Summary
توضح هذه الورقة تحديد البروتينات ملزم الجليد من مصانع تجميد متسامح من خلال تقييم النشاط تثبيط الجليد التبلور والعزلة اللاحقة IBPs الأم باستخدام تنقية الجليد تقارب.
Abstract
بروتينات ملزمة الجليد (IBPs) تنتمي إلى عائلة من البروتينات التي يسببها الإجهاد التي يتم توليفها من قبل بعض الكائنات المعرضة لدرجات حرارة تحت الصفر. في النباتات، ويحدث الضرر تجميد عندما تنمو بلورات الثلج خارج الخلية، مما أدى إلى تمزق الأغشية البلازما واحتمال موت الخلايا. امتصاص IBPs إلى بلورات الثلج يقيد مزيد من النمو من خلال عملية تعرف باسم الجليد التبلور تثبيط (IRI)، مما يقلل من تلف الخلايا. أيضا إثبات IBPs القدرة على خفض درجة التجمد حل أقل من نقطة التوازن ذوبان، وهي خاصية تعرف باسم التباطؤ الحراري (TH) النشاط. وقد أثارت هذه خصائص وقائية الفائدة في تحديد IBPs جديدة نظرا لاحتمال استخدامها في التطبيقات الصناعية والطبية والزراعية. وتصف هذه الورقة تحديد مصنع IBPs من خلال 1) تحريض واستخراج IBPs في الأنسجة النباتية، 2) فحص مقتطفات للنشاط IRI، و3) العزلة وpurification من IBPs. بعد تحريض IBPs عن التعرض درجة حرارة منخفضة، ويتم اختبار مقتطفات للنشاط IRI باستخدام "تنبيه الفحص"، الذي يسمح للمراقبة نمو البلورات الجليدية باستخدام المجهر الضوئي العادي. هذا الاختبار يتطلب تركيز منخفض البروتين ويولد النتائج التي يتم الحصول عليها بسرعة وتفسيرها بسهولة، وتوفير شاشة الأولية للنشاط ملزم الجليد. IBPs ومن ثم يمكن عزلها عن تلويث البروتينات من خلال الاستفادة من خاصية IBPs إلى كثف على الجليد، من خلال تقنية تسمى "تنقية الجليد تقارب. استخدام لست] خلية تم جمعها من المستخلصات النباتية، أحد نصفي الكرة الأرضية الجليد يمكن أن تنمو ببطء على التحقيق النحاس. هذا يتضمن IBPs في البنية البلورية من الجليد الكريستالات. لا تتطلب معرفة البيوكيميائية أو الهيكلية مسبقة من نقابة المحامين، هذا الأسلوب يسمح للانتعاش من البروتين النشط. كسور البروتين المنقى الجليد يمكن استخدامها لتطبيقات المصب بما في ذلك تحديد الحماسيتسلسل المد التي كتبها الطيف الكتلي وتحليل الكيمياء الحيوية للبروتينات الأم.
Introduction
بروتينات ملزمة الجليد (IBPs) هي عائلة متنوعة من البروتينات الوقائية التي تم اكتشافها في عدد من الكائنات الحية بما فيها النباتات 1، 2 الحشرات والأسماك 3، والميكروبات 4. الميزة الرئيسية لهذه البروتينات هي قدرتها الفريدة على كثف تحديدا وكفاءة لبلورات الثلج، وتعديل نموها. IBPs ديك العديد من الخصائص موثقة، مع اثنين تتميز الأكثر رفاهية التباطؤ الحراري (TH) وتثبيط الجليد التبلور (IRI). لوحظ نشاط TH بسهولة أكبر في IBPs المنتجة في الحيوانات تجميد التعصب. نتائج هذا النشاط في خفض درجة التجمد من السوائل في الدورة الدموية أو الخلالي الكائنات الحية "لمنع التجمد. في المقابل، في الكائنات الحية تجميد متسامح، والتي سوف تجميد حتما في درجات حرارة تحت الصفر، IBPs يبدو أن النشاط TH منخفضة. وعلى الرغم من النشاط TH منخفض، وهو نشاط IRI عالية لتقييد صرخة الجليدوكثيرا ما لوحظ نمو ستال مع هذه البروتينات. بالنسبة للكائن الحي تجميد متسامح، وهذا النشاط IRI يساعد يفترض حماية الخلايا من النمو غير المنضبط من الجليد في مقصورات خارج الخلية.
