Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Published: March 8, 2017 doi: 10.3791/55330
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute for Advanced Biosciences, Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR
* These authors contributed equally

Summary

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Abstract

Mechanosensitive hücre yüzeyi yapışma kompleksleri hücreler ortamda mekanik özellikleri duyu sağlar. Son zamanlarda yapılan çalışmalar adhezyon bölgelerinin kuvvet algılayıcı molekülleri, ve soy spesifik gen ekspresyonunu düzenleyen ve fenotipik çıktıları sürücü kuvveti bağımlı transkripsiyon faktörlerini belirledik. Ancak, biyokimyasal yollar içine mekanik gerilim dönüştürme sinyal ağları yakalanması zor kalmıştır. hücre yüzey reseptörüne uygulanan mekanik gerilim ile yapan sinyal yollarını araştırmak için, süperparamanyetik mikroboncuklar kullanılabilir. Burada hücre yüzeyi yapışma proteinlerine kuvvetleri uygulamak için, manyetik boncuklar kullanılarak bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, ligand kaplı boncuklara bağlı yapışma kompleksleri manyetik izolasyonu ile, sadece bir güç bağımlı çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar ile sitoplazmik sinyal yollarını ancak yapışma biçimlenme araştırılması mümkündür. Bu protokol ligand-co hazırlanmasını içermektedirated Süperparamanyetik boncuklar ve uygulama biyokimyasal analizler takip gerilme kuvvetleri tanımlar. Ayrıca, integrin tabanlı yapışma uygulanan gerilimin gösteren verilerin temsili numune yapışma biçimlenme tetikler ve protein tirozin fosforilasyonu değiştirir sağlar.

Introduction

Metazoada olarak, mekanik gerilme, proliferasyon, farklılaşma ve canlılık, 1, 2 gibi hücresel süreçleri sayısız düzenleme ile doku gelişimi ve homeostazı yönlendirir. Mekanik gerilim hücre dışı matrisin ortaya çıkabilir veya yapışık hücreler, örnek hücre-dışı matris üzerine çeker ve gerginlik duyarlı moleküllerin yoluyla sertliğini probları aktomiyosin kontraktil makineler yoluyla hücre dışı ortamı ile üretilebilir. gerilime karşılık olarak, mechanosensitive yapışma proteinleri, karmaşık bir sinyal gruplarının tetiklenmesinde uygun değişikliklere uğrar. Buna karşılık, bu sinyal yolları hücre dışı ortama hücresel davranış ayarlar proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma kapsayan bir mechanoresponse orkestra. Bu tür süreçler hızla mekanizmalarının döngü üzerine geri beslemeye (saniye dakika) kısa vadeli bir sürede çözülebilecek mechanosensitive yapıları değiştirerek notransduction. Örneğin, integrin göre yapışıklık Rho GTPaz aracılı hücre iskeleti yeniden 3, 4, 5 arasındaki gerilim yanıt olarak güçlendirir. Buna paralel olarak, diğer sinyal yollarının sonunda hücre kaderi 6 etkileyen genetik programları kontrol etmek için saat ve gün içinde aktif hale getirilir. Birçok çalışma, hücre determinizm ve hastalık gelişimi 1, 2 matris sertlik etkisini vurgulamıştır Oysa, yapışma aracılı mechanotransduction kesin moleküler mekanizmalar hala zor kalır.

