Summary
Dit document beschrijft de identificatie van ijs bindende eiwitten uit freeze-tolerante planten door de beoordeling van ijs herkristallisatie inhibitie activiteit en daaropvolgende isolatie van natieve IBP gebruik ice-affiniteitzuivering.
Abstract
Ice-bindende eiwitten (IBP) behoren tot een familie van stress-geïnduceerde eiwitten die worden gesynthetiseerd door bepaalde organismen blootgesteld aan temperaturen onder nul. In planten vorstschade ontstaat wanneer extracellulaire ijskristallen groeien, wat resulteert in het breken van plasmamembranen en eventuele celdood. Adsorptie van IBP ijskristallen beperkt verdere groei door een proces dat ijs herkristallisatie inhibitie (IRI), waardoor celbeschadiging verminderen. IBP laten ook de mogelijkheid om het vriespunt van de oplossing beneden het evenwicht smeltpunt, een eigenschap bekend als thermische hysterese (Th) activiteit onderdrukken. Deze beschermende eigenschappen hebben belangstelling voor de identificatie van nieuwe IBP's verhoogd als gevolg van hun potentieel gebruik in industriële, medische en agrarische toepassingen. Dit document beschrijft de identificatie van planten IBP m 1) de inductie en extractie van IBP in plantenweefsel, 2) de screening van extracten van IRI activiteit en 3) het isoleren en purificatie van IBP's. Na de inductie van IBP door blootstelling lage temperatuur worden extracten getest op activiteit met behulp van een IRI 'splat assay', waarbij de observatie van de groei van ijskristallen met een standaard lichtmicroscoop maakt. Deze test vereist een lage eiwitconcentratie genereert resultaten verkregen die snel en gemakkelijk te interpreteren, verschaffen een eerste screening voor ijs bindingsactiviteit. IBP kan daarna worden geïsoleerd uit contaminerende eiwitten door gebruik van de eigenschap IBP adsorbeert ijs, via een techniek genaamd "ice-affiniteitzuivering. Gebruik cellysaten vanuit plantenextracten, kan een ijs hemisfeer traag worden gekweekt op een koperen probe. Dit omvat IBP in de kristallijne structuur van de polykristallijne ijs. Waarbij geen a priori biochemische of structurele kennis van de IBP maakt deze werkwijze voor het terugwinnen van actief eiwit. -Ijs gezuiverde eiwitfracties kunnen worden gebruikt voor verdere toepassingen inclusief het bepalen van peptide sequenties door massaspectrometrie en biochemische analyse van natieve eiwitten.
Introduction
Ice-bindingseiwitten (IBP) zijn een diverse familie van beschermende eiwitten die zijn ontdekt in een aantal organismen, waaronder planten 1, 2 insecten, vissen 3 en 4 microben. Het belangrijkste kenmerk van deze eiwitten is hun unieke mogelijkheid om gericht en efficiënt adsorberen aan ijskristallen, het wijzigen van hun groei. IBP meerdere gedocumenteerde eigenschappen, met de twee meest kenmerk dat thermische hysterese (TH) en ijs herkristallisatie inhibitie (IRI). TH activiteit gemakkelijker waargenomen IBP geproduceerd in freeze-intolerant dieren. Deze activiteit leidt tot verlaging van het vriespunt van de bloedsomloop of interstitiële vloeistoffen organismen om bevriezing te voorkomen. Dit in tegenstelling tot freeze-tolerante organismen, wat onvermijdelijk zal bevriezen bij temperaturen onder het vriespunt, IBP's lijken te laag TH activiteit hebben. Ondanks de lage TH activiteit, een hoge IRI activiteit ijsk beperkenstal groei wordt vaak waargenomen met deze eiwitten. Voor de freeze-tolerante organisme, dit IRI activiteit waarschijnlijk helpt cellen tegen de ongecontroleerde groei van ijs in extracellulaire compartimenten.
