Method Article

זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

DOI:

10.3791/55302

⸱

May 5th, 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3School of Environmental Sciences, Queen's University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את זיהוי של חלבוני קושרי קרח מצמחי הקפאה-סובלנית דרך ההערכה של פעילות עיכוב-recrystallization הקרח והבידוד הבא של IBPs המקורית באמצעות טיהור זיקה-קרח.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרח מחייב חלבונים (IBPs) שייכים למשפחה של חלבונים-induced להדגיש כי מסונתזים על ידי אורגניזמים מסוימים חשופים לטמפרטורות שמתחת לאפס. בצמחים, ניזק הקפאה מתרחש כאשר גבישי קרח תאיים לגדול, וכתוצאה מכך פקיעת קרומי פלזמת תהליכי מוות תאי אפשרי. ספיחה של IBPs כדי גבישי קרח מגביל צמיחה נוספת על ידי תהליך המכונה עיכוב-recrystallization קרח (IRI), ובכך להפחית נזק הסלולר. IBPs גם להפגין את היכולת לדכא את נקודת הקיפאון של פתרון מתחת לנקודת היתוך שיווי משקל, בנכס הידוע היסטרזיס תרמית פעילות (TH). מאפייני הגנה אלו העלו עניין הזיהוי של IBPs הרומן עקב השימוש הפוטנציאלי שלהם ביישומים תעשייתיים, רפואיים וחקלאיים. מאמר זה מתאר את הזיהוי של הצמח IBPs דרך 1) והאימון החילוץ של IBPs ברקמת הצמח, 2) הקרנת תמציות לפעילות IRI, ו 3) בידוד purification של IBPs. בדומה להשפעת IBPs ידי חשיפה לטמפרטורה נמוכה, תמציות נבדקות לפעילות IRI באמצעות "assay מעיכה", המאפשר התצפית של צמיחת קריסטל קרח באמצעות מיקרוסקופ אור רגילה. assay זה דורש ריכוז חלבון נמוך ומייצר לתוצאות המתקבלות במהירות לפרש בקלות, מתן מסך ראשוני לפעילות מחייב קרח. IBPs ניתן לבודד אז את זיהום חלבונים על ידי ניצול רכושם של IBPs לספוג לקרח, באמצעות טכניקה הנקראת "טיהור קרח-זיקה". באמצעות lysates תא שנאסף תמציות צמח, חצי כדור ארץ קרח ניתן לגדל לאט על בדיקה פליז. זו משלבת IBPs לתוך המבנה הגבישי של קרח הגבישים. אין צורך בידע ביוכימיים או מבני אפריורי של IBP, שיטה זו מאפשרת התאוששות של חלבון פעיל. Ice-מטוהרים שברים חלבון יכול לשמש ליישומים במורד הזרם כולל זיהוי של PEPרצפים גאים ידי ספקטרומטריית מסה ואת לאנליזה ביוכימית של חלבונים מקומיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרח מחייב חלבונים (IBPs) הם משפחה מגוונת של חלבונים מגן כי התגלו מספר אורגניזמים כולל צמחים 1, חרקים 2, דגים 3, חיידקים 4. תכונת המפתח של חלבונים אלה היא היכולת הייחודית שלהם במיוחד וביעילות לספוג גבישי קרח, שינוי הצמיחה שלהם. יש IBPs כמה תכונות מתועדות, עם שתי היסטרזיס התרמית להיות המאופיין ביותר היטב (TH) והעיכוב-recrystallization הקרח (IRI). פעילות TH הוא ציינה ביתר קלות ב IBPs יוצר חיות הקפאה-סובלנות. תוצאות פעילות זו בהורדה של נקודת הקיפאון של נוזלי הדם או ביניים אורגניזמים כדי למנוע קפיאה. לעומת זאת, ב אורגניזמים הקפאה-סובלנית,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגדרת Apparatus ספלאט 1.

