Summary
Dette papir beskriver identifikation af is-bindende proteiner fra freeze-tolerante planter gennem vurderingen af is-omkrystallisation inhiberingsaktivitet og efterfølgende isolering af native IBPS anvender is-affinitetsoprensning.
Abstract
Is-bindende proteiner (IBPS) tilhører en familie af stressinducerede proteiner, der syntetiseres af visse organismer, der udsættes for frost. I planter, frostskader opstår, når ekstracellulære iskrystaller vokser, hvilket resulterer i brud af plasmamembraner og eventuel celledød. Adsorption af IBPS til iskrystaller begrænser yderligere vækst ved en proces kendt som is-omkrystallisation inhibering (IRI), og derved reducere cellulær skade. IBPS demonstrerer også evne til at sænke frysepunktet af en opløsning under ligevægtstemperaturen smeltepunktet, en egenskab kendt som termisk hysterese (TH) aktivitet. Disse beskyttende egenskaber har rejst interesse i identifikationen af hidtil ukendte IBPS grund af deres potentielle anvendelse i industrielle, medicinske og landbrugsmæssige anvendelser. Dette papir beskriver identifikation af plante IBPS gennem 1) induktionen og udvinding af IBPS i plantevæv, 2) screening af ekstrakter til IRI aktivitet, og 3) isolering og purifIcation af IBPs. Efter induktion af IBP'er ved lav temperatur eksponering testes ekstrakter for IRI aktivitet ved anvendelse af en 'splat-analyse', som muliggør observation af iskrystalvækst ved anvendelse af et standardlysmikroskop. Dette assay kræver en lavproteinkoncentration og frembringer resultater, som hurtigt opnås og fortolkes let, hvilket tilvejebringer en indledende skærm for isbindende aktivitet. IBP'er kan derefter isoleres fra forurenende proteiner ved at udnytte IBP'ernes egenskaber til at adsorbere til is ved hjælp af en teknik kaldet 'isaffinitetsrensning'. Ved anvendelse af cellelysater opsamlet fra planteekstrakter kan en ishalvkugle langsomt dyrkes på en messingprobe. Dette inkorporerer IBP'er i den krystallinske struktur af den polykrystallinske is. Kræver ingen biokemisk eller strukturel viden om IBP'en, giver denne metode mulighed for genopretning af aktivt protein. Isrensede proteinfraktioner kan anvendes til downstream-applikationer, herunder identifikation af peptidevand sekvenser ved massespektrometri og den biokemiske analyse af native proteiner.
Introduction
Is-bindende proteiner (IBPS) er en forskelligartet familie af beskyttende proteiner der er blevet opdaget i en række organismer, herunder planter 1, insekter 2, fisk 3, og mikrober 4. Det centrale element i disse proteiner er deres enestående evne til specifikt og effektivt adsorbere til iskrystaller, ændre deres vækst. IBPS har flere dokumenterede egenskaber, med de to mest velkarakteriserede være termisk hysterese (TH) og is-omkrystallisation inhibering (IRI). TH aktivitet lettere observeret i IBPS produceret i freeze-intolerant dyr. Denne aktivitet resulterer i sænkning af frysepunktet for organismernes kredsløbs- eller interstitielle væsker for at forhindre frysning. I modsætning hertil i fryse-tolerante organismer, som uundgåeligt vil fryse ved temperaturer under frysepunktet, IBPS synes at have lav TH aktivitet. Trods den lave TH aktivitet, til en høj IRI aktivitet begrænse iskrysstal vækst er ofte observeret med disse proteiner. For fryse-tolerante organisme, denne IRI aktivitet formentlig hjælper med at beskytte celler fra den ukontrollerede vækst af is i ekstracellulære rum.