De "matras toets" model kan worden gebruikt om het mechanisme waarmee IBP de groei van ijskristallen 5 beschrijven. In dit model IBP specifiek te adsorberen aan het ijskristal aanbrengen met tussenafstanden, zodat watermoleculen alleen nemen de groeiende ijs kristalrooster in de ruimte tussen gebonden IBP. Hierdoor ontstaat een kromming die de opname van extra watermoleculen ongunstig maakt, een gebeurtenis die kan worden beschreven door de Gibbs-Thomson effect 6. De verankerde water clathraat hypothese verschaft een mechanisme voor de specifieke binding van IBP aan het ijskristal oppervlak waardoor de aanwezigheid van geladen residuen, in het bijzonder geplaatst op het eiwit bindingsplaats ijs, resulteert in de reorganisatie watermoleculen zodat ze overeenkomen met een of meer vlakken van het ijskristal rooster 7.
TH activiteit kan worden gekwantificeerd door het verschil tussen de smelt- en vriespunt van een ijskristal in aanwezigheid van een IBP. Terwijl TH-activiteit is een algemeen aanvaarde methode voor het evalueren van de activiteit van IBP, de lage TH spleet geproduceerd door planten IBP (typisch slechts een fractie van een graad) gewoonlijk een hoge eiwitconcentratie, gespecialiseerde apparatuur en bestuurderservaring. Hoewel niet-IBP ijs kristalgroei beperken, is een eigenschap die door alle IBP en dus testen op IRI Activiteit effectief startscherm voor de aanwezigheid van IBP, met name voor de lage TH activiteit. De gebruikte deze activiteitstest methodologie is bekend als een 'splat assay', waarbij een eiwitmonster wordt snel ingevroren op een monolaag van kleine ijskristallen, die worden gemeten over een tijdsperiode te bepalen of producerenijs kristalgroei beperkt. In tegenstelling tot andere methoden om een bron weefselmonster op de aanwezigheid van IBP screenen Deze techniek is toepasbaar op lage eiwitconcentraties in het traject van 10-100 ng, gebruik gemakkelijk vervaardigde materiaal en genereert data die snel en gemakkelijk wordt geïnterpreteerd. Het is echter belangrijk te benadrukken dat deze test geeft een eerste scherm IBP die moet worden gevolgd door het bepalen van TH en ijskristal vormen.
De isolatie van natieve eiwitten is een uitdaging, waarvoor vaak informatie met betrekking tot de structurele en biochemische eigenschappen van een eiwit van belang. De affiniteit van IBP ijs maakt de isolatie van deze eiwitten met behulp van ijs als substraat voor zuiveringsdoeleinden. Aangezien de meeste moleculen vóór het ijswater begrenzing geduwd tijdens de groei van ijskristallen, trage groei van een ijs-halfrond in aanwezigheid van een IBP monster resulteert in een zeer gezuiverd monster, zonder grote quantitven van verontreinigende proteïnen en opgeloste stoffen. Deze werkwijze is gebruikt om IBP identificeren insecten 8, 9, 10, 11 bacteriën, vissen en planten 12 13 14. Daarnaast is de IBP-verrijkte fracties die met deze werkwijze kan ook worden gebruikt voor downstream biochemische analyse. Dit document beschrijft de identificatie van IBP in planten via de inductie en extractie van IBP, analyse van IRI activiteit de aanwezigheid van eiwitten, en de isolatie van eiwitten met behulp van ijs affiniteitzuivering bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inrichting Splat Setup
- Vul een temperatuur programmeerbare circulerend waterbad met ethyleenglycol (50% v / v in water).
LET OP: De groene auto-ethyleenglycol kunnen worden gebruikt. - De externe kamer monteren Gebruik geïsoleerde kunststofbuis aan het waterbad hechten aan een dubbelwandige glazen kom. Isoleer de glazen schaal met polystyreenschuim en bedekken met een plastic petrischaal deksel. Snijd een 4/3 inch gat in de bodem van het polystyreen kamer, zodat de lichtbron kan worden gezien door de glazen kamer.
- Monteer de externe kamer op een dissectie microscoop, uitgerust met een camera en een poort gepolariseerde 4x objectief met een 10x oculair lens. Plaatsen van een extra stuk gepolariseerde film in de bodem van de externe kamer.
- Een klem 1-1,5 m buis (~ 5 cm diameter) op een retort stand en plaats in een grote polystyreen container, samen met een koelblok geplaatst onder de buis aan de onderzijde van de retort stand.
