirer dissociation reagens og vaskes forsigtigt 2 gange med phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4).
- Tilsæt 1 ml stuetemperatur mTeSR1 komplet medium med 10 ng / mL Rho-associeret protein kinase inhibitor (Y-27632 ROCK inhibitor) til brønden.
BEMÆRK: Ved hjælp af en 50:50 blanding af iMEF-medium og mTeSR1 under denne indledende passage er foreslået og kan være gavnligt for overlevelse hiPSCs under dette medie overgang. - Ved hjælp af en lille fasekontrastmikroskop placeret delvist inde i hætten, manuelt score og vælge 1 - 2 hiPSC kolonier (~ 700 - 1000 um i diameter) ved hjælp af en sprøjte og kanyle (25 G, 1½ i). Skub off scorede stykker af kolonien i mediet med en P200 pipette spids.
- Aspirér og bortskaffe matricen fra den nye plade, og pas på ikke at forstyrre belægningen.
- Overfør 1 ml af cellesuspensionen fra den gamle brønd indeholdende de nu iPSCs i den nye matrix coatet brønd.
- Place pladen i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2. Rock pladen i flere hurtig, back-og-tilbage, og fra side til side bevægelser jævnt spredt ud cellerne. Forstyr ikke pladen i 24 timer.
- Udføre daglige fuld medieændringer med mTeSR1 komplet medium (tilsætning af Y-27632 ROCK Inhibitor er ikke nødvendigt efter den indledende udpladning i trin 2.5).
3. Mindre Passage af hiPSCs på Matrix-coatede plader
BEMÆRK: I almindelighed efter den første overførsel af de hiPSCs til matrix coatede plader, cellerne bør passeres en gang mere på en lignende måde for at sikre alle iMEFs er blevet elimineret, og celler har tilpasset sig fødefri betingelser.
- En dag før iPSC sammenflydning forberede frisk belagt matrix plader som omtalt i afsnit 1.
- På dagen for passagen, fjerne matrix overtrukket plade fra 4 ° C inkubation og lad pladen at akklimatisere til stuetemperatur i 1 time i vævet cultur hætte.
- Aspirer mediet fra en brønd i en 6-brønds plade af hiPSCs (oprindeligt skiftet fra feeder til matrix) og erstatte med 500 uL celle dissociation buffer.
BEMÆRK: Den kommercielle celle dissociation bruges her puffer (se Materialer tabel) er mere egnet til anvendelse med mTeSR1 medium sammenlignet med collagenase. - Der inkuberes ved stuetemperatur til en 3 - 7 min, indtil kanterne af IPSC kolonier synes at løfte en smule. Som nævnt før, inkubationstiden er line afhængige og variabel. Derfor overvåge cellulære dissociation under et mikroskop for at bestemme det optimale tidspunkt.
- aspireres forsigtigt dissociation buffer og vask forsigtigt 2 gange med PBS.
- Tilsæt 500 pi stuetemperatur mTeSR1 komplet medium med 10 ng / mL Y-27632 ROCK inhibitor til brønden.
- I stedet for scoring kolonier som i trin 2.6, skubbe det ønskede antal kolonier i mediet ved anvendelse af en P200 spids og forsigtigt udriv cellesuspensionen 2 gange against ene hjørne af brønden at bryde hiPSC kolonier i klumper af -50 - 200 um i størrelse. For eksempel, for en 12-brønds plade, pick 1 - 2 kolonier overføre til hver 1 ny brønd. Overfør cellesuspensionen fra den gamle brønd i en enkelt ny brønd i en plade med 12 brønde.
- Rock pladen i flere hurtig, frem-og-tilbage, og side-til-side bevægelser jævnt fordelt cellerne, og lad pladen hvile i 24 timer i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Udfør daglige fuld medier ændringer med mTeSR1 komplet medium. Som nævnt før, er det ikke nødvendigt at tilføje Y-27632 ROCK Inhibitor efter den indledende udpladning.