Çeşitli yaklaşımlar, akış sistemleri, flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) -tension sensörleri 7 de dahil olmak üzere hücre davranışı hücre tarafından üretilen kuvvetler veya dış kuvvetlerin etkilerini incelemek için geliştirilmiştirlass = "xref"> 8 uyumlu yüzeyler 9, manyetik cımbız, optik cımbız 10 ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 11. Burada belirli bir yapışma reseptörleri uygulanan gerilme kuvvetlerine karşılık olarak mechanotransduction yolları karakterize süperparamanyetik boncuklar kullanılarak, bir protokol mevcut. Süperparamanyetik boncuklar bir manyetik alan içine konulduğunda, tersine çevrilebilir manyetize parçacıklardır. Bir kez özel bir reseptör için bir ligand ile kaplı, bu boncuklar hücre dışı bir güç uygulamanın etkilerini incelemek için güçlü bir araç sunar. Bu yöntem bazı çalışmalarda 3, 5, 12 ile onaylandı - 17 ve büyük ölçüde yapışık hücreleri üzerinde biyokimyasal analizi kolaylaştırmak için avantaj sunuyoruz. Biyokimyasal analizi ile takip benzer kollajen kaplı manyetik boncuklar kullanılarak, erken iş bir artış olduğunu bildirdigerilim 5, 18, 19 karşılık olarak protein tirozin fosforilasyon ve RhoA aktivasyonu. Aşağıda tarif edilen yöntem, aynı zamanda integrin 3 uygulanan gerilimden aşağı sinyalleme yolunu tanımlamak için fibronektin (FN) kaplı boncuklar ile kullanılmıştır. Bu çalışmada, Guilluy ve ark. gerginlik integrin yapışma kompleksleri iki guanin nükleotid değişim faktörleri (gefs), LARG ve GEF-H1, işe yoluyla RhoA aktive olduğunu gösterdi. Bu yana, diğer çalışmalar GEF-H1, burada açıklanan metodolojiye sağlamlığını gösteren farklı yöntemler 20, 21 kullanılarak hücre tarafından üretilen gerilim yanıt olarak yapışma kompleksleri için işe olduğunu göstermiştir. Bunun bir sonucu olarak, aktive edilmiş RhoA sitoskeletal yeniden ile, yapışma takviye sağladığı gösterilmiştir. Bu sistem, aynı zamanda gerilim tatbik t araştırmak için kullanıldıHücre / hücre adezyon reseptörleri o. İntegrin ilişkili adhezyon kompleksleri 12 benzer vinkulin işe bir artışa neden olmadan E-kaderin hücre dışı kaplanmış manyetik boncuklar üzerine kuvvetlerinin uygulanması. Collins ve arkadaşları PECAM-1 integrin teşvik ve RhoA aktivasyonu 13 gerginlik bu uygulama görülmektedir. manyetik boncuklar kullanarak başka deneysel bir yaklaşım izole çekirdekleri uygulanan gerilim çalışmadır. Nesprin-1 çekirdek zarı proteine karşı antikorlarla kaplanmış boncuklar kullanılarak, çekirdek zarı kompleksleri dinamik mekanik gerilim 22 yanıt olarak ayarlanır olduğunu göstermek için saflaştırılmıştır. Bu sonuçlar, mechanotransduction yollarının çalışmada bu yöntemin güçlülüğü destekler. Akış veya çekme kuvveti sistemleri genel olarak hücresel işlemleri teşvik Dahası, manyetik boncuk özel reseptör ligandları kullanarak, bir hücre yapışma reseptörünü hedefleyen 13, 15 karşı monoklonal antikorlar.

Bu yöntemin diğer bir avantajı, basit bir bağ afinite saflaştırma prosedürü ile yapışma komplekslerinin izolasyondur. İyi hücrelere ligand kaplı boncuklar ilave yapışma reseptörleri bağlayan ve çeşitli yapışma proteinlerinin 23 alımı uyardığı bilinmektedir. Ligand kaplı manyetik boncuklar kuvvetlerin daha uygulaması 24, farklı gerilim bağımlı sinyalleme yolunu 4 aracılık makromoleküler platformlara bu yapışma kompleksleri döner. Bir mıknatıs kullanılarak kordon konsantrasyon izledi hücre liziz yapışma platformları izolasyonunu mümkün kılar. adezyon kompleksleri saflaştırmak için kullanılan diğer yöntemler, daha önce yapışkan hücreler kullanılmaktadır. Bunlar protein-protein etkileşimlerini muhafaza etmek için kimyasal çapraz-bağlanmasını birleştirirve deterjan ve kesme akış veya sonikasyon 20, 21, 25, 26, 27, 28, bir hücre parçalama adımı. Son adım yapışma kompleksleri içeren nihai ventral plazma zarlarının topluluğudur. Bu yöntemlerden farklı olarak, manyetik boncuk seçici adezyon reseptörlerinin özel bir ailesi hedef hücre yapışması kompleksleri daha büyük bir saflaştırma seviyesi sağlar. Manyetik boncuklar daha önce ligand kaplı mikro-29, 30 bağlı yapışmayan hücreler adezyon kompleksleri saflaştırılması için kullanılmıştır. kuvvet, kısa sürekli bir süre (dakika saniye) uygulanır taklit biyolojik durumlar aşağıda açıklanan yöntem. Bu nedenle, arıtılmış yapışma komplekslerinin moleküler kompozisyonu hem de soruşturma için güçlü bir araç sağlar veaşağı mechanosensitive-sinyal yolları.

