Summary
Bu çalışma, buz yeniden kristalleşme engelleme etkinliği ve buzlu afinite saflaştırmasını kullanarak yerel öğren daha sonra tecrit değerlendirme yoluyla dondurularak dayanıklı bitkiler buz bağlayıcı proteinin tanımlanmasını açıklar.
Abstract
Buz-bağlayan proteinler (öğren) sıfırın altındaki sıcaklıklara maruz belirli organizmalar tarafından sentezlenir stres kaynaklı bir protein ailesine aittir. Hücre dışı buz kristalleri büyüdükçe bitkilere, dondurarak hasar plazma membranları ve olası hücre ölümünün yırtılması sonuçlanır. Buz kristallerine öğren adsorpsiyonu, böylece, hücresel hasarı düşürerek, buz yeniden kristalleşme engelleme (IRI) olarak bilinen bir süreç ile daha fazla büyümesini kısıtlar. Öğren, denge erime noktasının altında bir çözeltisine, termal histerezis (T-H) aktivitesi olarak bilinen bir özelliği, donma noktasını düşürmek için yeteneğini göstermektedir. Bu koruyucu özellikler nedeniyle, endüstriyel, tıbbi ve tarımsal uygulamalarda potansiyel kullanımlarına yeni öğren belirlenmesinde çekmektedirler. Bu çalışma, 1 ile bitki öğren belirlenmesini) indüksiyonu ve çıkarma öğren bitki dokusunda, 2) IRI aktivitesi için özleri tarama, ve 3) izolasyon ve Purif tarifÖğren ait ication. Düşük sıcaklık maruz öğren sağlanmasının ardından, özü ve standart bir ışık mikroskobu kullanılarak, buz kristali büyümesinin gözlem sağlayan bir 'splat tahlili' kullanılarak IRI aktivitesi için test edilir. Bu deney, düşük protein konsantrasyonu gerektirir ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve kolayca buz bağlayıcı aktivitesi için bir başlangıç ekranını sağlayan yorumlanır sonuçlar üretir. Öğren sonra 'buz-afinite saflaştırma' adı verilen bir teknikle, buz adsorbe etmek öğren özelliğini kullanarak kirletici proteinler izole edilebilir. Bitki özlerinden derlenen hücre lizatları kullanılarak, bir buz yarımküre yavaş yavaş bir pirinç sonda üzerinde yetiştirilebilir. Bu polikristal buz kristal yapısına öğren içermektedir. Bir IBP önsel biyokimyasal ya da yapısal bilgiye gerektiren bu yöntem, aktif proteinin geri kazanımını sağlar. Buz ile saflaştırılmış protein fraksiyonları moral tanımlanması da dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilirkütle spektrometrisi ve doğal proteinlerin biyokimyasal analizi ile başlıktaki dizileri.
Introduction
Buz-bağlayan proteinler (öğren) bitkilerde 1, böcekler 2, balık 3 ve mikroplar 4 de dahil olmak üzere bir organizma sayısı tespit edilmiştir koruyucu proteinlerin farklı bir familyasıdır. Bu proteinlerin önemli bir özelliği, özellikle ve verimli bir şekilde büyümesini düzenleme, buz kristallerine adsorbe için kendi benzersiz yeteneğidir. Öğren birkaç belgelenmiş özelliklere sahip iki en iyi karakterize edilmiş olan termal histerezis (TH) ve buzlu rekristalizasyon inhibisyon (IRI) ile yıkanmıştır. TH aktivitesi daha kolay dondurularak tolere hayvanlarda üretilen öğren gözlenir. donmayı önlemek için organizmaların dolaşım veya geçiş sıvıların donma noktası düşürmede Bu etki gösterir. Buna karşılık, kaçınılmaz olarak sıfırın altındaki sıcaklıklarda donacak dondurularak toleranslı organizmalar, içinde, öğren düşük TH aktivitesine sahip görünmektedir. Düşük TH aktivite rağmen yüksek bir IRI aktivite buz ağlama kısıtlamak içinStal büyüme genellikle bu proteinlerle görülmektedir. Dondurularak toleranslı organizma için bu IRI aktivitesi muhtemelen dışı bölümlerde buz kontrolsüz büyümesi hücreleri korumaya yardımcı olur.
