Summary
Cellytan sammanväxningar är centrala i mechanotransduction, eftersom de sänder mekanisk spänning och initiera de signalvägar som är involverade i vävnadshomeostas och utveckling. Här presenterar vi ett protokoll för att dissekera de biokemiska vägar som aktiveras som svar på spänning, med hjälp av ligand-belagda magnetiska mikropärlor och kraft ansökan till vidhäftningsreceptorer.
Abstract
Mechanosensitive cellyte vidhäftningskomplex tillåter celler att känna av de mekaniska egenskaperna hos sin omgivning. Nyligen genomförda studier har identifierat både kraftkännande molekyler på vidhäftningsställen och kraftberoende transkriptionsfaktorer som reglerar härstamning specifika genuttryck och driver fenotypiska utgångar. Emellertid har signaleringsnätverk omvandlar mekanisk spänning i biokemiska vägar förblev svårfångade. För att utforska de signalvägar som deltar vid mekanisk spänning som anbringas till cellytereceptor, kan superparamagnetiska mikropärlor användas. Här presenterar vi ett protokoll för användning av magnetiska pärlor för att tillämpa krafter till cellytans vidhäftningsproteiner. Med hjälp av denna metod är det möjligt att undersöka inte bara kraftberoende cytoplasma signalvägar av olika biokemiska metoder, men också vidhäftnings ombyggnad av magnetisk isolering av vidhäftningskomplex bundna till ligand-belagda pärlor. Detta protokoll omfattar framställningen av ligand-cointresse- superparamagnetiska pärlor, och tillämpningen av definiera dragkrafter följt av biokemiska analyser. Dessutom ger vi ett representativt urval av uppgifter som visar att spänning appliceras på integrin-baserad adhesion utlöser vidhäftning ombyggnad och förändrar proteintyrosinfosforylering.
Introduction
I metazoer riktar mekaniska spänningar vävnadsutveckling och homeostas genom reglering av en myriad av cellulära processer såsom proliferation, differentiering och överlevnad 1, 2. Mekaniska spänningar kan uppstå från den extracellulära matrisen eller kan genereras av vidhäftande celler, vilket prov deras extracellulära miljön genom aktomyosin sammandragnings maskiner som drar till extracellulär matris och utför sin styvhet genom spänningskänsliga molekyler. Som svar på spänning, mechanosensitive vidhäftningsproteiner genomgå konformationsförändringar som utlöser komplexa signaleringskaskader. I sin tur dessa signaleringsvägar iscensätta en mechanoresponse omfattar proliferation, differentiering och överlevnad som justerar cellulära beteende till den extracellulära miljön. Sådana processer kan lösas på kort sikt tid (sekunder till minuter) för att snabbt mata tillbaka till slingan av mecha notransduction genom att modifiera mechanosensitive strukturer. Exempelvis grinbaserade adhesioner förstärker som svar på spänningar genom Rho GTPas-medierad cytoskelettala remodeling 3, 4, 5. Samtidigt är andra signalvägar aktiveras under timmar och dagar för att kontrollera genetiska program som så småningom påverka cellernas öde sex. Medan har många studier visat att det effekten av Matrix Stelhet på cell determinism och sjukdomsutveckling 1, 2, de exakta molekylära mekanismerna för vidhäftning förmedlad mechanotransduction fortfarande svårfångade.
