Summary
Ici, nous montrons une approche enzymatique pour isoler des hépatocytes primaires de souris adultes, et nous décrivons la quantification d'une réponse inflammatoire par ELISA et la PCR en temps réel.
Abstract
Le foie joue un rôle décisif dans la régulation de l'inflammation systémique. Dans la maladie rénale chronique, en particulier, le foie réagit en réponse au milieu urémique, le stress oxydatif, l'endotoxémie et la diminution de la clairance de la circulation cytokines pro-inflammatoires par la production d'un grand nombre de réactifs de phase aiguë. inflammation des outils expérimentaux pour étudier et le rôle sous-jacent des hépatocytes sont cruciales pour comprendre la régulation et la contribution des cytokines hépatiques à une réponse en phase aiguë systémique et un scénario pro-inflammatoire prolongée, en particulier dans un cadre complexe comme la maladie rénale chronique. Depuis l' étude des mécanismes complexes de l' inflammation in vivo reste difficile, de ressources et nécessite généralement l'utilisation d'animaux transgéniques, les hépatocytes isolés primaires constituent un outil robuste pour acquérir des connaissances mécanistes dans la réponse de phase aiguë hépatique. Cette technique in vitro comporte des coûts modérés, élevés reproductibilité et de la connaissance technique commune, hépatocytes isolés primaires peuvent également être facilement utilisé comme une approche de dépistage. Ici, nous décrivons une méthode enzymatique basée à isoler les hépatocytes primaires de souris, et on décrit l'évaluation d'une réponse inflammatoire dans ces cellules en utilisant la méthode ELISA et la PCR quantitative en temps réel.
Introduction
L' insuffisance rénale chronique (CKD) peut être définie comme un état d'inflammation aiguë et chronique 1. Chez les patients atteints de néphropathie chronique, les niveaux de l'hormone de croissance des fibroblastes facteur phosphaturique 23 (FGF23) sériques augmentent progressivement afin de maintenir l' homéostasie du phosphate sérique 2. Niveaux de FGF23 sérique accrus sont indépendamment associés à la morbidité et la mortalité cardiovasculaire chez les patients qui commencent un traitement d'hémodialyse 3, 4. En outre, plusieurs études cliniques ont montré une forte corrélation entre les niveaux de FGF23 élevés et des niveaux de protéine C-réactive (CRP), l' interleukine-6 (IL-6) et facteur de nécrose tumorale α (TNF) 5, 6 sérum. En outre, dans une étude expérimentale, nous avons récemment démontré que FGF23 peut cibler directement les hépatocytes et provoquer une réponse inflammatoire en augmentant la CRP et l'IL-6 production dans le foie 7. Par conséquent, le FGF23 pourrait agir comme un facteur de circulation qui contribue à l'inflammation systémique CKD.
Dans les années 70, les hépatocytes primaires ont été isolées et étudiées pour la première fois 8. Depuis lors , les cellules hépatiques en culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la transformation métabolique, de la fonction hormonale, le métabolisme des médicaments et de la toxicité, ainsi que l' immunité et les réponses inflammatoires 9, 10. Protocoles précédents ont principalement décrit l'isolement enzymatique des hépatocytes primaires à partir de tissus de foie humain 11, 12. Alors un excellent modèle, ce qui laisse la possibilité d'étudier la façon dont la manipulation génétique affecte les mécanismes de signalisation hépatique complexes ainsi que des conséquences fonctionnelles sur différents types de stimuli. Dans ce qui suit, nous décrivons l'isolement des hépatocytes primaires murins. Notamment, l'effet de plusieurs médiateurs de la réponse de phase aiguë hépatique, comme le lipopolysaccharide (LPS), IL-6 et FGF23 peut être analysé d'une manière facile, rapide et reproductible 13.
Ici, nous présentons un protocole pour l'isolement enzymatique des hépatocytes de souris adultes et nous démontrons que les inducteurs établies de l'inflammation, tels que le LPS et l'IL-6, ainsi que des médiateurs inflammatoires nouveaux tels que le FGF23, peuvent stimuler directement l'expression et la sécrétion de les cytokines inflammatoires, telles que la CRP et IL-6 dans des hépatocytes cultivés.