Den "madras knappen" model kan anvendes til at beskrive den mekanisme hvorved IBPS forhindre vækst af iskrystaller 5. Under denne model, IBPS specifikt adsorbere til iskrystallen overflade med mellemrum, således at vandmolekyler kun kan optage med den voksende is krystalgitteret i mellemrummet mellem bundet IBPS. Dette skaber en krumning, der gør inkorporering af yderligere vandmolekyler ugunstige, en begivenhed, der kan beskrives ved den Gibbs-Thomson-effekten 6. Det forankrede clathrathydrater farvande hypotese tilvejebringer en mekanisme til den specifikke binding af IBPS til iskrystallen overflade hvorved tilstedeværelsen af ladede rester specifikt placeret på proteinet is bindingsstedet, resulterer i reorganization af vandmolekyler, så de matcher et eller flere planer af isen krystalgitteret 7.
TH-aktivitet kan kvantificeres ved at måle forskellen mellem smelte- og frostgrader af en enkelt iskrystal i nærvær af en IBP. Mens TH aktivitet er en bredt accepteret fremgangsmåde til evaluering af aktiviteten af IBPS, den lave TH kampen produceret af planten IBPS (typisk kun en brøkdel af en grad) kræver normalt en høj proteinkoncentration, specialudstyr og operatør erfaring. Selvom ikke-IBPS kan begrænse iskrystalvækst, er det en egenskab deles af alle IBPS og dermed testning for IRI aktivitet er en effektiv indledende screening for tilstedeværelsen af IBPS, især for dem med lav TH-aktivitet. Den anvendte metode til at teste denne virkning er kendt som en 'splat assay', hvorved et protein prøve lynfrosset til frembringelse af et monolag af små iskrystaller, som er observeret over en tidsperiode for at bestemme, omiskrystalvækst er begrænset. I modsætning til andre metoder, der anvendes til at screene en kilde vævsprøve for tilstedeværelsen af IBPS, denne teknik kan anvendes på lave koncentrationer protein i området 10-100 ng, anvender let-fabrikeret udstyr, og genererer data, der er hurtigt og nemt tolkes. Det er imidlertid vigtigt at understrege, at dette assay tilvejebringer en indledende screening for IBPS der bør følges ved bestemmelse af TH og iskrystal formning.
Isolering af native proteiner er udfordrende, hvilket ofte kræver information vedrørende de strukturelle og biokemiske egenskaber af et protein af interesse. Affiniteten af IBPS til ice muliggør isoleringen af disse proteiner ved anvendelse is som et substrat til oprensningsformål. Da hovedparten af molekyler skubbes fremad for grænsen mellem isvand under iskrystalvækst, langsom vækst af et is-halvkugle i nærvær af en IBP prøven resulterer i en højt oprenset prøve, blottet for stor quantiterne af kontaminerende proteiner og opløste stoffer. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at identificere IBPS fra insekter 8, 9, 10, bakterier 11, fisk 12 og planter 13, 14. Desuden kan IBP-berigede fraktioner opnået gennem denne metode også anvendes til nedstrøms biokemisk analyse. Dette papir beskriver identifikationen af IBPS i planter gennem induktion og udvinding af IBPS, at analyse af IRI aktivitet bekræfte tilstedeværelsen af proteiner, og isoleringen af proteiner under anvendelse af is affinitetsoprensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Splat Apparat Setup
- Fyld en temperatur programmerbar cirkulerende vandbad med ethylenglycol (50% volumen / volumen i vand).
BEMÆRK: Grøn automotive ethylenglycol kan anvendes. - For at samle det eksterne kammer, anvender isolerede plastrør til at fastgøre vandbad til en dobbeltvægget glasskål. Isolere glasskål med polystyrenskum og tildækkes med en plastpetriskål låg. Skær en 3-4 tommer hul i bunden af polystyren kammeret, således at lyskilden kan ses gennem glasset kammer.
- Monter den eksterne kammer på en dissektion mikroskop, er udstyret med et kamera-port og en 4X polariseret objektiv med 10x okular linse. Placere en ekstra stykke polariseret folie i bunden af det eksterne kammer.