"Yatak düğmesi" modeli öğren buz kristallerinin 5 büyümesini önlemek mekanizmayı tarif etmek için kullanılabilir. Bu modelde, öğren özellikle su molekülleri bağlı öğren arasındaki boşlukta gelişen buz kristal kafesi ile birleştirmek için bu şekilde aralıklarla buz kristali yüzeyine adsorbe eder. Bu ilave su moleküllerinin eklenmesi elverişsiz kılan bir eğrilik Gibbs-Thompson etkisiyle 6 ile tarif edilebilir bir olay oluşturur. Bağlantılı klatrat suları hipotez buz kristali yüzeyine öğren spesifik bağlanmasını için bir mekanizma sağlar; reo spesifik olarak, protein buz bağlanma alanı üzerine yerleştirilmiş yüklü kalıntıların varlığı, sonuçSu moleküllerinin rganization böylece buz kristal kafes 7'nin bir ya da daha fazla uçak eşleşir.
TH aktivite erime arasındaki fark ölçülerek ve bir IBP mevcudiyetinde bir tek buz kristali donma sıcaklığının ile kantifiye edilebilir. TH aktivitesi öğren (a derece, tipik olarak sadece bir kısmı), bitki öğren tarafından üretilen düşük GAP etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilen yöntem olsa da, normal olarak yüksek bir protein konsantrasyonu, özel ekipman ve operatör deneyimi gerektirir. olmayan öğren buz kristali büyümesinin sınırlamak olsa da, tüm öğren ve böylece IRI aktivitesi için test edilmesi ile paylaşılan bir özellik, özellikle düşük TH aktivitesine sahip olanlar için, öğren mevcudiyeti için etkili bir başlangıç ekran. Bu aktiviteyi test etmek için kullanılan yöntem, bir protein numunesi flaş olmadığını belirlemek için belirli bir süre boyunca gözlenir küçük buz kristallerinin, bir tek tabaka üretmek için dondurulur ve böylece, bir 'splat tahlili' olarak bilinirbuz kristali büyümesi ile sınırlıdır. Öğren varlığı için bir kaynak doku örneği taramak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem 10-100 ng aralığında düşük protein konsantrasyonları için geçerlidir, kolayca imal teçhizatı kullanmaktadır ve hızlı ve kolay bir yorumlanır verileri üretir. Bununla birlikte, deneyin, TH belirlenmesi ve buz kristali şekillendirme ile takip edilmelidir öğren için bir başlangıç ekranını sağladığını vurgulamak önemlidir.
doğal proteinlerin izolasyonu genellikle ilgi konusu bir proteinin yapısal ve biyokimyasal özellikleri ile ilgili bilgi gerektiren zor bir iştir. buz öğren afınite saflaştırma amaçları için bir alt-tabaka olarak buz kullanılarak bu proteinlerin izolasyonu sağlar. moleküllerin büyük çoğunluğu, buz kristali büyümesi, yüksek saflaştırılmış örnekteki bir IBP örnek sonuçlarının mevcudiyetinde bir buz yarıkürenin düşük büyüme, büyük quantit yoksun esnasında öncesinde buz-su sınır itilir yanaproteinler ve çözünmüş kontamine ler. Bu yöntem, böcek 8, 9, 10, bakteriler 11, balık 12 ve bitkiler 13, 14 öğren tanımlamak için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem sayesinde elde edilen IBP zenginleştirilmiş kısımlar, aynı zamanda aşağı biyokimyasal analiz için kullanılabilir. Bu kağıt öğren indüksiyonu ve ekstraksiyon yoluyla bitkilerde öğren tanımlanmasını açıklar, IRI faaliyeti analizi proteinlerin, ve buz afinite saflaştırması kullanılarak proteinlerin izolasyonunu doğrulamak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Splat tertibat Ayar
- etilen glikol (% 50 v / su içinde hacim) olan bir sıcaklığa programlanabilir dolaşan su banyosu doldurun.
