Summary
Cell overflade sammenvoksninger er centrale i mechanotransduction, da de sender mekanisk spænding og indlede signalveje involveret i vævshomeostase og udvikling. Her præsenterer vi en protokol for at dissekere de biokemiske veje, der aktiveres som reaktion på spænding, ved hjælp af ligand-overtrukne magnetiske mikrokugler og force ansøgning til vedhæftning receptorer.
Abstract
Mekanosensitive celleoverflade adhæsionskomplekser tillader celler at fornemme de mekaniske egenskaber af deres omgivelser. Nylige undersøgelser har identificeret både kraft-sensing molekyler ved vedhæftning sites, og kraft-afhængige transkriptionsfaktorer, der regulerer slægt-specifikke genekspression og drive fænotypiske udgange. Imidlertid har de signalering netværk konvertere mekanisk spænding i biokemiske veje været undvigende. At udforske de signalveje beskæftiget ved mekanisk spænding påføres celleoverfladereceptor, kan superparamagnetiske mikroperler anvendes. Her præsenterer vi en protokol til at bruge magnetiske perler til at anvende styrker til celleoverfladen adhæsionsproteiner. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, er det muligt at undersøge ikke eneste kraft-afhængig cytoplasmatisk signalveje fra forskellige biokemiske metoder, men også adhæsion remodellering ved magnetisk isolering af adhæsionskomplekser knyttet til ligand-coatede perler. Denne protokol omfatter udarbejdelse af ligand-coerede superparamagnetiske perler og anvendelse af definere trækkræfter efterfulgt af biokemiske analyser. Derudover tilbyder vi et repræsentativt udsnit af data, der viser, at spændingen anvendes på integrin-baserede vedhæftning udløser vedhæftning remodellering og ændrer proteintyrosinphosphorylering.
Introduction
I Metazoa, mekanisk spænding dirigerer væv udvikling og homeostase gennem regulering af et utal af cellulære processer såsom proliferation, differentiering og overlevelse 1, 2. Mekaniske spænding kan opstå fra den ekstracellulære matrix eller kan genereres ved adhærente celler, som prøven deres ekstracellulære miljø gennem actomyosin kontraktile maskiner, der trækker på ekstracellulær matrix og prober sin stivhed gennem spændinger følsomme molekyler. Som reaktion på spænding, mekanosensitive adhæsionsproteiner undergå konformationsændringer der udløser komplekse signalleringskaskader. Til gengæld er disse signalveje iscenesætte en mechanoresponse omfatter proliferation, differentiering og overlevelse, der justerer cellulær adfærd til det ekstracellulære miljø. Sådanne processer kan afvikles i en kortvarig periode (sekunder til minutter) til hurtigt at fodre tilbage på løkke af mecha notransduction ved at ændre de mekanosensitive strukturer. For eksempel integrin-baserede adhæsioner styrke i afhængighed af spændingen gennem Rho GTPase-medieret cytoskeletal remodeling 3, 4, 5. Samtidig er andre signalveje aktiveret i løbet af timer og dage at kontrollere genetiske programmer, der i sidste ende påvirke celle skæbne 6. Betragtninger, har mange undersøgelser fremhævet effekten af matrix stivhed på celle determinisme og sygdom udvikling 1, 2, de præcise molekylære mekanismer i vedhæftning-medieret mechanotransduction stadig undvigende.
