Summary
Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von Eis-bindenden Proteinen aus gefriertoleranten Pflanzen durch die Beurteilung von Eis-Umkristallisation hemmende Aktivität und die anschließende Isolierung von nativem IBPs ice-Affinitätsreinigung verwendet wird.
Abstract
Eis-bindende Proteine (IBPs) gehören zu einer Familie von Stress-induzierten Proteine, die durch bestimmte Organismen Temperaturen unter Null ausgesetzt synthetisiert werden. In Pflanzen treten Frostschäden, wenn extrazelluläre Eiskristalle wachsen, was zu dem Bruch von Plasmamembranen und möglichem Zelltod. Adsorption von IBPs Eiskristalle beschränkt weiteres Wachstum durch ein Verfahren, wie Eis-Rekristallisation Hemmung (IRI) bekannt ist, um dadurch eine Zellschädigung zu verringern. IBPs zeigt auch die Fähigkeit, den Gefrierpunkt eine Lösung unter dem Gleichgewichtsschmelzpunkt, eine Eigenschaft bekannt als thermische Hysterese (TH) -Aktivität zu drücken. Diese Schutzeigenschaften haben Interesse an der Identifizierung neuer IBPs erhöhten aufgrund ihrer möglichen Verwendung in industriellen, medizinischen und landwirtschaftlichen Anwendungen. Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von Pflanzen IBPs durch 1) die Induktion und Extraktion von IBPs in Pflanzengeweben, 2), um das Screening von Extrakten für IRI-Aktivität, und 3) die Isolierung und purification von IBPs. Im Anschluss an die Induktion der IBPs durch geringe Temperaturbelastung, sind Extrakte für IRI Aktivität getestet einen ‚Splat-Tests‘ verwendet, die die Beobachtung von Eiskristallwachstum erlaubt eine Standard-Lichtmikroskop. Dieser Test erfordert eine niedrige Proteinkonzentration und erzeugt Ergebnisse, die erhalten schnell und einfach interpretiert werden, Eis-Bindungsaktivität ein Einstiegsbild bereitzustellen. IBPs Proteine kann dann isoliert werden, verunreinigt durch die Eigenschaft IBPs Verwendung auf Eis, durch eine Technik, ‚ice-Affinitätsreinigung‘ zu adsorbieren genannt. Mit Zelllysaten aus Pflanzenextrakten gesammelt, kann ein Eis Hemisphäre langsam auf einer Messingsonde angebaut werden. Dies beinhaltet IBPs in die kristalline Struktur des polykristallinen Eis. Erfordern a priori keine biochemische oder strukturelle Kenntnis des IBP ermöglicht dieses Verfahren zur Gewinnung von aktivem Protein. Eis-gereinigter Proteinfraktionen können für Downstream-Anwendungen, einschließlich der Identifizierung von pep verwendet werden,tide Sequenzen durch Massenspektrometrie und die biochemische Analyse der nativen Proteine.
Introduction
Eis-bindenden Proteine (IBPs) sind eine mannigfaltige Familie von Schutzproteinen , die in einer Reihe von Organismen , einschließlich Pflanzen , 1, 2 Insekten, Fischen 3 und 4 Mikroben entdeckt wurden. Das Hauptmerkmal dieser Proteine ist ihre einzigartige Fähigkeit, gezielt und effizient zu Eiskristallen, zu modifizieren ihr Wachstum zu adsorbieren. IBPs haben mehrere dokumentierten Eigenschaften, mit den beiden am besten charakterisierten sind thermische Hysterese (TH) und Eis-Rekristallisation Hemmung (IRI). TH-Aktivität wird leichter in IBPs beobachtet in gefrier intolerant Tieren. Diese Aktivität führt zu einer Absenkung des Gefrierpunktes von Organismen Kreislauf- oder interstitiellen Flüssigkeiten Einfrieren zu verhindern. Im Gegensatz dazu in gefriertoleranten Organismen, die bei Temperaturen unter Null zwangsläufig einfriert, erscheint IBPs niedrig TH-Aktivität zu haben. Trotz der geringen TH-Aktivität, eine hohe Aktivität IRI Eis Schrei zu beschränkenStal Wachstum wird oft mit diesen Proteinen beobachtet. Für die Gefrieren tolerant Organismus, dies vermutlich IRI Aktivität hilft Zellen aus dem unkontrollierten Wachstum von Eis in extrazellulären Kompartimenten zu schützen.