Olika metoder har utvecklats för att studera effekterna av cellgenererade styrkor eller externa krafter på cellens beteende, inklusive flödessystem, fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -Fjäderspänning sensorer 7,lass = "xref"> 8, kompatibla substrat 9, magnetiska pincett, optisk pincett 10 och atomkraftsmikroskopi (AFM) 11. Här presenterar vi ett protokoll med hjälp av superparamagnetiska pärlor för att karakterisera mechanotransduction vägar som svar på dragkrafter appliceras på specifika vidhäftningsreceptorer. Superparamagnetiska pärlor är partiklar som reversibelt magnetisera när den placeras i ett magnetiskt fält. När belagda med en ligand för en specifik receptor, dessa pärlor ger ett kraftfullt verktyg för att studera effekterna av extracellulära kraft ansökan. Denna metod har godkänts av flera studier 3, 5, 12 - 17 och har fördelen att i hög grad underlätta biokemisk analys på vidhäftande celler. Med användning av liknande kollagenbelagda magnetiska pärlor följt av biokemisk analys, tidigt arbete rapporterade en ökning avproteintyrosinfosforylering och RhoA-aktivering som svar på spänning 5, 18, 19. Metoden som beskrivs nedan har också använts med fibronektin (FN) -belagda pärlor för att karaktärisera de signalvägar nedströms spänning som anbringas till integriner 3. I denna studie Guilluy et al. visade att spänningen aktiverar RhoA genom rekrytering av de två guaninnukleotidutbytesfaktor (GEFs), larg och GEF-H1, till integrin vidhäftningskomplex. Sedan dess har andra studier visat att GEF-H1 rekryteras till vidhäftnings komplex som svar på cell genererade spänningen med hjälp av olika metoder 20, 21, vilket visar robustheten den metod som beskrivs här. Som ett resultat, aktiverades RhoA visat sig främja vidhäftning förstärkning, genom cytoskeletal ombyggnad. Detta system användes också för att undersöka spänning appliceras to cell / celladhesionsreceptorer. Applicering av krafter på magnetiska pärlor belagda med den extracellulära domänen av E-cadherin inducerade en ökning av vinkulin rekrytering på liknande sätt som grin associerad vidhäftningskomplex 12. Collins och kollegor observerade att tillämpningen av spänning på PECAM-1 främjar integrin och RhoA aktivering 13. En annan experimentell metod med hjälp av magnetiska pärlor är studiet av spänning appliceras på isolerade kärnor. Använda pärlor belagda med antikroppar mot kärn höljproteinet nesprin-1, var kärnhöljet komplex renas för att visa att de är dynamiskt regleras som svar på mekaniska spänningar 22. Dessa resultat stöder powerfulness av denna metod i studien av mechanotransduction vägar. Dessutom, medan flöde eller dragkraft system stimulera allmänna cellulära processer, magnetiska pärlor specifikt rikta en cellvidhäftningsreceptor med antingen receptorligander 13, 15.
En annan fördel med denna metod är isoleringen av vidhäftningskomplex genom ett enkelt ligand förfarande affinitetsrening. Det är välkänt att tillsats av ligand-belagda pärlor till celler binder adhesionsreceptorer och inducerar rekryteringen av flera adhesionsproteiner 23. Ytterligare tillämpning av krafter till ligand-belagda magnetiska pärlor visar dessa vidhäftnings komplex i makromolekylära plattformar som förmedlar olika spänningsberoende signalvägar 4, 24. Cellys följt av vulsten koncentration med användning av en magnet medger isolering av de vidhäftnings plattformar. Andra metoder som används för att rena vidhäftnings komplex har redan använts i vidhäftande celler. De kombinerar kemisk tvärbindning för att spara protein-proteininteraktioneroch en cell-lys steg för detergent och skjuvflöde eller sonikering 20, 21, 25, 26, 27, 28. Det sista steget är att samla de resulterande ventrala plasmamembran som innehåller vidhäftnings komplex. Till skillnad från dessa metoder, magnetiska kulor tillåta en större reningsnivå cellvidhäftningskomplex genom att selektivt rikta en specifik familj av adhesionsreceptorer. Magnetiska pärlor har redan använts för att rena vidhäftningskomplex i icke-adherenta celler bundna till ligand-belagda mikrokulor 29, 30. Metoden som beskrivs nedan efterliknar biologiska situationer där kraft appliceras under en kort längre period (sekunder till minuter). Därför ger det ett kraftfullt verktyg för att undersöka både den molekylära sammansättningen av renade vidhäftnings komplex ochnedströms mechanosensitive signaleringsvägar.
