Summary
Dette dokumentet beskriver identifikasjon av is-bindende proteiner fra fryse-tolerante planter gjennom vurdering av is-rekrystallisasjon inhiberende aktivitet og påfølgende isolering av naturlige aktørene kan ved hjelp av is-affinitetsrensing.
Abstract
Ice-bindende proteiner (uavhengige aktører) tilhører en familie av stress-induserte proteiner som syntetiseres av visse organismer som utsettes for temperaturer under frysepunktet. I planter, oppstår frostskader når ekstracellulære iskrystaller vokser, noe som resulterer i brudd på plasmamembraner og mulig celledød. Adsorpsjon av aktørene kan til iskrystaller begrenser videre vekst ved en prosess som er kjent som is omkrystallisering inhibering (IRI), for derved å redusere cellulær skade. Aktørene kan også vise evne til å nedsette frysepunktet av en løsning under likevektssmeltepunkt, en egenskap som er kjent som termisk hysterese (TH) aktivitet. Disse beskyttende egenskaper har hevet interesse i identifikasjon av nye aktørene kan på grunn av deres potensielle anvendelse i industri, medisin og jordbruksanvendelser. Dette dokumentet beskriver identifisering av plante aktørene kan gjennom 1) innløps- og utvinning av aktørene kan i plantevevet, 2) screening av ekstrakter for IRI aktivitet, og 3) isolering og opprensetication av globale kjernenettgrossistene. Etter induksjon av aktørene kan ved lav temperatur eksponering, blir ekstrakter testet for IRI-aktivitet ved anvendelse av en 'feilindikator assay', som muliggjør observasjon av is krystallvekst ved hjelp av et standard lysmikroskop. Denne analysen krever en lav proteinkonsentrasjon og frembringer resultater som er oppnådd raskt og enkelt tolket, og gir en første skjerm for is bindingsaktivitet. Aktørene kan kan så bli isolert fra forurensende proteiner ved å utnytte den egenskap uavhengige aktører å adsorbere til is, gjennom en teknikk som kalles 'is-affinitetsrensing'. Ved hjelp av cellelysater som er samlet fra planteekstrakter, kan en is halvkule langsomt dyrkes på en messing sonde. Dette gjelder blant uavhengige aktører i den krystallinske struktur av den polykrystallinske is. Krever noen a priori biokjemisk eller strukturell kjennskap til IBP, gir denne metode for utvinning av aktivt protein. Ice-rensede proteinfraksjoner kan brukes til nedstrøms applikasjoner inkludert identifikasjon av peptidevanns sekvenser ved massespektrometri og biokjemisk analyse av native proteiner.
Introduction
Ice-bindende proteiner (uavhengige aktører) er en sammensatt familie av beskyttende proteiner som har blitt oppdaget i en rekke organismer, inkludert planter, insekter 1 2, 3, fisk og mikrober 4. Den viktigste funksjonen til disse proteinene er deres enestående evne til spesifikt og effektivt adsorbere til iskrystaller, modifisere deres vekst. Aktørene kan ha flere dokumentegenskaper, sammen med de to mest godt karakterisert, er termisk hysterese (TH) og is-omkrystallisering inhibering (IRI). TH aktivitet er mer lett observeres i aktørene kan produseres i fryse-intolerant dyr. Denne aktivitet resulterer i en senkning av frysepunktet til organismenes sirkulasjons eller interstitielle væsker for å hindre frysing. I motsetning til dette, i fryse-tolerant organismer, som uunngåelig vil fryse ved temperaturer under frysepunktet, aktørene kan synes å ha lav TH aktivitet. Til tross for den lave TH aktivitet, til en høy aktivitet IRI begrense iskryststal vekst er ofte observert med disse proteiner. For fryse-tolerant organisme, dette IRI aktiviteten antagelig bidrar til å beskytte cellene mot ukontrollert vekst av is i ekstracellulære rom.
