Summary
यह पत्र बर्फ-पुनर्संरचना निरोधक गतिविधि के आकलन के माध्यम से फ्रीज-सहिष्णु पौधों से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान और बर्फ-आत्मीयता शुद्धि का उपयोग करके देशी आईबीपी के बाद अलगाव की रूपरेखा है।
Abstract
आइस बंधनकारी प्रोटीन (आईबीपीएस) तनाव प्रेरित प्रोटीन कि सबजीरो तापमान के संपर्क में कुछ जीवों द्वारा संश्लेषित कर रहे हैं के एक परिवार के हैं। पौधों में, फ्रीज क्षति होती है जब बाह्य बर्फ के क्रिस्टल बड़े होते हैं, प्लाज्मा झिल्ली और संभव कोशिका मृत्यु का टूटना में जिसके परिणामस्वरूप। बर्फ के क्रिस्टल करने के लिए आईबीपीएस की सोखना, बर्फ recrystallization निषेध (IRI) के रूप में जाना जिससे सेलुलर क्षति को कम करने के लिए एक प्रक्रिया से आगे के विकास को प्रतिबंधित करता है। आईबीपीएस भी संतुलन पिघल बिंदु से नीचे एक समाधान, एक संपत्ति थर्मल हिस्टैरिसीस (वें) गतिविधि के रूप में जाना जाता है का हिमांक दबाना करने की क्षमता का प्रदर्शन। इन सुरक्षात्मक गुण, औद्योगिक चिकित्सा और कृषि अनुप्रयोगों में अपनी क्षमता उपयोग के कारण उपन्यास आईबीपीएस की पहचान करने में दिलचस्पी बढ़ गई है। इस पत्र के माध्यम से 1 संयंत्र आईबीपीएस की पहचान) संयंत्र के ऊतकों में प्रेरण और निष्कर्षण आईबीपीएस की, 2) IRI गतिविधि के लिए अर्क की स्क्रीनिंग, और 3) अलगाव और purif का वर्णन करता हैआईबीपी की जानकारी निम्न तापमान के जोखिम से आईबीपी की प्रेरण के बाद, एक 'स्प्लैट परख' का उपयोग करके आईआरआई गतिविधि के लिए निष्कर्षों का परीक्षण किया जाता है, जो एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बर्फ के क्रिस्टल वृद्धि का अवलोकन करने की अनुमति देता है। इस परख को कम प्रोटीन एकाग्रता की आवश्यकता होती है और ऐसे परिणाम उत्पन्न होते हैं जो जल्दी से प्राप्त होते हैं और आसानी से व्याख्या करते हैं, बर्फ बाध्यकारी गतिविधि के लिए प्रारंभिक स्क्रीन प्रदान करते हैं। आईबीपी को फिर से आईबीपी की संपत्ति का उपयोग करके बर्फ को एक्सोर्ब करने के लिए प्रोटीन्स दूषित होने से अलग किया जा सकता है, जिसे 'आइस-एफ़िनिटी शुद्धि' नामक एक तकनीक के माध्यम से अलग किया जा सकता है। संयंत्र निष्कर्षों से एकत्र सेल lysates का उपयोग करते हुए, एक बर्फ गोलार्द्ध धीरे धीरे एक पीतल जांच पर उगाया जा सकता है। इसमें आईबीपी को पॉलीक्रिस्टेलिन बर्फ के क्रिस्टलीय संरचना में शामिल किया गया है। आईबीपी के किसी पूर्वोक्त जैव रासायनिक या संरचनात्मक ज्ञान की आवश्यकता नहीं है, इस पद्धति से सक्रिय प्रोटीन की वसूली की अनुमति मिलती है आइस-शुद्ध प्रोटीन अंशों का इस्तेमाल डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस के लिए किया जा सकता है जिसमें पीप की पहचान भी शामिल हैमास स्पेक्ट्रोमेट्री और देशी प्रोटीन की जैव रासायनिक विश्लेषण द्वारा ज्वार दृश्यों।
Introduction
आइस बंधनकारी प्रोटीन (आईबीपीएस) सुरक्षात्मक प्रोटीन है कि पौधों 1, कीड़े 2, मछली 3, और रोगाणुओं 4 सहित जीवों की संख्या में खोज की गई है की एक विविध परिवार हैं। इन प्रोटीनों की प्रमुख विशेषता उनके अद्वितीय विशेष रूप से और कुशलता से, बर्फ के क्रिस्टल के अधिशोषण के लिए उनके विकास को संशोधित करने की क्षमता है। आईबीपीएस, कई दस्तावेज गुण होते हैं दो सबसे अच्छी तरह से किया जा रहा है की विशेषता थर्मल हिस्टैरिसीस (वें) और बर्फ recrystallization निषेध (IRI) के साथ। वें गतिविधि और अधिक आसानी से फ्रीज असहिष्णु पशुओं में उत्पादित आईबीपीएस में मनाया जाता है। इस गतिविधि में ठंड को रोकने के लिए जीवों की संचार या मध्यवर्ती तरल पदार्थों का हिमांक को कम करने में परिणाम नहीं। इसके विपरीत, फ्रीज सहिष्णु जीवों, जो अनिवार्य रूप से सबजीरो तापमान पर फ्रीज होगा, आईबीपीएस कम वें गतिविधि दिखाई देते हैं। कम वें गतिविधि के बावजूद, एक उच्च IRI गतिविधि बर्फ रोना प्रतिबंधित करने के लिएstal विकास अक्सर इन प्रोटीनों के साथ मनाया जाता है। फ्रीज सहिष्णु जीव के लिए, यह IRI गतिविधि शायद बाह्य डिब्बों में बर्फ की अनियंत्रित वृद्धि से कोशिकाओं की रक्षा में मदद करता है।