- Klemme en 1-1,5 m rør (~ 5 cm i diameter) på en destilleringsstand og sted inde i en stor polystyrenbeholder, sammen med en køleblok placeret under røret ved bunden af destilleringsstand.
2. Udarbejdelse af Native Protein ekstrakter til IRI Analyse
- For at inducere ekspressionen af IBPS i fryse-tolerante græs eller andre freeze-tolerante plantearter, kolde akklimatisere planter i op til 1 uge ved 4 ° C, ved lav belysning (6 timers lys / 18 timer mørke). Dette gælder ikke for prøver indsamlet fra marken, der allerede er udsat for betingelser lav temperatur og akklimatisering perioder.
- Opnå ca. 0,1 g bladvæv ved at skære i bunden af stammen og derefter placere i et 1,5 ml rør. Straks flash fryse prøven i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse.
- At lysere celler, male vævsprøve til et fint pulver under anvendelse af morter og støder under flydende nitrogen. Sikre, at det flydende nitrogen ikke fordamper under homogeniseringen processen.
- Anbring straks formalede prøver på is og tillade det flydende nitrogen for fuldstændigt at fordampe. Tilsæt 1 ml af et nativt protein extractipå puffer indeholdende 10 mM Tris-HCI, 25 mM NaCl (pH 7,5), med to EDTA-fri proteaseinhibitor-tabletter tilsat umiddelbart før brug. Pipette til at blande; gør ikke vortex.
BEMÆRK: Yderligere additiver kan være nødvendigt at anvendes, hvis lysatet indeholder sekundære metabolitter (se diskussion). - Ryst forsigtigt prøver natten over (18-24 h) ved 4 ° C. Gennemføre de resterende trin ved 4 ° C.
- Fjerne cellerester ved centrifugering prøver på ~ 16.000 xg i 5 minutter. Bibeholde den opløselige fraktion og centrifuger i yderligere 5 min hvis cellerester fortsætter. Klarede prøver kan opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
3. Splat Assay Pre-eksperiment Opsæt
- Hæld 100 ml hexan i eksterne kammer oprettet med den polariserede film og tilføje 5-6 udtørring perler for at forhindre ophobning af fugt på objektglassene. Tilføje en lille mængde af vakuum fedt til pladen dækker bad og vride at sikre en tæt forsegling og forhindre afdampning af hexan. Afkøl hexan bad mellem -4 ° C og -6 ° C ved anvendelse af den programmerbare vandbad ca. 2-3 timer før start af forsøget. Sørg for at tjekke temperaturen i hexan med et termometer, inden der påbegyndes eksperimentet.
- Anbring køleblok i en polystyren kasse direkte under plastslangen og dække helt med tøris, 40 min før start af forsøget.
- Inden analysen startes, sikre, at røret er plan. At bestemme, hvor på køleblok prøven vil falde, første test proceduren med vand og angive, hvor prøven falder med en markør (som beskrevet nedenfor).
- Fjerne tøris fra toppen af den kolde blok og placere et mikroskop-dækglas på drop mærke, der er blevet bestemt med vand.
- Umiddelbart før start assay tænde lyskilden og skrabe eventuel is der er dannet på bunden af glasset kammeret. Undgå at holde lyskilden på mindre iskrystallerbliver visualiseret at forhindre opvarmning af hexan.
4. Udførelse af Splat-analysen
- Dyp engangsspids fastgjort til en automatisk pipette (1-20 pi) i immersionsolie, under anvendelse af en papirserviet fjerne overskydende olie. Dette skridt vil gøre det muligt for prøven at falde i stedet holde sig til ydersiden af pipetten.
BEMÆRK: Fjernelse af overskydende olie fra pipetten er afgørende for at sikre, at oliedråber ikke dannes på iskrystaller, hvilket gør visualisering vanskelig. - Pipetter 10 pi prøve og sted pipette direkte over plastrør før frigivelsen prøven. En distinkt 'splat' lyd skal høres, når prøven rammer glasset dækselskiven, hvilket skaber et monolag af iskrystaller.