Här presenterar vi en detaljerad försöksprotokoll för att använda magnetiska pärlor för att tillämpa dragkrafter vidhäftning ytproteiner. En permanent neodymium magnet placeras på toppen av odlingsskålen ytan. Polytan av magneten är placerad på en höjd av 6 mm så att kraften på ett enda 2,8 | j, m magnetisk pärla är konstant (ca 30-40 pn) 31. Varaktigheten av spännings stimulering bestäms av operatören beroende på molekylen av intresse och dess tid-skala från aktivering. Celler slutligen lyserade, vidhäftnings komplex renas genom pärlor separation med hjälp av en magnet och biokemiska analyser bearbetas. Detta protokoll omfattar framställningen av ligand-belagda superparamagnetiska pärlor, och tillämpningen av spänning genom magnet följt av biokemiska analyser. Dessutom ger vi ett representativt urval av uppgifter som visar att spänning appliceras på integrin baserade adhesions inducerar adhesion ombyggnad och förändrar proteintyrosinfosforylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ligand Konjugering till magnetiska pärlor
Notera: Ligand konjugering utförs med användning av superparamagnetiska tosyl-aktiverade pärlorna med en 2,8 ^ m diameter (stamlösningens koncentration 10 8 pärlor / ml, 30 mg pärlor / ml). Följande protokoll är baserat på prover av approximativt 2 x 10 5 celler, som motsvarar MRC-5-celler odlade till 80% sammanflytning i en 60 mm vävnadsodlingsplatta. Justera volymen av kulor och reagens i enlighet med om du använder plattor av olika storlekar eller celler vid olika confluences. Använda en mängd av superparamagnetiska pärlor i syfte att ha 2 pärlor per cell. Därför är 4 x 10 5 pärlor som behövs för en 60 mm platta.
- Grundligt resuspendera kulorna i originalflaskan genom virvelbildning åtminstone 30 sekunder. Alikvot 40 mikroliter av den återsuspenderade superparamagnetiska pärlor (motsvarande 4 x 10 6 pärlor) och 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Placera röret på en magnetisk separatipå stativ för att separera de magnetiska pärlorna från lösningen. Kassera supernatanten, ta bort röret från den magnetiska separations stativet och återsuspendera pärlorna i 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4.
- Upprepa tvättsteg två gånger med 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4.
- Efter den slutliga tvätten, resuspendera kulorna i 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4.
- Kombinera 100 ug bovint fibronektin (FN) eller någon annan cellvidhäftnings receptorligand till 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4 innehållande pärlor och blanda genom pipettering.
- Upprepa föregående steg genom att ersätta FN eller någon annan specifik ligand med BSA, poly-D-lysin eller apo-transferrin för negativa kontroller.
- Eventuellt, för gelanalys, ta en 10 mikroliter alikvot av ligandlösning för analys av tvärbindningseffektivitet och blanda med en lämplig volym av koncentrerad Laemmli provbuffert.
- Inkubera pärlor med liganden innehållande lösningen för 12-24 timmar vid 37 ° C på en rötor.
- Om pärla aggregat visas efter det att reaktionen har inträffat, Sonikera (kontinuerlig 39 W effekt) högst 10-20 s.
- Isolera pärlorna med hjälp av magnetisk separation stativ, aspirera den återstående lösningen och tillsätt 1 ml av PBS / 0,2% BSA pH 7,6-lösning. Inkubera under 1 h på rotorn vid 37 ° C.
- Tvätta pärlor med användning av en magnet två gånger med 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6. Återsuspendera pärlorna i 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6.
- Sonikera pärlor om aggregat visas för högst 20-30 s.
- Valfritt, ta bort en 10 mikroliter alikvot för att analysera kopplingseffektiviteten genom western blöt (blanda med en lämplig volym av koncentrerad Laemmli provbuffert).
- Fortsätt till cellanalyser eller lagra pärlor vid 4 ° C i upp till en månad.
- Eventuellt kör en SDS-PAGE-gel och fläcken med Coomassie blue för att analysera FN tvärbindning till de magnetiska pärlorna.
2. Tillämpning av dragkrafter på liganden belagda pärlor bundna till adhesionsreceptorer på DorsalYtan av celler
- Kultur vidhäftande celler på 60 mm vävnadsodlingsskål i lämplig odlingsmedium (vanligtvis DMEM 4,5 g / L D-glukos kompletterat med FCS 10%) tills den når 80% konfluens.
- Framställa icke-denaturerande nonjoniska lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,1% NP-40) och kyla mikrocentrifugrör.