  1. מלאו אמבט מים במחזור-לתכנות טמפרטורה עם אתילן גליקול (50% v / v במים).
    הערה: אתילן גליקול הרכב הירוק יכול לשמש.
  2. כדי להרכיב את התא החיצוני, להשתמש בצינור פלסטיק מבודד כדי לצרף את האמבטיה במי קערה מזכוכית דופן כפולה. לבודד את קערת זכוכית עם קצף פוליסטירן מכסים במכסה צלחת פטרי פלסטיק. חותכים חור אינץ 3-4 בבית התחתון של החדר פוליסטירן כך שמקור האור ניתן לראות דרך תא הזכוכית.
  3. הר הקאמרי החיצוני על מיקרוסקופ לנתיחה,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להקל על הגדרת, איור 1 ו איור 2 כלולים בייצוגים חזותיים של הציוד המשמש לניתוח IRI וטיהור זיקה לקרח, בהתאמה. תוצאות של ניתוח IRI באמצעות תמציות שנאספו חרדל עשב עם ובלי IBPs מתוארים באיור 3 . תוצאות אלו מראות שתמציות שנאספו מעשב חרדל, שאינו סובלני להקפיא, לא הצליחו להגביל את צמיחת גביש הקרח בשל היעדר נוכחות של IBP. לעומת זאת, גבישי קרח קטני.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לניתוח והטיהור המוצלח של IBPs, חשוב להבין את טבעו רגיש לטמפרטורה של כמה חלבונים אלה. צמח מסוים IBPs ולהיות יציב בטמפרטורה מעל 0 מעלות צלזיוס, וכתוצאה מכך התגלגלות, משקע וחוסר פעילות. על מנת לקבל IBPs הפעיל, הוא לעתים קרובות קריטי כי צמחים מעובדים בחדר קר (~ 4 ° C) ודגימות נשמרות על קרח במהלך ניסויים. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בעת ​​lysates הגולמי כולו התאים בעזרת הוא הפירוק של חלבונים על ידי פרוטאזות אנדוגניים. בצמחים, הביטוי של IBPs נמוך בדרך כלל, ולכן כל פסד תשואת חלבון עלול לגר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק NSERC (קנדה) ל VKW.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 מ"ל מיקרו-צנטריפוגותפישר05-408-129
שקע מעבדה מתכוונןפישרS63080
צנטריפוגה ספסליתDesaga MC2
בדיקת פליזנבנתה בהתאמה אישית
Canon Power Shot SX110 מצלמה דיגיטלית; יציאת
מיקרוסקופ בנויה בהתאמה אישיתבד גבינהPurewipe/Fisher Scientific06-665-25A
צינורות ריכוז (0.5 מ"ל)UFC501008EMD Millipore
(15 מ"ל)EMD MilliporeUFC900308
(50 מ"ל)בלוקAM12502
VWR13259השתמש בבלוק
חימום מתכתמסיר לחותWhirlpool50 ליטר מסיר לחות Energy Star; רכישה מהספק המקומי
חרוזי Dessciationt.h.e. Dessicant/VWREM-DX0017-26-8 גודל רשת; 100% מציין
מיקרוסקופ דיסקציהאולימפוס טוקיו
קערת זכוכית בעלת דופן כפולהגנריתמספק כלי זכוכית מעבדה מקומי
קרחיבש גנריהשתמש בספק מקומי; מסוכן 
טבליות מעכב EDTA-פרוטאזSigma Aldrich11836170001Roche cOmplete mini
Ethylene glycolGenericGreen Automotive אתילן גליקול ניתן לרכוש בכל חנות לחומרי בניין מקומית (כלומר הום דיפו)
HexaneSigma Aldrich296090נטול מים, 95%;
שמן טבילהSigma Aldrich56822
JA10/20 צנטריפוגהבקמן
צלחת פטרי פלסטיקגדולה גנרי
חנקן נוזליגנרישימוש מקומי; מסוכן 
צלחת ערבוב מגנטיתHanna InstrumentsHI190M
מיקרוסקופ כיסוי שקופיותפישר12-542A
צינור פלסטיקגנרירכש צינור PVC מחנות לחומרי בניין מקומית
סרט מקוטבאדמונד אופטיקה43-781
קצף פוליסטירןגנריניתן לבנות מקופסאות משלוח פוליסטירן
מרגמה ועלי פורקלייןפישרFB961
PVPPסיגמא אולדריץ'77627110 ומיקרו; m גודל חלקיקים
Retort StandFisher12-000
מוט ערבוב קטןפישר14-513-51
אמבט מים לתכנות טמפרטורהVWR13271-118
גריז ואקוםDow Corning/Sigma AldrichZ273554
צינורות וינילגנרי
יציאת מצלמה/מצלמה Canon צינורות ריכוז צינורות חרוטיים קירור Thermo Fisher רכישה מסוכן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256(2000).
  2. Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
  3. Davies, P. L., Hew, C. L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ice binding ProteinsIce recrystallization InhibitionIce affinity PurificationSplat AssayThermal HysteresisPlant Tissue ExtractionIce Hemisphere FormationMass SpectrometryNanoliter OsmometerFreeze Tolerance

Related Articles