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Protocol
Tous les protocoles des animaux et des procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Miami Miller School of Medicine.
1. Préparation
- les médias et le foie de perfusion du foie Préchauffer digérer les médias dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Mettre en place une pompe à perfusion (30 mL / min). pré-remplir soigneusement le système de tuyauterie de la pompe avec des milieux de perfusion du foie. Évitez les bulles d'air dans le système et préparer le microscope stéréotaxique.
- des boîtes de culture cellulaire de la couche en utilisant du collagène de type I selon le protocole du fabricant.
2. Liver Recovery
- Anesthésier la souris donneuse utilisant de l' oxygène / l' inhalation isoflurane (4% d' isoflurane / 2 L / min d'oxygène).
- Maintenir une anesthésie par l'isoflurane à abaisser 2-2,5% ou par injection de kétamine (100 mg / kg de poids corporel par voie intraperitoneale) et de xylazine (10 mg / kg de poids corporel intraperitoneally). isoflurane continue est préférée car la kétamine abaisse la pression artérielle et peut provoquer une hépatotoxicité.
- Placez la souris anesthésiés sur un tampon absorbant. Fixer les extrémités de la souris avec du ruban adhésif.
- Rasage et désinfecter l'abdomen de la souris et effectuer une laparotomie ventrale du pubis à la frontière crânienne du foie en utilisant des ciseaux chirurgicaux avec des bouts pointus / contondants. Inciser la paroi abdominale, des deux côtés, caudale du diaphragme.
- Exposer la veine cave inférieure (VCI) en déplaçant soigneusement l'intestin vers le côté droit. Disséquer soigneusement les tissus adipeux autour de l'IVC en utilisant des tampons de pointe de coton stériles et des pinces à pointe inclinées.
- Inciser le diaphragme et ouvrir la sus-hépatique cavité thoracique par deux incisions latérales à l'aide de ciseaux chirurgicaux fines avec des bouts pointus / tranchants. Ligaturer les IVC thoracique en utilisant la soie chirurgicale (5/0).
- Cathétériser la VCI infrarénale utilisant un cathéter iv blindé, retirer délicatement l'aiguille,raccorder la pompe à perfusion et commencer à perfuser le foie. Si effectué correctement, le foie doit immédiatement commencer à blanchir et houle.
- Transect la veine permettant le drainage approprié du sang et perfusion des médias en utilisant des ciseaux chirurgicaux fines.
- Perfuser le foie avec environ 30 ml de foie milieu de perfusion, puis passer au foie digérer les médias (30 ml). Éteignez la pompe à perfusion et retirer la canule une fois la perfusion est terminée.
- exposer doucement la région centrale du foie et de localiser des tissus de liaison entre les lobes du foie. Prenez les fibres de liaison central et soigneusement disséquer tous les tissus qui retiennent le foie en place et retirez délicatement le foie.
- transférer immédiatement le foie dans un tube conique de 50 ml en polypropylène contenant 15 ml de foie digérer les médias.
NOTE: Il n'y a pas de temps en ligne spécifique pour cette étape. Après perfusion du foie reste dans les milieux digérer pour le transport dans une hotte de culture cellulaire stérile. Tous subsequent étapes doivent être exécutées dans un environnement stérile.
3. Isolement et traitement des cellules
- À l'intérieur d'une hotte de culture cellulaire, le transfert du foie à partir du tube de 50 ml en polypropylène de forme conique contenant un milieu de digestion dans une boîte de culture tissulaire stérile.
- En utilisant des pinces stériles, déchirer délicatement les quatre lobes du foie. Si effectué correctement, le milieu de digestion devrait devenir turbide en raison de l'isolement des hépatocytes du foie.
- En utilisant une pointe de pipette stérile de 25 ml, filtrer le milieu de digestion turbide à travers une cellule de nylon tamis de 70 um dans un nouveau tube conique de 50 ml en polypropylene pour éliminer les particules de tissu non digérés et les débris cellulaires.