Burada yapışma yüzey proteinlerine gerilme kuvvetlerinin uygulamak için manyetik boncuklar kullanılarak için ayrıntılı bir deneysel protokol mevcut. Kalıcı Neodimyum mıknatıs kültür çanak yüzeyinin üstüne yerleştirilir. Tek bir 2.8 mikron manyetik boncuk kuvvet sabiti (yaklaşık 30-40 pN) 31 böylece mıknatıs kutup yüzü 6 mm yükseklikte yer almaktadır. Germe uyarım süresi çıkar ve aktivasyon zamanı ölçekli molekülüne bağlı olarak operatör tarafından belirlenir. Hücreler nihayet yapışma kompleksleri bir mıknatıs kullanarak boncuk ayırma ile saflaştırılmış ve biyokimyasal analizler işlenir, parçalanır. Bu protokol, ligand kaplamalı süperparamanyetik tanelerin hazırlanması ve biyokimyasal analizler, ardından Mıknatıs gerilim uygulanmasını içerir. Ayrıca, integrin tabanlı ADH uygulanan bu gerilim gösteren bir veri temsil eden örnek sunmakesions yapışma biçimlenme indükler ve protein tirosin fosforilasyonunu değiştirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Manyetik Boncuk 1. Ligand Konjugasyon

Not: Ligand konjügasyon 2.8 mikron çapında olan süperparamanyetik tosil-aktive boncuklar kullanılarak gerçekleştirilir (stok çözelti konsantrasyonu 10 8 boncuk / mL, 30 mg tane / mL) eklenmiştir. Aşağıdaki protokol, bir 60 mm doku kültürü plakası içinde% 80 konfluansa büyütülmüş MRC-5 hücreleri için uygun, yaklaşık 2 x 10 5 hücre, örnekleri dayanır. buna göre farklı akışlar farklı boyutlarda veya hücre plakaları kullanılması durumunda boncuk ve reaktiflerin ses seviyesini ayarlayın. hücre başına 2 boncuk olması için süperparamanyetik tanelerin miktarının kullanılması. Bu nedenle, 4 x 10 5 boncuk 60 mm tabak için ihtiyaç vardır.