Das „Matratze Schaltfläche“ Modell kann verwendet werden , um den Mechanismus zu beschreiben , durch die IBPs das Wachstum von Eiskristallen zu verhindern 5. Nach diesem Modell adsorbieren IBPs spezifisch an die Oberfläche von Eiskristallen in Intervallen, so dass Wassermoleküle nur mit den wachsenden Eiskristallen Gittern in dem Raum zwischen gebundener IBPs integrieren. Dadurch entsteht eine Krümmung auf, die der Einbau von zusätzlichen Wassermolekülen ungünstig, ein Ereignis macht, die von dem Gibbs-Thomson - Effekt 6 beschrieben werden kann. Die verankerte Clathrat Wasser Hypothese stellt einen Mechanismus für die spezifische Bindung von IBPs zur Eiskristall Oberfläche, wobei die Anwesenheit von geladenen Resten, insbesondere auf der Protein-Bindungsstelle Eis positioniert ist, ergibt die REOrganisation von Wassermolekülen , so passen sie einer oder mehreren Ebenen des Eises Kristallgitter 7.
TH-Aktivität kann durch Messen der Differenz zwischen dem Schmelz- und Gefriertemperaturen eines einzelnen Eiskristall in Gegenwart eines IBP quantifiziert werden. Während TH-Aktivität ein weithin akzeptiertes Verfahren zum Bewerten der Aktivität von IBPs, der niedrigen TH Spalte durch Pflanzen IBPs hergestellt (in der Regel nur einen Bruchteil eines Grades), die normalerweise erfordert eine hohe Proteinkonzentration, spezialisierte Ausrüstung und Erfahrung des Bedieners. Obwohl nicht-IBPs Eiskristallwachstum beschränken kann, ist es eine Eigenschaft von allen IBPs geteilt und damit für IRI Aktivitätstest wird ein effektiver Anfangsbildschirm für die Anwesenheit von IBPs, insbesondere für diejenigen mit geringer TH-Aktivität. Das verwendete Verfahren, diese Aktivität zu testen, wird als ‚Splat-Tests‘ bekannt, wobei eine Proteinprobe schockgefroren wird eine Monoschicht von kleinen Eiskristallen zu erzeugen, die sie über einen Zeitraum beobachtet werden, um zu bestimmen, obEiskristallwachstums eingeschränkt. Im Gegensatz zu anderen Methoden verwendet, um eine Quelle Gewebeprobe auf das Vorhandensein von IBPs zu screenen, diese Technik zu geringen Proteinkonzentrationen im Bereich von 10-100 ng anwendbar ist, nutzt leicht fabrizierten Ausrüstung, und erzeugt Daten, die schnell und einfach interpretiert wird. Jedoch ist es wichtig zu betonen, dass dieser Test eine Anfangsbildschirm für IBPs bereitstellt, die durch die Bestimmung von TH und Eiskristall Formgebung gefolgt werden soll.
Die Isolierung von nativen Proteinen ist eine Herausforderung und erfordert häufig Informationen über die strukturellen und biochemischen Eigenschaften eines Proteins von Interesse. Die Affinität von IBPs für Eis ermöglicht die Isolierung dieser Proteine Eis als Substrat für Reinigungszwecke verwendet wird. Da die Mehrzahl der Moleküle vor der Eis-Wasser-Grenze während des Wachstums von Eiskristallen, langsamem Wachstum einer Eis-Hemisphäre in Gegenwart einer IBP Probe ergibt eine hochgereinigte Probe geschoben, ohne großen quantities von Proteinen und gelöste Stoffe zu kontaminieren. Diese Methode wurde verwendet IBPs von Insekten 8 zu identifizieren, 9, 10, 11 Bakterien, Fisch und Pflanzen 12 13, 14. Zusätzlich können die IBP-angereicherten Fraktionen durch diese Methode erreicht auch für nachgelagerte biochemische Analyse verwendet werden. Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von IBPs in Pflanzen durch die Induktion und Extraktion von IBPs, die Analyse von IRI Aktivität die Anwesenheit von Proteinen und die Isolierung von Proteinen unter Verwendung von Eis Affinitätsreinigung zu bestätigen.