Der er udviklet forskellige metoder til at undersøge virkningerne af celle-genereret kræfter eller eksterne kræfter på celle adfærd, herunder flow-systemer, fluorescens resonans (FRET) -tension sensorer 7,lass = "xref"> 8, kompatible substrater 9, magnetiske pincet, optisk pincet 10 og atomic force mikroskopi (AFM) 11. Her præsenterer vi en protokol ved hjælp superparamagnetiske perler til at karakterisere mechanotransduction veje som reaktion på trækkræfter anvendes til specifikke vedhæftning receptorer. Superparamagnetiske perler er partikler, der reversibelt magnetize når den placeres i et magnetisk felt. Når belagt med en ligand for en specifik receptor, disse perler er et effektivt værktøj til at undersøge virkningerne af ekstracellulær kraftpåvirkning. Denne metode er blevet valideret af flere undersøgelser 3, 5, 12 - 17 og præsentere fordel at stort set lette biokemisk analyse på klæbende celler. Under anvendelse af lignende collagen-coatede magnetiske perler efterfulgt af biokemisk analyse, tidlige arbejde rapporteret en stigning iproteintyrosinphosphorylering og RhoA aktivering som respons på spænding 5, 18, 19. Den nedenfor beskrevne fremgangsmåde er også blevet anvendt med fibronectin (Fn) overtrukne perler til at karakterisere de signalveje nedstrøms fra spændinger påført integriner 3. I denne undersøgelse Guilluy et al. viste, at spændinger aktiverer RhoA gennem ansættelse af de to guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs), Larg og GEF-H1, til integrin vedhæftning komplekser. Siden da, har andre undersøgelser vist, at GEF-H1 rekrutteres til vedhæftning komplekser som reaktion på celle-genereret spænding ved hjælp af forskellige metoder 20, 21, viser robustheden af metoden beskrevet her. Som følge heraf blev aktiveret RhoA vist at fremme adhæsion forstærkning, gennem cytoskeletal remodeling. Dette system blev også anvendt til at undersøge spænding, der påføres to celle / celleadhæsionsreceptorer. Anvendelse af kræfter på magnetiske perler overtrukket med det ekstracellulære domæne af E-cadherin inducerede en forøgelse af vinculin rekruttering lighed med integrin associeret adhæsionskomplekser 12. Collins og kolleger observeret, at anvendelsen af spænding til PECAM-1 fremmer integrin og RhoA aktivering 13. En anden eksperimenterende tilgang med magnetiske perler er studiet af spænding anvendes på isolerede kerner. Brug af perler overtrukket med antistoffer mod nukleare kappeproteinet nesprin-1 blev envelope komplekser nukleare oprenset for at vise, at de dynamisk reguleres som respons på mekanisk spænding 22. Disse resultater understøtter powerfulness af denne metode i studiet af mechanotransduction pathways. Desuden mens flow eller trækkraft systemer stimulere generelle cellulære processer, magnetiske perler specifikt retter sig mod en celle vedhæftning receptor ved hjælp af enten ligander 13, 15.
En anden fordel ved denne fremgangsmåde er isolering af adhæsionskomplekser gennem en enkel ligandaffinitet oprensningsprocedure. Det er velkendt, at tilsætning af ligand-coatede perler til celler binder adhæsionsreceptorer og inducerer rekruttering af flere adhæsionsproteiner 23. Yderligere anvendelse af kræfter til ligand-coatede magnetiske perler forvandler disse vedhæftning komplekser i makromolekylære platforme, der formidler forskellige spændinger-afhængige signalveje 4, 24. Cellelyse efterfulgt af perle koncentration på en magnet tillader isoleringen af vedhæftning platforme. Andre metoder, der anvendes til at oprense adhæsionskomplekser er allerede blevet anvendt i adhærente celler. De kombinerer kemisk tværbinding for at bevare protein-protein interaktionerog en celle lysis trin vaskemiddel og shear flow eller lydbehandling 20, 21, 25, 26, 27, 28. Det sidste trin er en samling af de resulterende ventrale plasmamembraner indeholder adhæsionskomplekser. I modsætning disse metoder, magnetiske perler tillader en større rensning niveau af celleadhæsion komplekser ved selektivt at målrette en specifik familie af adhæsionsreceptorer. Magnetiske perler er allerede blevet anvendt til at oprense adhæsionskomplekser i ikke-adhærente celler bundet til ligand-coatede mikroperler 29, 30. Den nedenfor beskrevne efterligner biologiske situationer metode, hvor kraft påføres i en kort længere periode (sekunder til minutter). Derfor giver det et stærkt værktøj til at undersøge både den molekylære sammensætning af oprensede adhæsionskomplekser ogdownstream mekanosensitive-signalveje.