  1. İyice en az 30 sn vorteks orijinal flakon boncuk tekrar süspansiyon. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne (4 x 10 6 boncuk karşılık gelir) yeniden süspansiyon haline getirilmiş süperparamanyetik tanelerin kısım 40 uL.
  2. Manyetik separati tüp yerleştirinçözeltiden manyetik boncuklar ayırmak için stand. Süpernatantı atın manyetik ayırma standından tüp kaldırmak ve 1 ml 0.1 M Na-fosfat pH 7.4 boncuklar tekrar süspansiyon.
    1. 1 ml 0.1 M Na-fosfat, pH 7.4 ile iki kez tekrar yıkama aşaması.
  3. Son yıkamadan sonra, 1 ml 0.1 M Na-fosfat, pH 7.4 içinde yeniden süspanse boncuklar.
  4. Kombine 100 ug Sığır fibronektin (FN) ya da boncukları içeren 1 ml 0.1 M Na-fosfat, pH 7.4'e başka hücre yapışma reseptörü ligandı ve pipetleme karıştırın.
  5. FN veya negatif kontroller için BSA, poli-D-lisin ya da apo-transferin ile başka bir spesifik ligand yerine önceki adımları tekrarlayın.
  6. İsteğe bağlı olarak, jel analizi için, çapraz bağlama verimliliği analizi için ligand solüsyonu 10 uL kısım almak ve konsantre edilerek Laemmli numune tamponu uygun bir hacmi ile karıştırılır.
  7. Bir rotor üzerinde, 37 ° C'de 12-24 saat boyunca ligand ihtiva eden çözelti ile boncuk inkübe edin.
  8. Reaksiyon fazla 10-20 saniye boyunca, sonikasyon (sürekli 39 W güç) oluştuktan sonra boncuk agrega görünüyorsa.
  9. manyetik ayırma standı kullanarak boncuk izole kalan çözelti aspire ve 1 mL PBS /% 0.2 BSA pH 7.6 çözümü ekleyin. 37 ° C 'de, rotor üzerindeki 1 saat süreyle inkübe edin.
  10. 1 ml PBS /% 0.2 BSA, pH 7.6 ile iki kez bir mıknatıs kullanılarak boncuk yıkayın. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse boncuk /% 0.2 BSA, pH 7.6.
  11. Sonikasyon boncuk agrega fazla 20-30 saniyeden görünüyorsa.
  12. İsteğe bağlı olarak, Western blot ile bağlanma verimliliğini analiz etmek için bir 10 uL numuneyi çıkarın (konsantre Laemmli numune tamponu uygun bir hacmi ile karıştırıldı).
  13. kadar 1 ay boyunca 4 ° C'de deneyleri veya mağaza boncuk hücre geçin.
  14. İsteğe bağlı olarak, manyetik boncuk FN çapraz bağlanmasını analiz etmek için, Coomassie mavisi ile SDS-PAGE jeli ve leke çalıştırın.

Dorsal üzerinde yapışma reseptörlerine Bound Ligandla kaplı Boncuk üzerinde gerilme kuvvetlerinin 2. UygulamaHücreler yüzey

