Summary
I detta dokument beskrivs identifiering av is-bindande proteiner från fryst toleranta växter genom den bedömning av is-omkristallisation-inhibitionsaktivitet och efterföljande isolering av nativa IBPS användning is-affinitetsrening.
Abstract
Is-bindande proteiner (IBPS) tillhör en familj av stressinducerade proteiner som syntetiseras av vissa organismer som utsätts för temperaturer under noll. I växter, sker frysskada när extracellulära iskristallerna växer, vilket resulterar i bristning av plasmamembran och eventuell celldöd. Adsorption av IBPS till iskristaller begränsar ytterligare tillväxt genom en process känd som is-omkristallisation inhibering (IRI), och därigenom minska cellulär skada. IBPS demonstrerar också förmågan att sänka fryspunkten för en lösning under jämviktssmältpunkt, en egenskap som kallas termisk hysteres (TH) -aktivitet. Dessa skyddande egenskaper har höjt intresset för identifiering av nya IBPS på grund av deras potentiella användning i industriella, medicinska och jordbruksapplikationer. Detta dokument beskriver identifieringen av växt IBPS genom en) induktionen och extraktion av IBPS i växtvävnad, 2) screening av extrakt för IRI-aktivitet, och 3) isolering och purifblue av IBPS. Efter induktionen av IBPS genom exponering vid låg temperatur, är extrakten testas för IRI aktivitet med användning av en 'splat assay', som medger observation av iskristalltillväxt användning av en standardljusmikroskop. Denna analys kräver en proteinkoncentration låg och genererar resultat som snabbt erhålles och enkelt tolkas, vilket ger en initial skärm för is bindningsaktivitet. IBPS kan sedan isoleras från kontaminerande proteiner genom att använda egenskapen hos IBPS att adsorbera till is, genom en teknik som kallas 'ice-affinitetsrening'. Använda cellysat som samlats in från växtextrakt, kan en is hemisfär långsamt odlas på en mässingssond. Detta inkorporerar IBPS i den kristallina strukturen hos den polykristallina is. Kräver ingen a priori biokemisk eller strukturell kunskap om IBP medger denna metod för utvinning av aktivt protein. Is-renade proteinfraktioner kan användas för tillämpningar efter innefattande fastställande av peptide sekvenser genom masspektrometri och den biokemiska analysen av nativa proteiner.
Introduction
Is-bindande proteiner (IBPS) är en mångfaldig familj av skyddande proteiner som har upptäckts i ett antal organismer, inklusive växter 1, insekter 2, fisk 3, och mikrober 4. Det viktigaste inslaget i dessa proteiner är deras unika förmåga att specifikt och effektivt adsorberas till iskristaller, ändra deras tillväxt. IBPS har flera dokumenterade egenskaper, med de två mest väl karaktäriserade är termisk hysteres (TH) och is-återkristallise inhibering (IRI). TH-aktivitet är mera lätt observeras i IBPS framställda i fryst intoleranta djur. Denna aktivitet resulterar i sänkning av fryspunkten för organismernas cirkulations eller interstitiell vätska för att förhindra frysning. Däremot i frysttoleranta organismer, vilket oundvikligen kommer att frysa vid temperaturer under noll, IBPS verkar ha låg TH-aktiviteten. Trots den låga TH-aktiviteten, till en hög IRI aktivitet begränsa iskrstal tillväxt observeras ofta med dessa proteiner. För frys tolerant organism, bidrar detta IRI aktivitet förmodligen skyddar cellerna från okontrollerad tillväxt av is i extracellulära fack.
Den "madrass knappen" modellen kan användas för att beskriva mekanismen genom vilken IBPS förhindra tillväxt av iskristaller 5. Enligt denna modell, IBPS specifikt adsorbera till iskristallen ytan med intervaller, så att vattenmolekyler endast kan införliva med den växande is kristallgittret i utrymmet mellan bunden IBPS. Detta skapar en krökning som gör inkorporering av ytterligare vattenmolekyler ogynnsamma, en händelse som kan beskrivas med Gibbs-Thomson-effekten 6. Den förankrade klatrat vatten hypotes ger en mekanism för den specifika bindningen av IBPS till iskristallen ytan, varigenom närvaron av laddade rester, specifikt placerad på protein is-bindningsstället, resulterar i den reorganisation av vattenmolekyler så att de matchar ett eller flera plan av isen kristallgittret 7.