BEMÆRK: Ubrugte IPSC kolonier fra trin 3.7, kan være let kryopræserveret på dette punkt.
4. Fremstilling af Chamber Slides og Dækglas til såning af hiPSCs for Immuncytokemi
BEMÆRK: Følgende protokol udnytter 4-godt plastik kammer dias og 12 mm dækglas med appropriate mængder af medier i de multi-brønde til at understøtte en omkostningseffektiv immuncytokemi. Dog kan media mængder forøges, hvis der ønskes at anvende større godt og dækglas størrelser.
- En dag før hiPSC sammenløb, forberede kammer slides frisk belagt med ekstracellulære matrix som omtalt i afsnit 1. Tilføj nok matrix løsning (~ 300 - 500 uL per brønd af en 4-brønd kammer slide) til fuldt ud at pels hver brønd uden nogen bekymring fordampning. Alternativt efter at placere en rengøres og steriliseres dækglas i hver brønd af en 24-brønds plade, frakke med 500 uL ekstracellulære matrix og sørg dækglasset ikke flyder på toppen af opløsningen.
- På dagen for passagen, fjerne de overtrukne kammerskiver / dækglas fra 4 ° C og tillade akklimatisering til stuetemperatur i 1 time i vævskultur hætte.
- Aspirer mediet fra 1 brønd af en 12-brønds plade af hiPSCs og erstat med 500 pi dissociation buffer.
- Inkuber ved room tempeperaturen for ~ 3 - 7 min, indtil kanterne af IPSC kolonier synes at løfte en smule.
- aspireres forsigtigt dissociation buffer og tilsættes 1 ml stuetemperatur mTeSR1 komplet medium med 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibitor til brønden.
- Ved hjælp af en lille fasekontrastmikroskop placeret inde i vævskultur hætte, manuelt vælge 1 koloni / ny brønd af en 4-brønds kammer slide eller 1 nyt dækglas der skal pletteres (~ 1.000 - 1.500 um i diameter) ved anvendelse af en P200 pipettespids ved at skubbe det fra pladeoverfladen i mediet.
- Aspirer matricen fra den nye kammer dias / dækglas, og pas på ikke at forstyrre belægningen.
- Forsigtigt udriv cellesuspensionen 2 gange mod et hjørne af brønden for at bryde hiPSC kolonier i klumper af -50 - 200 um i størrelse. Overfør 250 pi af cellesuspensionen fra den gamle brønd i hver ny brønd af en 4-brønds kammer slide / dækglas.
- Bring lydstyrken for hver ny brønd op til 500 uL med mTeSR1 containing 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibitor.
- Placer kammeret slide / dækglas i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 24 timer, udføre daglige fuld medier ændringer med mTeSR1 komplet medium. Igen som tidligere nævnt, tilsætning af Y-27632 ROCK Inhibitor er ikke nødvendig efter den indledende udpladning.
5. Udarbejdelse af iPSCs for Immuncytokemi
- Når sammenflydende, bevare hiPSC kolonier via fiksering ved at fjerne mediet fra brøndene og tilføje forvarmet PAS 4% paraformaldehyd (~ 300 uL / brønd af en 4-brønd kammer slide / dækglas). Der inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Kassér paraformaldehyd passende efter institutionel biohazard og kemiske sikkerhedsretningslinjer.
- Vask cellerne 3 gange i 5 min hver på en bench-top shaker med PBS.
BEMÆRK: Celler på chamber slides / dækglas kan gemmes med rigelig PBS ved 4 ° C på ubestemt tid på dette tidspunkt.Alternativt kan de umiddelbart anvendes til ICC.
6. immunfarvning af hiPSCs med pluripotens Markers
BEMÆRK: immunofarvningsprocedure hiPSCs med standard pluripotens antistoffer. Som et eksempel, her celler er dobbelt-farvet med antistoffer målrettet imod et 1 overflade og 1 intracellulært antigen i en sekventiel måde som følger: Anti-Stage-Specific Embryonale Antigen-4 (SSEA4) med anti-octamer-bindende protein 4 (oktober- 4) og anti-Tra-1-60 med anti-SRY beslægtet HMG BOX gen 2 (SOX2) (se venligst Materialer Table for antistof detaljer).