- Hurtigt og omhyggeligt fjerne mikroskopobjektglasset fra den kolde blok med en pincet og plads i hexan bad på toppen af polariseret folie.
- Ser under mikroskop, satte lup glide ind i synsfeltet og adbare objektivlinsen således at krydspolarisation muliggør visualisering af høj kontrast iskrystaller. Justere forstørrelsen til 40x.
- Fastgør kameraet til mikroskopet og justere indstillingerne til "makro" for at tillade klar visualisering af iskrystaller og tage billedet.
BEMÆRK: Venter op til 1 time for at tillade iskrystaller at vokse kan give et klarere billede. - Gentag trin 4.1-4.5 for alle prøver. Typisk placere op til 6 glider med en anden prøve i hexan kammeret.
- Slukke lyskilden og placere en plastplade over hexanbadet, sikrer en tæt forsegling. Tillad iskrystaller at anneale natten over (12-24 timer, idet en konsekvent annealingperiode inden for et bestemt assay). Efter inkubation tage billeder af isen film, som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: Nogle prøver kan rekrystallisere hurtigere end andre. Hvis ingen omkrystallisation er tydelig efter 12 timer tillader krystaller at anneale i op til 24 timer for at sikre, at ingen recrystallining vil forekomme.
Analyse 5. Splat-analyse af data
- Upload billeder til en computer og direkte sammenligne størrelsen af iskrystaller før og efter udglødning. Prøver med is omkrystallisation aktivitet vil ikke vokse, mens prøver uden nogen IRI aktivitet vil rekrystallisere dannelse mærkbart større iskrystaller. Lys indblanding vil gøre store iskrystaller vises i lidt forskellige nuancer og dermed er let at se.
6. Ice-affinitet Oprensning Forsøgsopstilling
- Fyld en temperatur programmerbar cirkulerende vandbad med ethylenglycol. Grøn automotive ethylenglycol kan anvendes.
- Forbinde badet til en hul, messing probe under anvendelse af isoleret plastrør 15.
- Konstruere en polystyren beholder, hvori et 150 ml bæger kan passe godt ind. Skabe et låg til beholderen med et hul i midten til messing kolde finger.
7.Fremstilling af prøver for Is-affinitet Oprensning
- Kold akklimatisere plantevæv som beskrevet i afsnit 2.1.
- Indsamle ~ 100-150 g jorden biomasse (trin 2.3) i 20 ml rør og straks flash fryse. Prøver kan opbevares ved -80 ° C før anvendelse.
- Forberede prøve som beskrevet i afsnit 2,3-2,5. Brug en 1: 1-forhold (mg væv: ml nativt proteinekstraktionsbuffer) til resuspension af bladvæv. Bruge ekstra proteasehæmmere tabletter for at undgå nedbrydning af IBPS af endogene proteaser.
BEMÆRK: Hvis vævsprøven er for koncentreret, justere forholdet 1: 2 eller 1: 3 (mg væv: ml nativt proteinekstraktionsbuffer). - For at fjerne cellerester, si lysat gennem 2 lag osteklæde, 3 gange. Pelletering af rester ved centrifugering ved 30.000 xg i 40 minutter ved 4 ° C.
- Øge mængden af prøven til 120 ml under anvendelse af nativt proteinekstraktionsbuffer. Brug lysatet straks for is-affinitetsoprensning tilundgå ethvert tab af is-bindingsaktivitet.
8. Udførelse Ice-Affinitetsoprensning
- Før oprensning, indstille den programmerbare vandbad til afkøling fra -0.5 ° C til -3 ° C ved en hastighed på -0,04 ° C / time.
BEMÆRK: Afkølingshastigheden kan justeres afhængigt af det oprindelige volumen af prøven. - Afkøl is finger til -0.5 ° C og efterfølgende submerse det i et 50 ml rør indeholdende koldt destilleret vand. Tilføje et par isstykker at lette isnukleering og tillade et tyndt lag is til dannelse på fingeren. Denne proces tager typisk mellem 20 og 30 min.