Den "madrass knapp" modellen kan brukes til å beskrive mekanismen som aktørene kan hindre vekst av iskrystaller 5. Under denne modellen, aktørene kan spesifikt å adsorbere til den iskrystall overflate i intervaller, slik at vannmolekylene kan bare innlemme med økende is krystallgitteret i rommet mellom bundne uavhengige aktører. Dette skaper en krumning som gjør inkorporering av ytterligere vannmolekyler ugunstig, en hendelse som kan beskrives ved den Gibbs-Thomson-effekt 6. Det forankrede innesluttede vann hypotese gir en mekanisme for den spesifikke binding av aktørene kan til is krystalloverflaten, hvorved tilstedeværelsen av ladede rester, spesielt plassert på proteinet is bindingssetet, resulterer i den reorganization av vannmolekylene slik at de samsvarer med ett eller flere plan over is krystallgitteret 7.
TH aktivitet kan kvantifiseres ved å måle forskjellen mellom smelte og minusgrader i et enkelt iskrystaller i nærvær av en IBP. Mens TH aktivitet er en bredt akseptert metode for å vurdere aktiviteten av aktørene kan den lave TH gapet produsert ved anlegget uavhengige aktører (vanligvis bare en brøkdel av en grad) som normalt krever en høy proteinkonsentrasjon, spesialutstyr og operatørerfaring. Selv om det ikke kan uavhengige aktører begrense is krystallvekst, er det en egenskap som deles av alle aktørene kan og således teste for IRI-aktivitet er effektiv initial skjerm for tilstedeværelse av aktørene kan, spesielt for de med lav TH aktivitet. Den metodikk som brukes til å teste denne aktivitet er kjent som en 'feilindikator assay', hvorved en proteinprøve blir flash-frosset for å produsere et monolag av små iskrystaller, som observeres i løpet av en periode for å avgjøre omIskrystallvekst er begrenset. I motsetning til andre metoder som brukes til å skjerme en kildevevsprøve for nærvær av IBP, er denne teknikken anvendelig for lavproteinkonsentrasjoner i området 10-100 ng, benytter lettfabrikkert utstyr og genererer data som raskt og enkelt tolkes. Imidlertid er det viktig å understreke at denne analysen gir en innledende skjerm for IBPer som bør følges av bestemmelsen av TH og iskrystallforming.
Isoleringen av native proteiner er utfordrende, og krever ofte informasjon om de strukturelle og biokjemiske egenskapene til et protein av interesse. Affiniteten til IBPer for is muliggjør isolering av disse proteinene ved anvendelse av is som et substrat for rensningsformål. Siden flertallet av molekyler skyves foran isvannsgrensen under iskrystallvekst, resulterer langsom vekst av en iskule i nærvær av en IBP-prøve i en høyt renet prøve, uten stor kvantitettallet av kontaminerende proteiner og oppløste stoffer. Denne metoden har blitt anvendt for å identifisere aktørene kan fra insekter 8, 9, 10, 11 bakterier, fisk 12 og anleggene 13, 14. I tillegg kan de IBP-anrikede fraksjoner som er oppnådd gjennom denne fremgangsmåten også bli brukt til nedstrøms biokjemisk analyse. Dette dokumentet beskriver identifiseringen av aktørene kan i planter gjennom induksjon og utvinning av uavhengige aktører, til analyse av IRI-aktivitet bekrefter tilstedeværelse av proteiner, og isolering av proteiner ved anvendelse av is affinitetsrensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sprut Apparat oppsett
- Fyll en temperatur-programmerbar sirkulerende vannbad med etylenglykol (50% v / v i vann).
MERK: Grønn automotive etylenglykol kan brukes. - For å montere den ytre kammeret, bruk isolert plastrør for å feste vannbad til en dobbeltvegget glassbolle. Isoler glassbollen med polystyrenskum og dekk med en petriskål av plast lokk. Skjær en 3-4 tommers hull i bunnen av polystyren-kammeret, slik at lyskilden kan sees gjennom den glasskammer.
- Monter ytre kammer på en diseksjonsmikroskop, utstyrt med et kamera og en port 4X polarisert objektiv med et 10x okulær linse. Plassere en ekstra stykke polarisert film i bunnen av det ytre kammer.
