Summary
В настоящем документе описывается идентификация льда-связывающих белков с замораживанием терпимо растений путем оценки ингибирования активности льда рекристаллизации и последующего выделение нативных PIL, используя очистку льда сродства.
Abstract
Ice-связывающие белки (PIL,) принадлежат к семейству индуцированных стрессом белков, которые синтезируются с помощью некоторых организмов, подвергшихся воздействию отрицательных температур. В растениях, повреждение замораживания происходит, когда внеклеточные кристаллы льда растет, что приводит к разрыву плазматической мембраны и возможной гибели клеток. Адсорбция PIL, чтобы кристаллов льда ограничивает дальнейший рост с помощью процесса, известного как лед рекристаллизации торможения (IRI), тем самым уменьшая повреждение клеток. PIL, также демонстрирует способность угнетает температуру замерзания раствора ниже точки плавления равновесия, свойство известного как тепловая гистерезиса (TH) активность. Эти защитные свойства повысили интерес к идентификации новых PIL, из-за их возможное использование в промышленных, медицинских и сельскохозяйственных применениях. Этот документ описывает идентификацию растений PIL, через 1) индукцию и извлечение PIL, в растительной ткани, 2) скрининг экстрактов для активности IRI и 3) выделение и PurifЦия ИБП. После индуцирования ИБФ при воздействии низкой температуры экстракты испытывают на активность IRI с использованием «анализа splat», который позволяет наблюдать рост кристаллов льда с использованием стандартного светового микроскопа. Этот анализ требует низкой концентрации белка и генерирует результаты, которые быстро получены и легко интерпретируются, обеспечивая начальный экран для активности связывания льда. Затем ИБП могут быть выделены из загрязняющих белков, используя свойство ИБФ для адсорбции на льду, с помощью методики, называемой «аффинная очистка льдом». Используя клеточные лизаты, собранные из растительных экстрактов, можно медленно выращивать ледяное полушарие на латунном зонде. Это включает IBPs в кристаллическую структуру поликристаллического льда. Не требуя априорных биохимических или структурных знаний о ИБФ, этот метод позволяет восстановить активный белок. Очищенные от льда белковые фракции могут быть использованы для нижестоящих применений, включая идентификацию pepприлив последовательности по масс-спектрометрии и биохимического анализа нативных белков.
Introduction
Ice-связывающие белки (PIL , ) представляют собой разнородное семейство защитных белков , которые были обнаружены в ряде организмов , в том числе и растения, насекомых-2, 3, рыб и микробов 4. Ключевой особенностью этих белков является их уникальная способность специфически и эффективно адсорбироваться кристаллов льда, изменяя их рост. PIL, имеют несколько документированных свойств, с двумя наиболее хорошо охарактеризованных будучи тепловой гистерезис (TH) и ингибирование льда рекристаллизации (IRI). TH активность более легко наблюдать в PIL, произведенных в замораживающих непереносимостью животных. Результаты этой деятельности в снижении точки замерзания кровеносной или интерстициальных жидкостей организмов для предотвращения замерзания. В противоположность этому, в морозильных толерантных организмов, которые неизбежно будут замерзать при отрицательных температурах, PIL, по всей видимости, обладают низкой активностью TH. Несмотря на низкой активности TH, высокая активность IRI ограничить лед крикStal рост часто наблюдается с этими белками. Для сублимационной терпимы организма, эта деятельность IRI предположительно помогает защитить клетки от неконтролируемого роста льда в внеклеточных отсеках.
Модель «Кнопка Матрас» может быть использован для описания механизма , с помощью которого PIL , предотвратить рост кристаллов льда 5. В соответствии с этой моделью, PIL, специфически адсорбироваться на поверхности кристаллов льда с интервалами, таким образом, что молекулы воды могут только включают с ростом кристаллов льда решетки в пространстве между связанной PIL,. Это создает кривизну , что делает включение дополнительных молекул воды неблагоприятно, событие , которое может быть описано с помощью эффекта Гиббса-Томсон 6. Якорь решетчатые воды гипотеза обеспечивает механизм для специфического связывания PIL, на поверхности кристаллов льда при этом наличие заряженных остатков, в частности, расположен на участке белка, связывающего льда, приводит к REOРГАНИЗАЦИЯ молекул воды , таким образом они соответствуют один или несколько плоскостей кристаллической решетки льда 7.