"गद्दा बटन" मॉडल व्यवस्था है जिसके द्वारा आईबीपीएस बर्फ के क्रिस्टल 5 के विकास को रोकने का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मॉडल के तहत, आईबीपीएस विशेष रूप से अंतराल, ऐसी है कि पानी के अणुओं केवल बाध्य आईबीपीएस के बीच की जगह में बढ़ती बर्फ क्रिस्टल जालक के साथ शामिल कर सकते हैं पर बर्फ क्रिस्टल की सतह के लिए अधिशोषण। यह एक वक्रता है कि अतिरिक्त पानी के अणुओं का समावेश प्रतिकूल बना देता है, एक घटना गिब्स-थॉमसन प्रभाव 6 से वर्णित किया जा सकता है कि पैदा करता है। लंगर clathrate पानी परिकल्पना बर्फ क्रिस्टल की सतह के लिए आईबीपीएस के विशिष्ट बंधन के लिए एक तंत्र उपलब्ध कराता है जिसके आरोप लगाया अवशेषों की उपस्थिति, विशेष रूप से प्रोटीन बर्फ बाध्यकारी साइट पर तैनात, REO में परिणामपानी के अणुओं की rganization तो वे बर्फ क्रिस्टल जालक 7 में से एक या एक से अधिक विमानों से मेल खाते हैं।
वें गतिविधि पिघलने के बीच अंतर को मापने और एक आईबीपी की उपस्थिति में ठंड एक भी बर्फ क्रिस्टल के तापमान मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। जबकि वें गतिविधि आईबीपीएस, कम वें खाई संयंत्र आईबीपीएस (आमतौर पर केवल एक डिग्री का एक अंश) द्वारा उत्पादित की गतिविधि मूल्यांकन का एक व्यापक रूप से स्वीकार विधि है सामान्य रूप से एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता, विशेष उपकरणों और ऑपरेटर अनुभव की आवश्यकता है। हालांकि गैर आईबीपीएस बर्फ क्रिस्टल विकास को सीमित कर सकते हैं, यह एक संपत्ति सब आईबीपीएस और इस तरह IRI गतिविधि के लिए परीक्षण द्वारा साझा किया जाता है आईबीपीएस की उपस्थिति के लिए एक प्रभावी प्रारंभिक स्क्रीन, विशेष रूप से कम वें गतिविधि के साथ उन लोगों के लिए है। इस गतिविधि का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता कार्यप्रणाली एक 'सूचक परख', जिसके तहत एक प्रोटीन नमूना फ़्लैश छोटे बर्फ के क्रिस्टल, जो अगर निर्धारित करने के लिए समय की अवधि में मनाया जाता है की एक monolayer निर्माण करने के लिए जमे हुए है के रूप में जाना जाता हैबर्फ क्रिस्टल विकास प्रतिबंधित है। आईबीपीएस की उपस्थिति के लिए एक स्रोत ऊतक का नमूना स्क्रीन करने के लिए प्रयोग किया जाता है अन्य तरीकों के विपरीत, इस तकनीक 10-100 एनजी की सीमा में कम प्रोटीन सांद्रता के लिए लागू है, आसानी से मनगढ़ंत उपकरण का इस्तेमाल करता है, और है कि जल्दी और आसानी से व्याख्या डेटा उत्पन्न करता है। हालांकि, यह तनाव है कि इस परख आईबीपीएस कि वें के निर्धारण और बर्फ क्रिस्टल को आकार देने के द्वारा पालन किया जाना चाहिए के लिए एक प्रारंभिक स्क्रीन प्रदान करता है महत्वपूर्ण है।
देशी प्रोटीन का अलगाव चुनौती दे रहा है, अक्सर ब्याज की एक प्रोटीन के संरचनात्मक और जैव रासायनिक गुणों के बारे में जानकारी की आवश्यकता होती है। बर्फ के लिए आईबीपीएस की आत्मीयता इन शुद्धि प्रयोजनों के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में बर्फ का उपयोग कर प्रोटीन की अलगाव के लिए अनुमति देता है। के बाद से अणुओं के बहुमत बर्फ क्रिस्टल विकास, एक उच्च शुद्ध नमूने में एक आईबीपी नमूना परिणामों की उपस्थिति में एक आइस-गोलार्द्ध की धीमी वृद्धि, बड़े quantit से रहित दौरान बर्फ का पानी सीमा से आगे धकेल दिया जाता हैप्रोटीन और विलेय contaminating की एँ। इस विधि कीड़े 8, 9, 10, बैक्टीरिया 11, मछली 12 और पौधों 13, 14 से आईबीपीएस की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है। साथ ही, आईबीपी-समृद्ध इस पद्धति के माध्यम से प्राप्त अंशों भी नीचे की ओर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इस पत्र प्रेरण और आईबीपीएस की निकासी के माध्यम से पौधों में आईबीपीएस की पहचान की रूपरेखा, IRI गतिविधि का विश्लेषण प्रोटीन की उपस्थिति, और बर्फ आत्मीयता शुद्धि का उपयोग कर प्रोटीन के अलगाव की पुष्टि के लिए।