2. Bereiding van inheemse eiwitextracten van IRI Analysis
- Om de expressie van IBP in freeze-tolerante grassen of andere freeze-tolerante plantensoorten, koude acclimatiseren planten induceren tot 1 week bij 4 ° C onder omstandigheden met weinig licht (6 uur licht / 18 uur donker). Dit geldt niet voor monsters uit het veld die reeds zijn blootgesteld aan lage temperaturen en perioden acclimatisatie.
- Vinden ongeveer 0,1 g bladweefsel door het snijden aan de basis van de stam en plaats in een 1,5 ml buis. Onmiddellijk knipperen bevriezen het monster in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
- Om cellen te lyseren, vermalen weefselmonster tot een fijn poeder met behulp van een vijzel onder vloeibare stikstof. Waarborgen dat de vloeibare stikstof niet verdampt tijdens het homogenisatieproces.
- Plaats onmiddellijk gemalen monsters op ijs en kan de vloeibare stikstof volledig verdampen. Voeg 1 ml van een natuurlijk eiwit extractiOp buffer die 10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7,5), met twee EDTA-vrije proteaseremmer tabletten toegevoegd onmiddellijk voor gebruik. Pipet te mengen; niet vortex.
LET OP: Extra additieven kan het nodig zijn om te worden gebruikt als de lysaat bevat secundaire metabolieten (zie Discussie). - Schud monsters overnacht (18-24 uur) bij 4 ° C. Voeren de overige stappen bij 4 ° C.
- Verwijderen celresten door centrifugeren monsters bij ~ 16.000 xg gedurende 5 minuten. Bewaar de oplosbare fractie en centrifugeer gedurende nog 5 min of cellulair afval blijft. Geklaarde monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.
3. Splat Assay Pre-experiment opzetten
- Giet 100 ml hexaan in de externe kamer ingesteld met de gepolariseerde film en voeg 5-6 uitdroging korrels geen vocht ophopen op de glijbanen. Voeg een kleine hoeveelheid vacuüm vet aan de plaat die het bad en draait om een goede afdichting te waarborgen en verdamping van het hexaan voorkomen. Koel het hexaanbad tussen -4 ° C en -6 ° C met behulp van het programmeerbare waterbad ongeveer 2-3 uur voordat het experiment wordt gestart. Zorg ervoor dat u de temperatuur van de hexaan met een thermometer controleert voordat u het experiment begint.
- Plaats het koelblok in een polystyreenkast direct onder de plastic buis en bedek het geheel met droogijs, 40 minuten voor het starten van het experiment.
- Zorg ervoor dat de buis gelijk is voordat u de test begint. Om te bepalen waar op het koelblok het monster zal vallen, test eerst de procedure met water en geef aan waar het monster met een marker druppelt (zoals hieronder beschreven).
- Verwijder droogijs uit de bovenkant van het koude blok en plaats een glazen microscoopkap op het druppelmerk dat met water is bepaald.
- Onmiddellijk voordat u de test start, zet u de lichtbron aan en schraap ieder ijs dat op de bodem van de glazen kamer is gevormd. Vermijd het aanhouden van de lichtbron tenzij ijskristallenWorden geconfronteerd om verhitting van de hexaan te verhinderen.
4. Uitvoeren van de Splat-analyse
- Doe de weggooipunt aan een automatische pipet (1-20 μL) in onderdompelolie, doe een papierdoekje uit met een overmatige olie. Deze stap laat het monster toe vallen, in plaats van aan de buitenkant van de pipet te vallen.
OPMERKING: Het verwijderen van overtollige olie uit de pipet is cruciaal om ervoor te zorgen dat de oliedruppels niet op de ijskristallen vormen, waardoor de visualisatie moeilijk is. - Pipet 10 μL monster en plaats pipet direct over plastic buis voordat u het monster loslaat. Een duidelijk 'splat'-geluid moet gehoord worden wanneer het monster de glazen deksel glijdt, waardoor een monolaag van ijskristallen wordt gecreëerd.
- Verwijder de microscoopschuif uit het koude blok snel en zorgvuldig met behulp van een pincet en plaats het hexaanbad bovenop de polariserende film.