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Protocol
1. Splat Vorrichtungsaufbau
- Füllen ein temperaturprogrammierbaren zirkulierendes Wasserbad mit Ethylenglykol (50% v / v in Wasser).
HINWEIS: Grün Automobilethylenglykol verwendet werden. - Um die Außenkammer zubauen, verwenden isolierten Kunststoffschlauch in das Wasserbad zu einem doppelwandigen Glasschale zu befestigen. Isolieren der Glasschale mit Polystyrolschaum und die Abdeckung mit einer Kunststoff-Petrischale mit Deckel. Geschnitten, um ein 3-4 Zoll-Loch in der Unterseite der Polystyrol-Kammer, so daß die Lichtquelle durch die Glaskammer zu sehen ist.
- Montieren die Außenkammer auf einem Dissektionsmikroskop, ausgestattet mit einem Kameraanschluss und einer 4X polarisierter Objektivlinse mit einem 10-fach Okularlinse. Platzieren ein zusätzliches Stück, polarisierter Film in dem Boden der äußeren Kammer.
- Klemme einen 1-1,5 m Rohr (~ 5 cm Durchmesser) auf einen Ständer und Retorten Ort innerhalb eines großen Polystyrolbehälter, zusammen mit einem Kühlblock unterhalb des Rohrs an der Basis des Retorten Ständer positioniert ist.
2. Herstellung der Native Proteinextrakte für IRI Analyse
- Um die Expression von IBPs in gefriertoleranten Gräsern oder andere gefriertoleranten Pflanzenart, kalte acclimate Pflanzen für bis zu 1 Woche bei 4 ° C unter schwachem Licht (6 h Licht / 18 h Dunkelheit) zu induzieren. Dies gilt nicht für Proben aus dem Feld gesammelt, die bereits niedrigeren Temperaturen und Eingewöhnungszeiten ausgesetzt waren.
- Erhalten, etwa 0,1 g Blattgewebe von an der Basis des Stiels Schneidens und anschießend in einem 1,5-ml-Röhrchen. Unmittelbar blinken die Probe in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Verwendung einzufrieren.
- Lysieren Zellen, Gewebeprobe zu einem feinen Pulver zermahlen von Mörser und Pistill unter flüssigem Stickstoff. Sicherzustellen, dass der flüssige Stickstoff nicht während des Homogenisierungsverfahrens verdunstet.
- Unmittelbar Bodenproben auf Eis legen und der flüssige Stickstoff verdampft vollständig ermöglichen. 1 ml eines nativen Proteins extractiam Puffer 10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7,5), mit zwei EDTA-freien Proteasehemmer-Tabletten zugesetzt unmittelbar vor der Verwendung enthält. Pipette zu mischen; nicht vortexen.
HINWEIS: Zusätzliche Additive müssen verwendet werden, wenn das Lysat Sekundärmetaboliten (siehe Diskussion) enthält. - Schütteln über Nacht Proben (18-24 h) bei 4 ° C. Zuführen, um die verbleibenden Schritte wurden bei 4 ° C.
- Entfernen von Zelltrümmern von Proben bei ~ 16.000 × g für 5 min zentrifugiert. Behält die lösliche Fraktion und zentrifugiert für weitere 5 min bei Zelldebris weiterhin besteht. Geklärte Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
3. Splat-Assay Pre-Versuchsaufbau
- Gießen 100 ml Hexan in der Außenkammer mit dem polarisierten Film aufgebaut und fügen 5-6 Desikkation Kügelchen zu verhindern, dass Feuchtigkeit auf den Folien aufbauen. Eine kleine Menge von Vakuumfett auf die Platte in das Bad bedeckt und dreht um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten und die Verdampfung des Hexans zu verhindern. Kühle das Hexanbad zwischen -4 ° C und -6 ° C unter Verwendung des programmierbaren Wasserbad ca. 2-3 h vor Beginn des Versuchs. Achten Sie darauf, die Temperatur des Hexan mit einem Thermometer vor dem Beginn des Experiments zu überprüfen.