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Protocol
1. Splat उपकरण सेटअप
- इथाइलीन ग्लाइकॉल (50% v / पानी में v) के साथ एक तापमान-प्रोग्रामेबल प्रवाहित होने वाले पानी स्नान भरें।
नोट: ग्रीन मोटर वाहन इथाइलीन ग्लाइकॉल इस्तेमाल किया जा सकता। - बाहरी कक्ष को इकट्ठा करने के लिए, एक दोहरी दीवार कांच गेंदबाजी करने का जल स्नान संलग्न करने के लिए रोधन प्लास्टिक टयूबिंग का उपयोग करें। polystyrene फोम के साथ कांच का कटोरा बचाने और एक प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन के साथ कवर किया। polystyrene कक्ष के तल में एक 3-4 इंच छेद कट इतना है कि प्रकाश स्रोत कांच कक्ष के माध्यम से देखा जा सकता है।
- एक विच्छेदन खुर्दबीन पर बाहरी कक्ष, एक कैमरा पोर्ट और एक 10x नेत्र लेंस के साथ एक 4 एक्स ध्रुवीकरण ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ लगे माउंट करें। बाहरी कक्ष के तल में ध्रुवीकरण फिल्म के एक अतिरिक्त टुकड़ा रखें।
- एक प्रत्युत्तर स्टैंड और एक बड़े polystyrene कंटेनर के अंदर जगह पर एक 1-1.5 मीटर ट्यूब (~ 5 सेमी व्यास) क्लैंप, एक शीतलन प्रत्युत्तर स्टैंड के आधार पर ट्यूब के नीचे तैनात ब्लॉक के साथ।
2. मूल निवासी प्रोटीन की तैयारी IRI विश्लेषण के लिए निकालता है
- कम रोशनी (6 ज प्रकाश / 18 ज अंधेरे) के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए फ्रीज सहिष्णु घास या अन्य फ्रीज सहिष्णु पौधों की प्रजातियों, ठंड जलवायु के अनुकूल बनाना पौधों में आईबीपीएस की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए,। इस क्षेत्र को जो पहले से ही कम तापमान की स्थिति और दशानुकूलन अवधि के संपर्क में आए से एकत्र नमूनों पर लागू नहीं होता।
- तने के आधार पर कटौती करके पत्ता ऊतक के लगभग 0.1 ग्राम प्राप्त और उसके बाद एक 1.5 एमएल ट्यूब में जगह। इसके तत्काल बाद -80 डिग्री सेल्सियस प्रयोग से पहले तक पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में नमूना फ्रीज फ्लैश।
- कोशिकाओं lyse करने के लिए, एक ठीक पाउडर तरल नाइट्रोजन के तहत एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करते हुए ऊतक का नमूना पीस लें। सुनिश्चित करें कि तरल नाइट्रोजन एकरूपता की प्रक्रिया के दौरान लुप्त हो नहीं करता है।
- इसके तत्काल बाद बर्फ पर जमीन के नमूने जगह है और तरल नाइट्रोजन पूरी तरह लुप्त करने के लिए अनुमति देते हैं। एक देशी प्रोटीन extracti के 1 एमएल जोड़ेंबफर पर 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल युक्त, 25 एमएम नाओक्ल (पीएच 7.5), दो ईडीटीए-फ्री प्रोटीज अवरोधक गोलियां जो उपयोग के तुरंत बाद जोड़े गए हैं। मिश्रण करने के लिए पिपेट; भंवर न करें
नोट: यदि अतिरिक्त lysate माध्यमिक चयापचयों (चर्चा देखें) में अतिरिक्त एडिटिंग का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है - धीरे से नमूनों को रात भर (18-24 घंटे) 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष चरणों का संचालन करें
- सेंटीफ्यूगिंग सैंपल द्वारा 5 मिनट के लिए ~ 16,000 xg में सेलुलर मलबे निकालें घुलनशील अंश और अपकेंद्रित्र को एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए बनाए रखें यदि सेलुलर मलबे जारी रहती है। स्पष्ट उपयोग किए जाने तक, नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
3. Splat Assay पूर्व प्रयोग सेट अप