- Spenn 1-1,5 m rør (~ 5 cm diameter) på en retorte stativ og sted inne i en stor polystyren-beholder, sammen med en kjøleblokk som er plassert under røret ved bunnen av retorten stativet.
2. Fremstilling av native proteinekstrakter for IRI Analyse
- For å indusere ekspresjon av aktørene kan i fryse-tolerant gress eller andre fryse-tolerant plantearter, kalde akklimatisere planter i opptil 1 uke ved 4 ° C, under dårlige lysforhold (6 timer lys / 18 timer mørke). Dette gjelder ikke for prøver samlet fra feltet som allerede har vært utsatt for forhold med lav temperatur og akklimatiseringsperiodene.
- Oppnå omtrent 0,1 g bladvev ved å kutte i bunnen av stammen og deretter plassere i et 1,5 ml rør. Umiddelbart flash fryse prøven i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C inntil bruk.
- For å lysere cellene, slipe vevsprøve til et fint pulver ved å bruke en morter og støter under flytende nitrogen. Sørge for at det flytende nitrogenet ikke fordamper under homogeniseringsprosessen.
- Umiddelbart jordprøver på is og tillate den flytende nitrogen til fullstendig å fordampe. Tilsett 1 ml av en naturlig forekommende protein extractii buffer inneholdende 10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7,5), med to EDTA-fri proteasehemmer tabletter tilsatt umiddelbart før bruk. Pipette for å blande; ikke vortex.
MERK: Ytterligere additiver kan ha behov for å bli brukt om lysatet inneholder sekundære metabolitter (se diskusjon). - Rist prøver over natten (18-24 timer) ved 4 ° C. Gjennomføre de gjenværende trinnene ved 4 ° C.
- Fjern mobilnettet avfall ved sentrifugering prøver på ~ 16 000 xg i 5 min. Beholde den løselige fraksjon og sentrifuger i ytterligere 5 min hvis cellerester vedvarer. Klarede prøven kan oppbevares ved -20 ° C inntil bruk.
3. Splat analyse Pre-eksperiment Sett opp
- Hell 100 ml heksan til ytre kammer satt opp med det polariserte film og tilsett 5-6 tørkekuler for å hindre at fuktighet bygge seg opp på skinnene. Tilsett en liten mengde av vakuum fett på platen som dekker badet og vris for å sikre en tett forsegling og hindrer fordampning av heksan. Avkjøl heksan bad mellom -4 ° C og -6 ° C ved hjelp av den programmerbare vannbad ca. 2-3 timer før forsøket ble påbegynt. Sørge for å kontrollere temperaturen av heksanet med et termometer før start av eksperimentet.
- Plasser kjøleblokken i en polystyren-boksen rett under plastrøret og fullstendig dekke med tørris, 40 min før forsøket ble påbegynt.
- Før begynner med analysen, at slangen er nivå. For å bestemme hvor på kjøleblokken prøven vil falle, første test prosedyren med vann og indikere hvor prøven faller med en markør (som beskrevet nedenfor).
- Fjern tørris fra toppen av den kalde blokken og plassere et mikroskop-dekkglass på rullemerke som har blitt bestemt med vann.
- Umiddelbart før analysen, skru på lyskilden og skrape is som har dannet seg på bunnen av glasskammer. Unngå å holde på lyskilden mindre iskrystallerblir visualisert for å hindre oppvarming av heksan.
4. Gjennomføring av feilindikator-analysen
- Dypp kasserbar spiss festet til en automatisk pipette (1-20 ul) i nedsenking olje, ved hjelp av et papirhåndkle for å fjerne overskytende olje. Dette trinnet vil tillate prøven å falle snarere enn holder seg til utsiden av pipetten.
MERK: Fjerning av overskytende olje fra pipetten er avgjørende for å sikre at oljedråper ikke danner på iskrystallene, noe som gjør visualisering vanskelig. - Pipetter 10 ul prøve og sted pipette direkte over plastrøret før frigjøring av prøven. En distinkt 'splat' lyden skal høres når prøven treffer glassdeksel sleiden, og skaper et monolag av iskrystaller.