  1. Uygun büyüme ortamı içinde 60 mm doku kültürü çanağı üzerinde kültürü yapışan hücreler% 80 konfluent elde edilene kadar (genellikle DMEM 4.5 g / L D-glikoz FCS,% 10 ile takviye edilmiş).
  2. Denatüre edici olmayan iyonik olmayan liziz tamponu (20 mM Tris HCI pH 7.6, 150 mM NaCI, 2 mM MgCI2,% 0.1 NP-40) ve soğuk mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın.
  3. 1 ml PBS içinde bölümü 1.10 ve tekrar süspansiyon ligand kaplı boncuklar Pelet /% 0.2 BSA, pH 7.6. sıcak kültür ortamı ve vorteks 5 mL ligand kaplı boncuklar çözeltisi 100 uL ekleyin.
  4. Aspire 60 mm kültür çanak orta ve 5 mL boncuk ile desteklenmiş sıcak büyüme ortamı ekleyin.
  5. Hücre kültürü koşulları altında 20 dakika boyunca (37 ° C ve% 5 CO2) Taneler, tortu ve hücrelere yapışmasının sağlanması için inkübe edin. Boncuk fagositoz ile içselleştirilmiş olabilir çünkü 20 dk aşmaması için çok önemlidir.
  6. İsteğe bağlı olarak, 10X veya 20X obje kullanarak ışık mikroskobu altında boncuk gözlemlemekctive ve hafif takılı ve yüzer boncuk arasında ayrım çanak sallayarak boncuk yapışması için kontrol edin.
  7. inkübatör kültür çanak tutarken, üst yüzünde bağlı bir yuvarlak 38 mm neodimyum mıknatıs ile bir kapak normal çanak kapağı takas. Mıknatıs kapağın alt yüzü üzerine yerleştirilmiş iki küçük 13 mm neodimyum mıknatıslar tarafından yerinde tutulur. mıknatıslar çok güçlü olduğundan, bunları dikkatli bir şekilde manipüle.
  8. Hücre kültürü şartlarında arzu edilen bir zaman noktası için bir gerilim (37 ° C ve% 5 CO2) maruz hücreler inkübe edin.
  9. Tedaviden sonra, buz üzerinde çanak yerleştirin ve dikkatlice çanak tüm orta aspire.
  10. Hücre lisis tamponu 300 uL ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. Önceden soğutulmuş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne bir hücre kazıyıcı ve transfer kullanarak lizat toplayın.
  11. manyetik ayırma standı kullanarak manyetik boncuk pelet ve yeni bir ön-chill toplam hücre lizatı transferi1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ed. daha fazla analiz için -20 ° C'de Bu fraksiyon saklayın.
  12. 1 ml buzla soğutulmuş lizis tamponu ile boncuk 3 kez yıkayın. , Boncuk pelet 50 uL Laemmli numune tamponu ekleyin kuru blok ısıtıcı kullanılarak 5 dakika boyunca 95 ° C 'de pipetleme ve kaynatın karıştırılır. Bu fraksiyon izole yapışma kompleksleri içerir. -20 ° C'de biyokimyasal analiz veya saklamak için devam edin.
  13. Boncuklar ayırma (yaklaşık 300 uL) sonra elde edilen toplam hücre lizatından, Western blot analizi için, 50 uL numuneyi çıkarın.
    NOT: Bu protein-protein etkileşimi çalışmaları (immüno GST açılan tahlilleri) işaretlenebilir veya GTPaz aktivitesi deneyleri gibi başka biyokimyasal çalışmalar için kullanılan sol 250 uL (lizis tamponu değiştirmek ilgi GTPaz bağlı olarak gerekli olabilir).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tekniğin şematik Şekil 1a'da gösterilmektedir. Ligand konjugasyon sonra, manyetik boncuk 20 dakika için hücreler ile kuluçkalanmıştır, ve daha sonra, kalıcı bir mıknatısın, çeşitli zaman miktarı için yaklaşık 30-40 pN gerilme kuvvetleri uygulamak için kullanılır. Şekil 1b MRC5 hücre yapışma reseptörlerine bağlanan 2.8 um FN-kaplı manyetik boncuklar gösterir.

Hücre Parçalama işleminden sonra Süperparamanyetik boncuk yıkama aşamaları çok önemlidir ve arıtma derecesini belirler. Üç yıkamadan en az tavsiye edilir. Uzun pozlama ile GADPH immünblotlarında yapışma kompleksleri saflığını (Şekil 2a) test etmek için yararlı olabilir.

FN-kaplanmış boncuklar gerilime karşılık olarak yapışma kompleksleri zaman içinde meydana mechanotransduction işlemlerini incelemek için kullanılmıştır. yapışma karmaşık fraksiyonun manyetik ayırma sonra, lizat ve yapışma karmaşık fraksiyon tarafından analiz edildiWestern blot. Beklendiği gibi, hatta, mekanik uyarma ile (Şekil 2b) yokluğunda adezyon kompleksleri fraksiyonu Talin, vinkülin ve paxillin ancak GAPDH görülmektedir. Daha önceki raporlarda 32 ile uyumlu olarak, 33, gerginlik yapışma kompleksleri vinkulin işe tetikledi. Germe yapışma komplekslerine paxillin işe etki yoktu, tirozin 31 üzerinde fosforilasyon toplam hücre lizatı ve adezyon kompleksi fraksiyon hem de mekanik gerilim yanıt olarak geliştirilmiştir.