- ध्रुवीकृत फिल्म के साथ स्थापित किए गए बाह्य कक्ष में 100 मिलीलीटर हेक्सेन डालें और नमी को स्लाइड्स पर बनाए रखने से रोकने के लिए 5-6 डिसेकेशन मोती जोड़ें। एक तंग सील सुनिश्चित करने और हेक्सेन के वाष्पीकरण को रोकने के लिए स्नान और मोड़ को कवर करने वाली प्लेट में एक छोटी मात्रा में वैक्यूम ग्रीस जोड़ें। प्रयोग शुरू करने से पहले के बीच -4 डिग्री सेल्सियस और -6 डिग्री सेल्सियस प्रोग्राम पानी स्नान का उपयोग लगभग 2-3 घंटे हेक्सेन स्नान कूल। एक थर्मामीटर प्रयोग शुरू करने से पहले साथ हेक्सेन के तापमान की जांच करना सुनिश्चित करें।
- सीधे प्लास्टिक ट्यूब के नीचे एक polystyrene बॉक्स में ठंडा ब्लॉक रखें और सूखी बर्फ के साथ पूरी तरह से कवर किया, 40 मिनट प्रयोग शुरू करने से पहले।
- परख शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब स्तर है। ठंडा ब्लॉक नमूना छोड़ देंगे, पहले टेस्ट पर निर्धारित करने के लिए जहां पानी के साथ प्रक्रिया और संकेत मिलता है जहां नमूना (जैसा कि नीचे वर्णित) एक मार्कर के साथ चला जाता है।
- ठंड ब्लॉक के ऊपर से सूखी बर्फ निकालें और उस पानी से निर्धारित किया गया है ड्रॉप निशान पर एक गिलास खुर्दबीन कवर स्लाइड जगह।
- इसके तत्काल बाद परख शुरू करने से पहले, प्रकाश स्रोत पर कर देते हैं और किसी भी बर्फ है कि गिलास चैम्बर के तल पर का गठन किया है स्क्रैप। जब तक बर्फ के क्रिस्टल पर प्रकाश स्रोत रखने से बचेंहेक्सेन हीटिंग को रोकने के लिए कल्पना की जा रही हैं।
4. Splat परख आयोजित
- डिस्पोजेबल टिप विसर्जन के तेल में एक स्वचालित विंदुक (1-20 μL) से चिपका डुबकी, एक कागज तौलिया किसी भी अतिरिक्त तेल निकालने का उपयोग कर। यह कदम नमूना के बजाय गिर पिपेट के बाहर का पालन करने की अनुमति देगा।
नोट: पिपेट से अतिरिक्त तेल निकाल रहा है सुनिश्चित करने के लिए है कि तेल की बूंदों बर्फ के क्रिस्टल पर फार्म नहीं है, दृश्य कठिन बना महत्वपूर्ण है। - नमूना और जगह विंदुक सीधे नमूना छोड़ने से पहले प्लास्टिक टयूबिंग से अधिक की पिपेट 10 μL। जब नमूना कांच कवर स्लाइड मारता है, बर्फ के क्रिस्टल की एक monolayer बनाने एक विशिष्ट 'सूचक' आवाज सुनी जानी चाहिए।
- जल्दी और ध्यान से ध्रुवीकरण फिल्म के शीर्ष पर हेक्सेन स्नान में चिमटी और जगह का उपयोग कर ठंड ब्लॉक से खुर्दबीन स्लाइड को हटा दें।
- खुर्दबीन के नीचे देख रहे हैं, दृश्य और विज्ञापन के क्षेत्र में खुर्दबीन स्लाइड डालसिर्फ ऑब्जेक्टिव लेंस ताकि पार ध्रुवीकरण उच्च विपरीत बर्फ के क्रिस्टल के दृश्य के लिए अनुमति देता है। 40x करने के लिए आवर्धन को समायोजित करें।
- माइक्रोस्कोप के लिए कैमरा संलग्न करें और बर्फ के क्रिस्टल के स्पष्ट दृश्य की अनुमति है और छवि पर कब्जा करने के "मैक्रो" के लिए सेटिंग्स समायोजित करें।
नोट: 1 घंटे के लिए ऊपर प्रतीक्षा की जा रही बर्फ के क्रिस्टल विकसित करने के लिए एक स्पष्ट तस्वीर पेश कर सकते हैं अनुमति देने के लिए। - दोहराएँ सभी नमूनों के लिए 4.1-4.5 कदम दूर है। आमतौर पर, हेक्सेन कक्ष में एक अलग नमूने के साथ 6 स्लाइड करने के लिए जगह है।
- प्रकाश स्रोत बंद कर दें और हेक्सेन स्नान पर एक प्लास्टिक प्लेट जगह, एक तंग सील सुनिश्चित। बर्फ के क्रिस्टल रात भर पानी रखना करने की अनुमति दें (12-24 ज, एक विशेष परख के भीतर एक सुसंगत annealing अवधि के लिए)। ऊष्मायन के बाद, बर्फ फिल्मों के कब्जा छवियों ऊपर बताया गया है।
नोट: कुछ नमूने दूसरों की तुलना में अधिक तेजी से recrystallize सकता है। यदि कोई recrystallization 12 घंटे के बाद स्पष्ट है, 24 घंटे के लिए ऊपर यह सुनिश्चित करने के लिए है कि कोई recrystalli क्रिस्टल पानी रखना करने की अनुमतिzation हो जाएगा।
5. Splat परख डेटा विश्लेषण
- एक कंप्यूटर से फ़ोटो अपलोड करें और सीधे से पहले और annealing के बाद बर्फ के क्रिस्टल के आकार की तुलना। बर्फ recrystallization गतिविधि के साथ नमूने विकसित नहीं होगा, जबकि कोई IRI गतिविधि के बिना नमूने काफ़ी बड़ा बर्फ के क्रिस्टल के गठन recrystallize होगा। लाइट हस्तक्षेप बड़ी बर्फ के क्रिस्टल थोड़ा अलग रंग में दिखाई देते हैं और इस तरह आसानी से देख रहे हैं कर देगा।
6. आइस आत्मीयता शोधन उपकरण सेटअप