- Kijk onder de microscoop, zet de microscoop dia in het zichtveld en de advertentiealleen de objectieflens, zodat de kruispolarisatie maakt de visualisatie van hoge contrast ijskristallen. Pas de vergroting 40x.
- Bevestig de camera aan de microscoop en de instellingen op "macro" aan te passen aan duidelijke visualisatie van ijskristallen mogelijk te maken en vastleggen van het beeld.
OPMERKING: Wachten tot 1 uur om ijskristallen te groeien kan een duidelijker beeld te geven. - Herhaal stap 4,1-4,5 voor alle monsters. Kenmerkend plaats tot 6 dia met een ander monster in de kamer hexaan.
- Schakel de lichtbron en een plastic plaat over het bad van hexaan, waardoor een goede afdichting. Toestaan ijskristallen een nacht hybridiseren (12-24 h, consistent blijft gloeiduur binnen een bepaalde assay). Na incubatie foto's maken van het ijs films zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Sommige monsters kunnen sneller rekristalliseren dan anderen. Als er geen herkristallisatie blijkt na 12 uur, laat kristallen versmelten tot 24 uur te voorkomen dat recrystallisatie optreedt.
5. Splat Assay Data Analysis
- Upload de foto's naar een computer en direct vergelijken van de grootte van ijskristallen voor en na gloeien. Monsters met ijs herkristallisatie activiteit niet groeien, terwijl monsters zonder enige IRI activiteit herkristalliseren vormen duidelijk groter ijskristallen. Licht interferentie zal maken grote ijskristallen verschijnen in iets andere tinten en zijn dus gemakkelijk te zien.
6. Ice-affiniteit Materiaal van de Reiniging Setup
- Vul een temperatuur programmeerbare circulerend waterbad met ethyleenglycol. Groen auto ethyleenglycol kan worden gebruikt.
- Sluit het bad een holle, koperen probe behulp geïsoleerde kunststofbuis 15.
- Construct een polystyreen houder waarin een 150 ml bekerglas behaaglijk past. Maak een deksel van de container met een gat in het centrum voor de koperen koude vinger.
7.Bereiding van monsters voor Ice-affiniteitzuivering
- Koude acclimatiseren plantenweefsel zoals in hoofdstuk 2.1.
- Verzamel ~ 100-150 g van de gemalen biomassa (stap 2.3) in 20 ml buizen en onmiddellijk knipperen bevriezen. Monsters kunnen bij -80 ° C voor gebruik worden bewaard.
- Bereid monster zoals uitgelegd in sectie 2,3-2,5. Met een 1: 1 verhouding (mg weefsel: ml natief proteïne extractiebuffer) te resuspenderen bladweefsel. Gebruik extra proteaseremmer tabletten om de afbraak van IBP voorkomen door endogene proteasen.
Opmerking: Als het weefselmonster te geconcentreerd, passen de verhouding 1: 2 of 1: 3 (mg weefsel: ml natief proteïne extractiebuffer). - Verwijderen van cellulair debrie, zeef lysaat tot 2 lagen kaasdoek, 3 keer. Pellet de afval door centrifugatie bij 30.000 xg gedurende 40 min bij 4 ° C.
- Het volume van het monster tot 120 ml met behulp van natief proteïne extractiebuffer. Met het lysaat direct voor consumptie-affiniteitszuivering tevoorkomen dat het verlies van ijs bindingsactiviteit.
8. uitvoeren Ice-affiniteitzuivering
- Vóór zuivering stellen de programmeerbare waterbad afkoelen van -0,5 ° C tot -3 ° C met een snelheid van -0,04 ° C / h.
OPMERKING: De koelsnelheid kan worden aangepast afhankelijk van het aanvankelijke volume van het monster. - Koel het ijs vinger tot -0,5 ° C en vervolgens dompel deze in een 50 ml buis met koud gedestilleerd water. Voeg enkele ijsblokjes op ijskiem vergemakkelijken en een dunne laag ijs vormen op de vinger. Dit proces neemt meestal tussen 20 en 30 minuten.