Her præsenterer vi en detaljeret forsøgsprotokol for at bruge magnetiske perler til at anvende trækkræfter vejgreb overfladeproteiner. En permanent neodym magnet placeres oven på dyrkningsskålen overflade. Polfladen af magneten er placeret i en højde på 6 mm, således at kraften på et enkelt 2,8 um magnetisk perle er konstant (ca. 30-40 pn) 31. Varigheden af spænding stimulation bestemmes af operatøren afhængigt af molekylet af interesse og dens tidsplan for aktivering. Celler endelig lyseres, adhæsionskomplekser oprenses ved perler separation under anvendelse af en magnet og biokemiske analyser behandles. Denne protokol omfatter udarbejdelse af ligand-coatede superparamagnetiske perler, og anvendelsen af spænding gennem magnet efterfulgt af biokemiske analyser. Derudover tilbyder vi et repræsentativt udsnit af data, der viser, at spændingen anvendes på integrin-baserede adhesions inducerer vedhæftning remodellering og ændrer proteintyrosinphosphorylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ligand Konjugering til magnetiske perler
Bemærk: Ligand konjugation udføres ved anvendelse superparamagnetiske tosyl--aktiverede perler med en 2,8 um diameter (stamopløsning koncentration 10 8 perler / ml, 30 mg perler / ml). Den følgende protokol er baseret på prøver af ca. 2 x 10 5 celler, som svarer til MRC-5-celler dyrket til 80% konfluens i en 60 mm vævskulturplade. Juster lydstyrken af perler og reagenser i overensstemmelse hermed, hvis du bruger plader i forskellige størrelser eller celler ved forskellige Confluences. Bruge en mængde superparamagnetiske perler for at få 2 perler pr celle. Derfor er der behov 4 x 10 5 perler for en 60 mm plade.
- Grundigt resuspender perlerne i det originale hætteglas ved hvirvelbehandling mindst 30 s. Aliquot 40 pi af den genopslæmmede superparamagnetiske perler (svarende til 4 x 10 6 perler) til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Glasset anbringes på en magnetisk separator;på stand for at adskille de magnetiske perler fra opløsningen. Supernatanten fjernes, fjernes røret fra den magnetiske separation stativet og resuspender perlerne i 1 ml 0,1 M Na-phosphat pH 7,4.
- Gentag vasketrin to gange med 1 ml 0,1 M Na-phosphat pH 7,4.
- Efter den sidste vask resuspenderes perlerne i 1 ml 0,1 M Na-phosphat pH 7,4.
- Kombiner 100 ug bovint fibronectin (FN) eller enhver anden celleadhæsion receptor ligand til 1 ml 0,1 M Na-phosphat pH 7,4 indeholdende perler og blandes ved pipettering.
- Gentag forrige trin ved at erstatte FN eller andre specifikke ligand med BSA, poly-D-lysin eller apo-transferrin for negative kontroller.
- Eventuelt til gelanalyse, tage en 10 pi alikvot af ligandopløsning til analyse af tværbinding effektivitet og blandes med en passende mængde af koncentreret Laemmli prøvebuffer.
- Inkuber perler med liganden indeholdende opløsning til 12-24 timer ved 37 ° C på en rotor.
- Hvis perle aggregater vises efter reaktionen har fundet sted, soniker (kontinuerlig 39 W effekt) i højst 10-20 s.
- Isoler perlerne ved hjælp af magnetisk separation stå, aspireres den resterende opløsning og tilsættes 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6 løsning. Der inkuberes i 1 h på rotor ved 37 ° C.
- Vask perler ved anvendelse af en magnet to gange med 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. Resuspender perler i 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6.
- Soniker perler hvis aggregater vises for ikke mere end 20-30 s.
- Eventuelt fjerne en 10 pi alikvot til analyse koblingseffektivitet ved Western blot (blandes med en passende mængde af koncentreret Laemmli prøvebuffer).
- Fortsæt til celleassays eller oplagre perler ved 4 ° C i op til 1 måned.
- Eventuelt køre en SDS-PAGE-gel og pletten med Coomassie blå til at analysere FN tværbinding til de magnetiske perler.
2. Anvendelse af trækkræfterne på Ligand-belagte kugler bundet til adhæsionsreceptorer på DorsalOverflade Celler
- Kultur adhærente celler på 60 mm vævskulturskål i passende vækstmedium (sædvanligvis DMEM 4,5 g / l D-glucose tilsat FCS 10%) indtil den når 80% konfluens.
- Forbered ikke-denaturerende nonioniske lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,1% NP-40) og chill mikrocentrifugerør.