TH-aktivitet kan kvantifieras genom att mäta skillnaden mellan smält- och frystemperaturer av en enda iskristall i närvaro av en IBP. Medan TH-aktivitet är en allmänt accepterad metod för att utvärdera aktiviteten av IBPS, den låga TH gapet som produceras av växten IBPS (typiskt endast en bråkdel av en grad) som normalt kräver en hög proteinkoncentration, specialiserad utrustning och operatör erfarenhet. Även om icke-IBPS kan begränsa iskristalltillväxt, är det en egenskap som delas av alla IBPS och sålunda testning för IRI aktiviteten en effektiv inledande screening för närvaron av IBPS, särskilt för dem med låg TH-aktiviteten. Den metod som används för att testa denna aktivitet är känd som en 'splat assay', varvid ett proteinprov är snabbfrystes för att producera ett monoskikt av små iskristaller, som observeras under en tidsperiod för att bestämma omiskristalltillväxt är begränsad. Till skillnad från andra metoder som används för att screena ett provkällan vävnad för närvaron av IBPS är denna teknik tillämpbar på låga proteinkoncentrationer i området 10-100 ng, utnyttjar lätt-fabricerade utrustning, och genererar data som snabbt och enkelt tolkas. Emellertid är det viktigt att betona att denna analys ger en initial skärm för IBPS som bör följas genom bestämning av TH och iskristall formning.
Isoleringen av nativa proteiner är utmanande, som ofta kräver information om de strukturella och biokemiska egenskaperna hos ett protein av intresse. Affiniteten av IBPS för ice möjliggör för isolering av dessa proteiner med användning is som ett substrat för reningsändamål. Eftersom majoriteten av molekylerna skjuts framåt av isvatten gräns under iskristalltillväxt, långsam tillväxt av en is-hemisfär i närvaro av en IBP provresulterar i ett högt renat prov, som saknar stora quantittalet av kontaminerande proteiner och lösta ämnen. Denna metod har använts för att identifiera IBPS från insekter 8, 9, 10, bakterier 11, fisk 12 och växter 13, 14. Dessutom kan de IBP-anrikade fraktionerna som uppnås genom denna metod även användas för nedströms biokemisk analys. I detta dokument beskrivs identifiering av IBPS i växter genom induktion och extraktion av IBPS, till analys av IRI-aktivitet bekräftar närvaron av proteiner och isolering av proteiner med användning av is affinitetsrening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Splat Apparat Setup
- Fyll en temperatur programmerbar cirkulerande vattenbad med etylenglykol (50% volym / volym i vatten).
OBS: Grön fordons etylenglykol kan användas. - Att montera den yttre kammaren, använder isolerade plaströr att fästa vattenbad till en dubbelväggig glasskål. Isolera glasskål med polystyrenskum och täck med en petriskål av plast lock. Skära en 3-4 tums hål i botten av polystyrenen kammaren, så att ljuskällan kan ses genom glaskammaren.
- Montera den externa kammaren på en dissektion mikroskop, utrustat med en kamera-port och en 4X polariserad objektivlins med ett 10x okular. Placera en extra bit av polariserad film i botten av den yttre kammaren.
- Klämma en 1-1,5 m rör (~ 5 cm diameter) på en retort stativ och plats inuti en stor polystyren behållare, tillsammans med en kylblock placerad under röret vid basen av retorten stativet.
2. Framställning av Native proteinextrakt för IRI Analys
- Att inducera uttrycket av IBPS i fryst toleranta gräs eller andra fryst toleranta växtarter, kalla acklimatisera växter för upp till en vecka vid 4 ° C, under låga ljusförhållanden (6 h ljus / 18 h mörker). Detta gäller inte för prover som tagits från det område som redan har utsatts för låga temperaturer och Acklimatisering perioder.
- Erhålla ungefär 0,1 g bladvävnad genom att skära vid basen av stammen och sedan placera i en 1,5 ml rör. Omedelbart flash frysa provet i flytande kväve och förvara vid -80 ° C fram till användning.
- Att lysera celler, mala vävnadsprov till ett fint pulver med användning av en mortel och mortelstöt under flytande kväve. Se till att det flytande kvävet inte avdunstar under homogenisering processen.
- Omedelbart placera markprover på is och låt det flytande kvävet för att fullständigt avdunsta. Tillsätt 1 ml av ett nativt protein extractipå buffert innehållande 10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7,5), med två EDTA-fri proteashämmare tabletter tillsatta omedelbart före användning. Pipett för att blanda; inte virvel.