- Pelletera ligand-belagda pärlor från avsnitt 1,10 och återsuspendera i 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6. Tillsätt 100 mikroliter av den ligand-belagda pärlor lösningen till 5 ml varmt odlingsmedium och vortexa.
- Aspirera medium i 60 mm odlingsskål och tillsätt 5 ml varm tillväxtmedium kompletterat med pärlor.
- Inkubera i 20 minuter under cellodlingsbetingelser (37 ° C och 5% CO2) för att tillåta pärlorna att sedimentera och vidhäftar till cellerna. Det är viktigt att inte överskrida 20 minuter sedan pärlor kan internaliseras genom fagocytos.
- Eventuellt observera pärlorna under ett ljusmikroskop med hjälp av en 10X eller 20X OBJEctive och kontrollera pärla vidhäftning av något skaka skålen att skilja mellan bundna och rörliga pärlor.
- Samtidigt kulturen skålen i inkubatorn, byta normala skålen lock för ett lock med en rund 38 mm neodymium magnet fäst på den övre ytan. Magneten hålls på plats av två mindre 13 mm neodymmagneter placerade på den undre ytan av locket. Eftersom magneterna är mycket kraftfulla, manipulera dem noga.
- Inkubera celler som utsatts för spänning för de önskade tidpunkterna vid cellodlingsbetingelser (37 ° C och 5% CO2).
- Efter behandling, placera skålen på is och försiktigt aspirera hela mediet från skålen.
- Tillsätt 300 mikroliter av cell-lys-buffert, och inkubera i 10 minuter på is. Samla lysatet med användning av en cellskrapa och överföring till en i förväg kyld 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Pellets de magnetiska pärlorna med hjälp av magnetisk separering stativet och överföra den totala cellysatet till en ny pre-chilled 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förvara denna fraktion vid -20 ° C för vidare analys.
- Tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml iskall lyseringsbuffert. Tillsätt 50 | il Laemmli provbuffert till pärlan pellet, blanda genom pipettering och kokar vid 95 ° C under 5 min med användning av en torr blockvärmare. Denna fraktion innehåller de isolerade vidhäftnings komplex. Fortsätt till biokemisk analys eller förvara vid -20 ° C.
- Från den totala cellysatet erhålls efter pärlor separation (cirka 300 mikroliter), ta bort en 50 mikroliter alikvot för Western blot-analys.
OBS: De 250 mikroliter kvar kan användas för ytterligare biokemiska studier såsom protein-proteininteraktionsstudier (immunoprecipitation, GST rullgardins analyser) eller GTPas aktivitet experiment (förändrar lysisbuffert kan vara nödvändigt beroende på GTPas av intresse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den schematiska av teknik illustreras i figur 1a. Följande ligand konjugering, är magnetiska pärlor inkuberas med cellerna under 20 min, och sedan en permanentmagnet används för att applicera dragkrafter på ca 30-40 pN för olika tid. Figur 1b visar 2,8 fim FN-belagda magnetiska pärlor bundna till MRC5 celladhesionsreceptorer.
Tvättstegen av superparamagnetiska pärlor efter cellys är avgörande och bestämma graden av rening. Ett minimum av tre tvättningar rekommenderas. GADPH immunoblot med långa exponeringar kan vara användbart för att testa renheten hos vidhäftnings komplex (Figur 2a).
FN-belagda pärlor användes för att undersöka mechanotransduction processer som sker över tid på vidhäftnings komplex som svar på spänning. Efter magnetisk separation av vidhäftningen komplexa fraktionen, var lysatet och vidhäftningen komplexa fraktionen analyserades medwestern blöt. Som förväntat, observerade vi Talin, vinkulin och paxillin, men inte GAPDH i vidhäftningskomplex fraktionen även i frånvaro av mekanisk stimulering (Figur 2b). I överensstämmelse med tidigare rapporter 32, 33, utlöste spänning vinkulin rekrytering till vidhäftningskomplex. Även om spänningen inte påverkade paxillin rekrytering till vidhäftnings komplex, dess fosforylering på tyrosin 31 förbättras till följd av mekanisk spänning både i det totala cellysatet och i vidhäftningen komplexa fraktionen.