- इथाइलीन ग्लाइकॉल के साथ एक तापमान-प्रोग्रामेबल प्रवाहित होने वाले पानी स्नान भरें। ग्रीन मोटर वाहन इथाइलीन ग्लाइकॉल इस्तेमाल किया जा सकता।
- अछूता प्लास्टिक टयूबिंग 15 का उपयोग करते हुए एक खोखले, पीतल जांच करने के लिए स्नान से कनेक्ट करें।
- एक polystyrene कंटेनर जिसमें एक 150 एमएल बीकर snuggly फिट कर सकते हैं का निर्माण। पीतल ठंड उंगली के लिए बीच में एक छेद के साथ कंटेनर के लिए एक ढक्कन बनाएँ।
7।आइस आत्मीयता शोधन के लिए नमूने की तैयारी
- शीत जलवायु के अनुकूल बनाना संयंत्र के ऊतकों के रूप में खंड 2.1 में वर्णित है।
- एकत्र जमीन बायोमास (कदम 2.3) 20 एमएल ट्यूबों में की ~ 100-150 ग्राम और तुरंत फ्रीज फ्लैश। नमूने -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करने से पहले पर रखा जा सकता है।
- वर्गों 2.3-2.5 में वर्णित के रूप नमूना तैयार करें। पत्ता ऊतक के मेजबान के लिए: 1 के अनुपात (देशी प्रोटीन निष्कर्षण बफर के एमएल ऊतक के मिलीग्राम:) एक 1 का प्रयोग करें। अंतर्जात proteases द्वारा आईबीपीएस की गिरावट से बचने के लिए अतिरिक्त प्रोटीज अवरोध करनेवाला गोलियाँ का प्रयोग करें।
नोट: 2 या 1: 3 (ऊतक के मिलीग्राम: देशी प्रोटीन निष्कर्षण बफर के एमएल) ऊतक का नमूना भी ध्यान केंद्रित किया है, तो 1 के अनुपात को समायोजित करें। - सेलुलर मलबे को निकालने के लिए जाली की 2 परतों, 3 बार के माध्यम से lysate छलनी। 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 30,000 XG पर centrifugation द्वारा मलबे गोली।
- 120 देशी प्रोटीन निष्कर्षण बफर का उपयोग कर एमएल के नमूने की मात्रा बढ़ाएँ। करने के लिए बर्फ आत्मीयता शुद्धि के लिए तुरंत lysate का प्रयोग करेंबर्फ बाध्यकारी गतिविधि के किसी भी नुकसान से बचें
8. आइस-एफिनिटी शुद्धि का आयोजन करना
- शुद्धिकरण से पहले, -0.04 डिग्री सेल्सियस / प्रति घंटे की दर से -0.5 डिग्री सेल्सियस से -3 डिग्री सेल्सियस तक शांत करने के लिए प्रोग्रामयोग्य जल स्नान सेट करें।
नोट: शीतलन दर को नमूना की प्रारंभिक मात्रा के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। - -0.5 डिग्री सेल्सियस के लिए बर्फ की उंगलियों को शांत करें और बाद में इसे ठंडा आसुत जल युक्त 50 एमएल ट्यूब में छिड़क दें। आइस न्यूक्लियेशन की सुविधा के लिए कुछ बर्फ चिप्स जोड़ें और उंगली पर बर्फ की एक पतली परत बनाने की अनुमति दें। यह प्रक्रिया आमतौर पर 20 और 30 मिनट के बीच लेती है।
नोट: बर्फ-लेपित उंगली पर कोई भी ढक्कन नमूना में रखने से पहले एक हाथ में हाथ से चिकना होना चाहिए। यदि बर्फ परत -0.5 डिग्री सेल्सियस पर नहीं होती है, तो तापमान -0.75 डिग्री सेल्सियस तक कम करें - चुंबकीय उत्तेजक के शीर्ष पर एक पॉलीस्टायिन कंटेनर में एक छोटे से चुंबकीय हलचल बार युक्त 150 एमएल ग्लास बीकर में नमूना रखें। सुनिश्चित करें कि बर्फ की उंगली हैकेंद्रित और तरल के नमूने में कम से कम आधे रास्ते को कम कर दिया। कंटेनर सील।
- कार्यक्रम लगभग दो दिनों के लिए चलाने की अनुमति दें, हर 24 घंटे की जाँच। एक बार नमूना के 50% जमे हुए है, कार्यक्रम बंद करो। बर्फ गोलार्द्ध में आईबीपीएस को शामिल "बर्फ नक़्क़ाशी" का परिणाम देगा।
नोट: शोधन प्रयोगों समय की लंबाई, जिस पर कार्यक्रम रन तदनुसार समायोजित के साथ बड़ा नमूना मात्रा का उपयोग किया जा सकता है। - 4 डिग्री सेल्सियस के लिए, बर्फ गोलार्द्ध हटाने जांच गर्म करने के लिए आदेश में, अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए आसुत जल से गोलार्द्ध कुल्ला, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना।