Şekil 1
Yöntemin 1. Açıklama Şekil. (A) tekniğinin şematik gösterimi. İstenen kaynaşma elde edilene kadar hücreler öncelikle kültür ortamı içinde kültürlenir. Daha sonra, süperparamanyetik taneler 15-20 dakika boyunca ilave edilir. Çekme kuvvetleri yaklaşık 30-40 pN vardırDaha sonra farklı zaman miktarı için kalibre mıknatıs kullanarak uyguladı. (B) fibronektin kaplı süperparamanyetik boncuklar hücre yapışma reseptörlerine bağlanır. Hücreler ortamda Süperparamanyetik boncuk (beyaz ok) eklendikten sonra iletilen ışık mikroskobu 15 dakika faz kontrast tarafından görüntülenmiş. (Üst resim: Ölçek çubuğu = 25 mikron, alt resim: Ölçek çubuğu = 100 mikron) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 1
Şekil 2. mekanik gerilim yapışma olgunlaşmasını indükler. Adezyon kompleksleri (A) saflaştırma. GAPDH immünoblot toplam hücre lizatı için yükleme kontrolü olarak kullanılır ve yapışma kompleksleri saflığını kontrol etmek için. nitroselüloz membran th göstermek için uzun bir pozlama kullanılarak görüntülendi olmuşturyapışma karmaşık fraksiyonunda sinyalin e yokluğu. (B) Gerilim yapışma olgunlaşmasını uyarır. Yükleme kontrol (GAPDH) ve mekanik gerilmeye cevap olarak işe ya da yapışma kompleksleri fosforile olduğu bilinen aday (vinkülin Talin ve paxillin) bağışık lekelenmesi edilir. Bu deney, MRC5 hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tarif edilen yöntem, hücre yüzeyi yapışma reseptörlerine gerilim uygulamak ve daha sonra saflaştırmaya olanak sağlamak üzere basit bir yaklaşım oluşturmaktadır. Ancak, bazı adımlar hedeflenen yapışma reseptörleri bağlı verimli yapışma arıtma ve potansiyel iyileştirme yapılabilir gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir. Biz kullanıcı aşağıda karşılaşabileceğiniz olası sorunları sunuyoruz.

Bu 2.8 mikron çapında manyetik boncuklar kullanılabilir, ancak daha büyük taneler gibi 4.5 mikron çapında kullanılabilir. Fagositoz 30-60 dakika inkübasyon sırasında daha hızlı ortaya çıkabilir ve bu boncuk deplasman manyetik alan 34, 35 altında sınırlı olacaktır böylece büyük boncuk güçlü yapışma beri Ancak, boncuk çapı 2-5 mikron sınırlı olmalıdır. Nedenle, kısa süreler için inkübasyon süresi sınırlamak ve uygun boncuk boyutunu kullanmak önemlidir. Hücre başına kuluçkalanmış boncuk sayısı f miktarını etkileyecekTek bir hücre tarafından orce deneyim. Bir etkin gerilim ve hücreleri uyarır ister birlikte, hücre başına çok fazla boncuk alakasız sinyal yollarının aktivasyonu neden olabilir. Genellikle FN-kaplanmış boncuklar için, hücre başına iki boncuk ortalama inkübe, ancak bu miktar, hücre tipi, hücre yüzey reseptörüne bağlı olarak [1 ila 5 boncuklar hücre başına] ayarlanabilir. Mıknatıs ile ilgili olarak, burada açıklanan yöntem, bunun, ancak, seyreltilmemiş gliserol, bilinen viskozitesi 31 Bir Newtonyen sıvı manyetik boncuk yer değiştirme ölçümü ile 2.8 um nihai kuvvet (yaklaşık 30-40 pN ölçülmüştür olan bir mıknatıs kullanılmaktadır mümkün gerekirse kuvvet daha fazla miktarda uygulamak için büyük mıknatıslar kullanmak. mıknatıslar son derece güçlü olduğunu not etmek ve bunları dikkatle işlemek için önemlidir.

ayrıca, PBS /% 0.2 BSA, pH 7.6 tampon maddesi ile 1 saat kuluçkadan (aşama 1.9) sonra, ECM ligand (aşama 1.7), m 12-24 saat kuluçkadan sonraagnetic mikroboncuklarının agrega oluşturabilir. Hücre başına 2 boncuk oranı saygı mümkün olduğu kadar boncuk ayırmak için kritik öneme sahiptir. : 1 oranını Bununla birlikte, yine de, 5 olması kabul edilebilir. Boncuk ayrılması, karıştırılması ve pipetleme veya sonikasyon kullanılarak da elde edilebilir, ancak kısa bir süre (20-30 s) dir.