Figur 1. Beskrivning av metoden. (A) Schematisk illustration av tekniken. Celler först odlas i medium kultur tills önskad konfluens uppnåtts. Då, är superparamagnetiska pärlor tillsätts i 15-20 min. Dragkrafter ca 30-40 pN ärapplicerades sedan med användning av den kalibrerade magnet för olika tid. (B) fibronektinbelagda superparamagnetiska pärlor binda till celladhesionsreceptorer. Cellerna avbildas av faskontrast i genomlysningsmikroskop 15 min efter tillsats av de superparamagnetiska pärlor (vit pil) i medium. (Top bild: Skala bar = 25 pm, nedre bilden: Skalstreck = 100 nm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mekanisk spänning inducerar adhesion mognad. (A) Rening av vidhäftningskomplex. GAPDH immunoblotting används som lastkontroll för totalt cellysat och för att kontrollera renheten hos vidhäftningskomplex. Nitrocellulosamembranet har avbildas med en lång exponering för att visa ee frånvaro av signal i vidhäftning komplexa fraktion. (B) Spänningar inducerar adhesion mognad. Lastkontroll (GAPDH) och kandidater (vinkulin, Talin och paxillin) är kända för att rekryteras eller fosforyleras vid vidhäftnings komplex som svar på mekaniska spänningar är immun. Detta experiment har utförts på MRC5 celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här beskrivna metoden utgör en okomplicerad metod för att anbringa spänning till cellytans vidhäftningsreceptorer och tillåta deras efterföljande rening. Men några steg är avgörande för att utföra en effektiv vidhäftning rening och potentiella optimering kan göras beroende på de riktade vidhäftningsreceptorer. Vi presenterar potentiella problem användaren kan stöta nedan.
Vi använde magnetiska pärlor 2,8 um diameter men större pärlor kan användas, såsom 4,5 um diameter. Dock bör begränsas pärla diameter 2-5 pm eftersom fagocytos kan inträffa snabbare under 30-60 min inkubation och större pärlor har starkare vidhäftning så att pärla förskjutning skulle begränsas under magnetiskt fält 34, 35. Därför är det viktigt att begränsa inkubationstiden till korta perioder och använda den korrekta pärlstorlek. Antalet pärlor inkuberades per cell kommer att påverka mängden av force upplevelse genom en enda cell. Medan man vill att effektivt stimulera celler med spänning, kan alltför många pärlor per cell leda till aktivering av irrelevanta signaleringsvägar. Vi inkubera vanligtvis i genomsnitt två pärlor per cell för FN-belagda pärlor, men denna mängd kan justeras [1 till 5 pärlor per cell] beroende på celltyp och cellytan receptor. Avseende magneten, den här beskrivna metoden används en magnet för vilken den resulterande kraften på en 2,8 | im har mätts (ca 30-40 pN genom att mäta förskjutningen av magnetiska pärlor i outspädd glycerol, en newtonsk vätska med känd viskositet 31, även om det är det möjligt att använda större magneter för att applicera större mängd kraft vid behov. Det är viktigt att notera att dessa magneter är extremt kraftfulla och att manipulera dem noga.
Efter 12-24 h inkubation med ECM-ligand (steg 1,7) såväl som efter 1 h inkubation (steg 1,9) med PBS / 0,2% BSA pH 7,6 buffert, den magnetic mikropärlor kan bilda aggregat. Det är då viktigt att separera pärlor så mycket som möjligt att respektera förhållandet 2 pärlor per cell. Emellertid är det fortfarande godtagbart att ha en 5: 1-förhållande. Pärlor separation kan uppnås antingen genom blandning och pipettering eller genom användning av ultraljudsbehandling, även om under en kort period (20-30 s).
Olika proteiner kan konjugeras till pärlorna, inklusive integrin-ligand (FN, kollagen), rekombinanta proteiner eller antikroppar riktade mot särskilda cellytereceptorer. Fästandet av ligand-belagda magnetiska pärlor till den dorsala cellytan skulle kunna försvagas av den låga kopplingseffektiviteten av liganden på kornen. Det rekommenderas att kontrollera för ligandbindning till kulorna genom att samla en alikvot av den utspädda ligandlösningen före tillsats till pärlorna och en alikvot av pärlor vid slutet av kopplingsprocessen. Dessa alikvoter kan bearbetas för SDS-PAGE-analys och Coomassie blue-färgning.