- Raskt og fjern forsiktig objektglass fra det kalde blokken ved hjelp av pinsetter og sted i heksan bad på toppen av den polariserende film.
- Ser under mikroskopet, sette mikroskop lysbilde i synsfeltet og annonsebare objektivlinsen, slik at den krysspolariserings gjør det mulig for visualisering av bilder med høy kontrast iskrystaller. Juster forstørrelsen til 40x.
- Fest kameraet til mikroskopet og justere innstillingene til "makro" for å tillate klart visualisering av iskrystaller og ta bildet.
MERK: Venter opp til 1 time for å tillate iskrystaller å vokse kan gi et klarere bilde. - Gjenta trinn 4,1-4,5 for alle prøvene. Vanligvis legger opp til 6 objektglass med en annen prøve i heksan kammeret.
- Slå av lyskilden og plassere et plastplate over badekaret heksan, noe som sikrer en tett forsegling. Tillat iskrystaller sammensmeltet over natten (12-24 timer, få en konsistent gløding periode innenfor et bestemt assay). Etter inkubering ta bilder i kjøle filmene som beskrevet ovenfor.
MERK: Noen prøver kan recrystallize raskere enn andre. Hvis ingen rekrystallisering er åpenbar etter 12 timer, tillate krystallene å gløde i opptil 24 timer for å sikre at ingen recrystalliZation vil skje.
5. Splat Assay Data Analysis
- Last opp bildene til en datamaskin, og sammenlign direkte størrelsen på iskrystaller før og etter annealing. Prøver med isomkrystallisasjonsaktivitet vil ikke vokse, mens prøver uten IRI-aktivitet vil omkrystallisere danner merkbart større iskrystaller. Lys interferens vil gjøre store iskrystaller fremstilt i litt forskjellige fargetoner og er dermed lett å se.
6. Ice-affinitet Rensingsutstyr Oppsett
- Fyll et temperaturprogrammerbart sirkulerende vannbad med etylenglykol. Grønn automotiveetylenglykol kan brukes.
- Koble badet til en hul, messing sonde ved hjelp av isolert plastrør 15 .
- Konstruer en polystyrenbeholder inn i hvilken en 150 ml beger kan passe snuggly. Lag et lokk til beholderen med et hull i midten for messingens kaldfinger.
7.Fremstilling av prøver for is-affinitetsrensing
- Cold akklimatisere plantevev som beskrevet i avsnitt 2.1.
- Samle ~ 100-150 g av det malte biomassen (trinn 2.3) i 20 ml rør og straks flash fryse. Prøvene kan oppbevares ved -80 ° C før bruk.
- Forberede prøven som er beskrevet i avsnitt 2,3-2,5. Bruke en 1: 1-forhold (mg vev: ml av nativt protein utvinning buffer) for suspendering av bladvev. Bruke flere protease inhibitor tabletter for å unngå nedbrytning av aktørene kan av endogene proteaser.
MERK: Hvis vevsprøve er for konsentrert, justere forholdet til 1: 2 eller 1: 3 (mg vev: ml av nativt protein utvinning buffer). - For å fjerne cellerester, sil lysat gjennom 2 lag osteklede, 3 ganger. Pellet ved sentrifugering ved 30.000 x g i 40 min ved 4 ° C.
- Øke volumet av prøven til 120 ml ved bruk av naturlig forekommende protein ekstraksjonsbuffer. Bruk lysatet umiddelbart for is-affinitetsrensing tilunngå tap av is-bindingsaktivitet.
8. Gjennomføring Is-affinitetsrensing
- Før rensning sette den programmerbare vannbad for å avkjøle fra -0,5 ° C til -3 ° C med en hastighet på -0,04 ° C / time.