- Platzieren der Kühlblock in einer Polystyrolkasten direkt unter dem Kunststoffrohr und die Abdeckung vollständig mit Trockeneis, 40 min vor dem Experiment zu starten.
- Vor der Durchführung des Tests sicher, dass der Rohrebene ist. Um zu bestimmen, wo auf dem Kühlblock wird die Probe, erster Test das Verfahren mit Wassertropfen und zeigen an, wo die Probe mit einem Marker Tropfen (wie unten beschrieben).
- Entfernen Trockeneis von oben des kalten Blockes und einen Glasmikroskopdeckglas auf der Tropfenmarkierung, das mit Wasser bestimmt wurde.
- Unmittelbar vor Testbeginn Einschalten der Lichtquelle und schaben das Eis, die auf dem Boden der Glaskammer gebildet hat. Vermeiden Sie die Lichtquelle zu halten auf, es sei denn EiskristallenErwärmen des Hexan werden zu verhindern, sichtbar gemacht.
4. Durchführung der Splat-Assay
- Tauchen Sie die Wegwerfspitze befestigt an einer automatischen Pipette (1-20 ul) in Sionsöl, mit einem Papiertuch entfernen überschüssiges Öl. Dieser Schritt ermöglicht die Probe eher zu fallen als auf der Außenseite der Pipette zu haften.
HINWEIS: überschüssiges Öl aus der Pipette zu entfernen ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Öltröpfchen auf dem Eiskristallen nicht bilden, wodurch die Visualisierung schwierig. - Je 10 ul der Probe und die Stelle Pipette direkt auf Kunststoffschlauch, bevor die Probe freizugeben. Ein deutlicher ‚Splat‘ Ton zu hören sein, wenn die Probe des Glas Abdeckschlitten trifft, um eine Monoschicht von Eiskristallen zu schaffen.
- Schnell und sorgfältig den Objektträger aus dem kalten Block entfernen Pinzette und in dem Hexanbad oben auf dem polarisierenden Film verwendet wird.
- Suchen Sie unter dem Mikroskop, legen Sie die Objektträger in das Sichtfeld und Anzeigenur die Objektivlinse so, daß die Kreuzpolarisation ermöglicht die Visualisierung von hohem Kontrast Eiskristallen. Justieren Vergrößerung zu 40x.
- Befestigen Sie die Kamera an das Mikroskop und passen Sie die Einstellungen auf „Makro“ klare Visualisierung von Eiskristallen zu ermöglichen und um das Bild zu erfassen.
HINWEIS: Warten bis 1 h bis Eiskristalle zu ermöglichen, um ein klareres Bild zu wachsen geben. - Wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,5 für alle Proben. Typischerweise Platz mit einer anderen Probe in der Kammer Hexan bis 6 gleitet nach oben.
- Schalten der Lichtquelle und Platzieren einer Kunststoffplatte über dem Hexanbad ab, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Erlaubt Eiskristalle über Nacht tempern (12-24 h, eine konsistente Glühdauer in einem bestimmten Assay zu halten). Nach der Inkubation der Aufnahmen der Ei Filme wie oben beschrieben.
HINWEIS: Einige Proben können schneller als andere kristallisieren. Wenn keine Rekristallisation nach 12 h deutlich wird, lassen Kristalle dafür keine recrystalli, um sicherzustellen, bis zu 24 Stunden tempernsation auftreten.
5. Splat-Assay Datenanalyse
- Laden Sie die Fotos auf einen Computer und vergleichen Sie direkt die Größe der Eiskristalle vor und nach dem Glühen. Die Proben mit der Aktivität Eis Rekristallisation werden nicht wachsen, während Proben ohne werden ohne IRI Aktivität kristallisieren deutlich größere Eiskristalle bilden. Lichtinterferenz machen große Eiskristalle in leicht unterschiedlichen Farbtönen erscheinen und sind somit leicht zu sehen.
6. Ice-Affinitätsreinigung Geräte Installation
- Füllen eines temperaturprogrammierbaren zirkulierendes Wasserbad mit Ethylenglykol. Grünes Automobilethylenglykol verwendet werden.