BEMÆRK: Eventuelle klumper på isen-coatede finger skal glattes med en behandsket hånd før placering i prøven. Hvis et islag ikke dannes med -0,5 ° C, sænke temperaturen til -0,75 ° C. - Sted prøve i en 150 ml bægerglas indeholdende en lille magnetisk omrører i en polystyrenbeholder oven på magnetomrører. Sørg for, at isen finger ercentreret og sænkes mindst halvvejs i den flydende prøve. Forsegle beholderen.
- Lad programmet køre i ca. to dage kontrol af de enkelte 24 timer. Når 50% af prøven er frosset, stoppe programmet. Inkorporering af IBPS i isen halvkugle vil resultere i "ice-ætsning".
BEMÆRK: Oprensning eksperimenter kan gøres ved hjælp større prøvevolumener med det tidsrum, hvor programmet kører justeres i overensstemmelse hermed. - For at fjerne isen halvkugle, opvarme proben til 4 ° C, skylles halvkugle med destilleret vand for at fjerne ubundet protein, og derefter tø op ved 4 ° C.
BEMÆRK: De fleste IBPS ikke er stabile i vand og en passende buffer (dvs. 50 mM Tris-HCI, pH 8 eller 50 mM ammoniumbicarbonat, pH 8) skal tilsættes periodisk under optøningsprocessen (ca. 1 ml / 2 h) . Is halvkugle kan være indpakket i aluminiumsfolie og opbevaret ved -20 ° C forud for optøning. - Hvis isen-halvkugle stadig indeholdes pigment, eller at forøge prøveoprensning Gentag trin 8.1-8.5 2-3 gange.
BEMÆRK: Selvom koncentrationen af IBP kan være lavere efter multiple runder af oprensning, renheden er mere værdifuld end udbytte hvis de oprensede prøver vil blive analyseret ved anvendelse af MS. Hvis der er tilstrækkelig materiale til rådighed, anbefales tre runder is-affinitetsoprensning.
9. Identifikation af IBPS
- Eftersom IBPS er indeholdt i et stort volumen efter optøning af is-halvkugle, koncentrere prøverne. Koncentrer prøver indeholdende ~ 100 g væv til ~ 1-3 mL under anvendelse centrifugal koncentration rør med en 3.000 Da molekylvægt cut-off for at undgå tab af små proteiner.
- Før afsendelse prøver til MS, bestemme proteinkoncentrationen anvendelse af et protein kvantificering assay, såsom et BCA eller Bradford-assay. Estimere renheden af prøverne ved gelelektroforese, såsom SDS-PAGE. Test de oprensede proteiner til IRI aktivitet før seNding for MS for at sikre, at aktivt protein er blevet bibeholdt gennem rensnings- og koncentrationsstrinnene.
- Brug koncentrerede prøver direkte til massespektrometrianalyse 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at lette opsætning, figur 1 og Figur 2 er inkluderet som visuelle repræsentationer af udstyr til IRI analyse og is-affinitetsoprensning hhv. Resultaterne af IRI analyse under anvendelse af ekstrakter opsamlet fra sennep ukrudt med og uden IBPS er afbildet i figur 3. Disse resultater viser, at ekstrakter indsamlet fra sennep ukrudt, som ikke er fryse-tolerant, var ude af stand til at begrænse iskrystalvækst grund af manglen på IBPS stede. Derimod de små iskrystaller set med transgene planter indeholdende IBPS fra flerårig rajgræs begrænser iskrystalvækst væsentligt. Figur 4 viser ice halvkugler dyrket under anvendelse af almindelig rajgræs ekstrakter udtrykker IBPS efter to runder af oprensning. Efter den første runde af oprensning den høje grad af is-ætsning på hemisphere overfladen, at IBPS har adsorberet til isen og modificeret vækst af iskrystaller (figur 4A). Den anden runde af oprensning vist i figur 4B har klarere is, hvilket indikerer, at der var en vis udelukkelse af kontaminerende molekyler. Ice-ætsning på halvkugle overflade viser at IBPS er stadig til stede. Figur 5 viser en SDS-PAGE efter is-affinitetsoprensning af proteiner opsamlet fra flerårig rajgræs, og efterfølgende farvet med en sølvfarve. Et antal proteiner blev identificeret med syv distinkte bånd, der svarer til de mest rigelige proteiner, der adsorberer til is.