Not: Yeşil otomotiv etilen glikol kullanılabilir. - Harici odasını monte etmek için, bir çift duvarlı cam kaseye su banyosu takmak için yalıtılmış plastik boru kullanılmalıdır. polistiren köpük cam kase izole ve bir plastik petri kabı bir kapak ile kaplayın. Işık kaynağı, cam odasının içinden görülebilir ve böylece polistiren bölmenin tabanında yer alan 3-4 inçlik bir delik.
- Bir kamera portu ve bir 10x oküler lens ile bir 4X polarize objektif lens ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu üzerinde dış odasını, monte edin. Dış haznenin altına polarize filmin ek bir parça yerleştirin.
- imbik tezgahının tabanında boru altında yer alan bir soğutma bloğu ile birlikte, büyük bir polistiren kap içinde bir otoklav standı ve yer üzerine 1-1.5 m borusu (~ 5 cm çapında) kelepçe.
Doğal protein 2. Hazırlık IRI Analiz için özler
- Düşük ışık koşullarında (6 saat ışık / 18 saat karanlık) altında, 4 ° C 'de en fazla 1 hafta dondurularak dayanıklı otları ve diğer donma toleranslı bitki türleri, soğuk iklime alışmaları bitkilerde öğren ekspresyonunu indüklemek için. Bu zaten düşük sıcaklık koşullarında ve aklimasyonundan dönemleri maruz kalmış sahadan toplanan numuneler için geçerli değildir.
- sapının kesilerek yaprak dokusunun yaklaşık olarak 0.1 g elde edilir ve daha sonra 1.5 ml bir tüp içinde yer. Kullanımdan hemen kadar -80 ° C'de sıvı azot ve mağaza örnek flaş dondurma.
- , Hücreler lize edildi, sıvı azot altında bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde doku öğütülmesine için. Sıvı azot homojenleştirme işlemi sırasında buharlaşmaz emin olun.
- Hemen buz üzerinde yer örnekleri yer ve sıvı azot tamamen buharlaşmasına izin verin. bir doğal protein extracti 1 ml ekleyin10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7.5) ihtiva eden, iki EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tableti içeren tampon, kullanımdan hemen önce eklenmiştir. Karıştırmak için pipet; Girdapsız davranma
NOT: lizat ikincil metabolitler içeriyorsa ilave katkı maddelerinin kullanılması gerekebilir (bkz. Tartışma). - Örnekleri gece boyunca (18-24 saat) 4 ° C'de hafifçe çalkalayın. Kalan adımları 4 ° C'de gerçekleştirin.
- 5 dakika boyunca ~ 16,000 xg'de numuneleri santrifüj ederek hücre döküntülerini alın. Hücresel enkaz devam ediyorsa, çözünür fraksiyonu ve santrifüjü ilave 5 dakika muhafaza edin. Açıklanan numuneler kullanıma kadar -20 ° C'de saklanabilir.
3. Splat Assay Deney öncesi kurulum
- Polarize film ile kurulan harici odaya 100 mL hekzan dökün ve slaytlar üzerinde nem oluşmasını önlemek için 5-6 kurutucu boncuk ekleyin. Hamamı kaplayan plakaya az miktarda vakum gres ekleyin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak ve hekzanın buharlaşmasını önlemek için bükün. Deneye başlamadan önce, arasında -4 ° C ve -6 ° C programlanabilen bir su banyosu kullanılarak yaklaşık olarak 2-3 saat heksan banyosu soğutulur. deney başlamadan önce bir termometre ile hekzan sıcaklığını kontrol etmek emin olun.
- Doğrudan plastik tüp altında bir polistiren kutu soğutma blok yerleştirin ve kuru buz tamamen deney başlamadan önce 40 dakika kapsamaktadır.