على زر "فراش" نموذج يمكن استخدامها لوصف الآلية التي IBPs منع نمو بلورات الثلج 5. وبموجب هذا النموذج، IBPs كثف خصيصا لسطح الجليد الكريستال على فترات، مثل أن جزيئات الماء يمكن أن تتضمن فقط مع تنامي شعرية الكريستال الجليد في الفضاء بين IBPs المربوطة. وهذا يخلق انحناء الذي يجعل إدماج جزيئات الماء إضافية غير مواتية، وهو الحدث الذي يمكن وصف تأثير جيبس-تومسون 6. تقدم الراسية المياه مشبكة فرضية آلية لملزمة محددة من IBPs على سطح الجليد الكريستال حيث وجود بقايا اتهم المتمركزة على وجه التحديد على موقع بروتين ملزمة الجليد، والنتائج في ريوبأنهم يعتمدون على جزيئات الماء بحيث تتطابق مع واحد أو أكثر من الطائرات شعرية الكريستال الجليد 7.
النشاط TH يمكن كميا عن طريق قياس الفرق بين الذوبان وانخفاض درجات الحرارة من الكريستال الجليد واحد في وجود نقابة المحامين. في حين أن النشاط TH هي طريقة مقبولة على نطاق واسع لتقييم نشاط IBPs، فإن الفجوة TH المنخفضة التي تنتجها IBPs محطة (عادة سوى جزء صغير من درجة) عادة يتطلب تركيز نسبة عالية من البروتين، والمعدات المتخصصة والخبرة المشغل. وعلى الرغم من عدم IBPs-قد تحد من نمو البلورات الجليدية، بل هو ملكية مشتركة من قبل جميع IBPs وبالتالي اختبار للنشاط IRI وشاشة الأولية الفعالة لوجود IBPs، خصوصا بالنسبة لأولئك مع النشاط TH منخفضة. المنهجية المستخدمة لاختبار هذا النشاط يعرف باسم "فحص تنبيه"، حيث عينة البروتين فلاش تجميد لإنتاج أحادي الطبقة من بلورات الثلج الصغيرة، التي تمت ملاحظتها على مدى فترة من الوقت لتحديد ما إذا كانيقتصر نمو البلورات الجليدية. وخلافا للطرق الأخرى المستخدمة لفحص عينة الأنسجة مصدر لوجود IBPs، هذه التقنية قابلة للتطبيق لتركيزات بروتين منخفضة في حدود 10-100 نانوغرام، وتستخدم معدات يسهل ملفقة، ويولد البيانات التي يتم تفسيرها بسرعة وسهولة. ومع ذلك، فمن المهم التأكيد على أن هذا الفحص يوفر شاشة الأولية لIBPs التي ينبغي اتباعها من قبل تحديد TH وتشكيل الكريستال الجليد.
عزل البروتينات الأم يمثل تحديا، وغالبا ما تتطلب من المعلومات حول الخصائص التركيبية والكيميائية الحيوية للبروتين من الفائدة. تقارب من IBPs من أجل الايس يسمح لعزل هذه البروتينات باستخدام الثلج باعتبارها الركيزة لأغراض تنقية. منذ يتم دفع غالبية الجزيئات قبل الحدود، الماء المثلج أثناء نمو البلورات الجليدية، والنمو البطيء للجليد نصف الكرة في وجود نتائج العينة IBP في عينة درجة عالية من النقاء، خالية من الكميه كبيرالمنشأ من تلويث البروتينات والأملاح. وقد استخدم هذا الأسلوب لتحديد IBPs من الحشرات 8، 9، 10، 11 البكتيريا والأسماك والنباتات 12 13 و 14. بالإضافة إلى ذلك، الكسور المخصب IBP الذي تحقق من خلال هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل الكيمياء الحيوية المصب. توضح هذه الورقة تحديد IBPs في النباتات من خلال الاستقراء واستخراج IBPs، وتحليل النشاط IRI للتأكد من وجود البروتينات، وعزل البروتينات باستخدام تنقية تقارب الجليد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إعداد جهاز 1. الضجة
- ملء تعميم حمام الماء برمجة درجات الحرارة مع جلايكول الإثيلين (50٪ ت / ت في الماء).