OBS: Ytterligare tillsatser kan behöva användas om lysatet innehåller sekundära metaboliter (se diskussion). - Skaka försiktigt prover över natten (18-24 h) vid 4 ° C. Utföra de återstående stegen vid 4 ° C.
- Ta bort cellrester genom centrifugering prover vid ~ 16.000 xg under 5 minuter. Behålla den lösliga fraktionen och centrifugera under ytterligare 5 min om cellrester kvarstår. Klar prover kan lagras vid -20 ° C fram till användning.
3. Splat analys Pre-experiment Konfigurera
- Häll 100 ml hexan till extern kammare inställd med den polariserade filmen och tillsätt 5-6 uttorknings pärlor för att förhindra fukt bygga upp på objektglasen. Lägga till en liten mängd av vakuum fett till plattan som täcker badet och vrida för att säkerställa en tät förslutning och förhindra avdunstning av hexan. Kyla hexan badet mellan -4 ° C och -6 ° C med användning av den programmerbara vattenbad cirka 2-3 h innan experimentet. Se till att kontrollera temperaturen i hexan med en termometer innan du påbörjar experimentet.
- Placera kylblocket i en polystyren låda direkt nedanför plaströret och täcker fullständigt med torr is, 40 min före start av experimentet.
- Innan analysen se till att slangen är nivån. För att bestämma var på kylblocket provet kommer att sjunka, första testet förfarandet med vatten och ange där provet droppar med en markör (såsom beskrivs nedan).
- Ta torris från toppen av det kalla blocket och placera en glasmikroskoplocket på drop märke som har bestämts med vatten.
- Omedelbart innan analys, slå på ljuskällan och skrapa eventuell is som har bildats på botten av glaskammare. Undvik att hålla ljuskällan på om iskristallerhåller på att visualiseras för att förhindra upphettning av hexan.
4. Utförandet av splat-analysen
- Doppa engångsspets fäst vid en automatisk pipett (1-20 | il) i immersionsolja, med användning av en pappershandduk avlägsna eventuell överskottsolja. Detta steg gör det möjligt för provet att falla i stället ansluta sig till utsidan av pipetten.
OBS: Ta bort överflödig olja från pipetten är avgörande för att säkerställa att oljedroppar inte bildas på iskristallerna, vilket gör visualisering svårt. - Pipettera 10 | il av provet och placera pipetten direkt över plaströr innan du släpper provet. En distinkt 'splat' ljud skall höras när provet träffar glaslocket, vilket skapar ett monolager av iskristaller.
- Snabbt och försiktigt bort objektglas från det kalla blocket med användning av pincett och plats i hexan badet ovanpå den polariserande filmen.
- Titta under mikroskopet, placera objektglas i synfältet och adbara objektivlinsen så att korspolarisation möjliggör visualisering av hög kontrast iskristaller. Justera förstoringen till 40x.
- Fäst kameran till mikroskop och justera inställningarna för "macro" för att tillåta klar visualisering av iskristaller och ta bilden.
OBS: Väntar upp till 1 h för att tillåta iskristaller att växa kan ge en tydligare bild. - Upprepa steg 4,1-4,5 för alla prover. Typiskt, placera upp till 6 glider med ett annat prov i hexan kammaren.
- Stäng av ljuskällan och placera en plastplatta över hexan badet, vilket garanterar en tät förslutning. Tillåta iskristaller att hybridisera över natten (12-24 h, varvid en konsekvent glödgning period inom en speciell analys). Efter inkubation ta bilder av isen filmerna som beskrivits ovan.
OBS: Vissa prover kan rekristallisera snabbare än andra. Om ingen rekristallisation är uppenbart efter 12 timmar, låt kristaller att para upp till 24 timmar för att säkerställa att ingen recrystallisering kommer att ske.
5. Splat Assay Dataanalys
- Ladda upp bilder till en dator och direkt jämföra storleken på iskristaller före och efter glödgning. Prover med is omkristallisering aktivitet inte kommer att växa, medan prover utan någon IRI aktivitet kommer omkristallisera bildar märkbart större iskristaller. Lätt störning kommer att göra stora iskristaller visas på lite olika nyanser och därmed är lätt att se.
6. Ice-affinitet Rening Utrustning Setup
- Fyll en temperatur programmerbar cirkulerande vattenbad med etylenglykol. Grön fordons etylenglykol kan användas.