- tahlil başlamadan önce tüp seviyesi olduğundan emin olun. Örnek düşecek soğutma bloğu, birinci test ile burada su ile prosedür belirlemek ve (aşağıda tarif edildiği gibi) bir numune, bir marker ile düşünceye göstermek için.
- Soğuk bloğun üstünden kuru buz çıkarın ve suyla belirlenmiştir damla işareti üstünde cam mikroskop kapak slayt yerleştirin.
- Hemen Deneye başlamadan önce, ışık kaynağı açmak ve cam bölmenin alt kısmında oluşturulmuş olan herhangi bir buz kazıyın. buz kristalleri sürece ışık kaynağını tutmamaya özenheksan ısıtma önlemek için görüntülenmiştir edilmektedir.
4. Splat tahlili yapılması
- bir kağıt havlu fazla yağı kaldırmak kullanarak, immersiyon otomatik pipet (1-20 ul) yapıştırılmış atılabilir ucu batırın. Bu adım örnek düşmek yerine pipet dışına uymak sağlayacaktır.
NOT: pipet fazla yağı çıkarma yağ damlacıkları görselleştirme zorlaştırır buz kristalleri üzerinde oluşturmuyor sağlamak için kritik öneme sahiptir. - şirketinden örnek bırakmadan önce plastik boru üzerine numune ve yer pipetin pipet 10 uL. Numune buz kristallerinin bir tek tabaka oluşturmaya, cam kapak slayt çarptığında bir tat 'splat' sesi duyulmalıdır.
- Çabuk ve dikkatle polarize filmin üstünde hekzan banyosuna cımbız ve yer kullanarak soğuk bloktan mikroskop lamı çıkarın.
- Mikroskop altında bakıldığında, görünümü ve reklamın alanına mikroskop lamı koymakSadece objektif lens böylece çapraz polarizasyon yüksek kontrast buz kristallerinin olarak gösterebilir. 40x büyütme ayarlayın.
- mikroskoba kamera takın ve buz kristallerinin net görüntülenmesine yol açar ve görüntüyü yakalamak için "makro" için ayarları yapın.
NOT: 1 saat kadar bekleyen buz kristalleri daha net bir görüntü verebilir büyümeye izin vermek. - Tekrarlayın tüm numuneler için 4,1-4,5 adımları tekrarlayın. Tipik olarak, heksan odasında farklı numune ile 6 slaytlar yerleştirebilir.
- sıkı bir mühür sağlanması ışık kaynağını kapatın ve hekzan küvetin üzerinde plastik tabak koyun. (Belirli bir analiz içinde, tutarlı bir tavlama süresi tutarak, 12-24 saat) buz kristalleri gece boyunca tavlanmasına izin verin. İnkübasyon sonrasında, buz filmlerin yakalama görüntüleri yukarıda açıklandığı gibi.
NOT: Bazı numuneler diğerlerinden daha çabuk rekristalize edilebilir. bir yeniden kristalizasyon, 12 saat sonra olması halinde, 24 saate kadar herhangi bir yeniden kristalize olmasını sağlamak için kristaller tavlanmasına izin verecekkıymetleştirme meydana gelecektir.
5. Splat tahlili Veri Analizi
- Fotoğrafları bilgisayara yükleyin ve doğrudan öncesi ve tavlama sonrası buz kristallerinin büyüklüğünü karşılaştırın. bir IRI faaliyeti olmayan örnekler fark daha büyük buz kristallerinin oluşturulması yeniden kristalleşen ise buz yeniden kristalleşme aktivitesi olan örnekler, büyüme olmaz. Işık girişim büyük buz kristalleri biraz farklı tonlar görünür ve böylece görmek kolaydır yapacaktır.
6. Buz yakınlık Arıtma Ekipmanları Kurulumu
- etilen glikol ile bir sıcaklığa programlanabilir dolaşan su banyosu doldurun. Yeşil otomotiv etilen glikol kullanılabilir.