- Aspirer PBS fra brøndene og tilføje i 500 pl / brønd blokeringsopløsning uden Triton-X-100. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered en forudbestemt koncentration (her, bruger 1: 200) af overflade-antistoffer, enten SSEA4 eller Tra-1-60, ved fortynding i blokeringsopløsning uden Triton X-100.
- For kammerskiver, forberede 300 uL / brønd af en 4-brønds kammer slideved blanding 298,5 pi blokeringsopløsning ovenfor og 1,5 pi anti-SSEA4 eller Tra-1-60 primært antistof.
- For dækglas, forberede 40 uL / dækglas ved at blande 199 pi blokeringsopløsning og 1 pi anti-SSEA4 eller Tra-1-60 primært antistof.
- Aspirer blokeringsopløsningen fra kammeret slide og dispensere det primære antistof i passende brønde. For dækglas, lægge et stykke parafilm fast inde i en petriskål og dispensere 40 pi det primære antistof oven som en dråbe. Ved hjælp af en bøjet sprøjte nål og pincet, forsigtigt løfte dækglasset ud af kulturen godt og læg den celle nedad på dråbe antistof på parafilm. Inkuber natten over ved 4 ° C.
- Den næste morgen vaskes cellerne 3 gange, 5 - 10 min hver, ved at fjerne antistoffet fra kammeret slide og tilsætning i PBS. For dækglas, løft hver en fra parafilm og læg den tilbage i en brønd i en plade med 24 brønde, celle opad. tilsættes forsigtigt PBS.
- Forbered passende sekundære antistoffer ved 1: 500 i Blocking Solution.
- For kammerskiver, forberede 300 uL / brønd af en 4-brønds kammer slide ved blanding 499 pi blokeringsopløsning og 1 pi gede-anti-muse IgG3 Alexa Fluor 488 (for SSEA4) eller 1 pi gede-anti-muse-IgM Alexa Fluor 488 (for Tra-1-60).
- For dækglas, forberede 40 uL / dækglas ved at blande 499 pi blokeringsopløsning og 1 pi gede-anti-muse IgG3 Alexa Fluor 488 (for SSEA4) eller 1 pi gede-anti-muse-IgM Alexa Fluor 488 (for Tra-1-60 ).
- Aspirer PBS fra kammeret slide og dispensere det sekundære antistof i passende brønde. For dækglas, efter trin 6.2, vendes dækglassene onto antistofopløsningen placeret på parafilm ved stuetemperatur i 2 timer.
BEMÆRK: Hvis du bruger fluorescerende mærkede sekundære antistoffer, skal cellerne være beskyttet mod lys. Placer kammer dias og dækglas i en mørk environment under inkubationer og vaske. - Vask cellerne 3 gange i 5 - 10 min hver ved at fjerne antistoffet fra kammeret slide og tilsætning i PBS. For dækglas, løfte hver enkelt omhyggeligt fra parafilm og anbringes tilbage i en brønd i en plade med 24 brønde, celle opad. Forsigtigt tilføje PBS under vaske.
- Forud for probing for det andet antigen, intracellulær OLT 4 eller SOX2 i dette tilfælde inkuberes igen i blokeringsopløsning lavet med permeabiliseringsreagenset (Triton-X-100) i 1 time ved stuetemperatur.
- For at immunfarvning for OLT 4 eller SOX2, blot følge den metode, der er beskrevet i trin 6.1-6.6 for at anvende de primære og sekundære antistoffer. Ved anvendelsen af denne protokol, skal du bruge OLT 4 og SOX2 i en koncentration på 1: 200 og den sekundære antistof gede anti-kanin IgG Alexa Fluor 594 på 1: 500.