TH активность может быть определена количественно путем измерения разности между плавления и замораживания температуры одного ледяного кристалла в присутствии IBP. В то время как активность TH является широко распространенным методом оценки активности, PIL, низкого зазора TH производимого заводом PIL, (как правило, лишь доли градуса) обычно требует высокой концентрации белка, специализированного оборудования и опыта оператора. Несмотря на то, не PIL, может ограничить рост кристаллов льда, это свойство, присущее всем PIL, и, таким образом, тестирование на активность IRI является эффективным начальный экран на наличие PIL, особенно для тех, с низкой активностью TH. Методология, используемая для проверки этой активности известен как «знак» анализа, в результате чего образец белка флэш заморожены для получения монослой мелких кристаллов льда, которые наблюдаются в течение определенного периода времени, чтобы определить, является лиРост кристаллов льда ограничен. В отличие от других методов, используемых для скрининга образца источника ткани на наличие PIL, этот метод применим к низкой концентрации белка в диапазоне 10-100 нг, использует легко панельном оборудование, и генерирует данные, которые быстро и легко интерпретировать. Тем не менее, важно подчеркнуть, что этот анализ обеспечивает начальный экран для PIL, которым необходимо следовать путем определения TH и формирования кристаллов льда.
Выделение нативных белков является сложной задачей, часто требует информации о структурных и биохимических свойств белка. Сродство PIL, для льда позволяет для выделения этих белков с использованием льда в качестве субстрата для целей очистки. Поскольку большинство молекул выталкиваются вперед границы льда-воды в процессе роста кристаллов льда, медленный рост ледяной полусферы в присутствии результатов выборки IBP в высоко очищенной пробе, лишенный большого quantitх года примесных белков и растворенные вещества. Этот метод был использован для идентификации PIL , от насекомых 8, 9, 10, 11 бактерий, рыб и растений 12 13, 14. Кроме того, IBP-обогащенные фракции, полученные с помощью этого метода можно также использовать для нисходящего биохимического анализа. В настоящем документе описывается идентификацией PIL, в растениях путем индукции и извлечения PIL, анализ активности IRI, чтобы подтвердить наличие белков, а также выделение белков с помощью аффинной очистки льда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настройка устройства 1. Splat
- Заполните температурно-программируемой ванны, циркулирующей воды с этиленгликолем (50% об / об в воде).
Примечание: Зеленый автомобильной этиленгликоль может быть использован. - Чтобы собрать внешнюю камеру, использовать изолированный пластиковые трубы, чтобы прикрепить ванну воды в стеклянную емкость с двойными стенками. Изолируйте стеклянный шар с пенополистиролом и крышка с пластиковой крышкой чашки Петри. Вырезать 3-4 дюйма отверстие в нижней части камеры полистирола, так что источник света можно увидеть через стеклянную камеру.
- Установите внешнюю камеру на рассечение микроскоп, снабженный портом камеры и 4X поляризованной линзы объектива с 10-кратным хрусталика. Поместите дополнительный кусок поляризованной пленки в нижней части внешней камеры.
- Зажим на 1-1,5 м трубки (~ 5 см в диаметре) на штатив и место внутри большого контейнера полистирола, наряду с охлаждающим блоком, расположеннымами под трубку на основании штатива.
2. Получение нативного белка экстрактов для анализа IRI
- Для того, чтобы индуцировать экспрессию PIL, в замораживающих толерантных трав или других замораживающих устойчивых видов растений, холодных акклиматизации растений в течение 1 недели при температуре 4 ° С в условиях низкой освещенности (6 ч свет / 18 ч темного). Это не относится к образцам, собранных с поля, которые уже подверглись воздействию низких температурных условий и сроков акклиматизации.
- Получают примерно 0,1 г ткани листьев путем разрезания у основания стебля, а затем поместить в 1,5 мл трубки. Сразу вспышка заморозить образец в жидком азоте и хранят при -80 ° С до использования.
- Для того, чтобы лизировать клетки, измельчить образец ткани в мелкий порошок с помощью ступки и пестика в присутствии жидкого азота. Убедитесь, что жидкий азот не испаряется в процессе гомогенизации.
- Сразу же место пробы грунта на лед и позволяют жидкий азот полностью испарился. Добавляют 1 мл нативного белка extractiна буфере, содержащий 10 мМ Трис-HCl, 25 мМ NaCl (рН 7,5), с двумя ЭДТОМ свободных ингибиторов протеазы таблеток добавлены непосредственно перед использованием. Пипетка для смешивания; не вихрь.