- Yalıtımlı plastik boruyu 15 kullanılarak içi boş, pirinç proba banyo bağlayın.
- 150 mL çanak kuytu uyabildiği bir polistiren kap oluşturmak. pirinç soğuk parmağı için merkezi bir delik olan kap için bir kapak oluşturun.
7.Buz-afinite temizliği için Örneklerinin Hazırlanması
- Soğuk iklime alışmaları bitki dokusu olarak bölüm 2.1'de anlatıldığı.
- 20 ml tüpler içinde öğütülmüş biyokütle (aşama 2.3) ~ 100-150 g toplayın ve hemen dondurularak yanıp söner. Numuneler, kullanımdan önce -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
- bölümlerde 2.3-2.5 tarif edildiği gibi örnek hazırlayın. yaprak dokusunun yeniden süspanse edilmesi için: 1 oranında (doğal protein ekstraksiyon tamponu ml doku mg olarak verir:), 1 kullanın. endojen proteaz ile öğren bozulmasını önlemek için ek proteaz inhibitör tabletleri kullanın.
Not: 2 veya 1: 3 (dokusunun mg: doğal protein ekstraksiyon tamponu mL) doku örneği, çok konsantre olduğunda, 1 oranının ayarlanması. - Hücresel enkaz kaldırmak için tülbent 2 kat, 3 kat aracılığıyla lizat eleyin. 4 ° C'de 40 dakika boyunca 30,000 x g'de santrifüj ile artık taneleri.
- doğal protein çıkarma tamponu kullanarak 120 mL numune hacmini artırır. buz afinite temizliği için hemen lizat kullanınbuz bağlayıcı aktivitesi kaybını önlemek.
8. İletken buz afinite saflaştırma
- saflaştırma öncesinde, -0.04 ° C / saatlik bir oranda ° -3 için -0.5 ° C'den soğumaya programlanabilen bir su banyosu ayarlayın.
Not: soğutma hızı numunenin başlangıç hacmine bağlı olarak ayarlanabilir. - -0.5 ° C'ye kadar buz parmak soğutun ve daha sonra soğuk damıtılmış su ihtiva eden bir 50 mL tüp içine daldırılması. parmağına oluşturmak üzere buz ince bir tabaka buz çekirdekleşmeyi kolaylaştırmak ve sağlamak için bir kaç buz yongaları ekleyin. Bu işlem, tipik olarak, 20 ile 30 dakika sürer.
Not: buzla kaplanmış parmak bütün topaklar önceki çalışmalar yerleştirilmesi için bir eldivenli eli ile düzeltilmelidir. bir buz tabakası -0.5 ° C de meydana değilse, -0.75 ° C'ye sıcaklığını düşürmek. - Manyetik karıştırıcı üstünde bir polistiren kap içine küçük bir manyetik karıştırma çubuğu içeren 150 mL glass beher içinde yer örneği. buz parmak olduğundan emin olunmerkezli ve sıvı numune içine en az yarı yol düşürdü. bir kap kapağı.
- 24 saatte bir kontrol programı yaklaşık iki gün boyunca çalışmasına izin verin. Numunenin% 50 dondurulmuş sonra, bir program dur. Buz yarımkürede içine öğren katılması "buz aşındırma" sonuçlanacaktır.
NOT: Arıtma deneyleri program çalışır buna göre ayarlanır hangi süreye sahip büyük örnek hacimleri kullanılarak yapılabilir. - 4 ° C'ye kadar prob, buz yarı-küresinin kaldırmak ısınmaya amacıyla, bağlanmamış proteinin ayrılması için damıtılmış su ile yarım küre yıkayın ve daha sonra 4 ° C'de eritin.
Not: çoğu öğren su ve uygun bir tampon içinde kararlı değildir (diğer bir deyişle, 50 mM Tris-HCI, pH 8 ya da 50 mM amonyum bikarbonat, pH 8) çözülme işlemi sırasında periyodik olarak ilave edilmesi gerekir (yaklaşık 1 mL / 2 saat) . Buz hemisfer alüminyum folyo ile sarılmış ve önceki eritme -20 ° C'de saklanabilir. - buz yarımküre hala içeriyorsas pigment ya da örnek saflaştırma geliştirmek için, tekrar 8,1-8,5 2-3 yineleyin.