नोट: अधिकांश आईबीपीएस पानी और एक उपयुक्त बफर में स्थिर नहीं कर रहे हैं (यानी 50 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8 या 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, पीएच 8) विगलन प्रक्रिया के दौरान समय-समय पर जोड़ा जा करने की आवश्यकता होगी (लगभग 1 एमएल / 2 घंटे) । बर्फ गोलार्द्धों एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जाता है और विगलन से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। - यदि बर्फ गोलार्द्ध अभी भी शामिलरों वर्णक, या नमूना शुद्धि को बढ़ाने के लिए, दोहराएँ 8.1-8.5 2-3 बार दोहराएँ।
नोट: हालांकि आईबीपी की एकाग्रता कम हो सकता है शुद्धि के कई दौर के बाद, पवित्रता उपज की तुलना में अगर शुद्ध नमूने एमएस का उपयोग कर विश्लेषण किया जाएगा और अधिक मूल्यवान है। यदि पर्याप्त सामग्री उपलब्ध है, बर्फ आत्मीयता शुद्धि के तीन चक्र की सिफारिश की है।
9. आईबीपीएस की पहचान
- चूंकि आईबीपीएस बर्फ गोलार्द्ध के विगलन निम्नलिखित एक बड़ी मात्रा में निहित हैं, नमूने ध्यान केंद्रित। ~ 1-3 एमएल युक्त ऊतक के ~ 100 ग्राम एक 3000 दा आणविक भार कट के साथ केन्द्रापसारक एकाग्रता ट्यूबों का प्रयोग छोटे प्रोटीन के नुकसान से बचने के लिए नमूने ध्यान लगाओ।
- एमएस के लिए नमूने भेजने से पहले, एक प्रोटीन मात्रा परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण इस तरह के एक बीसीए या ब्रैडफोर्ड परख के रूप में। इस तरह के एसडीएस-पृष्ठ के रूप में जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नमूनों की शुद्धता का अनुमान लगाएं। से करने के लिए परीक्षण करें IRI गतिविधि के लिए शुद्ध प्रोटीन पहलेएमएस के लिए nding सुनिश्चित करना है कि सक्रिय प्रोटीन शोधन और एकाग्रता चरणों के माध्यम से बनाए रखा गया है।
- केंद्रित नमूने मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण 10 के लिए सीधे का उपयोग करें।
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Representative Results
सेट-अप की आसानी के लिए, चित्रा 1 और चित्र 2 IRI विश्लेषण और बर्फ आत्मीयता शुद्धि, क्रमशः के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के दृश्य निरूपण के रूप में शामिल किए गए हैं। साथ और आईबीपीएस बिना सरसों घास से एकत्र अर्क का उपयोग कर IRI विश्लेषण के परिणाम 3 चित्र में चित्रित कर रहे हैं। ये परिणाम बताते हैं कि सरसों घास है, जो फ्रीज सहिष्णु नहीं है से एकत्र अर्क, आईबीपीएस वर्तमान की कमी के कारण बर्फ क्रिस्टल विकास को प्रतिबंधित करने में असमर्थ थे। इसके विपरीत, छोटे बर्फ के क्रिस्टल ट्रांसजेनिक पौधों आईबीपीएस बारहमासी ryegrass से काफी बर्फ क्रिस्टल विकास को प्रतिबंधित युक्त के साथ देखा। चित्रा 4 शुद्धि के दो दौर के बाद आईबीपीएस व्यक्त बारहमासी ryegrass अर्क का प्रयोग करके विकसित बर्फ गोलार्द्धों को दर्शाता है। शुद्धि के पहले दौर के उच्च स्तर के बाद hemisphe पर बर्फ नक़्क़ाशीफिर से सतह इंगित करता है कि आईबीपीएस बर्फ को adsorbed और बर्फ के क्रिस्टल (चित्रा 4 ए) के विकास को संशोधित किया है। शोधन के दूसरे दौर चित्रा 4 बी में दिखाया गया है यह दर्शाता है अणुओं को दूषित कर के कुछ बहिष्कार किया कि स्पष्ट बर्फ है। गोलार्द्ध सतह पर बर्फ नक़्क़ाशी इंगित करता है कि आईबीपीएस अभी भी मौजूद हैं। चित्रा 5 बर्फ आत्मीयता शुद्धि निम्नलिखित एक एसडीएस-पृष्ठ, बारहमासी ryegrass से एकत्र प्रोटीन का पता चलता है, और बाद में एक चांदी दाग के साथ दाग। प्रोटीन का एक नंबर सात पृथक बैंड के साथ की पहचान की गई सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है कि बर्फ के लिए अधिशोषण करने के लिए इसी।