- Pelletere ligand-coatede perler fra punkt 1.10 og resuspender i 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. Tilsæt 100 pi af ligand-coatede perler opløsning til 5 ml varm dyrkningsmedium og vortex.
- Aspirer medium i 60 mm dyrkningsskål og tilsæt 5 ml varm vækst medium suppleret med perler.
- Der inkuberes i 20 min under celledyrkningsbetingelser (37 ° C og 5% CO2) for at give perlerne at sedimentere og klæbe til cellerne. Det er afgørende for ikke overstige 20 min siden perler kan internaliseres ved fagocytose.
- Eventuelt observere perlerne under et lysmikroskop med en 10X eller 20X objective og tjekke for perle vedhæftning med lidt ryste fadet til at skelne mellem vedhæftede og flydende perler.
- Mens du holder kulturen fadet i inkubatoren, bytte den normale parabol låg til et låg med en rund 38 mm neodym magnet fastgjort på oversiden. Magneten holdes på plads af to mindre 13 mm neodym magneter anbragt på undersiden af låget. Da magneterne er meget kraftige, manipulere dem omhyggeligt.
- Cellerne inkuberes underkastet spændinger for de ønskede tidspunkter ved celledyrkningsbetingelser (37 ° C og 5% CO2).
- Efter behandling placere skålen på is og omhyggeligt opsuge hele medium fra skålen.
- Der tilsættes 300 pi af cellelyse-buffer og inkuberes i 10 minutter på is. Saml lysatet ved anvendelse af en celleskraber og overførsel til en forud kølet 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Pelletere magnetiske perler ved hjælp af magnetisk separation stå og overføre det samlede cellelysat i et nyt pre-chilled 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gemme denne fraktion ved -20 ° C til yderligere analyse.
- Vask perlerne 3 gange med 1 ml iskold lysepuffer. Der tilsættes 50 pi Laemmli prøvepuffer til vulsten pellet, blandes ved pipettering og kog ved 95 ° C i 5 min under anvendelse af en tør blok varmelegeme. Denne fraktion indeholder de isolerede adhæsionskomplekser. Fortsæt til biokemisk analyse eller opbevares ved -20 ° C.
- Af det samlede cellelysat opnået efter perler separation (ca. 300 pi), fjerne en 50 pi alikvot til western blot-analyse.
BEMÆRK: De 250 pi venstre kan anvendes til yderligere biokemiske undersøgelser såsom protein-protein-interaktion undersøgelser (immunpræcipitation, GST pull-down assays) eller GTPase aktivitet eksperimenter (skiftende lysis buffer kan være nødvendig afhængigt af GTPase af interesse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skematiske af teknikken er vist i figur 1a. Efter ligand konjugering, er magnetiske perler inkuberes med celler i 20 minutter, og derefter anvendes en permanent magnet til at anvende trækkræfter på ca. 30-40 pN for forskellige tidsrum. Figur 1b viser 2,8 um FN-belagte magnetiske kugler bundet til MRC5 celleadhæsionsreceptorer.
Vasketrinnene af superparamagnetiske perler efter cellelysis er afgørende og bestemme graden af oprensning. Mindst tre vaske anbefales. GADPH immunoblots med lange eksponeringer kan være nyttigt at teste renheden af adhæsionskomplekser (figur 2a).
FN-overtrukne perler blev anvendt til at undersøge de mechanotransduction processer, der sker over tid på adhæsionskomplekser som reaktion på spænding. Efter magnetisk separation af adhæsionen kompleks fraktion, blev lysatet og adhæsionen komplekse fraktion analyseret vedwestern blot. Som forventet, observerede vi Tallinn, vinculin og paxillin, men ikke GAPDH i vedhæftning komplekser fraktionen selv i fravær af mekanisk stimulation (figur 2b). I overensstemmelse med tidligere rapporter 32, 33, spænding udløst vinculin rekruttering til vedhæftning komplekser. Mens spændingen ikke påvirkede paxillin rekruttering til adhæsionskomplekser blev dets phosphorylering på tyrosin 31 forøget i respons på mekanisk spænding både i den samlede cellelysat og i adhæsionen kompleks fraktion.