Not: IBP konsantrasyonu düşük saflaştırma çok sayıda mermi aşağıdaki rağmen, saflık saflaştırılmış örnekleri MS kullanılarak analiz edilecektir verim daha değerlidir. yeterli malzeme mevcut ise, buzlu afinite saflaştırma üç tur önerilmektedir.
Öğren 9. tanımlanması
- Öğren buz yarıküre erimeyi takiben büyük hacimde içerdiği için, numune konsantre edin. Küçük protein kaybını önlemek için bir 3000 Da molekül ağırlığı kesmesi ile santrifüj konsantrasyon tüpler kullanılarak ~ 1-3 mL doku ~ 100 g içeren örnekler konsantre edilir.
- MS örnekleri göndermeden önce, bu tür bir BCA veya Bradford analizi gibi bir protein miktar tahlil kullanılarak protein konsantrasyonunu belirlemek. SDS-PAGE gibi jel elektroforezi ile numunelerin saflık tahmin. se önce IRI aktivitesi için saflaştırılmış proteinler testMS nding aktif protein saflaştırma ve konsantrasyon adım adım muhafaza edildiğinden emin olmak için.
- Kütle spektrometre analizi 10 doğrudan konsantre örnekleri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kurulum kolaylığı için, Şekil 1 ve Şekil 2, sırasıyla IRI analizi ve buzlu afinite temizliği için kullanılan ekipman, görsel bir gösterge olarak dahil edilmiştir. Öğren olan ve olmayan hardal otu toplanan özler kullanılarak IRI analiz sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu sonuçlar, dondurularak dayanıklı değildir hardal otu, toplanan ekstraktlar bağlı öğren mevcut olmaması buz kristali büyümesini sınırlamak mümkün olduğunu göstermektedir. Bunun aksine, küçük buz kristallerinin transgenik bitkiler esas buz kristali büyümesinin sınırlamak çok yıllık çim gelen öğren içeren görülür. Şekil 4, saflaştırma işleminin iki aşaması sonrasında öğren ifade ingiliz çimi özleri kullanılarak yetiştirilen buz hemisferlerin gösterir. Saflaştırma işleminin ilk tur yüksek derecede sonra hemisphe buz-etchingYüzey öğren buz adsorbe edilir ve buz kristalleri (Şekil 4A) büyümesini modifiye olduğunu gösterir yeniden. Şekil 4B'de gösterilen ikinci saflaştırma tur kirletici moleküller arasında dışlama olduğunu gösteren, net buz sahiptir. yarımküre yüzeyinde buz dağlama öğren hala mevcut olduğunu gösterir. Şekil 5, çok yıllık çim toplanan proteinlerin buz afinite saflaştırma işleminden sonra bir SDS-PAGE, gösterir, ve daha sonra bir gümüş boya ile boyanmıştır. Bir dizi protein, buzun adsorbe en bol proteinlere karşılık gelen, yedi farklı bantlar tespit edilmiştir.