OPMERKING: knobbeltjes op het ijs bedekt vinger worden uitgevlakt met een gehandschoende hand voorafgaand aan het plaatsen in de steekproef. Als een ijslaag vormt geen -0,5 ° C, laat de temperatuur tot -0,75 ° C. - Het monster in een 150 ml glazen beker met een kleine magnetische roerstaaf in een polystyreen container bovenop de magnetische roerder. Zorg ervoor dat het ijs vingergecentreerd en neergelaten ten minste halverwege in het vloeibare monster. Verzegeling van de container.
- Laat het programma te lopen voor ongeveer twee dagen, het controleren van elke 24 uur. Zodra 50% van de steekproef is bevroren, stopt het programma. Incorporatie van IBP in het ijs halfrond resulteert in "ice-etsen".
OPMERKING: Zuivering experimenten kunnen worden uitgevoerd met grotere monstervolumes met de tijd waarop het programma loopt dienovereenkomstig aangepast. - Om het ijs halfrond de sonde te verwijderen opwarmen tot 4 ° C, spoel de halve bol met gedestilleerd water om niet-gebonden eiwit te verwijderen en vervolgens ontdooien bij 4 ° C.
OPMERKING: De meeste IBP niet stabiel in water en een geschikte buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8 en 50 mM ammoniumbicarbonaat, pH 8) moet periodiek worden toegevoegd tijdens het ontdooiproces (ongeveer 1 ml / 2 uur) . Ijs halve bollen kunnen worden in aluminiumfolie gewikkeld en bewaard bij -20 ° C voorafgaande aan ontdooien. - Als het ijs-halfrond nog steeds bevattens pigment, of om het monster te zuiveren verhogen Herhaal stap 8.1-8.5 2-3 keer.
Opmerking Hoewel de concentratie IBP lager kan zijn na meerdere rondes van zuivering, zuiverheid waardevoller dan verkregen wanneer het gezuiverde monsters worden geanalyseerd met MS. Indien voldoende materiaal beschikbaar is drie rondes van consumptie-affiniteitszuivering aanbevolen.
9. Identificatie van de IBP's
- Aangezien IBP zijn opgenomen in een groot volume na ontdooien van het ijs hemisfeer, concentreer de monsters. Concentreren monsters die -100 g weefsel tot ~ 1-3 ml gebruikt centrifugale concentratie buizen met een 3000 Da molecuulgewicht cut-off om het verlies van kleine eiwitten voorkomen.
- Voorafgaand aan het verzenden van monsters voor MS Bepaal de eiwitconcentratie onder gebruikmaking van een eiwit kwantificering test zoals een BCA of Bradford assay. Schat de zuiverheid van de monsters door gelelektroforese zoals SDS-PAGE. Test de gezuiverde eiwitten IRI activiteit vóór sending voor MS opdat actief eiwit werd vastgehouden door de zuivering en concentratiestappen.
- Gebruik geconcentreerde monsters direct voor massaspectrometrie analyse 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor het gemak van de set-up, figuur 1 en Figuur 2 worden als visuele representaties van de voor IRI analyse en ijs-affiniteitzuivering respectievelijk materiaal. IRI resultaten van analyse met extracten vanuit mosterd onkruid met en zonder IBP zijn weergegeven in figuur 3. Deze resultaten tonen aan dat extracten verzameld uit mosterd wiet, die niet bevriezen-tolerant, waren niet in staat om de groei van ijskristallen te beperken als gevolg van het ontbreken van IBP's aanwezig. In tegenstelling tot de kleine ijskristallen waargenomen bij transgene planten met IBP uit Engels Raaigras hoofdzaak beperken ijs kristalgroei. Figuur 4 ijs hemisferen geteeld met behulp Engels raaigras extracten tot expressie IBP na twee ronden van zuivering. Na de eerste ronde van zuivering de hoge mate van consumptie-etsen op het hemisphere oppervlak aan dat IBP het ijs geadsorbeerd en gewijzigde groei van de ijskristallen (Figuur 4A). De tweede ronde van zuivering figuur 4B duidelijker ijs, wat aangeeft dat er een uitsluiting van verontreinigende moleculen. Ice-etsen op de halve bol oppervlak aan dat IBP nog aanwezig. Figuur 5 toont een SDS-PAGE na ice-affiniteitszuivering van eiwitten verzameld uit Engels raaigras en vervolgens gekleurd met een zilverkleuring. Een aantal eiwitten werden geïdentificeerd met zeven afzonderlijke banden overeenkomend met de meest overvloedige eiwitten die adsorberen aan ijs.