ملاحظة: الأخضر السيارات جلايكول الإثيلين يمكن استخدامها. - لتجميع الغرفة الخارجية، واستخدام أنابيب بلاستيكية معزول إرفاق حمام الماء إلى وعاء زجاجي مزدوج الجدران. عزل وعاء زجاجي مع رغوة البوليسترين، وتغطي مع البلاستيك طبق بتري غطاء. قطع حفرة 4/3 بوصة في الجزء السفلي من الغرفة البوليسترين بحيث يمكن أن ينظر إلى مصدر الضوء من خلال غرفة زجاجية.
- جبل غرفة الخارجية على مجهر التشريح، مزودة بمنفذ الكاميرا و4X الاستقطاب عدسة موضوعية مع 10X عدسة العين. ضع قطعة إضافية من الفيلم الاستقطاب في الجزء السفلي من الغرفة الخارجية.
- المشبك أنبوب 1-1.5 متر (~ 5 سم القطر) على موقف معوجة ومكان داخل حاوية البوليسترين كبيرة، جنبا إلى جنب مع كتلة التبريد وضعه تحت الأنبوب في قاعدة موقف معوجة.
2. إعداد البروتين الأصلي مقتطفات لتحليل IRI
- للحث على التعبير عن IBPs في الأعشاب تجميد متسامح أو غيرها من الأنواع النباتية تجميد متسامح والنباتات تأقلم الباردة لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية، في ظل ظروف الإضاءة الخافتة (6 ساعات ضوء / 18 ساعة الظلام). هذا لا ينطبق على العينات التي تم جمعها من الحقل الذي تعرضوا بالفعل لظروف درجات الحرارة المنخفضة وفترات التأقلم.
- الحصول على ما يقرب من 0.1 غرام من الأنسجة ورقة عن طريق قطع عند قاعدة الساق وبعد ذلك وضعت في أنبوب 1.5 مل. مضة فورا تجميد العينة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ليز الخلايا، طحن عينات الأنسجة إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة تحت النيتروجين السائل. تأكد من أن النيتروجين السائل لا يتبخر أثناء عملية التجانس.
- المكان على الفور عينات الأرض على الجليد، والسماح للالنيتروجين السائل لتتبخر تماما. إضافة 1 مل من extracti البروتين الأصليعلى العازلة التي تحتوي على 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 25 مم كلوريد الصوديوم (7.5 درجة الحموضة)، مع اثنين من أقراص مثبط البروتياز خالية من EDTA وأضاف مباشرة قبل الاستعمال. ماصة لخلط. لا الدوامة.
ملاحظة: قد تحتاج إلى استخدام مواد مضافة إضافية إذا كان المحللة يحتوي المركبات الثانوية (انظر مناقشة). - يهز بلطف عينات بين عشية وضحاها (18-24 ساعة) في 4 ° C. إجراء الخطوات المتبقية في 4 درجات مئوية.
- إزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي العينات في ~ 16000 x ج لمدة 5 دقائق. الإبقاء على جزء قابل للذوبان وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق إضافية إذا استمر الحطام الخلوي. عينات أوضح يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. الضجة الفحص ما قبل التجربة قم بإعداد
- صب 100 مل من الهكسان في الغرفة الخارجية بإعداد مع الفيلم المستقطب وإضافة 5-6 حبات جفاف لمنع الرطوبة تبنى على الشرائح. إضافة كمية صغيرة من الشحوم فراغ لوحة تغطي حمام وتطور لضمان ختم مشددة ومنع التبخر من الهكسان. تبريد حمام الهكسان بين -4 ° C و-6 درجة مئوية باستخدام حمام مائي برمجة حوالي 2-3 ساعات قبل بدء التجربة. تأكد للتحقق من درجة حرارة الهكسان مع ميزان حرارة قبل بداية التجربة.
- وضع كتلة التبريد في مربع البوليسترين تحت أنبوب بلاستيكي مباشرة وتغطية تماما مع الثلج الجاف، 40 دقيقة قبل بدء التجربة.