- Eine Verbindung in das Bad an einem hohlen, Messing Sonde isolierte Kunststoffschlauch unter Verwendung von 15.
- Konstrukt einen Polystyrolbehälters, in dem ein 150 ml-Becherglas snuggly passen. Erstellen Sie einen Deckel für den Behälter mit einem Loch in der Mitte für den Messing kalten Finger.
7.Herstellung von Proben für Ice-Affinitätsreinigung
- Kaltes akklimatisieren Pflanzengewebe, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
- Sammle ~ 100-150 g des gemahlenen Biomasse (Schritt 2.3) in 20 ml-Röhrchen und sofort blinken einzufrieren. Die Proben können bei -80 ° C vor der Verwendung aufbewahrt werden.
- Bereiten Probe als 2,3-2,5 in Abschnitten beschrieben. Verwenden, um ein 1: 1-Verhältnis (mg Gewebe: ml nativem Protein-Extraktionspuffer) zur Resuspension von Blattgeweben. Verwenden zusätzliche Protease-Inhibitor den Abbau von Tabletten IBPs durch endogene Proteasen zu vermeiden.
HINWEIS: Wenn die Gewebeprobe zu konzentriert ist, stellt das Verhältnis auf 1: 2 oder 1: 3 (mg Gewebe: ml nativem Protein-Extraktionspuffer). - Zum Entfernen von Zelltrümmern, Sieb-Lysat durch 2 Schichten Mull, 3-mal. Pellet die Trümmer durch Zentrifugation bei 30.000 xg für 40 min bei 4 ° C.
- Erhöhen des Volumens der Probe auf 120 ml unter Verwendung von nativem Protein-Extraktionspuffer. Verwenden Sie das Lysat sofort für Eis-Affinitätsreinigung zueinen Verlust von Eis-Bindungsaktivität vermeiden.
8. Durchführung von Ice-Affinitätsreinigung
- Vor der Reinigung eingestellt den programmierbaren Wasserbad von -0,5 ° C abkühlen ° C mit einer Rate von -0,04 ° C / h bis -3.
HINWEIS: Die Kühlgeschwindigkeit in Abhängigkeit von dem anfänglichen Volumen der Probe eingestellt werden kann. - Kühlt das Eis Finger auf -0,5 ° C und anschließend submerse es in ein 50-ml-Röhrchen mit kaltem destilliertem Wasser. Fügen Sie ein paar Eisstückchen Eisnukleation und erlauben eine dünne Schicht aus Eis zu erleichtern auf dem Finger zu bilden. Dieser Prozess dauert in der Regel zwischen 20 und 30 min.
HINWEIS: Alle Klumpen auf dem vereisten Finger sollte mit einer behandschuhten Hand geglättet werden, bevor sie in Probe stellen. Wenn eine Eisschicht nicht bei -0,5 ° C bildet, um die Temperatur auf -0.75 ° C niedriger. - Wägegut in einem 150 ml Becherglas einen kleinen Magnetrührstab in einen Polystyrolbehälter auf der Oberseite des Magnetrührers enthält. Stellen Sie sicher, dass das Eis Fingerzentriert und zumindest zur Hälfte in der flüssigen Probe abgesenkt. Verschließen Sie den Behälter.
- Lassen Sie das Programm für etwa zwei Tage laufen, alle 24 Stunden überprüft. Sobald 50% der Probe gefroren ist, um das Programm zu stoppen. Der Einbau von IBPs in das Eis Hemisphäre wird in „Eis-Radierung“ zur Folge hat.
HINWEIS: Die Reinigung Experimente können unter Verwendung größerer Probenvolumina mit der Länge der Zeit, das Programm ausgeführt wird entsprechend angepasst, an dem durchgeführt werden. - Um das Eis Hemisphäre, erwärmen die Sonde auf 4 ° C, spülen Sie die Halbkugel mit destilliertem Wasser zu entfernen, um ungebundenes Protein zu entfernen, und dann auftauen bei 4 ° C.