चित्र 1: सूचक उपकरण 16 वर्ष की चित्रात्मक प्रस्तुति। हमें उपकरण बर्फ के क्रिस्टल (ए) की एक monolayer की पीढ़ी के लिए और बर्फ क्रिस्टल विकास (बी) के दृश्य के लिए एड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: आईबीपीएस 16 वर्ष की बर्फ आत्मीयता शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया उपकरण। एक पीतल "बर्फ उंगली" एक प्रोग्राम इथाइलीन ग्लाइकॉल स्नान से जुड़ी धीरे-धीरे एक आइस-गोलार्द्ध विकसित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्र 3: प्रतिनिधि डेटा IRI विश्लेषण 17 का उपयोग कर प्राप्त। पौधों के अर्क का उपयोग कर का गठन बर्फ के क्रिस्टल की एक monolayer 40x बढ़ाई पर कल्पना है। जंगली प्रकार Arabidopsis थालिअना के अर्क कि आईबीपीएस (-IBPs) शामिल नहीं है Lolium perenne (+ आईबीपीएस) से आईबीपीएस व्यक्त ट्रांसजेनिक ए थालिअना के अर्क की तुलना में कर रहे थे। एक 18 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद से -4 डिग्री सेल्सियस, बर्फ के क्रिस्टल बफर और जंगली प्रकार ए थालिअना नमूनों में recrystallized था। इसके विपरीत, बर्फ क्रिस्टल विकास ए थालिअना अर्क एक आईबीपी को व्यक्त करने में प्रतिबंधित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: फ्रीज-सहिष्णु घास से एकत्र आईबीपी अर्क के माध्यम से उगने वाले आइस-गोलार्धियों, एल । पेरेन । बर्फ के आग्नेय शुद्धि के एक दौर के अधीन घास के अर्क के बाद, बर्फ गोलार्ध की सतह के आइस-एखिंग आईबीपी ( ए ) के सफल निगमन को इंगित करता है। अतिरिक्त विलायकों, रंगद्रव्य और दूषित प्रोटीनों को निकालने के लिए, बर्फ के संबंध का एक दूसरा दौर इस्तेमाल किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप स्पष्ट बर्फ-गोलार्ध ( बी ) का परिणाम था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: बारहमासी ryegrass से देशी आईबीपी की शुद्धिकरण की निगरानी बर्फ-आत्मीयता शुद्धि और केन्द्रापसारक एकाग्रता के दो राउंड के बाद,देशी घास अर्क एक denaturing polyacrylamide जेल (एसडीएस पृष्ठ) पर electrophoresed रहे थे और फिर चांदी दाग का उपयोग कर देखे। लेन 1: आणविक भार प्रोटीन सीढ़ी; लेन 2: undiluted निकालने; लेन 3-5: 2, 1: 5, और 1:10 (नमूना: पानी) अनुपात एक 1 के साथ जेल लोड हो रहा है से पहले पानी में पतला नमूने हैं। के बाद से इस विशेष पौधों की प्रजातियों आईबीपीएस की एक संख्या में शामिल हैं, कई बैंड मनाया जाता है अलग आईबीपी isoforms के अनुरूप हो सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सफल विश्लेषण और आईबीपीएस की शुद्धि के लिए, यह इन प्रोटीनों में से कुछ के तापमान के प्रति संवेदनशील प्रकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ संयंत्र आईबीपीएस ऊपर 0 डिग्री सेल्सियस तापमान पर अस्थिर हो, खुलासा, वर्षा और निष्क्रियता में जिसके परिणामस्वरूप। आदेश सक्रिय आईबीपीएस प्राप्त करने के लिए, यह अक्सर महत्वपूर्ण है कि पौधों को एक कोल्ड रूम (~ 4 डिग्री सेल्सियस) में कार्रवाई की जाती है और नमूने प्रयोग के दौरान बर्फ पर रखा जाता है। एक और पहलू पर विचार करने के लिए जब पूर्ण-कोशिका कच्चे lysates का उपयोग कर अंतर्जात proteases द्वारा प्रोटीन की गिरावट है। पौधों में, आईबीपीएस की अभिव्यक्ति आम तौर पर कम है, और इस तरह प्रोटीन उपज में किसी भी हानि के भविष्य प्रयोग या विश्लेषण के लिए अपर्याप्त सामग्री हो सकती थी। प्रोटीन निष्कर्षण के दौरान जल्दी काम करते हुए, एक विश्वसनीय प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल के योग के साथ इस तरह के प्रोटीन के नुकसान को कम कर सकते हैं। साथ ही, यह महत्वपूर्ण है कि ठंड में दशानुकूलन अवधि प्रयोगशाला विकसित में आईबीपीएस की सबसे बड़ी संचय के लिए अनुकूलित कियापौधों।
एक अन्य आम समस्या जब आईबीपीएस के साथ काम है कि परीक्षणों की कई तापमान और आर्द्रता के प्रति संवेदनशील हैं है। IRI विश्लेषण के संबंध में, माइक्रोस्कोप कवर स्लाइड पर नमी निर्माण बर्फ की एक परत होती है जो बर्फ के क्रिस्टल के दृश्य कठिन बना देता है हो सकता है। एक dehumidifier का उपयोग करना और अतिरिक्त सुखाना मोती इस कठिनाई को हल कर सकते हैं; तथापि, यह सिफारिश की है कि इस परख का आयोजन नहीं किया गया है प्रयोगशाला सापेक्ष आर्द्रता का स्तर 70% से ऊपर हैं जब।