- قبل البدء في الفحص، تأكد من أن الأنبوب هو المستوى. لتحديد مكان على كتلة التبريد سوف عينة إسقاط، أول اختبار الإجراء مع الماء وتشير إلى حيث تنخفض عينة مع علامة (كما هو موضح أدناه).
- إزالة الثلج الجاف من الجزء العلوي من كتلة البارد ووضع ميكروسكوب زجاجية غطاء الشريحة على علامة قطرة التي تم تحديدها مع الماء.
- على الفور قبل بدء الفحص، بدوره على مصدر الضوء وكشط أي الجليد التي شكلت على الجزء السفلي من الغرفة الزجاجية. تجنب الاحتفاظ مصدر الضوء على ما لم بلورات الثلجويجري تصور لمنع تسخين الهكسان.
4. إجراء الفحص على الضجة
- تراجع غيض المتاح الملصقة على ماصة أوتوماتيكية (1-20 ميكرولتر) في النفط الغمر، وذلك باستخدام منشفة ورقية إزالة أي فائض من النفط. سوف تسمح هذه الخطوة العينة في الانخفاض بدلا من الانضمام إلى خارج ماصة.
ملاحظة: إزالة فائض المعروض النفطي من ماصة أمر بالغ الأهمية لضمان أن قطرات النفط لا تشكل على بلورات الثلج، مما يجعل من الصعب التصور. - ماصة 10 ميكرولتر من العينة ومكان ماصة مباشرة عبر أنابيب بلاستيكية قبل الافراج عن العينة. يجب أن يسمع واضح 'تنبيه' الصوت عندما يضرب العينة الشريحة الغطاء الزجاجي، وخلق أحادي الطبقة من بلورات الثلج.
- بسرعة وإزالة بعناية شريحة المجهر من كتلة الباردة باستخدام الملقط ومكان في الحمام الهكسان على رأس الفيلم الاستقطاب.
- أبحث تحت المجهر، ووضع شريحة المجهر في مجال الرؤية والإعلانمجرد عدسة موضوعية بحيث يسمح الاستقطاب المتقاطع لتصور من بلورات الثلج عالية التباين. ضبط التكبير إلى 40X.
- نعلق الكاميرا إلى المجهر وضبط الإعدادات إلى "ماكرو" للسماح التصور الواضح من بلورات الجليد والتقاط الصورة.
ملاحظة: في انتظار ما يصل الى 1 ساعة للسماح بلورات الثلج في النمو يمكن أن تعطي صورة أكثر وضوحا. - كرر الخطوات من 4،1-4،5 لجميع العينات. عادة، وضع ما يصل إلى 6 شرائح مع عينة مختلفة في غرفة الهكسان.
- إيقاف مصدر الضوء ووضع لوحة من البلاستيك على الحمام الهكسان، وضمان ختم مشددة. السماح بلورات الثلج ليصلب بين عشية وضحاها (12-24 ساعة، والحفاظ على فترة الصلب متناسقة ضمن فحص معين). وبعد الحضانة، والتقاط الصور من الأفلام الجليد كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: بعض العينات قد أعد بلورة بسرعة أكثر من غيرها. إذا لم يكن هناك التبلور هو واضح بعد 12 ساعة، والسماح بلورات ليصلب لمدة تصل إلى 24 ساعة لضمان عدم recrystalliوتحدث اإلثيوبية.
تحليل 5. الضجة الفحص بيانات
- تحميل الصور إلى جهاز الكمبيوتر ومقارنة مباشرة حجم بلورات الثلج قبل وبعد الصلب. سوف العينات مع النشاط التبلور الجليد لا تنمو، في حين أن العينات دون أي نشاط IRI سوف أعد بلورة تشكيل بلورات الثلج أكبر بشكل ملحوظ. سوف تدخل ضوء جعل تظهر بلورات الثلج الكبيرة بألوان مختلفة قليلا، وبالتالي من السهل أن نرى.
6. الآيس تقارب إعداد معدات تنقية
- ملء تعميم حمام الماء برمجة درجات الحرارة مع جلايكول الإثيلين. الأخضر السيارات جلايكول الإثيلين يمكن استخدامها.