Figur 1. Beskrivelse af fremgangsmåden. (A) Skematisk illustration af teknikken. Celler først dyrkes i dyrkningsmedium, indtil den ønskede sammenflydning er nået. Derefter er superparamagnetiske perler tilsættes i 15-20 min. Trækkræfter omkring 30-40 pN erderefter påført ved hjælp af den kalibrerede magnet for forskellige tidsrum. (B) fibronectincoatede superparamagnetiske perler binder til celleadhæsionsreceptorer. Celler afbildes af fasekontrast i transmitteret-lysmikroskopi 15 min efter tilsætning af superparamagnetiske perler (hvid pil) i medium. (Top billede: Scale bar = 25 um, bund billede: Scale bar = 100 um) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Mekanisk spænding inducerer adhæsion modning. (A) Oprensning af adhæsionskomplekser. GAPDH immunoblotting anvendes som ladningskontrol for total cellelysat og at kontrollere renheden af adhæsionskomplekser. Nitrocellulosemembranen er afbildet under anvendelse af en lang eksponering til at demonstrere the fravær af signal i adhæsion kompleks fraktion. (B) Spændinger inducerer adhæsion modning. Loading kontrol (GAPDH) og kandidater (vinculin, Tallinn og paxillin) er kendt for at blive ansat eller phosphoryleret i vedhæftning komplekser som reaktion på mekanisk spænding er immunoblottedes. Dette forsøg er blevet udført på MRC5 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne fremgangsmåde er en enkel tilgang til at anvende spænding til celleoverflade adhæsionsreceptorer og tillade deres efterfølgende oprensning. Men nogle trin er afgørende for at udføre en effektiv vedhæftning rensning og potentiel optimering kan gøres afhængig af de målrettede adhæsionsreceptorer. Vi præsenterer potentielle problemer brugeren kan støde nedenfor.
Vi anvendte 2,8 um diameter magnetiske perler, men større perler kan anvendes, såsom 4,5 um diameter. Dog bør perle diameter begrænses til 2-5 um siden fagocytose kan forekomme mere hurtigt under 30-60 min inkubation og større perler har stærkere vedhæftning så perle forskydning ville være begrænset under magnetisk felt 34, 35. Derfor er det vigtigt at begrænse inkubationstid til korte perioder og bruge den korrekte perlestørrelse. Antallet af perler inkuberet per celle vil påvirke mængden af fOrce oplevelse af en enkelt celle. Mens man ønsker at effektivt stimulere celler med spænding, kan for mange perler pr celle føre til aktivering af irrelevante signalveje. Vi inkuberes sædvanligvis i gennemsnit to perler pr celle for Fn-belagte kugler, men denne mængde kan justeres [1 til 5 perler pr celle] afhængigt af celletypen og celleoverfladereceptoren. Med hensyn til magneten, den her beskrevne fremgangsmåde anvendes en magnet, for hvilken den resulterende kraft på en 2,8 um er blevet målt (ca. 30-40 pN ved måling af forskydningen af magnetiske perler i ufortyndet glycerol, en newtonsk væske med kendt viskositet 31, selv om det er muligt at anvende større magneter til at anvende større mængde kraft, om nødvendigt. Det er vigtigt at bemærke, at disse magneter er yderst kraftfulde og manipulere dem omhyggeligt.
Efter 12-24 timers inkubation med ECM ligand (trin 1.7) og efter 1 times inkubation (trin 1.9) med PBS / 0,2% BSA, pH 7,6 puffer, er magnetisk mikroperler kan danne aggregater. Det er derefter vigtigt at adskille perler så meget som muligt til at respektere forholdet 2 perler pr celle. Det er dog stadig acceptabelt at have en 5: 1-forhold. Perler separation kan opnås enten ved blanding og pipettering eller ved anvendelse af lydbehandling, selv i en kort periode (20-30 s).
Forskellige proteiner kan konjugeres til perlerne, herunder integrin ligand (FN, kollagen), rekombinante proteiner eller antistoffer rettet mod specifikke celleoverfladereceptorer. Fastgørelsen af ligand-coatede magnetiske perler på den dorsale celleoverfladen kan blive svækket af den lave koblingseffektivitet af liganden på perlerne. Det anbefales at kontrollere for ligandbinding til perlerne ved at samle en alikvot af den fortyndede ligandopløsning før tilsætning til perlerne og en alikvot af perler ved udgangen af koblingen processen. Disse aliquoter kan forarbejdes til SDS-PAGE analyse og Coomassie blue-farvning.