Примечание: Дополнительные добавки, возможно, должны быть использованы, если лизат содержит вторичные метаболиты (см Обсуждения). - Осторожно встряхните образцы в течение ночи (18-24 ч) при температуре 4 ° С. Провести оставшиеся шаги при 4 ° С.
- Удалить клеточный дебрис путем центрифугирования образцов при ~ 16000 мкг в течение 5 мин. Сохранить растворимую фракцию и центрифуги в течение еще 5 мин, если клеточный дебрис сохраняется. Очищенные образцы можно хранить при температуре от -20 ° С до использования.
3. Анализ Splat Предварительный эксперимент Настройка
- Налейте 100 мл гексана во внешнюю камеру, созданной с поляризованной пленкой и добавить 5-6 десикацию шарики, чтобы предотвратить попадание влаги накапливаться на слайдах. Добавьте небольшое количество вакуумной смазки на пластины, закрывающей ванну и крутить, чтобы обеспечить герметичное уплотнение и предотвратить испарение гексана. Охладите гексановую ванну между -4 ° C и -6 ° C с помощью программируемой водяной бани примерно за 2-3 часа до начала эксперимента. Перед началом эксперимента обязательно проверьте температуру гексана с помощью термометра.
- Поместите охлаждающий блок в полистироловую коробку непосредственно под пластиковую трубку и закройте полностью сухим льдом за 40 минут до начала эксперимента.
- Перед началом анализа убедитесь, что трубка ровная. Чтобы определить, где на охлаждающем блоке будет падать образец, сначала проверьте процедуру с водой и укажите, где образец падает с помощью маркера (как описано ниже).
- Удалите сухой лед с верхней части холодного блока и поместите крышку стекла микроскопа слайд на метку капли, которая была определена с водой.
- Непосредственно перед началом анализа включите источник света и очистите лед, образовавшийся на дне стеклянной камеры. Избегайте держать источник света включенным, если не кристаллы льдав настоящее время визуализируется, чтобы предотвратить нагревание гексана.
4. Проведение анализе Splat
- Окуните одноразовый наконечник, прикрепленный к автоматической пипетки (1-20 мкл) в иммерсионного масла, используя бумажное полотенце удалить излишки масла. Этот шаг позволит образец падать, а не придерживаться внешней пипетки.
Примечание: Удаление избытка масла из пипетки имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы капли масла не образуются на кристаллах льда, что делает визуализацию трудно. - Пипетка 10 мкл образца и поместить пипеткой непосредственно над пластиковой трубки перед выпуском образца. Отдельный «знак» звук должен быть услышан, когда образец попадет в стекле крышку слайд, создавая монослой кристаллов льда.
- Быстро и осторожно снять стекло микроскопа с холодной блока с помощью пинцета и место в гексане ванны на верхней части поляризационной пленки.
- Глядя под микроскопом, поставить стекло микроскопа в поле зрения и объявленияпросто линза объектива, так что кросс-поляризация позволяет для визуализации высокого контраста кристаллов льда. Отрегулировать увеличение до 40x.
- Установите камеру к микроскопу и настроить параметры на «макро», чтобы позволить четкую визуализацию кристаллов льда и захвату изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидание до 1 ч, чтобы кристаллы льда расти может дать более четкую картину. - Повторите шаги 4.1-4.5 для всех образцов. Как правило, размещать до 6 слайдов с различным образцом в камере гексан.
- Выключите источник света и поместите пластиковую пластину над гексаном ванной, что обеспечивает герметичное уплотнение. Разрешить кристаллы льда отжечь в течение ночи (12-24 ч, поддерживая постоянный период отжига в пределах конкретного анализа). После инкубации захвата изображения ледяных пленок, как описано выше.
Примечание: Некоторые образцы могут рекристаллизации быстрее, чем другие. Если нет рекристаллизации не видно через 12 ч, кристаллы позволяют отжечь до 24 ч, чтобы гарантировать, что не recrystalliзация будет происходить.
Анализ 5. Анализ данных Splat
- Загрузить фотографии на компьютер и непосредственно сравнить размер кристаллов льда до и после отжига. Образцы с активностью льда рекристаллизации не будет расти, тогда как образцы без IRI не будет активности рекристаллизации формированию заметно более крупные кристаллы льда. Свет помехи сделают крупные кристаллы льда появляются в нескольких различных оттенках и, таким образом, легко видеть.