Figur 1: Skematisk fremstilling af Splat apparatet 16. Udstyr os ed til generering af et monolag af iskrystaller (A) og til visualisering af iskrystalvækst (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Apparater, der anvendes til is-affinitetsoprensning af IBPS 16. En messing "ice finger" knyttet til en programmerbar ethylenglycolbad anvendes til langsomt vokse et is-halvkugle. Klik her for at se en større version af dette tal.
g3.jpg"/>
Figur 3: Repræsentative data opnået under anvendelse af IRI analyse 17. En monolag af iskrystaller dannet ved anvendelse af planteekstrakter visualiseres ved 40x forstørrelse. Ekstrakter fra vild type Arabidopsis thaliana, som ikke indeholder IBPS (-IBPs) blev sammenlignet med ekstrakter af transgene A. thaliana udtrykker IBPS fra almindelig rajgræs (+ IBPS). Efter en 18 timer inkubationsperiode ved -4 ° C, havde iskrystaller omkrystalliseret i buffer og vildtype A. thaliana prøver. I modsætning hertil blev iskrystalvækst begrænset i A. thaliana ekstrakterne udtrykker et IBP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ice-halvkugler dyrket under anvendelse IBP ekstrakter opsamlet fra freeze-tolerant græs, L. perenne. Efter græs ekstrakter blev underkastet en runde af is-affinitetsoprensning, is-ætsning af overfladen af isen halvkugle indikerer en vellykket inkorporering af IBPS (A). At fjerne yderligere opløste stoffer, pigmenter og kontaminerende proteiner, blev en anden runde af is-affinitet anvendt, hvilket resulterede i en klarere is-halvkugle (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kontrol med oprensning af native IBPS fra flerårig rajgræs. Efter to runder af is-affinitetsoprensning og centrifugal koncentration,native græs ekstrakter blev underkastet elektroforese på en denaturerende polyacrylamidgel (SDS-PAGE) og derefter visualiseret ved anvendelse af sølvfarvning. Bane 1: molekylvægt protein stigen; Bane 2: ufortyndet ekstrakt; Bane 3-5: prøver fortyndet i vand før gel loading med en 1: 2, 1: 5 og 1:10 (prøve: vand) -forhold. Da denne særlige plantearter indeholder en række IBPS, multiple bånd observeres som kan svare til forskellige IBP isoformer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For vellykket analyse og oprensning af IBPS, er det vigtigt at forstå den temperaturfølsomme karakter af nogle af disse proteiner. Bestemt plante IBPS bliver ustabile ved temperaturer over 0 ° C, hvilket resulterer i udfoldning, udfældning og inaktivitet. For at opnå aktive IBPS, er det ofte kritisk, at planterne behandles i et koldt rum (~ 4 ° C) og Prøverne opbevares på is under eksperimentering. En anden faktor at overveje ved brug helcelle rålysater er nedbrydningen af proteiner ved endogene proteaser. I planter, ekspressionen af IBPS er generelt lav, og dermed tab af proteinudbytte kunne resultere i utilstrækkeligt materiale til fremtidig forsøg eller analyse. Arbejder hurtigt under proteinekstraktion, med tilføjelse af en pålidelig proteaseinhibitor-cocktail kan reducere en sådan proteintab. Derudover er det vigtigt, at den kolde-akklimatiseringsperiode være optimeret til den største akkumulering af IBPS i laboratorium-grownplanter.