- Efter de ovennævnte primære og sekundære antistofbehandlinger, vaske cellerne 3 gange i 5 - 10 min hver med PBS og kontrafarve med 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorid (DAPI) efter standardprotokoller hvis der ønskes nuklear visualisering.
7. Forberedelse til visning
- For kammer dias, forsigtigt fjerne det øverste kammer fra slide, efter fabrikantens anvisninger. Derefter skylles i destilleret vand, og der tilsættes monteringsmedium og et dækglas for at aktivere mikroskopi.
- For dækglas, invertere dækglas på en dråbe montering medium placeret på et objektglas.
- Billede under en standard eller konfokal fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol giver en trinvis beskrivelse af, hvordan human iPSCs kan overføres fra fødelag til fødefri betingelser, og efterfølgende opformeres i begrænset omfang til specifikt muliggøre omkostningseffektive immuncytokemi til bekræftelse pluripotens vedligeholdelse. Figur 1 viser en skematisk fremstilling af denne protokol. Figur 2A viser hiPSC kolonier vokser på iMEFs i 6-brønds plader. Disse kolonier udviser typiske morfologi med definerede grænser og tætte fase lyse centre. Som vist i figur 2B, efter overførslen af iPSCs at fødefri forhold i 12-brønds plader, vises kolonimorfologi noget kaotisk med mindre adskilte kanter. Desuden kan nogle iMEFs forblive i kulturen på dette tidspunkt. Figur 2C viser, at efter yderligere passage i fødefri system IPSC kolonier vise en klassisk monolag morfologi med en høj kerne til cytoplasm forhold. På nuværende tidspunkt er det set, at iMEFs er stort set elimineret fra kulturen.
Kolonier vokser under fødefri betingelser er mekanisk opsamlet og udpladet på lille multi-brønds kammerobjektglas eller dækglas, og probet for specifikke pluripotency antigener via immuncytokemi. Figur 3 viser repræsentative kolonier, som er immunpositive for SSEA4 eller Tra-1-60 (3B, 3F, overflade pluripotens antigener) og Oct-4 eller Sox2 (3 A, 3E, intracellulære pluripotens antigener).
Figur 1: Skematisk repræsentation af protokollen. Samlet skema af den beskrevne metode, der anvendes til overgangen menneskelige iPSCs fra iMEF foderautomater til feeder-fri kultur og efterfølgende sondering af celler med pluripotens markører. iMEF: irradia Ted mus embryonale fibroblast; iPSC: Provokeret Pluripotente Stem Cell. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative Billeder af IPSC Kolonier Overgang fra iMEF Feedere til Feeder-fri kultur Betingelser. A) Dense iPSC koloni (hvid pil) dyrket på iMEF feeder-celler (sort pil). B) Efter den første passage på en matrix-coatede plade med 12 brønde i serumfrit medium, et par iMEFs kan stadig observeres i kultur (sort pil). C) Typisk morfologi et monolag iPSC koloni dyrket feeder-fri. Ingen iMEFs forbliver i kulturen på dette tidspunkt. Scale Bar (AC) = 100 pm.> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Immuncytokemiske Karakterisering af human iPSCs udpladet i Lille brønds plader. Repræsentative immunofluorescens billeder af iPSCs, opnået via en konfokal mikroskop, og viser den positive udtryk for pluripotens markører A) oktober-4 (rød) og B) SSEA4 (grøn) med C) den nukleare pletten DAPI (blå) og E) Sox2 ( rød) og F) Tra-1-60 (grøn) med G) DAPI (blå). D og H viser overlay billeder vedrørende AC og EG. Scale bar (AH) = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
| hiPSC Media for vedligeholdelse på Feeders | ||
| Komponent | Stock Concentration | slutkoncentration |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Knockout Serum Udskiftning | 100% | 20% |
| L-Glutamin | 200 mM | 1 mM |
| MEM-NEAA | 10 mM | 0,1 mM |
| 2-mercaptoethanol | 55 mM | 0,1 mM |
| Rekombinant human FGF-Basic | 10 ug / ml | 10 ng / ml |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | 10 uM | |
| Matrigel belægning til Feeder-Free kulturer | ||
| Komponent | ||
| Matrigel hESC-kvalificeret Matrix | Fortyndingsfaktor 269 uL | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 ml | |
| Bemærk: Fortyndingsfaktor er meget afhængig og skal undersøges fra certifikat for analyse | ||
| mTeSR1 komplet medier til Feeder-Free kulturer | ||
| Komponent | Beløb | |
| mTeSR1 Basal Medium | 400 ml | |
| mTeSR1 5x Supplement | 100 ml | |
| Bemærk: Når blandet, kan mTeSR1 komplette medier fryses i portioner og anvendes indtil komponent udløbsdato | ||
| Bemærk: mTeSR1 komplette medier skal varmes på kun stuetemperatur. Anbring ikke i vandbad | ||
Tabel 1: IPSC Kultur Media Opskrifter og Plate Coatings.