Şekil 1: splat cihazının 16 şematik gösterimi. Ekipman bizi Buz kristallerinin (A) 'nın bir tek tabaka meydana getirilmesi ve bir buz kristali büyümesi (B) görselleştirilmesi için ed. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: öğren 16 buz afinite temizliği için kullanılmış tertibat. programlanabilir bir etilen glikol banyosuna bağlı bir pirinç "buz parmak" yavaş yavaş buz yarımkürede üretmek için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
g3.jpg"/>
Şekil 3: IRI analizi 17 kullanılarak elde Örnek verileri. Bitki özleri kullanılarak oluşturulan buz kristallerinin tek-katlı bir 40x büyütmede görüntülenmiştir. Öğren (-IBPs) içermeyen, vahşi tip Arabidopsis thaliana 'dan özler Lolium perenne (+ öğren) gelen öğren eksprese eden transjenik A. thaliana'nın özleri ile karşılaştırılmıştır. ° C, buz kristalleri tampon ve vahşi tip A. thaliana numunelerinde yeniden kristalize olan en -4, 18 saatlik inkübasyon süresinin ardından. Bunun aksine, buz kristali büyümesinin IBP eksprese, A. thaliana ekstrelerinde kısıtlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: dondurularak dayanıklı çimen, L. perenne toplanan IBP özler kullanılarak buz-hemisferlerin büyütüldüler. Ot ekstratları, buz-eğilim saflaştırma işlemi bir döngüsüne tabi tutulmuştur sonra buz yarı-küresinin yüzeyi buz aşındırma öğren (A) 'nın başarılı bir şekilde dahil edilmesini gösterir. Ek solütler, pigmentler ve kirletici proteinleri uzaklaştırmak için, buzlu afiniteli ikinci tur daha net bir buz hemisferde (B) 'de elde edilen, kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5: çok yıllık çim yerli öğren saflaştırılmasını izlenmesi. buz afinite saflaştırma ve santrifüj konsantrasyonunun iki tur sonra,doğal çim ekstreler denatüre edici poliakrilamid jeli (SDS-PAGE) üzerinde elektroforez uygulanır ve daha sonra gümüş leke kullanılarak görüntülenmiştir. Şerit 1: moleküler ağırlık proteini merdiven; Şerit 2: seyreltilmemiş özü; Şerit 3-5: 2, 1: 5, ve 1:10 (örnek: su) oranında önce bir 1 jel yükleme için suda seyreltilir örnekler. Bu özel bitki türleri IBPS bir dizi içerir, gözlenen çoklu bantlar farklı IBP izoformlarına karşılık gelebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Öğren başarıyla analiz ve saflaştırma için, proteinlerin bazı sıcaklığa duyarlı doğasını anlamak önemlidir. Bazı bitki öğren açılması, çökeltme ve işlem içinde elde edilen, 0 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda stabil hale gelir. Aktif öğren elde etmek için, bitkiler, soğuk bir odada (~ 4 ° C) içinde işlenir ve numuneler, deney sırasında buz üzerinde tutulur, çok daha önemlidir. Bütün hücreli ham lizatları kullanılarak endojen proteazlar tarafından proteinlerinin parçalanma olduğunda diğer bir faktör dikkate. Bitkilerde, öğren ifadesi genel olarak düşük olduğunu ve bu nedenle protein, verimde herhangi bir kayıp gelecekteki deneyler ve analiz için yeterli malzeme neden olabilir. Güvenilir bir proteaz inhibitör kokteyli ilavesi ile, protein ekstraksiyonu sırasında hızla çalışan bu tür protein kaybını azaltabilir. Ayrıca, soğuk aklimasyonundan süre laboratuar yetişkin gibi IBPS büyük birikimi için optimize edilmiş olması önemlidirbitkiler.
Öğren ile çalışan diğer sorun, tahlillerin birçok ısı ve neme duyarlı olmalarıdır. IRI analizi ile ilgili olarak, mikroskop kapak sürgü üzerindeki nem birikmesi buz kristallerinin görselleştirme zorlaştırır buz tabakası ile sonuçlanabilir. poşetli kullanma ve ekstra kuruma boncuklar bu zorluğu çözebilirsiniz; Bununla birlikte, laboratuar bağıl nem seviyesi% 70 üzerinde olduğunda, bu deney yürütülen değildir önerilir.