- ربط الحمام لتحقيق جوفاء، والنحاس باستخدام معزول أنابيب البلاستيك (15).
- بناء حاوية البوليسترين داخل أي 150 مل دورق يمكن أن يصلح سنججلي. إنشاء غطاء للحاوية مع وجود ثقب في مركز للإصبع تبريد النحاس.
7.إعداد عينات لتنقية الآيس تقارب
- تأقلم البارد الأنسجة النباتية كما وصفها في القسم 2.1.
- اجمع ~ 100-150 غرام من الكتلة الحيوية الأرض (الخطوة 2.3) في 20 مل من أنابيب ومضة فورا تجميد. يمكن أن تظل عينات في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- تحضير العينة كما هو موضح في أقسام 2،3-2،5. استخدم 1 من: 1 نسبة (ملغ من الأنسجة: مل من العازلة استخراج البروتين الأصلي) لإعادة تعليق من الأنسجة ورقة. استخدام أقراص إضافية مثبط البروتياز لتجنب تدهور IBPs بواسطة البروتياز الذاتية.
ملاحظة: إذا كانت عينة الأنسجة هي مركزة للغاية، وضبط نسبة إلى 1: 2 أو 1: 3 (ملغ من الأنسجة: مل من العازلة استخراج البروتين الأصلي). - لإزالة الحطام الخلوي، غربال المحللة الى 2 طبقات من القماش القطني، و 3 مرات. بيليه الحطام بواسطة الطرد المركزي في 30000 x ج لمدة 40 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- زيادة حجم العينة 120 مل باستخدام عازلة استخراج البروتين الأصلي. استخدام المحللة فورا لتنقية الجليد تقارب لتجنب أي فقدان النشاط ملزم الجليد.
8. إجراء تنقية الآيس تقارب
- قبل التنقية، وتعيين حمام ماء للبرمجة لتبرد من -0.5 ° C إلى C -3 ° بمعدل -0.04 ° C / ساعة.
ملاحظة: يمكن تعديل معدل التبريد اعتمادا على حجم الأولي من العينة. - تبريد إصبع الجليد إلى -0.5 ° C وبعد ذلك سوبمرز ذلك في أنبوب 50 مل تحتوي على الماء المقطر البارد. إضافة بضع رقائق الثلج لتسهيل التنوي الجليد والسماح طبقة رقيقة من الجليد لتشكيل على الاصبع. هذه العملية تستغرق عادة ما بين 20 و 30 دقيقة.
ملاحظة: أي كتل في الإصبع المغلفة الجليد يجب ممهدة مع قفاز قبل وضعها في العينة. إذا لم طبقة الجليد تشكل في -0.5 ° C، وانخفاض درجة الحرارة إلى -0.75 ° C. - عينة مكان في 150 مل دورق زجاجي يحتوي على شريط مغناطيسي صغير في وعاء البوليسترين على أعلى من محرك مغناطيسي. تأكد من أن إصبع الجليدوتركزت على خفض ما لا يقل عن نصف الطريق في عينة السائل. ختم الحاويات.
- ويسمح هذا البرنامج لتشغيل ما يقرب من يومين، والتحقق من كل 24 ساعة. مرة واحدة يتم تجميد 50٪ من العينة، ووقف البرنامج. وإدماج IBPs في نصف الكرة الجليد يؤدي إلى "الجليد الحفر".
ملاحظة: تجارب تنقية ويمكن أن يتم باستخدام وحدات التخزين عينة أكبر مع طول الوقت الذي يدير برنامج تعديلها وفقا لذلك. - من أجل إزالة نصف الكرة الجليد، تدفئة التحقيق إلى 4 درجات مئوية، وشطف نصف الكرة مع الماء المقطر لإزالة البروتين غير منضم، ومن ثم ذوبان الجليد في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: معظم IBPs ليست مستقرة في الماء وجود مخزن مؤقت المناسب (أي 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8 أو 50 ملي بيكربونات الأمونيوم، ودرجة الحموضة 8) سوف تحتاج إلى أن تضاف دوريا أثناء عملية ذوبان الجليد (حوالي 1 مل / 2 ح) . نصفي الكرة الجليد يمكن أن تكون ملفوفة في رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية قبل الذوبان. - إذا كان الجليد نصف الكرة لا تزال تحتوي علىالصورة الصباغ، أو لزيادة تنقية العينة، كرر الخطوات من 8،1-8،5 2-3 مرات.