HINWEIS: Die meisten IBPs nicht stabil sind in Wasser und einem geeigneten Puffer (zB 50 mM Tris-HCl, pH 8 oder 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8) müssen in regelmäßigen Abständen während des Auftauprozesses hinzugefügt werden (ca. 1 mL / 2 h) . Ice Hemisphären können in Aluminiumfolie und gelagert bei -20 ° C vor dem Auftauen gewickelt werden. - Wenn das Eis-Hemisphäre noch enthaltens Pigment oder die Probenreinigung zu erhöhen, wiederholen Sie die Schritte 8,1-8,5 2-3 mal.
Hinweis: Obwohl die Konzentration von IBP unteren mehr Runden der Reinigung folgende sein kann, Reinheit ist wertvoller als ergeben, wenn die gereinigten Proben werden unter Verwendung von MS analysiert werden. Wenn genügend Material zur Verfügung steht, drei Runden der Eis-Affinitätsreinigung empfohlen.
9. Identifizierung von IBPs
- Da IBPs in einem großen Volumen nach dem Auftauen des Eises Hemisphäre enthalten sind, konzentrieren sich die Proben. Konzentratproben enthalten, ~ 100 g Gewebe auf ~ 1-3 ml Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von Konzentrations mit einem 3000 Da Molekulargewicht cut-off um den Verlust von kleinen Proteinen zu vermeiden.
- Vor den Proben für die MS zu senden, bestimmen die Proteinkonzentration eine Proteinquantifizierung Assay, wie ein BCA oder Bradford-Test verwendet wird. Schätzen, um die Reinheit der Proben durch Gelelektrophorese, wie SDS-PAGE. Testen Sie die gereinigten Proteine für IRI Aktivität vor senden für MS, um sicherzustellen, dass die aktive Protein durch die Reinigungs- und Konzentrationsschritte beibehalten.
- Verwenden konzentrierte Proben direkt für die Massenspektrometrie - Analyse 10.
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Representative Results
Für eine einfache Set-up, Abbildung 1 und Abbildung 2 als visuelle Darstellungen der Ausrüstung für die Analyse IRI und Eis-Affinitätsreinigung bzw. verwendet eingeschlossen. Die Ergebnisse der IRI Analyse Auszüge aus Senf Unkraut mit und ohne IBPs gesammelt verwenden , sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Extrakte aus Senf Unkraut gesammelt, die nicht gefrier tolerant, nicht in der Lage waren Eiskristallwachstums aufgrund des Fehlens von IBPs anwesend zu beschränken. Im Gegensatz dazu sah die kleine Eiskristalle mit transgenen Pflanzen IBPs aus Weidelgras enthalten im Wesentlichen Eiskristallwachstums beschränken. Abbildung 4 zeigt Eis Hemisphären unter Verwendung Weidelgras Extrakte exprimierenden IBPs nach zwei Runden der Reinigung gezüchtet. der hohe Grad an Eis-Ätzung auf der hemisphe Nach der ersten Runde der Reinigungre Oberfläche zeigt an, dass IBPs , um das Eis und verändertes Wachstum der Eiskristalle (4A) adsorbiert haben. Die zweite Runde der Reinigung in 4B gezeigt ist , weist klareres Eis, was darauf hinwies , dass es einige Ausschlüsse von verunreinigenden Molekülen war. Ice-Ätzung auf der Hemisphäre Oberfläche zeigt an, dass IBPs ist noch vorhanden. Figur 5 zeigt eine SDS-PAGE folgenden ice-Affinitätsreinigung von Proteinen aus Deutschem Weidelgras gesammelt und anschließend mit einer Silberfärbung gefärbt. Eine Reihe von Proteinen wurden mit sieben unterschiedlichen Banden identifiziert, auf denen am häufigsten vorkommenden Proteinen entsprechen, die zu Eis adsorbieren.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Splat Vorrichtung 16. Ausrüstung uns ed für die Erzeugung einer Monoschicht von Eiskristallen (A) und für die Visualisierung von Eiskristallwachstum (B). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2: Vorrichtung zur Eis-Affinitätsreinigung von IBPs 16 verwendet. Ein Messing „ice finger“ an einem programmierbaren ethylenglycol Bad wird verwendet, um ein Eis-Hemisphäre langsam zu wachsen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3: Repräsentative Daten unter Verwendung von 17 IRI - Analyse erhalten. Eine Monoschicht von Eiskristallen unter Verwendung von Pflanzenextrakten gebildet wird, bei 40-facher Vergrößerung sichtbar gemacht. Extrakte von Wildtyp - Arabidopsis thaliana, die nicht IBPs (-IBPs) enthalten , wurden Extrakte von transgenen A. thaliana verglichen IBPs aus Lolium perenne (+ IBPs) exprimieren. Nach einer 18 h Inkubation bei 4 ° C, Eiskristalle in dem Puffer und Wildtyp A. thaliana Proben umkristallisiert hatte. Im Gegensatz dazu Wachstum von Eiskristallen wurde in den A. thaliana Extrakten Expression einen IBP beschränkt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Eis-Halbkugeln, die mit IBP-Extrakten gezüchtet wurden, die aus dem Gefriertoleranten Gras gesammelt wurden, L. perenne . Nachdem Gras-Extrakte einer Runde der Eis-Affinitäts-Reinigung unterworfen wurden, zeigt das Eis-Ätzen der Oberfläche der Eishalbkugel den erfolgreichen Einbau von IBPs ( A ) an. Um zusätzliche gelöste Stoffe, Pigmente und kontaminierende Proteine zu entfernen, wurde eine zweite Runde der Affinität verwendet, was zu einer klareren Eishalbkugel ( B ) führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Überwachung der Reinigung von nativen IBPs aus mehrjährigem Weidelgras. Nach zwei Runden der Eisaffinitätsreinigung und der Zentrifugalkonzentration,nativer Gras Extrakte wurden auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) elektrophoresiert und dann Silberfärbung sichtbar gemacht werden. Spur 1: Molekulargewicht Protein-Leiter; Spur 2: unverdünnter Extrakt; Spur 3-5: Proben, die in Wasser verdünnt vor der Gel-Beladung mit einem 1: 2, 1: 5, und 1:10 (Beispiel: Wasser-Verhältnis). Da diese besondere Pflanzenart mehr IBPs enthält, werden mehrere Banden beobachtet, die zu unterschiedlichen IBP Isoformen entsprechen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Für die erfolgreiche Analyse und Reinigung von IBPs, ist es wichtig, die temperaturempfindlichen Natur einige dieser Proteine zu verstehen. Bestimmte Pflanzen IBPs instabil bei Temperaturen über 0 ° C, was zu einer Entfaltung, Niederschlags- und Inaktivität. Um aktive IBPs zu erhalten, ist es oft wichtig, dass Pflanzen in einem kalten Raum verarbeitet werden (~ 4 ° C) und die Proben werden auf Eis gehalten, während der Experimente. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor bei der Rohlysate Ganzzell verwendet, ist der Abbau der Proteine durch endogene Proteasen. In Pflanzen ist die Expression von IBPs Allgemeinen gering, und somit der Verlust in Proteinausbeute in nicht genügend Material für zukünftige Experimente oder Analyse führen könnte. schnell während der Proteinextraktion arbeitet, mit dem Zusatz eines zuverlässigen Protease-Inhibitor-Cocktails kann solchen Proteinverlust reduzieren. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Kalteingewöhnungszeit für die größte Ansammlung von IBPs in Labor-grown optimiert werdenPflanzen.
Ein weiteres häufiges Problem, wenn sie mit IBPs arbeitet, ist, dass viele der Tests sind empfindlich gegenüber Temperatur und Feuchtigkeit. In Bezug auf dem IRI-Analyse auf dem Mikroskop Abdeckschlitten Feuchtigkeitsbildung kann in einer Schicht aus Eis führen, die Visualisierung von Eiskristallen erschwert. Mit einem Entfeuchter und extra Austrocknungs Perlen, diese Schwierigkeit beheben können; Es wird jedoch empfohlen, dass dieser Test nicht durchgeführt wird, wenn Labor einer relativen Luftfeuchtigkeit von über 70% sind.