- Ansluta badet till en ihålig, mässing proben med användning av isolerade plaströr 15.
- Konstruera en polystyren behållare, i vilken en 150 ml bägare kan passa tätt. Skapa ett lock för behållaren med ett hål i centrum för mässing kalla fingret.
7.Framställning av prover för Ice-affinitets Rening
- Kall ACKLIMATISERA växtvävnad, såsom beskrivs i avsnitt 2,1.
- Samla ~ 100-150 g av den malda biomassa (steg 2,3) i 20 ml rör och omedelbart flash frysas. Prover kan hållas vid -80 ° C före användning.
- Framställning av prov såsom beskrivits i avsnitten 2.3-2.5. Använda en 1: 1-förhållande (mg vävnad: ml nativt protein extraktionsbuffert) för återsuspension av bladvävnad. Använd ytterligare tabletter proteashämmare för att undvika nedbrytning av IBPS av endogena proteaser.
OBS: Om tissueprovet är alltför koncentrerad, justera förhållandet till 1: 2 eller 1: 3 (mg vävnad: ml nativt protein extraktionsbuffert). - För att avlägsna cellrester, sil lysat genom 2 lager cheesecloth, 3 gånger. Pelle skräpet genom centrifugering vid 30 tusen xg under 40 min vid 4 ° C.
- Öka volymen av provet till 120 ml med användning av nativt protein extraktionsbuffert. Använd omedelbart lysat för ice-affinitetsrening tillundvika någon förlust av is-bindningsaktivitet.
8. Ledande Ice-affinitets Rening
- Före rening, ställa in programmerbara vattenbad för att kyla från -0,5 ° C till -3 ° C vid en hastighet av -0,04 ° C / h.
OBS: kylningshastighet kan justeras beroende på den initiala volymen av provet. - Kyla isen fingret till -0,5 ° C och därefter Doppa den i ett 50 ml rör innehållande kallt destillerat vatten. Lägg några isbitar för att underlätta is kärnbildning och tillåta ett tunt lager av is bildas på fingret. Denna process tar vanligtvis mellan 20 och 30 min.
OBS: Eventuella klumpar på isen belagda finger bör jämnas med en behandskad hand innan den placeras i provet. Om ett isskikt inte bildar vid -0,5 ° C, sänka temperaturen till -0,75 ° C. - Plats provet i en 150 mL glass bägare innehållande en liten magnetisk omrörarstav i en polystyren behållare ovanpå den magnetomrörare. Se till att isen finger ärcentrerad och sänkas åtminstone halv väg in i vätskeprovet. Förslut behållaren.
- Låt programmet att gå under ca två dagar, kontroll av varje 24 timmar. När 50% av provet fryses, stoppa programmet. Införande av IBPS i isen halvklotet kommer att resultera i "ice-etsning".
OBS: Renings experiment kan göras med större provvolymer med den tid då programmet körs justeras därefter. - I syfte att avlägsna isen halvklotet, värma sonden till 4 ° C, skölj halvsfären med destillerat vatten för att avlägsna obundet protein, och sedan tina vid 4 ° C.
OBS: De flesta IBPS är inte stabila i vatten och en lämplig buffert (dvs 50 mM Tris-HCl, pH 8 eller 50 mM ammoniumbikarbonat, pH 8) kommer att behöva läggas periodiskt under upptiningsprocessen (ungefär 1 ml / 2 h) . Is hemisfärerna kan lindas in i aluminiumfolie och förvarades vid -20 ° C före upptining. - Om is halvklotet fortfarande innehållas pigment, eller för att öka provrening, upprepa steg 8.1-8.5 2-3 gånger.
OBS: Även om koncentrationen av IBP kan vara lägre efter multipla rundor av rening, är mer värdefullt än ge efter om de renade prover kommer att analyseras med användning av MS renhet. Om tillräckligt med material finns tillgängligt, är tre omgångar av is-affinitetsrening rekommenderas.
9. Identifiering av IBPS
- Eftersom IBPS finns i en stor volym efter upptining av is-halvklotet, koncentrera proverna. Koncentrera prover innehållande ~ 100 g vävnad till ~ 1-3 ml med användning av centrifugal-koncentrations rör med en 3000 Da molekylvikt cut-off för att undvika förlust av små proteiner.
- Innan sändning prover för MS, bestämma proteinkoncentrationen med användning av ett protein kvantifiering analys såsom en BCA eller Bradford-analys. Uppskatta renheten hos prover genom gel-elektrofores såsom SDS-PAGE. Testa de renade proteinerna för IRI aktivitet före och för sigENDE för MS för att säkerställa att aktivt protein har bibehållits genom de renings- och koncentrationssteg.