ملاحظة: على الرغم من أن تركيز IBP قد تكون أقل يلي جولات متعددة لتنقية والنقاء هو أكثر قيمة من انتاج ما اذا كان سيتم تحليل عينات النقاء باستخدام MS. إذا كانت المادة كافية متاحة، فمن المستحسن ثلاث جولات من تنقية الجليد تقارب.
9. تحديد IBPs
- منذ ترد IBPs في كمية كبيرة بعد ذوبان الجليد نصف الكرة، والتركيز على العينات. التركيز عينات تحتوي على ~ 100 غرام من الأنسجة إلى ~ 1-3 مل باستخدام أنابيب الطرد المركزي تركيز مع 3000 دا الوزن الجزيئي قطع لتجنب فقدان بروتينات صغيرة.
- قبل إرسال عينات للMS، تحديد تركيز البروتين باستخدام البروتين الكمي فحص مثل BCA أو برادفورد الفحص. تقدير نقاء العينات عن طريق الكهربائي للهلام مثل SDS-PAGE. اختبار تنقية البروتينات للنشاط IRI قبل حد ذاتهاnding لMS للتأكد من أن البروتين النشط الذى تم الاحتفاظ من خلال تنقية وتركيز الخطوات.
- استخدام عينات المركزة مباشرة لتحليل الطيف الكتلي 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لسهولة انشاء الشكل 1 و وترد الرقم 2 كما تمثيلات بصرية من المعدات المستخدمة لتحليل IRI وتنقية الثلج تقارب، على التوالي. وصفت نتائج التحليل IRI باستخدام مقتطفات جمعها من الاعشاب الخردل مع وبدون IBPs في الشكل (3). وتبين هذه النتائج أن مستخلصات الاعشاب التي تم جمعها من الخردل، الذي لا تجميد متسامح، لم يتمكنوا من تقييد نمو البلورات الجليدية بسبب عدم وجود IBPs الحاضر. في المقابل، فإن بلورات الثلج الصغيرة شهدت مع النباتات المعدلة وراثيا تحتوي على IBPs من ryegrass المعمرة تقييد نمو البلورات الجليدية بشكل كبير. ويبين الشكل 4 نصفي الكرة الجليد نمت باستخدام مقتطفات ryegrass المعمرة معربا عن IBPs بعد جولتين من التنقية. بعد الجولة الأولى من تنقية درجة عالية من الجليد الحفر على hemispheإعادة يشير السطحية التي IBPs وقد كثف إلى الجليد وتعديل نمو بلورات الجليد (الشكل 4A). الجولة الثانية من تنقية هو مبين في الشكل 4B ديها أكثر وضوحا الجليد، مشيرا إلى أن هناك بعض استبعاد الجزيئات الملوثة. الآيس الحفر على سطح الكرة الأرضية يشير إلى أن IBPs لا تزال موجودة. ويبين الشكل 5 وSDS-PAGE التالية تنقية الجليد تقارب، من البروتينات التي تم جمعها من ryegrass المعمرة، وملطخة وقت لاحق مع وصمة عار الفضة. وقد تم التعرف على عدد من البروتينات مع سبعة فرق متميزة، الموافق البروتينات الأكثر وفرة أن كثف إلى جليد.