Et andet almindeligt problem, når man arbejder med IBPS er, at mange af de assays er følsomme over for temperatur og fugtighed. I forhold til IRI analyse kan fugt opbygning på mikroskopet dækselskiven resultere i et lag is, der gør visualisering af iskrystaller vanskelig. Ved hjælp af en affugter og ekstra udtørring perler kan løse dette problem; dog anbefales det, at dette assay ikke udføres, når laboratorie luftfugtighed er over 70%.
Den splat assay som fremlagt, er kvalitativt. Ved at udføre en fortyndingsserie før analyse, kan IRI endpoint etableres for at bestemme koncentrationen område, i hvilket IBPS ikke længere kan begrænse iskrystalvækst. Forskellige laboratorier har også brugt computersoftware til at måle den gennemsnitlige størrelse af iskrystal korn 18. Som tidligere anført mens teste for IRI aktivitet er en effektiv indledende screening, bekræftelse af is-bindendeaktivitet bør etableres ved at bestemme niveauet af TH eller ved direkte at visualisere adsorptionen af IBPS til iskrystaller 16. Et bemærkelsesværdigt begrænsning af IRI analyse er, at adskillige ikke-IBP molekyler er blevet identificeret, som efterligner IRI aktivitet. Disse molekyler kan indbefatte voluminøse proteiner, phenolforbindelser glycosider, og syntetiske polymerer såsom polyvinylalkohol 19, 20, 21. Som følge heraf bør en puffer kontrol altid køres med prøver for at sikre, at eventuelle forureninger eller tilsætningsstoffer ikke resulterer i den observerede IRI aktivitet.
Mens is-affinitetsoprensning let udføres, når det ikke gøres korrekt, kan andre proteiner, opløste stoffer og metabolitter fremherskende. En vigtig overvejelse er hastigheden for iskrystalvækst; ved at sænke afkølingshastigheden (dvs. til -0,02 ° C / time), ice halvkugle vokser langsommere, og enhver ikke-is-bindende molecules er mindre tilbøjelige til at blive inkorporeret i isen krystalgitteret. Tilstedeværelsen af kontaminerende molekyler kan også undgås ved at sikre, at kun 50% af lysatet indarbejdes i halvkugle (dvs. 50:50, væske til is-forhold). Som tidligere nævnt, kan multiple runder af is affinitet også præcisere is-fraktionen og resultere i en prøve af højere renhed. Især er sekundære metabolitter ofte overproduceret under biotiske og abiotiske stressbetingelser i planter. Under oprensningen af phenol-rige plantevæv, hvis mørkebrune pigmenter vedvarer, 1,5% (v / v) polyvinylpyrrolidon (PVP) og 1,5% polyvinylpolypyrrolidon (vægt / volumen) (PVPP) tilsættes til ekstraktionspufferen, at neutralisere sekundær metabolitter. Antioxidant additiver, såsom thiourinstof (5-10 mM) kan også anvendes 19, 21.
Hvis information om IBP af interesse er kendt, yderligere rensningstrin, såsom højtryks-likan også anvendes quid chromatografi (HPLC). Modifikationer is-affinitetsoprensning kan også betragtes og er blevet rapporteret at optimere proteinudbytte og opnå yderligere indsigt i IBP egenskaber herunder hurtigere isskal oprensning 23 og fluorescens-baserede is planet affinitet (FIPA) 24.
Når optimeret, kan de ovenfor beskrevne teknikker, hvilket gav et oprenset protein pulje til identifikation af IBPS; dog kan uspecifik inkorporering af andre stærkt rigelige proteiner være uundgåelig. Mens IBPS fra Pooideae familien deler sekvenshomologi 25, på grund af den høje diversitet mellem IBPS fra forskellige organismer, er det typisk ikke muligt at identificere en IBP ved sekvenshomologi alene. Fælles for IBPS er tilstedeværelsen af aminosyrer vides at binde til is, herunder threonin, serin og valin 26; identifikation af peptider sekvenser rig på thEse rester kan være nyttige ved minedrift af sekvensdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en NSERC (Canada) tilskud til VKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L.
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L.
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