MERK: Avkjølingshastigheten kan justeres avhengig av det opprinnelige volum av prøven. - Avkjøl is finger til -0,5 ° C, og deretter dyppes den i et 50 ml rør inneholdende kaldt destillert vann. Legg et par isbiter for å lette iskjernedannelse og tillate at et tynt lag av is for å danne på fingeren. Denne prosessen tar vanligvis mellom 20 og 30 min.
MERK: Eventuelle klumper på is-belagte finger skal glattes med en behansket hånd før de plasseres i prøven. Dersom et islag ikke dannes ved -0.5 ° C ble temperaturen senket til -0,75 ° C. - Prøven ble anbragt i et 150 mL begerglass inneholdende en liten magnetisk rørestav inn i en polystyren-beholder på toppen av magnetrører. Sørg for at isen fingeren ersentrert og senkes i det minste halvveis inn i den flytende prøven. Avtette beholderen.
- Tillate programmet å kjøre i ca to dager, sjekke hver 24 time. Når 50% av utvalget er frosset, stoppe programmet. Inkorporering av aktørene kan i isen halvkule vil resultere i "is-etsning".
MERK: Rensing eksperimenter kan gjøres bruk av større prøvevolumer med lengden av tid ved hvilken programmet kjøres justert tilsvarende. - For å fjerne isen halvkule, varme opp sonden til 4 ° C, skylles halvkule med destillert vann for å fjerne ubundet protein, og deretter tines ved 4 ° C.
MERK: De fleste aktørene kan ikke være stabile i vann, og en egnet buffer (dvs. 50 mM Tris-HCl, pH 8 og 50 mM ammoniumbikarbonat, pH 8) må tilsettes periodisk under tiningsprosessen (ca. 1 ml / 2 h) . Is halvkuler kan være innpakket i aluminiumfolie og lagret ved -20 ° C før tining. - Hvis isen-halvkule fortsatt inneholdes pigment, eller for å øke prøven rensing, gjenta trinn 8.1-8.5 2-3 ganger.
MERK: Selv om konsentrasjonen av IBP kan være lavere etter multiple runder med rensing, er mer verdifull enn utbytte hvis de rensede prøvene blir analysert ved hjelp av MS renhet. Når tilstrekkelig materiale er tilgjengelig, blir tre runder med is-affinitetsrensing anbefalt.
9. Identifikasjon av uavhengige aktører
- Siden aktørene kan inneholdes i et stort volum etter tining av is-halvkule, konsentrere prøvene. Konsentrer prøver inneholdende ~ 100 g vev til ~ 1-3 ml med sentrifugalkraft konsentrasjons rør med en 3.000 Da molekylvekt cut-off for å unngå tap av små proteiner.
- Før sending av prøver for MS, bestemme proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en protein kvantifisering assay, slik som et BCA eller Bradford assay. Estimer renheten av prøvene ved gel-elektroforese, slik som SDS-PAGE. Test de rensede proteiner for IRI aktivitet før og for segnding til MS for å sikre at aktive protein, er blitt beholdt gjennom rense og konsentrering.