Hvis ingen ændringer isignalveje eller forventede mechanosensing processer detekteres, er det vigtigt at overveje forskellige muligheder. En måde at identificere problemet er at modulere eksperimentets varighed med magneten. Det er velkendt, at hastigheden af cellulære processer varierer afhængigt af den anvendte celletype. En anden mulighed ville være at teste kendte spændinger følsomme molekyler og tjekke for deres indlæg translationelle modifikationer ved western blotting (f.eks paxillin fosforylering eller FAK phosphorylering kan analyseres). Mængden af kraft kan også være kritisk og bruge en tykkere magnet (samme lønklasse N52) eller større perler kan være en mulighed. Derudover kan ligand / receptor-bindende effektivitet undersøges ved at analysere vedhæftning kompleks og se efter celleoverfladereceptorer (såsom cadherin eller integrin). Cellen sammenflydning kan også påvirke cellulære respons på spænding. Som det er blevet observeret, at celle / celle-adhæsion kan påvirke cellernes adfærd og cystokeletal forspænding, er det important at bemærke, at sammenflydning kan påvirke cellulære respons på spænding. Selvom vi anbefaler 80% konfluens til påføring af spænding til integrin-baserede sammenvoksninger kan forskellige betingelser testes for at optimere det eksperimentelle system.
Selv om denne fremgangsmåde tilvejebringer et kraftfuldt værktøj til at dechifrere spændingen følsomme adhesome samt de tilhørende signalveje, det havde også nogle begrænsninger. Først, da den største bekymring ved anvendelse af sådanne små størrelse magnetiske perler er risikoen for deres internalisering af cellerne, kan denne metode ikke anvendes til at studere langsigtede mekanosensitive signal- cellulære reaktioner, der modificerer celleskæbne såsom differentiering og proliferation. En anden begrænsning ligger i vejen for, hvordan kræfterne påføres lag af celler i kulturen plade. Faktisk eftersom magnetfeltet er altid højere ved periferien af magneten, kunne kræfter variere på overfladen af kulturen plade med en faldende gradient af cellestrækker sig fra periferien til centrum og kan føre til heterogene cellulære reaktioner.
Den her beskrevne procedure udgør en enkel og omkostningseffektiv metode, der tillader at studere mekanosensitive cellulære veje samt undersøge den molekylære sammensætning af adhæsionskomplekser udsat for spændinger. Andre metoder, såsom strække enhed, der anvender cyklisk stamme til celler, føre til anvendelse af spænding til alle celleoverfladereceptorer interagerer med den ekstracellulære matrix. Den her beskrevne metode har den fordel, at force stimulering af en specifik undergruppe af celleoverfladereceptorer og et stort udvalg af ligander kan anvendes, såsom integrin ligander eller antistoffer rettet mod celleoverfladereceptorer, tillader studiet af mange forskellige mekanosensitive systemer. En anden fordel ved denne fremgangsmåde er, at det fører til oprensningen af proteinerne komplekser, oplevede spænding og arbejde på bærende elemeNTS, som er kendt for at spille en central rolle i mechanotransduction 36. Det oprensede vedhæftning komplekset kan også anvendes til forskellige biokemiske metoder 14, såsom kinase assays for at undersøge kinase aktivitet som respons på spænding, eller actinpolymerisation assay. Derudover kan denne eksperimentelle system, kobles med magnetiske pincet til at udforske den cellulære mekanisk respons og til at korrelere dette svar med de identificerede signalveje. Interessant nok har magnetoplasmonic nanopartikler seneste blevet anvendt til mekanisk belastning Notch og E-cadherin med præcis kontrol i tid og rum 37. Denne seneste udvikling kan hjælpe udforske mekanosensitive signalveje med forskellige rumlige, tidsmæssige og mekaniske indgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
CG er støttet af tilskud fra Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), fra EU syvende rammeprogram (Marie Curie Career Integration n˚8304162) og fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU 's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (ERC Starting Grant n˚639300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al.
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J.
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , San Diego, Calif. (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