- Répéter les étapes 3.2 et 3.3 avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Cela aide à l'élimination de tous les hépatocytes résiduels du foie.
- Centrifugeuse à 50 g pendant 2 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant contenant les débris cellulaires en excès et en douceur les cellules dans 25 ml 1x froid remettre en suspensionMedium E. Williams
- En utilisant une pointe de pipette stérile 25 ml, filtrer la remise en suspension grâce à un nouveau 70 um cellule de nylon crépine dans un tube de 50 ml polypropylène conique pour obtenir une suspension plus propre.
- Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour trois lavages supplémentaires à l'aide de froid Medium E 1x 'Williams pour obtenir une suspension cellulaire plus claire.
- Après l'étape finale de lavage, aspirer le surnageant pour éliminer les débris cellulaires en excès. Re-suspendre les cellules de filtre dans 25 mL chaud Williams 'Media E 1x qui contient la décongélation des hépatocytes primaires et des suppléments de placage à travers un nouveau 70 um cellule de nylon crépine dans un tube de 50 ml polypropylène conique.
- Compter les cellules au sein de la ml suspension cellulaire 25 en utilisant un hémocytomètre. En moyenne, attendre 15 - 20 millions de cellules par foie adulte. Déterminer la viabilité des cellules en utilisant une coloration au bleu trypan.
- cellules de plaques dans les médias E 1x de 2 mL de Williams qui contient la décongélation des hépatocytes primaires et des suppléments de placage sur un collagène enduit CE 6 puitscluster de culture ll (9 x 10 5 cellules par puits).
- Après 4 h, changer de support aux médias E 1x Williams qui contient des suppléments d'entretien d'hépatocytes primaires.
- Après 24 h, le sérum affamer les cellules avec un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) médias 1x pour 6 h.
- Traiter les cellules avec du PBS en tant que véhicule, FGF23 (25 ng / mL), le LPS (100 pg / ml) ou IL-6 (50 ng / ml) dans du milieu exempt de sérum et on incube pendant 24 heures.
4. Isolement de l'ARN
- Préparer l'ARN en utilisant un kit de colonne spin du commerce, selon les instructions du fabricant.
5. Génération d'ADNc à partir d'ARN isolé par transcription inverse
- Ajouter 200 ng isolé échantillon d'ARN à un tube PCR.
- Ajouter 14 pi de libre-endonucléase de H 2 O PCR tube à partir de l' étape 5.1.
- Ajouter 4 pi de transcriptase inverse pour tube PCR de l'étape 5.1.
- Re-suspendre le contenu doucement pour faire mélange homogène; centrifuger doucement. Placez le tube PCR contenant le mélange dans un thermocycleur. thermocycleur Run pour la transcription inverse: 1 cycle de 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) puis maintenez à 4 ° C. Le produit final sera l'ADNc désiré.
6. Analyse des cellules par PCR quantitative en temps réel (qPCR)
- Préparer la plaque de 96 puits.
- Placez tous les composants de la réaction qPCR sur la glace: 1 ul d'ADNc, .25 pM amorce avant, .25 uM amorce inverse, 5 pi SYBR Green, 3,5 pi PCR de qualité de l'eau pour un volume total de 10 pi. Utilisation de SYBR Green, préparer master mix pour exécuter tous les échantillons en triple exemplaire.
- Une fois que le mélange maître est terminée, vortex pour rendre homogène. Aliquoter 9 pi de qPCR mélange maître dans chaque puits d'une plaque à 96 WLL. Par la suite, ajouter avec précaution 1 pi d'ADNc dans chaque puits. Le volume total de réaction sera de 10 pi.
- Après le chargement est terminé, sceller la plaque de 96 puits avec optiqueun film adhésif et plaque de 96 puits centrifuger brièvement (50 g pendant 1 min).
- Échantillons Run dans un instrument PCR en temps réel. Placez étanche plaque à 96 puits en instrument de PCR en temps réel et des échantillons gérés selon les recommandations du fabricant de l' instrument. Des exemples de cycles standard et rapides sont incluses ci - dessous.
- Pour les paramètres de vélo standard, utilisez ce qui suit: dénaturation initiale à 94 ° C pendant 120 s, puis 40 cycles de 94 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 60 s, puis maintenez éventuellement à 4 ° C.