Figuur 1: Schematische weergave van de inrichting 16 splat. Equipment ons ed voor het genereren van een monolaag van ijskristallen (A) en voor de visualisatie van ijs kristalgroei (B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Inrichting voor consumptie-affiniteitszuivering van IBP 16. Een messing "ice finger" gekoppeld aan een programmeerbaar ethyleenglycol bad wordt gebruikt groeien langzaam een ijs-halfrond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
g3.jpg"/>
Figuur 3: Representatieve gegevens verkregen via IRI analyse 17. Een monolaag van ijskristallen gevormd onder gebruikmaking plantenextracten wordt afgebeeld op 40x vergroting. Extracten van wildtype Arabidopsis thaliana die bevatten geen IBP (-IBPs) vergeleken met extracten van transgene A. thaliana tot expressie IBP uit Lolium perenne (+ IBP). Na een 18 uur incubatieperiode bij -4 ° C was ijskristallen in de buffer en wild-type A. thaliana monsters herkristalliseerd. In tegenstelling daarmee werd de groei van ijskristallen beperkt het A. thaliana extracten expressie een IBP. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Ice-halfrond geteeld met behulp van IBP extracten verzameld uit de freeze-tolerante gras, L. perenne. Nadat gras extracten werden onderworpen aan een ronde van consumptie-affiniteitszuivering, ice-etsen van het oppervlak van de halve bol ijs geeft de succesvolle opname van IBP (A). Aanvullende opgeloste stoffen, pigmenten en verontreinigende proteïnen te verwijderen, een tweede ronde van consumptie-affiniteit werd gebruikt, waardoor een duidelijker ijs hemisfeer (B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Toezicht op de zuivering van inheemse IBP van Engels raaigras. Na twee ronden van affiniteitszuivering ijs en centrifugale concentratie,inheemse gras extracten werden onderworpen aan elektroforese op een denaturerende polyacrylamidegel (SDS-PAGE) en vervolgens gevisualiseerd met behulp van kleuring met zilver. Laan 1: moleculair gewicht proteïneladder; Laan 2: onverdund extract; Laan 3-5: monsters verdund in water vóór gel geladen met een 1: 2, 1: 5 en 01:10 (voorbeeld: water) -verhouding. Aangezien dit specifieke plantensoort een aantal IBP bevat meerdere banden waargenomen die zou kunnen corresponderen met verschillende IBP isovormen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor de succesvolle analyse en zuivering van IBP's, is het belangrijk om de temperatuur-gevoelige aard van sommige van deze eiwitten te begrijpen. Bepaalde plantaardige IBP instabiel bij temperaturen boven 0 ° C, wat resulteert in ontvouwen, neerslag en inactiviteit. Om actieve IBP te verkrijgen, is het vaak belangrijk dat planten worden verwerkt in een koude ruimte (~ 4 ° C) en monsters worden op ijs gehouden tijdens de experimenten. Een andere factor die meespeelt bij gebruik van hele cellen ruwe lysaten is de afbraak van eiwitten door endogene proteasen. In planten de expressie van IBP het algemeen laag, en dus verlies aan eiwit opbrengst kan leiden tot onvoldoende materiaal voor toekomstige experimenten en analyses. snel werken tijdens eiwitextractie, onder toevoeging van een betrouwbare proteaseremmer kan dergelijk eiwit te verminderen. Daarnaast is het belangrijk dat de koude-acclimatisatie periode worden geoptimaliseerd voor de grootste accumulatie van IBP's in laboratorium-grownplanten.
Een ander veel voorkomend probleem bij het werken met IBP is dat veel van de tests zijn gevoelig voor temperatuur en vochtigheid. Met betrekking tot IRI analyse kan vocht afzettingen op de microscoop dekglaasje tot een ijslaag die visualisatie van ijskristallen bemoeilijkt. Met behulp van een ontvochtiger en extra uitdroging kralen kan dit probleem op te lossen; echter aanbevolen dat deze test niet worden uitgevoerd als laboratorium relatieve vochtigheid boven 70%.