Die Splat-Tests, wie vorgestellt, ist qualitativ. Durch Durchführen des IRI Endpunkt kann eine Verdünnungsreihe vor der Analyse, festgelegt werden, um den Konzentrationsbereich zu bestimmen, in dem der IBPs nicht mehr Eiskristallwachstum beschränken. Verschiedene Labors haben auch Computer - Software zu messen , die durchschnittliche Größe der Eiskristallkörner 18 verwendet. Wie zuvor angedeutet, während Aktivitätstests für IRI ist ein effizientes Einstiegsbild Bestätigung von Eis bindendeAktivität sollte durch die Bestimmung der Höhe der TH oder durch die direkte Sichtbarmachung der Adsorption von IBPs zu Eiskristallen 16 festgelegt werden. Eine bemerkenswerte Beschränkung der IRI-Analyse ist, dass mehrere nicht-IBP-Molekül, die mimische IRI-Aktivität identifiziert. Diese Moleküle können sperrige Proteine, phenolische Glykoside umfassen, und synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohol , 19, 20, 21. Als Ergebnis sollte eine Puffersteuerung immer mit Proben durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass alle Verunreinigungen oder Zusatzstoffe führen nicht zu der beobachteten IRI Aktivität.
Während Eis-Affinitätsreinigung leicht durchgeführt wird, wenn es nicht richtig gemacht, andere Proteine, gelöste Stoffe und Metaboliten vorherrschend. Eine wichtige Überlegung ist die Rate des Wachstums von Eiskristallen; von den Abkühlgeschwindigkeit Absenken (dh auf -0.02 ° C / h), wächst das Eis Hemisphäre langsamer und jede nicht-Eis-bindende Molekules sind weniger wahrscheinlich im Eis Kristallgitter eingebaut werden. Die Anwesenheit von verunreinigenden Moleküle können auch , indem sichergestellt wird vermieden werden , dass nur 50% des Lysats in die Halbkugel aufgenommen wird (dh 50:50, Flüssigkeit zu Eis - Verhältnis). Wie bereits mehr Runde von Eis Affinität angegeben, können auch die Eis-Fraktion klären und in einer Probe mit höherer Reinheit führen. Bemerkenswerterweise sind Sekundärmetaboliten oft unter biotischen und abiotischen Stressbedingungen in Pflanzen überproduzierte. Während die Reinigung von phenolreiche Pflanzengeweben, wenn dunkelbraune Pigmente bestehen bleiben, 1,5% (v / v) Polyvinylpyrrolidon (PVP) und 1,5% Polyvinylpolypyrrolidon (w / v) (PVPP) kann den Extraktionspuffer zugesetzt wird, zu neutralisieren Sekundär Metaboliten. Antioxidative Additive wie Thioharnstoff (5-10 mM) 19 kann auch verwendet werden, 21.
Wenn Informationen über das IBP von Interesse ist bekannt, zusätzliche Reinigungsschritte, wie zum Beispiel Hochdruck-liquid-Chromatographie (HPLC) kann ebenfalls verwendet werden. Modifikationen an ice-Affinitätsreinigung kann auch in Betracht gezogen werden und berichtet Proteinausbeute zu optimieren und zusätzlichen Einblick in IBP Eigenschaften , einschließlich der schnelleren Eismantel Aufreinigungs 23 und fluoreszenzbasierten Eis Ebene Affinität (FIPA) 24 zu gewinnen.
Wenn optimiert, die oben beschriebenen Techniken kann ein gereinigtes Protein-Pools zur Identifikation von IBPs ergeben; jedoch unspezifisch Einbau anderer hoch reichlich Proteine können unvermeidlich sein. Während IBPs aus der Homologie Pooideae Familie teilt Sequenz 25, aufgrund der hohen Vielfalt zwischen IBPs aus verschiedenen Organismen, es ist in der Regel nicht möglich , eine IBP durch Sequenzhomologie allein zu identifizieren. Ein gemeinsames Merkmal der IBPs ist die Anwesenheit von Aminosäuren bekannt Eis zu binden, einschließlich Threonin, Serin und Valin 26; Identifizieren von Peptidsequenzen reich an these Reste können nützlich sein, wenn Sequenzdaten abgebaut werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem NSERC (Kanada) Zuschuss VKW finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic Petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al.
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