- Pour les paramètres de cyclisme rapide: utiliser les éléments suivants: dénaturation initiale à 94 ° C pendant 30 s, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s, 58 ° C pendant 15 s, puis 72 ° C pendant 10 s.
- Reportez-vous au manuel de l'instrument pour des conseils sur la façon d'analyser les données.
7. Analyse des cellules surnageants par ELISA
Remarque: Toutes les étapes sont effectuées selon le protocole du fabricant.
- Distribuer 398 ul de diluant dans des tubes séparés. Introduire à la pipette 2 ml de l'échantillon de surnageant de cellules dans le tube de diluant 398 pi. Cela fournira un pli de dilution de 200.
- Répétez l'étape 7.1.1 pour chaque échantillon à tester.
- Pipeter 100 pi de 200 fois échantillon dilué et un standard dans les puits d'une plaque de 96 puits.
- Incuber la plaque à 96 puits à 25 ° C pendant 45 min sur un agitateur de microplaque à 150 tours par minute.
- Laver les puits 5 fois avec une solution de tampon de lavage 1x. Une fois que le dernier lavage est terminé, enlever toute solution de lavage résiduelle avec du papier absorbant.
- Ajouter 500 ul de réactif conjugué HRP dans chaque puits.
- Répétez les étapes 7.2.2 - 7.2.3.
- Pipeter 100 ul de tétraméthylbenzidine (TMB) réactif dans chaque puits de plaque de 96 puits.
- Mélanger délicatement la plaque à 96 puits à 25 ° C pendant 20 min sur une microplaqueagitateur à 150 tours par minute. Arrêter la réaction en ajoutant directement 100 ul de solution d'arrêt à chaque puits et mélanger doucement. Une fois la solution d'arrêt est ajouté la couleur doit virer au jaune. Cela informe que la solution d'arrêt a été correctement mélangé.
- En utilisant un lecteur de microplaques, déterminer la densité optique à 450 nm dans les 5 premières minutes.
- Calculer une table de valeurs d'absorbance moyenne (A 450) pour chaque échantillon et chaque norme.
- Assembler une courbe standard en traçant la A 450 moyenne de chaque norme par rapport à sa concentration standard en ng / mL sur un graphique linéaire. Permettre à l'axe des x pour représenter la concentration et l'axe des ordonnées pour représenter A 450 valeurs.
- L' utilisation de la moyenne A 450 de l'échantillon dilué, déterminer la concentration de la protéine désirée en ng / ml à partir de la courbe standard.
- Multiplier la concentration de l'échantillon par la dilution faitr. Ceci permettra la détermination de la concentration réelle de la protéine souhaitée dans l'échantillon de surnageant cellulaire.
- Tracer la table construite à partir d'échantillons dans un graphique linéaire. Si OD 450 se situent en dehors de la courbe standard, les échantillons doivent être dilués de manière appropriée et re-testés.
- Normaliser résultats 500.000 cellules.
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Representative Results
Histologie
Représentatifs des images de microscopie de lumière de cellules isolées et cultivées primaires sont représentées sur la figure 1A. Analyse immunocytochimique démontre que des hépatocytes isolés expriment fortement l'albumine (rouge) ainsi que des récepteurs de croissance des fibroblastes facteur 4 (FGFR4) (vert). Les noyaux sont colorés avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu). (Figure 1B).