6. Ice сродством Установка очистки оборудования
- Заполните температурно-программируемой ванны, циркулирующей воды с этиленгликолем. Зеленый автомобильной этиленгликоль может быть использован.
- Подключите ванну к полой, латуни зонду с использованием изолированных пластиковых трубок 15.
- Построить полистирол контейнер, в котором 150 мл химического стакан может поместиться ожидающим. Создайте крышку для контейнера с отверстием в центре для духового хладопроводе.
7.Приготовление образцов для льда-аффинной очистки
- Холодное акклиматизироваться растительной ткани, как описано в разделе 2.1.
- Собирают ~ 100-150 г измельченного биомассы (этап 2.3) в 20 мл пробирки и немедленно заморозить мигать. Образцы могут храниться при температуре -80 ° C до использования.
- Подготовка образца, как описано в разделах 2.3-2.5. Используйте соотношение 1: 1 (мг ткани: мл нативного буфера для экстракции белка) для взмучивания листовой ткани. Используйте дополнительные таблетки ингибитора протеазы, чтобы избежать деградации PIL, эндогенных протеаз.
Примечание: Если образец ткани слишком концентрированный, регулировать соотношение до 1: 2 или 1: 3 (мг ткани: мл нативного буфера для экстракции белка). - Для того, чтобы удалить остатки клеток, сито лизата через 2 слоя марли, 3 раза. Гранулы мусора путем центрифугирования при 30000 х г в течение 40 мин при 4 ° С.
- Увеличение объема образца до 120 мл с использованием нативного буфера для экстракции белка. Используйте лизат немедленно для очистки льда сродства кВо избежание какой-либо потери льда-связывающей активности.
8. Проведение ледово-аффинной очистки
- До начала очистки, установить ванну программируемую воды для охлаждения от -0.5 ° C до -3 ° С со скоростью -0.04 ° C / ч.
Примечание: Скорость охлаждения может быть скорректирована в зависимости от начального объема образца. - Охлаждает лед палец до -0,5 ° С, а затем погружать его в 50 мл пробирки, содержащей холодную дистиллированную воду. Добавьте несколько кусочков льда для облегчения льда зарождение и позволяют тонким слоем льда, образуя на пальце. Этот процесс обычно занимает от 20 до 30 мин.
Примечание: Любые шишки на пальце со льдом покрытием должны быть сглажены с рукой в перчатке до размещения в образце. Если слой льда не образуется при -0.5 ° С, понизить температуру до -0.75 ° C. - Поместите образец в стеклянном стакане объем 150 мл, содержащий небольшую магнитную мешалку в полистирольном контейнер на верхней часть магнитной мешалки. Убедитесь в том, что лед палецпо центру и опускается по меньшей мере, на полпути в жидкой пробе. Печать контейнера.
- Позволяет программе работать в течение примерно двух дней, проверяя каждые 24 часа. После того, как 50% выборки заморожен, остановить программу. Включение PIL, в ледяном полушарие приведет к «льду травлению».
Примечание: Очистные эксперименты можно сделать с использованием больших объемов образцов с длиной времени, в котором работает программа скорректированной соответствующим образом. - Для того, чтобы удалить лед полушарие, теплый зонд до 4 ° С, полоскание полусферу с дистиллированной водой для удаления несвязанного белка, а затем оттаивают при температуре 4 ° С.
Примечание: Большинство PIL , не стабильны в воде и соответствующего буфера (т.е. 50 мМ Трис-HCl, рН 8 или 50 мМ бикарбоната аммония, рН 8) должны быть добавлены периодически в процессе оттаивания (приблизительно 1 мл / 2 ч) , Лед полушария могут быть заворачивали в алюминиевой фольге и хранили при -20 ° C до оттаивания. - Если ледяная полусфера все еще содержитс пигментом, или для увеличения очистки образца, повторите шаги 8.1-8.5 2-3 раза.
Примечание: Хотя концентрация IBP может быть ниже после нескольких раундов очистки, чистота является более ценным, чем выход, если очищенные образцы будут проанализированы с помощью MS. Если достаточное количество материала доступно, рекомендуются три раунда очистки льда сродства.
9. Определение PIL,
- Так как PIL, содержатся в большом объеме следующего таяния ледяного полушария, концентрат образцов. Концентрат образцов, содержащих ~ 100 г ткани до ~ 1-3 мл с помощью центробежных концентрационных пробирок с 3000 Да молекулярной массой отсечением, чтобы избежать потерь мелких белков.