सूचक परख, के रूप में प्रस्तुत किया, गुणात्मक है। विश्लेषण करने से पहले एक कमजोर पड़ने श्रृंखला निष्पादित करने से, IRI endpoint एकाग्रता रेंज, जिसमें आईबीपीएस अब बर्फ क्रिस्टल विकास सीमित कर सकते हैं निर्धारित करने के लिए स्थापित किया जा सकता। विभिन्न प्रयोगशालाओं भी कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया है बर्फ क्रिस्टल अनाज 18 के औसत आकार को मापने के लिए। पूर्व में इंगित किया है, जबकि IRI गतिविधि के लिए परीक्षण के लिए एक कुशल प्रारंभिक स्क्रीन, की पुष्टि है बर्फ बाध्यकारीगतिविधि वें के स्तर का निर्धारण द्वारा या सीधे बर्फ के क्रिस्टल से 16 आईबीपीएस की सोखना visualizing द्वारा स्थापित किया जाना चाहिए। IRI विश्लेषण का एक उल्लेखनीय सीमा यह है कि कई गैर आईबीपी अणुओं पहचान की गई है कि नकल IRI गतिविधि है। इन अणुओं भारी प्रोटीन, phenolic ग्लाइकोसाइड, और इस तरह पॉलीविनाइल शराब 19, 20, 21 के रूप में सिंथेटिक पॉलिमर शामिल कर सकते हैं। नतीजतन, एक बफर नियंत्रण हमेशा यह सुनिश्चित करें कि किसी भी दूषित पदार्थों या additives मनाया IRI गतिविधि में परिणाम नहीं नमूने के साथ चलाने की जानी चाहिए।
बर्फ आत्मीयता शुद्धि आसानी से किया जाता है, वहीं जब सही ढंग से नहीं किया, अन्य प्रोटीन, विलेय और चयापचयों प्रबल कर सकते हैं। एक महत्वपूर्ण विचार बर्फ क्रिस्टल विकास की दर है, ठंडा दर को कम करके (यानी -0.02 डिग्री सेल्सियस / घंटा के लिए), आइस गोलार्द्ध और धीरे धीरे और किसी भी गैर बर्फ बाध्यकारी molecu बढ़ता हैलेस कम बर्फ क्रिस्टल जालक में शामिल बनने की संभावना है। अणुओं contaminating की उपस्थिति भी सुनिश्चित करना है कि lysate के केवल 50% गोलार्द्ध में शामिल किया जाता है से बचा जा सकता (यानी 50:50, बर्फ के अनुपात में तरल)। जैसा कि पहले कहा, बर्फ आत्मीयता के कई दौर भी बर्फ अंश को स्पष्ट और उच्च शुद्धता का एक नमूना हो सकता है। विशेष रूप से, गौण चयापचयी अक्सर पौधों में जैविक और अजैविक तनाव की शर्तों के तहत overproduced कर रहे हैं। फिनोल संपन्न संयंत्र के ऊतकों की शुद्धि के दौरान, अगर गहरे भूरे रंग पिगमेंट जारी रहती है, 1.5% (v / v) polyvinylpyrrolidone (पीवीपी) और 1.5% polyvinylpolypyrrolidone (w / v) (PVPP) निष्कर्षण बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है, माध्यमिक बेअसर करने के लिए चयापचयों। इस तरह के thiourea (5-10 मिमी) के रूप में एंटीऑक्सीडेंट additives भी, 21 19 इस्तेमाल किया जा सकता।
ब्याज की आईबीपी के बारे में जानकारी में जाना जाता है अगर इस तरह के उच्च दबाव ली के रूप में, अतिरिक्त शोधन कदम,रुपये क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। बर्फ आत्मीयता शुद्धि में संशोधन पर भी विचार किया जा सकता है और प्रोटीन उपज का अनुकूलन और तेजी से बर्फ खोल शुद्धि 23 और प्रतिदीप्ति आधारित बर्फ विमान आत्मीयता (Fipa) 24 सहित आईबीपी विशेषताओं में अतिरिक्त जानकारी हासिल करने के लिए सूचित किया गया है।
जब अनुकूलित किया है, ऊपर वर्णित तकनीकों आईबीपीएस की पहचान के लिए एक शुद्ध प्रोटीन पूल उपज कर सकते हैं; हालांकि, अन्य अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की unspecific समावेश अपरिहार्य हो सकता है। जबकि Pooideae परिवार शेयर अनुक्रम अनुरूपता 25 से आईबीपीएस, विभिन्न जीवों से आईबीपीएस के बीच उच्च विविधता के कारण, यह आमतौर पर संभव नहीं अकेले अनुक्रम अनुरूपता द्वारा एक आईबीपी पहचान करना है। आईबीपीएस की एक आम सुविधा अमीनो threonine, सेरीन और वेलिन 26 सहित बर्फ, करने के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता एसिड की उपस्थिति है; पेप्टाइड्स की पहचान वीं में अमीर अनुक्रमESE अवशेषों उपयोगी जब सेक्ेनस दाटा खनन हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम के लिए एक VKW NSERC (कनाडा) अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
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