PCR quantitative en temps réel
hépatocytes isolés primaires ont été traitées avec FGF-23 (25 ng / ml) LPS (100 pg / ml) ou IL-6 (50 ng / ml) pendant 24 heures et les taux d'ARNm de CRP et IL-6 ont été analysés par PCR quantitative en temps réel . FGF23, LPS et IL-6 ont augmenté de manière significative l'expression de CRP et d'IL-6. (Figure 2A)
Les surnageants de culture de cellules isolées à partir des hépatocytes primaires ont été analysés par ELISA pour déterminer les niveaux de CRP. Conformément à notre analyse quantitative PCR en temps réel, LPS, IL-6, ainsi que les traitements de FGF23 ont augmenté de manière significative les niveaux de CRP dans les surnageants de cellules par rapport aux cellules traitées avec du STP. (Figure 2B)
Figure 1: (A) Le contraste de phase image microscopique des hépatocytes primaires isolés de souris. 24 heures après l'étalement, les cellules présentent une forme hexagonale ressemblant et apparaissent souvent bi-nucléées. (Barre d'échelle = 100 um); (B) Immunofluorescence analyse au microscope montre que la majorité des cellules isolées expriment l' albumine (rouge), un marqueur spécifique de l' hépatocyte. Les cellules expriment également très FGFR4 (vert). DAPI colore les noyaux. grossissement d'origine 40X. (barre d'échelle = 50 pm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Analyse quantitative PCR en temps réel des isolés murins hépatocytes primaires pour déterminer CRP et d' IL-6 Expression. (A) du LPS, IL-6 et FGF23 traitements augmentent de façon significative les taux d' ARNm de CRP par rapport aux cellules traitées avec du STP. (Les valeurs sont exprimées en tant que facteur de variation ± SEM, p <0,01; n = 3 isolements indépendants). (B) Les cellules traitées avec du LPS, l' IL-6 ou le FGF23 montrent également une augmentation significative des taux d' ARNm d'IL-6 par rapport aux traitements de PBS. ( les valeurs sont exprimées en tant que facteur de variation ± écart - type, p <0,001, n = 3 isolements indépendants) , (C) Quantification des niveaux de protéine CRPsurnageants des isolés hépatocytes primaires murins par dosage immuno-enzymatique (ELISA). LPS, IL-6 et FGF23 augmenter significativement les taux de protéine CRP par rapport aux traitements de PBS. Les valeurs représentent des concentrations de CRP en mg / dl par 500.000 cellules. (P <0,05, n = 3 isolements indépendants). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Isoler hépatocytes primaires de souris est un outil rapide, peu coûteux et fiable pour étudier les réponses inflammatoires ex vivo. Si effectué correctement, les résultats peuvent être facilement générés et reproduits en temps opportun et rentable. Les points suivants doivent être évalués avec soin afin d'assurer une isolation efficace.
L'incision chirurgicale et de la canulation de la VCI doivent être effectuées sous anesthésie générale et non pas après l'euthanasie. Un jeune chercheur inexpérimenté aura besoin de plus de temps au début de se familiariser avec les caractéristiques anatomiques de l'abdomen de souris et d'effectuer un cathétérisme correct. Garder l'animal donneur vivant jusqu'à ce que la perfusion commence, va augmenter de manière significative la viabilité des cellules isolées. Ligation du supra-hépatique IVC doit être effectuée car elle va augmenter de manière significative le rendement des hépatocytes isolés. En variante, un micro-chirurgical de serrage peut être placé sur la veine cave inférieure.Cependant, après thoracotomie, l'animal deviendra décédé en quelques minutes. Par conséquent toutes les étapes suivantes doivent être effectuées rapidement pour veiller à ce que le foie maintient un débit sanguin suffisant jusqu'à l'initiation de la perfusion. Pour le cathétérisme, l'utilisation d'un cathéter intraveineux rétractable est fortement recommandé. Après canulation la veine cave inférieure, l'aiguille du cathéter peut être retiré avec soin, ce qui minimise le risque de perforation du vaisseau. La dernière étape critique est la connexion du système de perfusion du cathéter. Après avoir enlevé l'aiguille du cathéter, le sang doit être évacuée de l'extrémité du cathéter avant de le raccorder à une pompe à perfusion. Cette étape minimise le risque d'embolies l'air, ce qui peut entraîner une réduction significative de la quantité ainsi que la qualité des cellules isolées.