- Använd koncentrerade prov direkt för masspektrometri analys 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att underlätta installation, Figur 1 och Figur 2 är inkluderade som visuella representationer av den utrustning som används för IRI analys och is-affinitetsrening, respektive. Resultaten av IRI-analys med användning av extrakt som insamlats från senap ogräs med och utan IBPS är avbildade i Figur 3. Dessa resultat visar att extrakt som samlats in från senaps ogräs, som inte är frystolerant, var oförmögna att begränsa iskristall tillväxt på grund av brist på IBPS närvarande. I kontrast, de små iskristaller ses med transgena växter innehållande IBPS från rajgräs begränsar iskristalltillväxt väsentligt. Figur 4 visar is hemisfärer odlas med användning av perenna rajgräs extrakt som uttrycker IBPS efter två rundor av rening. Efter den första omgången av rening den höga graden av is-etsning på hemisphere ytan att IBPS har adsorberats till is och modifierade tillväxt av iskristallerna (Figur 4A). Den andra omgången av rening visas i fig 4B har tydligare is, vilket indikerar att det var någon uteslutning av kontaminerande molekyler. Is-etsning på halvsfären ytan att IBPS är fortfarande närvarande. Figur 5 visar en SDS-PAGE efter is-affinitetsrening, av proteiner som samlats in från rajgräs, och färgades därefter med en silverfärgning. Ett antal proteiner identifierades med sju distinkta band, som motsvarar de mest rikligt förekommande proteinerna som adsorberar till is.
Figur 1: Schematisk återgivning av den splat apparaten 16. utrustning oss ed för generering av ett monoskikt av iskristaller (A) och för visualisering av iskristalltillväxt (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Apparat som användes för ice-affinitetsrening av IBPS 16. En mässings "is finger" fäst till en programmerbar etylenglykol bad används för att sakta växa ett is-hemisfär. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
g3.jpg"/>
Figur 3: Representativa data erhållna med användning av IRI-analys 17. Ett monoskikt av iskristaller bildas med användning av växtextrakt visualiseras vid 40x förstoring. Extrakt från vildtyp Arabidopsis thaliana som inte innehåller IBPS (-IBPs) jämfördes med extrakt av transgena A. thaliana uttryck IBPS från Lolium perenne (+ IBPS). Efter en 18 h inkubationsperiod vid -4 ° C, hade iskristaller omkristalliserades i buffert och vildtyp A. thaliana prover. I kontrast, var iskristalltillväxt begränsad i A. thaliana extrakten som uttrycker en IBP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Is-hemisfärer odlas med användning av IBP extrakt som samlats in från den fryst toleranta gräs, L. perenne. Efter gräsextrakt underkastades en omgång av is-affinitetsrening, is-etsning av ytan av isen hemisfären indikerar den framgångsrika inkorporeringen av IBPS (A). Att ta bort ytterligare lösta ämnen, pigment och kontaminerande proteiner, utfördes en andra runda av is-affinitet används, vilket resulterar i en tydligare is-hemisfären (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Övervakning reningen av nativa IBPS från engelskt rajgräs. Efter två omgångar av is-affinitetsrening och centrifugal koncentration,nativa gräs extrakt utsattes för elektrofores på en denaturerande polyakrylamidgel (SDS-PAGE) och visualiserades sedan med användning av silverfärgning. Lane 1: molekylviktsproteinstege; Lane 2: outspädd extrakt; Lane 3-5: prover utspädda i vatten före gel lastning med en 1: 2, 1: 5, och 01:10 (prov: vatten) förhållande. Eftersom denna särskilda växtarter innehåller ett antal IBPS, multipla band observeras, vilka kan motsvara olika IBP isoformer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För framgångsrik analys och rening av IBPS är det viktigt att förstå temperaturkänsliga karaktären hos vissa av dessa proteiner. Viss växt IBPS blir instabila vid temperaturer över 0 ° C, vilket resulterade i utfällning, utfällning och inaktivitet. I syfte att erhålla aktiva IBPS, är det ofta kritiskt att växter bearbetas i ett kallt rum (~ 4 ° C) och proverna hålls på is under experimenterande. En annan faktor att beakta vid användning av helcells-rålysat är nedbrytningen av proteiner genom endogena proteaser. I växter, är uttrycket för IBPS generellt låga, och sålunda någon förlust i proteinutbytet kunde resultera i otillräcklig material för framtida experiment eller analys. Arbeta snabbt under proteinextraktion, med tillägg av en tillförlitlig proteasinhibitorcocktail kan reducera sådan proteinförlust. Dessutom är det viktigt att kall acklimatiseringsperiod optimeras för den största ansamlingen av IBPS i laboratorie vuxenväxter.