De splat assay, zoals gepresenteerd is kwalitatief. Door het uitvoeren van een verdunningsreeks voorafgaand aan analyse, kunnen de IRI eindpunt worden ingesteld om het concentratiegebied waarin de IBP niet meer ijskristal groei beperken bepalen. Verschillende laboratoria hebben ook gebruikt computer software om de gemiddelde grootte van ijskristal korrels 18 te meten. Zoals eerder aangegeven, het testen van IRI activiteit een efficiënte beginscherm bevestiging van consumptie-bindendeactiviteit worden vastgesteld door het bepalen van het niveau van TH of door direct visualiseren van de adsorptie van IBP aan ijskristallen 16. Een opmerkelijke beperking van IRI analyse is dat een aantal niet-IBP moleculen geïdentificeerd die nabootsen IRI activiteit. Deze moleculen kunnen omvatten volumineuze eiwitten, fenol glycosiden, en synthetische polymeren zoals polyvinylalcohol 19, 20, 21. Hierdoor zou een bufferbesturing steeds uitgevoerd met monsters zodat alle verontreinigingen of additieven niet leiden tot de waargenomen IRI activiteit.
Terwijl ice-affiniteit zuivering eenvoudig wordt uitgevoerd, wanneer deze niet correct gedaan, andere eiwitten, opgeloste stoffen en metabolieten kunnen overheersen. Een belangrijke overweging is de snelheid van groei van ijskristallen; door verlaging van de afkoelsnelheid (dwz -0,02 ° C / h), het ijs halfrond groeit langzamer en alle niet-ice bindende molecules minder snel opgenomen in het ijs kristalrooster worden. De aanwezigheid van contaminerende moleculen kunnen ook worden vermeden door te waarborgen dat slechts 50% van het lysaat wordt opgenomen in de halve bol (dwz 50:50, vloeibare ijs verhouding). Zoals eerder vermeld, kunnen meerdere ronden van ijs affiniteit ook duidelijk het ijs-fractie en resulteren in een monster van hogere zuiverheid. Met name worden secundaire metabolieten vaak overproductie onder biotische en abiotische stress omstandigheden in planten. Tijdens de zuivering van fenolrijke plantenweefsels of donkerbruin pigment blijven, 1,5% (v / v) polyvinylpyrrolidon (PVP) en 1,5% polyvinylpolypyrrolidon (w / v) (PVPP) kan worden toegevoegd aan de extractiebuffer, te neutraliseren secundaire metabolieten. Antioxidantadditieven zoals thioureum (5-10 mM) kunnen ook worden gebruikt 19, 21.
Indien informaties IBP plaats bekend is, verdere zuiveringsstappen, zoals hoge-druk liquid chromatografie (HPLC) kan ook worden gebruikt. Modificaties ijs-affiniteitszuivering kan ook worden beschouwd en is gerapporteerd eiwitopbrengst optimaliseren en meer inzicht te verwerven in IBP kenmerken, waaronder het sneller ijs shell zuivering 23 en fluorescentie-gebaseerde ice vlak affiniteit (FIPA) 24.
Wanneer geoptimaliseerd kunnen de hierboven beschreven technieken een gezuiverd eiwit pool voor de identificatie van IBP te leveren; kan echter niet-specifieke incorporatie van andere zeer overvloedig aanwezige eiwitten onvermijdelijk zijn. Terwijl IBP van Pooideae-familie sequentiehomologie 25, vanwege de grote verschillen tussen IBP van verschillende organismen, is het meestal niet mogelijk om een IBP alleen herkennen aan sequentiehomologie. Een gemeenschappelijk kenmerk van IBP is de aanwezigheid van aminozuren bekend bindt aan ijs, waaronder threonine, serine en valine 26; identificeren van peptiden sequenties rijk these resten kunnen nuttig zijn bij mijnbouw sequentiegegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een NSERC (Canada) subsidie aan VKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L.
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L.
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