الشكل 1: التمثيل البياني للجهاز تنبيه 16. المعدات لنا إد لتوليد أحادي الطبقة من بلورات الثلج (A) ولتصور للنمو وضوح الشمس الجليد (B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: جهاز يستخدم لتنقية الجليد تقارب IBPs 16. ويستخدم النحاس "إصبع الجليد" تعلق على حمام جلايكول الإثيلين برمجة تنمو ببطء على الجليد نصف الكرة الغربي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
g3.jpg "/>
الشكل 3: بيانات تمثيلية تم الحصول عليها باستخدام تحليل IRI 17. هو تصور أحادي الطبقة من بلورات الثلج شكلت استخدام المستخلصات النباتية في التكبير 40X. وتمت مقارنة مقتطفات من النوع البري نبات الأرابيدوبسيس thaliana التي لا تحتوي على IBPs (-IBPs) لمقتطفات من المعدلة وراثيا A. thaliana معربا عن IBPs من زوان معمر (+ IBPs). بعد فترة الحضانة 18 ساعة في -4 ° C، وبلورات الثلج بلورته في المخزن المؤقت والبرية من نوع عينات A. thaliana. في المقابل، كان مقتصرا نمو البلورات الجليدية في مقتطفات A. thaliana إبداء IBP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الآيس نصفي الكرة الأرضية المزروعة باستخدام مقتطفات IBP التي تم جمعها من العشب تجميد متسامح، L. perenne. بعد تعرض مقتطفات العشب لجولة واحدة من تنقية الجليد تقارب والآيس الحفر من سطح الكرة الأرضية الجليد يشير إلى التأسيس الناجح لIBPs (A). لإزالة الأملاح إضافية، أصباغ، والبروتينات تلويث، وكان يستخدم في الجولة الثانية من الجليد تقارب، مما أدى إلى أكثر وضوحا الجليد نصف الكرة الأرضية (B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رصد تنقية IBPs الأم من ryegrass دائم. وبعد جولتين من تنقية الجليد تقارب والتركيز الطرد المركزي،تم electrophoresed مقتطفات عشب الأم على تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ومن ثم تصور باستخدام صمة عار الفضة. حارة 1: الجزيئي سلم وزن البروتين. لين 2: استخراج مخفف. لين 3-5: عينات المخفف في الماء قبل التحميل هلام مع نسبة 1: 2، 1: 5، و01:10 (الماء العينة). منذ يحتوي هذا الأنواع النباتية معين عدد من IBPs، والعصابات متعددة لوحظ والتي قد تتوافق مع مختلف الأشكال الإسوية IBP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتحليل ناجحة وتنقية IBPs، فمن المهم أن نفهم طبيعة حساسة للحرارة بعض هذه البروتينات. بعض النباتات IBPs تصبح غير مستقرة في درجات حرارة أعلى من 0 درجة مئوية، مما أدى إلى تتكشف، وهطول الأمطار وقلة النشاط. من أجل الحصول على IBPs النشطة، فمن الأهمية بمكان في كثير من الأحيان أن تتم معالجة النباتات في غرفة باردة (~ 4 ° C) ويتم الاحتفاظ عينات على الجليد خلال التجريب. وثمة عامل آخر للنظر عند استخدام لست] الخام خلية كاملة هو تدهور البروتينات التي البروتياز الذاتية. في النباتات، والتعبير عن IBPs منخفضة عموما، وبالتالي أي خسارة في العائد البروتين يمكن أن يؤدي إلى مواد كافية للتجريب أو تحليل المستقبل. يمكن أن تعمل بسرعة خلال استخراج البروتين، مع إضافة موثوق الكوكتيل مثبط البروتياز لحد من هذه الخسائر البروتين. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن يكون الأمثل فترة التأقلم البارد لأكبر تراكم IBPs في مختبر نمتالنباتات.
مشكلة مشتركة أخرى عند العمل مع IBPs هي أن العديد من المقايسات حساسة لدرجة الحرارة والرطوبة. في ما يخص تحليل IRI، يمكن أن رطوبة تراكم على المجهر غطاء منزلق يؤدي إلى طبقة من الجليد الذي يجعل التصور من بلورات الثلج صعوبة. باستخدام مزيل الرطوبة، ويمكن أن حبات جفاف إضافية حل هذه الصعوبة. ومع ذلك، فمن المستحسن أن هذا الاختبار لا تجري عند المختبر مستويات الرطوبة النسبية هي فوق 70٪.