- Bruk konsentrerte prøver direkte for massespektrometrianalyse 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For enkel oppsett, figur 1 og Figur 2 er inkludert som visuelle representasjoner av det utstyr som brukes for IRI analyse og is-affinitetsrensing, henholdsvis. Resultater av analyse ved hjelp av IRI-ekstrakter samles inn fra sennep luke med og uten uavhengige aktører er avbildet i figur 3. Disse resultatene viser at ekstrakter samlet inn fra sennep luke, som ikke er fryse-tolerant, ikke var i stand til å begrense is krystallvekst på grunn av mangel på aktørene kan til stede. I motsetning til de små iskrystaller sees med transgene planter inneholdende fra aktørene kan flerårig raigress begrenser is krystallvekst betydelig. Figur 4 viser is halvkuler dyrket ved hjelp flerårig raigress ekstrakter som uttrykker aktørene kan etter to runder med rensing. Etter den første runde av rense den høye graden av is-etsing på hemisphere overflate indikerer at aktørene kan ha adsorbert til is og modifiserte vekst av iskrystaller (figur 4A). Den andre runden av rensing er vist i figur 4B er tydeligere is, noe som indikerer at det ikke var noen utelukkelse av forurensende molekyler. Is-etsing på den halvkule overflaten indikerer at aktørene kan fremdeles er til stede. Figur 5 viser en SDS-PAGE følgende is-affinitetsrensing, av proteiner som er samlet fra flerårig raigress, og deretter farget med et sølvfarge. Et antall proteiner ble identifisert med sju distinkte bånd, som svarer til de mest rikelige proteiner som adsorberer til is.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av sprutapparatet 16. utstyr oss ed for generering av et monolag av iskrystaller (A) og for visualisering av is krystallvekst (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Apparat som brukes for is-affinitetsrensing av aktørene kan 16. En messing "is finger" som er festet til en programmerbar etylenglykol-bad blir brukt til å vokse langsomt en is-halvkule. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
g3.jpg"/>
Figur 3: Representative data oppnådd ved hjelp av IRI-analyse 17. Et monolag av iskrystaller som dannes ved bruk av planteekstrakter er anskueliggjort ved 40 gangers forstørrelse. Ekstrakter fra vill-type Arabidopsis thaliana som ikke inneholder uavhengige aktører (-IBPs) ble sammenlignet med ekstrakter av transgene A. thaliana som uttrykker aktørene kan fra Lolium perenne (+ uavhengige aktører). Etter en 18 timers inkuberingsperiode ved -4 ° C, hadde is krystallisert på nytt i buffer og villtype A. thaliana prøver. I motsetning til dette ble is krystallveksten begrenses i A. thaliana ekstrakter som uttrykker en IBP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Is halvkuler dyrket ved hjelp av IBP ekstrakter oppsamlet fra fryse-tolerant gress, L. perenne. Etter gress ekstrakter ble underkastet en runde med is-affinitetsrensing, is-etsing av overflaten av isen halvkule indikerer vellykket inkorporering av aktørene kan (A). For å fjerne flere oppløste stoffer, pigmenter og forurensende proteiner, ble en andre runde med is-affinitet, og dermed få et klarere is-halvkule (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Overvåking rensing av innfødte globale kjernenettgrossistene fra flerårig raigras. Etter to runder med is-affinitetsrensing og sentrifugal konsentrasjon,naturlige gress ekstrakter ble elektroforert på en denaturerende polyakrylamidgel (SDS-PAGE) og deretter visualisert ved hjelp av sølvfarging. Felt 1: molekylvektprotein stige; Spor 2: ufortynnet ekstrakt; Felt 3-5: prøvene fortynnet i vann før gel-oppfyllings med en 1: 2, 1: 5 og 1:10 (prøve: vann forhold). Etter denne spesielle planteart som inneholder en rekke uavhengige aktører, flere bånd observert som kan tilsvare forskjellige IBP isoformer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For vellykket analyse og rensing av uavhengige aktører, er det viktig å forstå den temperaturfølsomme innholdet i noen av disse proteiner. Visse anlegg aktørene kan bli ustabil ved temperaturer over 0 ° C, noe som resulterer i utfolding, nedbør og inaktivitet. For å oppnå aktive uavhengige aktører, er det ofte viktig at plantene blir behandlet i et kaldt rom (~ 4 ° C) og prøvene blir holdt på is i løpet av eksperimentering. En annen faktor å vurdere ved bruk av helcelle-rå lysater er nedbrytningen av proteiner ved hjelp av endogene proteaser. I planter, er et uttrykk for aktørene kan generelt lav, og således tap i proteinutbytte kan resultere i utilstrekkelig materiale for fremtidig eksperimentering eller analyse. Arbeider raskt under proteinekstraksjon, med tillegg av en pålitelig protease inhibitor cocktail kan redusere slik proteintap. I tillegg er det viktig at den kalde-akklimatiseringsperiode være optimalisert for den største ansamling av globale kjernenettgrossistene i laboratorie voksenplanter.