- Перед отправкой образцов для MS, определяет концентрацию белка с помощью количественного анализа белка, таких как BCA или Бредфорд. Оценка чистоты образцов методом гель-электрофореза, таких как SDS-PAGE. Тест очищенных белков для активности IRI до сутиnding для MS, чтобы гарантировать, что активный белок был сохранен за счет стадий очистки и концентрации.
- Использование концентрированных образцов непосредственно для масс - спектрометрического анализа 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для простоты установки, рис 1 и На рисунке 2, включены в качестве визуальных представлений оборудования , используемого для анализа IRI и очистки льда сродства, соответственно. Результаты анализа IRI с использованием экстрактов , собранных из горчицы сорняков с и без PIL , изображены на фиг.3. Эти результаты показывают, что экстракты, полученные из горчицы сорняков, которое не замерзает толерантным, не смогло ограничить рост кристаллов льда из-за отсутствие PIL, настоящее время. В отличие от этого, мелкие кристаллы льда видели с трансгенные растения, содержащие PIL, райграса пастбищного ограничивают рост кристаллов льда существенно. На рисунке 4 показаны льда полушарий , выращенных с использованием экстрактов райграса пастбищного , экспрессирующие PIL , после двух раундов очистки. После первого раунда очистки высокой степени льда травления на hemispheповторно поверхность указывает на то, что PIL , которые адсорбируют на льду и модифицированного роста кристаллов льда (фиг.4А). Второй раунд очистки показан на фиг. имеет четкую лед, что свидетельствует о том , что было некоторое исключение загрязняющих молекул. Лед-травления на поверхности полусферы указывает, что PIL, все еще присутствуют. На фиг.5 показан SDS-PAGE следующей очистки льда сродства, белков , собранных из райграса пастбищного, а затем окрашивают серебр ным красителем. Ряд белков были идентифицированы с семью различными группами, соответствующих наиболее распространенных белков, которые адсорбируют на лед.
Рисунок 1: Схематическое представление устройства 16 знака. оборудование нами ред для генерации монослоя кристаллов льда (А) и для визуализации роста кристаллов льда (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Устройство используется для очистки ото льда сродства PIL , 16. Духовой «ледяной палец» присоединенный к программируемому этиленгликоля ванны используют медленно расти со льдом полушарие. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
g3.jpg»/>
Рисунок 3: Типичные данные , полученные с помощью анализа IRI 17. Монослой кристаллов льда формируется с использованием растительных экстрактов, визуализируется при 40-кратном увеличении. Экстракты из Резуховидка Таль дикого типа , которые не содержат PIL , (-IBPs) сравнивали с экстрактами трансгенного A. thaliana , экспрессирующих PIL , от плевел многолетних (+ PIL , ). После инкубационного периода 18 ч при температуре от -4 ° С, кристаллы льда были перекристаллизовывают в буфер и дикого типа образцов А. thaliana. В отличие от этого , рост кристаллов льда был ограничен в А. thaliana экстрактах , экспрессирующих IBP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Ice-полусфера , выращенное с использованием IBP экстрактов , собранные из лиофильно терпимы трав, L. perenne. После того, как экстракты трав были подвергнуты один раунд очистки льда сродства, лед-травление поверхности льда полушарии указывает на успешное включение PIL , (A). Чтобы удалить дополнительные растворенные вещества, пигменты и примесные белки, был использован второй раунд ледяного сродства, что приводит к четкому льду полушария (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Мониторинг очистки нативных PIL , райграса пастбищного. После двух раундов очистки льда сродства и центробежной концентрации,нативные экстракты трав подвергали электрофорезу на денатурирующем полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а затем визуализируют с использованием серебра пятно. Дорожка 1: молекулярная масса белка лестницы; Дорожка 2: в неразбавленном виде экстракта; Дорожка 3-5: образцы, разбавленные в воде до загрузки гель с соотношением 1: 2, 1:: 5 и 1:10 (пробы воды). Так как этот конкретный вид растений содержит ряд PIL, множественные полосы, наблюдаемые, которые могут соответствовать различному изоформу IBP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для успешного анализа и очистки PIL, важно понимать, чувствительная к температуре характера некоторых из этих белков. Некоторые растения PIL, становится нестабильной при температуре выше 0 ° С, что приводит к развертке, осадков и бездействию. Для того чтобы получить активный PIL, часто бывает важно, чтобы растения обрабатываются в холодном помещении (~ 4 ° C) и образцы выдерживают на льде в течение эксперимента. Другой фактор, который следует учитывать при использовании целых клеток сырых лизатов является деградацией белков эндогенных протеаза. В растениях, экспрессия PIL, как правило, низок, и, следовательно, любые потери, выход белка может привести к недостаточному материала для будущих экспериментов или анализа. Работа быстро при экстракции белка, с добавлением надежного ингибиторов протеаз может уменьшить такие потери белка. Кроме того, важно, что период холодной акклиматизации быть оптимизирован для наибольшего накопления PIL, в лаборатории, выращеннойрастения.