| 4% paraformaldehyd fiksativ | |
| Komponent | Beløb |
| 0,1 M PO4 buffer | 2 L |
| Paraformaldehyd, pilleform | 80 g |
| ICC blokeringsopløsning uden Triton-X-100 | |
| Komponent | Beløb |
| 1x phosphatpufret saltvand | 49 ml |
| Normalt gedeserum | 1 ml |
| Bovint serumalbumin | 0,5 g |
| ICC blokeringsopløsning med Triton-X-100 | |
| Komponent | Beløb |
| 1x phosphatpufret saltvand | 49 ml |
| Normalt gedeserum | 1 ml |
| Bovint serumalbumin | 0,5 g |
| Triton-X-100 | 200 pi |
Tabel 2: Fixative og immuncytokemi opskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den systematiske protokol præsenteres her giver en tidsbesparende og omkostningseffektiv metode, i form af en nedskaleret kultur teknik, specielt designet til at understøtte effektiv pluripotens analyse via immuncytokemi.
De væsentligste fordele ved den beskrevne metode er som følger. Traditionelt mere end 3 til 4 passager er nødvendige for at overgangen iPSCs fra feeder lag for at feeder-frie dyrkningsbetingelser for at fjerne resterende iMEFs tilbage efter brug af bulk dissociation teknikker og for typiske monolag morfologi vises 12, 13. I modsætning hertil metode præsenteres her involverer en forkortet tidslinje, som giver mulighed for relativt hurtig overførsel af iPSCs til serumfrie betingelser via den manuelle plukning af IPSC kolonier. De iPSCs dyrkes i begrænsede mængder i små kammer dias eller dækglas befordrende for immuncytokemi. Faktisk volumig dyrkningsmedium nødvendige pr brønd er blot 0,5 ml, og volumenet af fortyndet antistofopløsning kræves for en enkelt dækglas er så nominelle som 40 pi eller 300 pi pr kammeret godt, når denne protokol.
Vi finder, at tilsætning af lige dele iMEF konditioneret medium til mTeSR1 under den indledende passage (Trin 2.5) er et vigtigt skridt, der hjælper med overlevelse og vedligeholdelse af IPSC er pluripotente morfologi. Desuden, hvis cellevedhæftning ikke er optimal efter passage (trin 2.2, 3.3 og 4.3), fejlfinding kan udføres ved yderligere at optimere dissociation gange anvendte.
Endelig en begrænsning af den foreliggende fremgangsmåde i lille målestok, når der sammenlignes med andre teknikker, såsom flowcytometri anvendes også til at verificere pluripotens, er, at den ikke giver mulighed for den fortsatte formering af analyserede celler til efterfølgende anvendelser. Anvendeligheden af vores fremgangsmåde, skyldes en specifik design, som understøtter cost og effektiv kultur hiPSCs for bekræftelse pluripotens via rutine immuncytokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