Om inga förändringar isignalvägar eller förväntade mechanosensing processer detekteras, är det viktigt att överväga olika möjligheter. Ett sätt att identifiera problemet är att modulera hela experimentet med magneten. Det är väl känt att hastigheten för cellulära processer varierar beroende på celltypen som används. Ett annat alternativ skulle vara att testa kända spänningskänsliga molekyler och kontrollera deras post translationella modifieringar genom Western blotting (till exempel paxillin fosforylering eller FAK fosforylering kan analyseras). Den kraft som kan vara också kritisk och användning av en tjockare magnet (samma grad N52) eller större pärlor kan vara ett alternativ. Dessutom kan ligand / receptorbindande effektivitet undersökas genom att analysera vidhäftning komplex och leta efter cellytreceptorer (t.ex. cadherin eller integrin). Cellsammanflytning kan också påverka cellulärt svar på spänning. Eftersom det har observerats att cell / cellvidhäftning kan påverka cellbeteende och cystokeletal förspänning, är det important för att notera att konfluens kan påverka cellulärt svar på spänning. Även om vi rekommenderar 80% konfluens för applicering av spänning till integrin-baserade sammanväxningar, kan olika förhållanden testas för att optimera det experimentella systemet.
Även om denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att dechiffrera spänningen känsliga adhesome samt tillhörande signalvägar, det hade också vissa begränsningar. Först, eftersom det största problemet med hjälp av sådan liten storlek magnetiska pärlor är risken för deras internalisering av cellerna, denna metod kan inte användas för att studera långtids mechanosensitive signalerings cellulära svar som modifierar cell öde såsom differentiering och proliferation. En annan begränsning ligger i vägen för hur krafter appliceras på skiktet av celler i odlingsplattan. Faktiskt, eftersom det magnetiska fältet är alltid högre vid periferin av magneten, kunde krafterna variera vid ytan av odlingsplattan med en minskande gradient av cellsom sträcker sig från periferin till centrum och kan leda till heterogena cellulära svar.
Det förfarande som beskrivs här utgör en enkel och kostnadseffektiv metod som gör det möjligt att studera mechanosensitive cellulära vägar samt att undersöka den molekylära sammansättningen av vidhäftningskomplex som utsätts för spänning. Andra metoder, såsom sträckningsanordning som gäller cykliska påfrestningar på celler, leda till tillämpning av spänning till alla cellytereceptorer som interagerar med den extracellulära matrisen. Den här beskrivna metoden har fördelen av att möjliggöra kraft stimulering av en särskild undergrupp av cellytereceptorer och en stor mängd olika ligander kan användas, såsom integrinligander eller antikroppar riktade mot cellytreceptorer, vilket möjliggör studier av många distinkta mechanosensitive system. En annan fördel med denna metod är att det leder till rening av proteiner komplex som upplevt spänning och att arbeta på bärande elemeNTS som är kända för att spela en central roll i mechanotransduction 36. Det renade vidhäftningskomplex kan också användas för olika biokemiska metoder 14, såsom kinasanalyser för att undersöka kinasaktivitet som svar på spänning, eller aktin polymerisation assay. Dessutom kan detta experimentella system kopplas till magnetiska pincett för att utforska den cellulära mekanisk respons och att korrelera detta svar med de identifierade signalvägar. Intressant nog har magnetoplasmonic nanopartiklar på senare tid använts för att mekaniskt belastnings Notch och E-cadherin med exakt kontroll i tid och rum 37. Denna senaste utvecklingen kan bidra till att utforska mechanosensitive signalvägar med olika rumsliga, tidsmässiga och mekaniska ingångar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
CG stöds av bidrag från Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), från Europeiska unionens sjunde ramprogram (Marie Curie Karriär Integration n˚8304162) och från European Research Council (ERC) under EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogram (ERC Starting Grant n˚639300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al.
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J.
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , San Diego, Calif. (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