Une fois que la perfusion est initiée, le foie doit immédiatement et de façon homogène changer sa couleur de rouge à jaune pâle. Pièces restant rouge indiquera insufficperfusion ient ou la présence d'air-embolies. Lavage et filtration de cellules isolées doivent être effectuées de façon répétée. Cela permettra d'assurer une élimination efficace des débris cellulaires en excès. hépatocytes isolés sains adhèrent dans les 4 premières heures d'être plaqué. Par conséquent, les médias de placage peuvent être modifiés pour les médias d'entretien à ce point de temps. Après une nuit d'incubation, les cellules apparaissent dans une forme plus hexagonale avec un noyau de premier plan. Hépatocytes peuvent également être bi-nucléaire (figure 1A). Granulation ou bourgeonnement cellulaire est un indicateur pour une mauvaise isolation. Si hépatocytes continue pas adhérer correctement ou la viabilité cellulaire reste faible, la quantité de support de digestion utilisée pour perfusion doit être modifié. Cela devrait éviter de sur- ou underdigestion du tissu hépatique.
Si un plus grand rendement de cellules est nécessaire, une perfusion anterograde par l'intermédiaire de la veine porte peut être effectuée. Klaunig et al. ont montré que cette technique particulière peut augmenter le rendement cellulaire totale. Alternatively, suivant portail canulation de la veine clasping intermittente de la VCI peut être appliquée. Cette périodiquement augmenter la pression au cours de la perfusion et soi-disant peut également augmenter le nombre total de cellules isolées. Temps de Perfusion, ainsi que le taux de perfusion peut être ajustée 14. Cependant, nous n'avons pas effectué des protocoles de perfusion alternatives.
Après un premier isolement réussi, une immunocoloration spécifique de l' hépatocyte (par exemple l' albumine) doit être effectué pour garantir la pureté de l'isolement (figure 1B). 24 h après l'isolement des hépatocytes doit être privées de sérum pendant 4 à 8 h, puis utilisées pour les traitements. Lors de l' étude de la réponse en phase aiguë, les cellules peuvent être traitées avec du LPS, qui est connu pour induire une inflammation par l' intermédiaire des récepteurs de type Toll 4 et NF-kB 15. Les cytokines pro-inflammatoires, comme l' IL-6, médient leurs effets par l' intermédiaire des récepteurs d' interleukine 16.De plus, nous avons récemment démontré que FGF23 peut activer FGFR4 et / calcineurine / NFAT voie PLCy et induire une réponse inflammatoire dans le foie 7, 17. Afin d'assurer la transcription et la traduction des gènes cibles suffisante, les cellules doivent être traitées pendant 24 h. Isolement de l'ARNm et l'analyse consécutive de l'expression des gènes par PCR quantitative en temps réel avec ELISA de surnageants de cellules fournit des informations solides qui peuvent être facilement répétés. Cela permet à l'enquête des médiateurs pro-inflammatoires nouveaux, ses récepteurs hépatiques et de leurs mécanismes de signalisation en aval consécutifs. les cellules primaires isolées, en particulier des animaux transgéniques fournissent des résultats supérieurs par rapport aux lignées cellulaires de cancer génériques telles que des cellules HepG2 et Hep3B. En raison de sa simplicité, cette approche peut également être utilisé pour des projections pour étudier l'effet de nouveaux médicaments. Néanmoins, l'étude pharmacologique complexe ou patho-physiolomécanismes giques nécessiteront des expériences confirmatifs supplémentaires, principalement dans un cadre in vivo.
On n'a pas effectué d'études à long terme depuis hépatocytes isolés ont tendance à dédifférencier dans quelques jours. Cependant, ceci peut être résolu par des techniques de culture de cellules spécifiques, tel que rapporté par d' autres 18. Ceux-ci comprennent la configuration d'un collagène double gel, sphéroïdes hépatocytes, co-culture avec des cellules endothéliales, et les co-cultures microélectrodes avec des fibroblastes 3T3-J2. Pris ensemble, l'isolement des hépatocytes adultes murins primaires fournit un outil robuste pour les scientifiques intéressés par la métabolomique, l'inflammation, l'immunité et la réponse hépatique à des médicaments et des toxines. Elle est caractérisée par une simple faisabilité, des coûts modérés et de la reproductibilité rapide.
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Disclosures
Les auteurs ne sont pas de conflit d'intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH (R01HL128714 à CF) et (F31DK10236101 à KS) et l'American Heart Association (CF et AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
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