splat analiz, sunulan, nitel olduğunu. analizden önce bir seyreltme serisinin gerçekleştirilerek, IRI uç öğren artık buz kristali büyümesinin kısıtlayabilir olan konsantrasyon aralığını belirlemek için kurulabilir. Çeşitli laboratuarları aynı zamanda buz kristal tanelerin 18 ortalama boyutunu ölçmek için bilgisayar yazılımı kullanılmıştır. Daha önce belirtildiği gibi, IRI aktivitesi için test sırasında etkin bir başlangıç ekranı, doğrulanmasıdır buz bağlamaaktivitesi TH seviyesinin belirlenmesi ile ya da doğrudan buz kristallerinin 16 öğren adsorpsiyonunu görselleştirerek kurulmalıdır. IRI analizi dikkate değer bir sınırlama olmayan çeşitli IBP moleküller, bu taklit IRI aktivitesi tespit edilmiş olmasıdır. Bu moleküller, büyük proteinleri, fenolik glikozitler ve polivinil alkol 19, 20, 21 gibi sentetik polimerler de içerebilir. Bunun bir sonucu olarak, bir tampon kontrol her zaman herhangi bir kirletici veya katkı maddeleri gözlenen IRI aktivitesi neden olmayan sağlamak için numune ile çalıştırılmalıdır.
buz afinite saflaştırma kolayca gerçekleştirilir birlikte doğru yapılmazsa zaman, diğer proteinler, çözeltiler ve metabolitleri baskın olabilir. Önemli bir husus, buz kristali büyümesinin oranıdır; soğutma hızını düşürerek (örneğin, -0.02 ° C / saat), buz yarı-küresinin daha yavaş ve olmayan buz bağlayıcı molecu büyürles buz kristal örgüsünde olma olasılığı daha düşüktür. Kirletici moleküllerinin varlığı da lizatının sadece% 50 yarım küre içine dahil edilir sağlayarak kaçınılabilir (yani 50:50, buz oranı, sıvı). Daha önce belirtildiği gibi, buz afinite birçok raund da buz kısmını açıklığa kavuşturmak ve daha yüksek saflıkta bir örnek ile sonuçlanabilir. Özellikle, sekonder metabolitler genellikle bitkilerde biyotik ve abiyotik stres koşulları altında fazlasıyla üretilmiştir edilir. Koyu kahverengi pigmentler,% 1.5 (h / h) polivinilpirolidon (PVP) ve% 1.5 polivinilpolipirolidon devam ederse fenol açısından zengin bitki dokularının saflaştırma sırasında (a / h) (PVPP) ekstraksiyon tamponu ilave edilebilir, ikincil etkisiz hale getirmek için metabolitleri. Tiyoüre (5-10 mM) gibi antioksidan katkı maddeleri de, 21 19 kullanılabilir.
Çevrede IBP ile ilgili bilgi, yüksek basınçlı li gibi, ek saflaştırma adımları, biliniyorsaIndirgeme kromatografisi (HPLC) de kullanılabilir. Buz-afiniteli saflaştırmaya yönelik değişiklikler de düşünülebilir ve protein verimini en iyi hale getirdiği ve daha hızlı buz kabuğu saflaştırması 23 ve flüoresans esaslı buz düzlemi afinitesi (FIPA) 24 dahil olmak üzere IBP karakteristikleri hakkında ilave bir içgörünün kazanıldığı bildirilmiştir.
Optimize edildiğinde, yukarıda tarif edilen teknikler IBP'lerin tanımlanması için saflaştırılmış bir protein havuzu oluşturabilir; Bununla birlikte, diğer oldukça bol miktarda proteinlerin belirlenmemiş bir şekilde eklenmesi kaçınılmaz olabilir. Pooideae ailesinden gelen IBP'ler, farklı organizmalardan gelen IBP'ler arasındaki yüksek çeşitlilik nedeniyle dizi homolojisini 25 paylaşırken, tipik olarak bir IBP'yi tek başına dizi homolojisi ile tanımlamak mümkün değildir. IBP'lerin ortak bir özelliği, treonin, serin ve valin 26 da dahil olmak üzere buza bağlandığı bilinen amino asitlerin varlığıdır; Zengin peptid sekanslarını tanımlamaksequence data madencilik zaman, ese kalıntıları faydalı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma VKW bir NSERC (Kanada) hibe ile finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L.
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L.
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