فحص تنبيه، كما وردت، هو نوعي. عن طريق إجراء سلسلة تخفيف قبل التحليل، يمكن تحديد نقطة النهاية IRI لتحديد نطاق التركيز فيها IBPs لم تعد قادرة على تقييد نمو البلورات الجليدية. وقد استخدمت مختبرات مختلفة أيضا برامج الكمبيوتر لقياس متوسط حجم الحبوب وضوح الشمس الجليد (18). كما ذكر سابقا، أثناء اختبار للنشاط IRI هو الشاشة الأولي كفاءة، وتأكيد الربط الجليدوينبغي وضع النشاط من خلال تحديد مستوى TH أو من خلال وضع تصور بشكل مباشر على امتصاص IBPs إلى بلورات الثلج 16. وجود قيود ملحوظ للتحليل IRI هو أن العديد من الجزيئات غير نقابة المحامين وقد تم تحديد أن النشاط IRI تقليد. ويمكن أن تشمل هذه الجزيئات البروتينات الضخمة، جليكوسيدات الفينول، والبوليمرات الاصطناعية مثل البولي فينيل الكحول 19 و 20 و 21. ونتيجة لذلك، ينبغي دائما أن يتم تشغيل جهاز تحكم عازلة مع عينات للتأكد من أن أي ملوثات أو مواد مضافة لا يؤدي في النشاط IRI ملاحظتها.
في حين يتم تنفيذ تنقية الجليد تقارب بسهولة، وعندما لا يتم بشكل صحيح والبروتينات الأخرى، المواد المذابة ونواتج يمكن الغالبة. وهو عامل مهم هو معدل نمو البلورات الجليدية. عن طريق خفض معدل التبريد (أي إلى -0.02 ° C / ساعة)، في نصف الكرة الجليد تنمو ببطء أكثر وأي molecu غير ملزم الجليدهم أقل عرضة لتصبح إدراجها في شعرية الكريستال الجليد ليه. وجود جزيئات تلوث يمكن تجنبه عن طريق ضمان أن 50٪ فقط من المحللة وهو مدرج في نصف الكرة الأرضية (أي 50:50، السائل إلى نسبة الجليد). كما ذكر سابقا، جولات متعددة من تقارب الجليد يمكن أيضا توضيح الجليد جزء ويؤدي إلى عينة من أعلى نقاء. والجدير بالذكر أن كثيرا ما يفرط إنتاجها المركبات الثانوية تحت ظروف الإجهاد الحيوية وغير الحيوية في النباتات. خلال تنقية الأنسجة النباتية الفينول الغنية، إذا أصباغ داكنة اللون البني لا تزال قائمة، 1.5٪ (ت / ت) بوفيدون (PVP) و 1.5٪ polyvinylpolypyrrolidone (ث / ت) (PVPP) يمكن أن تضاف إلى المخزن المؤقت استخراج، لتحييد الثانوية الأيض. ويمكن أيضا الإضافات المضادة للأكسدة مثل ثيوريا (5-10 ملم) يمكن أن تستخدم 19 و 21.
إذا كانت المعلومات عن IBP من الفائدة هو معروف، خطوات تنقية إضافية، مثل ارتفاع ضغط لىويمكن أيضا اللوني مضغة (HPLC) يمكن استخدامها. ويمكن أيضا إدخال تعديلات على تنقية الجليد تقارب اعتبار وتم الإبلاغ لتحسين العائد البروتين واكتساب المعرفة إضافية إلى خصائص IBP بما في ذلك تقارب أسرع القشرة الجليدية تنقية 23 ومضان المستندة إلى الطائرة الجليد (FIPA) 24.
عندما الأمثل، يمكن للتقنيات المذكورة أعلاه تسفر عن تجمع البروتين النقي لتحديد IBPs. ومع ذلك، دمج غير محدد من البروتينات وفيرة للغاية أخرى قد تكون لا مفر منه. في حين IBPs من عائلة Pooideae حصة تسلسل تناظر 25، نظرا لتنوع كبير بين IBPs من الكائنات الحية المختلفة، فإنه عادة لا يمكن التعرف على IBP من تسلسل تناظر وحده. وثمة سمة مشتركة من IBPs هي وجود الأحماض الأمينية المعروفة لربط الجليد، بما في ذلك ثريونين، سيرين وحمض أميني أساسي 26؛ تحديد الببتيدات تسلسل غنية عشرقد تكون بقايا جنوب شرقي مفيدا عندما التعدين سيكوينس داتا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل منحة NSERC (كندا) إلى VKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L.
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L.
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