Ett annat vanligt problem när man arbetar med IBPS är att många av de analyser är känsliga för temperatur och fuktighet. I fråga om att IRI-analys, kan fuktuppbyggnad på mikroskoplocket resultera i ett skikt av is som gör visualisering av iskristaller svår. Med hjälp av en avfuktare och extra uttorknings pärlor kan lösa detta problem; emellertid, är det rekommenderat att denna analys inte bedrivs när laboratorie relativa luftfuktigheten är över 70%.
Den splat-analysen, som presenteras, är kvalitativ. Genom att utföra en utspädningsserie före analys, kan fastställas IRI endpoint för att bestämma koncentrationsområde i vilket IBPS inte längre kan begränsa iskristalltillväxt. Olika laboratorier har också använt datorprogram för att mäta den genomsnittliga storleken på is kristallkorn 18. Såsom tidigare angivits, medan testning för IRI aktivitet är en effektiv inledande screening, bekräftelse av is-bindandeaktivitet bör fastställas genom bestämning av nivån av TH eller genom direkt visualisering av adsorption av IBPS till iskristaller 16. En anmärkningsvärd begränsning av IRI analys är att flera icke-IBP molekyler har identifierats som imiterar IRI aktivitet. Dessa molekyler kan inkludera skrymmande proteiner, fenol glykosider, och syntetiska polymerer såsom polyvinylalkohol 19, 20, 21. Som ett resultat bör en buffertkontroll alltid köras med prover för att säkerställa att eventuella föroreningar eller tillsatser inte resulterar i den observerade IRI aktivitet.
Medan is-affinitetsrening utförs enkelt, när den inte görs på rätt sätt, kan andra proteiner, lösta ämnen och metaboliter dominerande. Ett viktigt övervägande är graden av iskristalltillväxt; genom sänkning av kylningshastigheten (dvs till -0,02 ° C / h), växer isen hemisfären långsammare och varje icke-is-bindande molecules är mindre benägna att bli införlivad i isen kristallgittret. Närvaron av kontaminerande molekyler kan också undvikas genom att säkerställa att endast 50% av lysatet införlivas i hemisfären (dvs. 50:50, vätska till is-förhållande). Såsom tidigare angivits, kan multipla omgångar med is affinitet också klargöra is-fraktionen och resultera i ett prov med högre renhet. Noterbart är sekundära metaboliter ofta överproduceras i biotiska och abiotiska stressförhållanden i växter. Under reningen av fenolrika växtvävnader, om mörkbruna pigment kvarstår, 1,5% (volym / volym) polyvinylpyrrolidon (PVP) och 1,5% polyvinylpolypyrrolidon (vikt / volym) (PVPP) kan tillsättas till extraktionsbufferten, att neutralisera sekundär metaboliter. Antioxidanttillsatsmedel, såsom tiourea (5-10 mM) kan också användas 19, 21.
Om information om IBP av intresse är känd, ytterligare reningssteg, såsom högtrycks liquid kromatografi (HPLC) kan också användas. Modifieringar av is-affinitetsrening kan också beaktas och har rapporterats för att optimera proteinutbyte och få ytterligare insikt i IBP egenskaper inklusive snabbare is skal rening 23 och fluorescensbaserad is planet affinitet (FIPA) 24.
När optimerad, kan de tekniker som beskrivs ovan ge en renad proteinpoolen för identifiering av IBPS; emellertid kan ospecifik inkorporering av andra mycket rikligt förekommande proteiner vara oundvikligt. Medan IBPS från Pooideae familjen delar sekvenshomologi 25, på grund av den höga mångfalden mellan IBPS från olika organismer, är det typiskt inte möjligt att identifiera en IBP genom sekvenshomologi enbart. Gemensamt för IBPS är närvaron av aminosyror kända för att binda till is, inklusive treonin, serin och valin 26; identifiering av peptider sekvenser rika på these rester kan vara användbart när gruv sequence data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av en NSERC (Canada) bidrag till VKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L.
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L.
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