Другая распространенная проблема при работе с PIL, что многие из анализов чувствительны к температуре и влажности. В отношении анализа IRI, накопление влаги на крышке стекло микроскопа может привести слоем льда, что делает визуализацию кристаллов льда трудно. Использование осушителя и дополнительные усыхания шарики могут решить эту трудность; Однако, рекомендуется, чтобы этот анализ не проводится, когда относительные уровни влажности лабораторные выше 70%.
Анализ знак, как представлено, качественно. Выполняя серию разбавления перед проведением анализа, конечная точка МРИ может быть установлена, чтобы определить диапазон концентраций, в котором PIL, больше не может ограничивать рост кристаллов льда. Различные лаборатории также использовали компьютерное программное обеспечение для измерения среднего размера зерен кристаллов льда 18. Как было указано выше, при тестировании на активность IRI является эффективным начальным экраном, подтверждением лед связываниядеятельность должна быть установлена путем определения уровня TH или непосредственно визуализировать адсорбцию PIL , к кристаллам льда 16. Заметный недостаток анализа IRI является то, что несколько не-IBP молекулы была идентифицирована, которые имитируют активность IRI. Эти молекулы могут включать в себя объемные белки, фенольные гликозиды, и синтетические полимеры , такие как поливиниловый спирт 19, 20, 21. В результате, управление буфером всегда должен быть запущен с образцами, чтобы гарантировать, что любые примеси или добавки не приводят к наблюдаемой активности IRI.
В то время очистки льда сродством легко выполняется, если не сделано правильно, другие белки, растворенные вещества и метаболиты могут преобладающими. Важным фактором является скорость роста кристаллов льда; за счет снижения скорости охлаждения (т.е. -0.02 ° C / ч), лед полушарии растет более медленно и любой не-лед-связывающий molecuле, менее вероятно, чтобы стать включено в кристаллической решетке льда. Наличие загрязняющих молекул , также можно избежать, гарантируя , что только 50% от лизата включен в полушарие (т.е. 50:50, жидкость соотношения со льдом). Как указывалось ранее, несколько раундов сродства со льдом могут также уточнить лед-фракцию и результат в пробе более высокой чистоты. Следует отметить, что вторичные метаболиты часто избыточном под биотическими и абиотическими условиями стресса у растений. Во время очистки фенола богатых растительных тканей, если темно-коричневые пигменты сохраняются, 1,5% (об / об) поливинилпирролидона (ПВП) и 1,5% поливинилполипирролидоном (вес / объем) (PVPP), могут быть добавлены в буфер экстракции, для нейтрализации вторичного метаболиты. Антиоксидантные добавки , такие как тиомочевины (5-10 мМ) также может быть использован 19, 21.
Если информация о IBP интересе известна, дополнительные стадии очистки, таких как литий высокого давленияфунтов хроматография (ВЭЖХ), также могут быть использованы. Модификации очистки льда сродства могут быть также рассмотрены и были зарегистрированы , чтобы оптимизировать выход белка и получить дополнительное понимание характеристик IBP включая более быстрой очистки льда оболочки 23 и флуоресценции на основе льда плоскости сродства (FIPA) 24.
После оптимизации, методы, описанные выше, могут давать очищенный пул белка для идентификации PIL,; однако, неспецифические включение других весьма распространенных белков может быть неизбежным. В то время как PIL , из семейства мятликового имеют гомологичные последовательности 25, в связи с большим разнообразием между PIL , из различных организмов, то , как правило , не представляется возможным идентифицировать IBP по гомологии последовательностей в одиночку. Общей чертой PIL , является наличие аминокислот , известных для связывания льда, включая треонин, серин и валин 26; идентификации пептидов последовательности богаты гоESE остатки могут быть полезны при добыче Секенс Дата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет гранта NSERC (Канада) в VKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L.
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L.
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