Et annet vanlig problem når man arbeider med uavhengige aktører er at mange av analysene er følsomme for temperatur og fuktighet. I forhold til IRI-analyse, kan fuktighet oppbygning på mikroskop-dekkglide resultere i et lag av is som gjør visualisering av iskrystaller vanskelig. Ved hjelp av en avfukter og ekstra tørke perler kan løse dette problemet; imidlertid, er det anbefalt at denne analysen ikke utføres når laboratorie relative fuktighet er over 70%.
Sprut -forsøket, som er presentert, er kvalitative. Ved å utføre en serie fortynning før analyse, kan etableres IRI endepunktet for å bestemme konsentrasjonsområdet i hvilket aktørene kan ikke lenger kan begrense is krystallvekst. Forskjellige laboratorier har også brukt dataprogram for å måle den gjennomsnittlige størrelsen på is krystallkorn 18. Som tidligere antydet, mens testing for IRI-aktivitet er en effektiv forut skjerm, bekreftelse av is-bindendeaktivitet bør etableres ved å bestemme nivået av TH, eller ved direkte å visualisere adsorpsjonen av aktørene kan til iskrystaller 16. En viktig begrensning av IRI-analyse er at flere ikke-IBP molekyler har blitt identifisert som etterligner IRI aktivitet. Disse molekylene kan omfatte store proteiner, fenoliske glykosider, og syntetiske polymerer slik som polyvinylalkohol 19, 20, 21. Som et resultat av dette vil en bufferkontroll alltid kjøres med prøver for å sikre at eventuelle forurensninger eller tilsetninger ikke resulterer i den observerte IRI-aktivitet.
Mens is-affinitetsrensing er lett utføres, da det ikke gjøres riktig, kan andre proteiner, oppløste stoffer og metabolitter dominerende. En viktig faktor er hastigheten av is krystallvekst; ved å senke kjølehastigheten (dvs. til -0,02 ° C / h), is halvkule vokser langsommere og enhver ikke-is-bindende molecules er mindre sannsynlig for å bli inkorporert i den is krystallgitteret. Tilstedeværelsen av forurensende molekyler kan også unngås ved å sørge for at bare 50% av løsningen er innlemmet i den halvkule (dvs. 50:50, væske til is-forhold). Som tidligere nevnt, kan flere runder med is affinitet også klar is-fraksjonen og resultere i en prøve av høyere renhet. Spesielt, blir sekundære metabolitter ofte overproduseres i henhold biotiske og abiotiske spenningsforhold i planter. Under rensing av fenol-rik plantevev, hvis mørke brune pigmenter vedvarer, 1,5% (v / v) polyvinylpyrrolidon (PVP) og 1,5% polyvinylpolypyrrolidon (w / v) (PVPP) kan tilsettes til ekstraksjonen buffer, for å nøytralisere sekundær metabolitter. Antioksidant additiver slik som tiourea (5-10 mM), kan også bli anvendt 19, 21.
Dersom informasjon om IBP av interesse er kjent, ytterligere rensetrinn, slik som høyt trykk lipund kromatografi (HPLC) kan også anvendes. Modifikasjoner til is-affinitetsrensing kan også overveies og er blitt rapportert å optimalisere proteinmengde og få ytterligere innsikt i IBP egenskaper inkludert raskere is skallet rensing 23 og fluorescens-baserte is planet affinitet (FIPA) 24.
Når optimalisert, kan de teknikker som er beskrevet ovenfor, hvilket ga et renset protein basseng for identifisering av aktørene kan; Imidlertid kan uspesifikk inkorporering av andre sterkt utbredte proteiner være uunngåelig. Mens aktørene kan fra Pooideae familien dele sekvenshomologi 25, på grunn av den store variasjonen mellom aktørene kan fra forskjellige organismer, er det vanligvis ikke er mulig å identifisere en IBP ifølge sekvenshomologien alene. Et felles trekk ved uavhengige aktører er tilstedeværelsen av aminosyrer som er kjent for å binde seg til is, inkludert treonin, serin og valin 26; å identifisere peptider sekvenser rik på thESE rester kan være nyttig når gruvedrift sequence data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en NSERC (Canada) tilskudd til VKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L.
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L.
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