Çeşitli proteinler, integrin ligandı (FN, kolajen), spesifik hücre yüzey reseptörlerine hedef rekombinant proteinlerin veya antikorlar da dahil olmak üzere boncuklar, konjuge edilebilir. Dorsal hücre yüzeyine ligand kaplı manyetik boncuklar bağlanma boncuklar üzerine ligandın düşük bir bağlanma etkisine zayıflamış olabilir. Boncuk ve birleştirme işleminin sonunda tanelerin bir kısım eklenmeden önce seyreltildi ligand çözeltisi bir kısım toplayarak tanelere ligand kontrol etmek için önerilmektedir. Bu bölümler, SDS-PAGE analizi ve Coomassie Blue lekelemesi ile işlenebilir.

Hiçbir değişiklik varsayollar veya tespit edildiği beklenen mechanosensing süreçleri sinyalizasyon, farklı olasılıkları dikkate almak önemlidir. sorunu tanımlamak için bir yolu mıknatıslı deney süresini modüle etmektir. Hücresel süreçlerin hızı kullanılan hücre türüne göre değişir bilinmektedir. Başka bir seçenek bilinen gerginlik duyarlı molekülleri test etmek ve blotlama batılı kendi sonrası translasyonel modifikasyonlar kontrol etmek olacaktır (örneğin paxillin fosforilasyon veya FAK fosforilasyonu için analiz edilebilir). kuvvet miktarı da kritik bir seçenek olabilir kalın bir mıknatıs (aynı sınıf N52) veya daha büyük boncuklar kullanarak olabilir. Buna ek olarak, ligand / reseptör bağlanma etkinliği analiz yapışma kompleksi tarafından araştırılmıştır (örneğin, cadherin veya integrin gibi) hücre yüzeyi reseptörleri için bir nokta olabilir. Hücre confluency da gerginlik hücresel cevabı etkileyebilir. Bu hücre davranışını ve cystokeletal ön gerilimi etkiler, hücre / hücre yapışmasını gözlenmiştir gibi, önemli olduğuna inanılmaktadırt confluency gerginlik hücresel cevabı etkileyebilir unutmayın. Bu integrin göre yapışıklıklar gerilim uygulanması için% 80 konfluent tavsiye olsa da, farklı koşullar, deney sistemi optimize etmek için test edilebilir.

Bu yöntem gerginlik duyarlı adhesome yanı sıra ilişkili sinyal yollarını deşifre etmek için güçlü bir araç sağlar olsa da bazı sınırlamalar vardı. Bu tür küçük boyutlu manyetik boncuklar kullanılarak ana endişe hücrelerin kendi içselleştirme riski olduğu İlk olarak, bu yöntem, farklılaşması ve proliferasyonu gibi hücre kaderine değiştirme uzun süreli mechanosensitive sinyal hücresel yanıtları çalışmak için kullanılamaz. Diğer bir kısıtlama kuvvetleri kültür plakasının hücre tabakasına uygulanan ne şekilde yer alır. Manyetik alan mıknatısın çevresinde her zaman daha yüksek olduğu için Nitekim, kuvvetler hücrenin azalan bir gradyanı ile kültür plakasının yüzeyinde değişebilirÇevreden merkeze doğru uzanan ve heterojen hücresel yanıtları yol açabilir.

Burada tarif edilen prosedür mechanosensitive yolakları okuyan ve gerilmeye tabi yapışma kompleksleri moleküler bileşim araştıran sağlayan bir basit ve uygun maliyetli bir yöntem teşkil etmektedir. bu hücrelerin siklik suşu uygulanır germe aygıtının gibi diğer yaklaşımlar, hücre dışı matriks ile etkileşen tüm hücre yüzeyi reseptörlerine gerilim uygulanmasına yol açar. Burada tarif edilen yöntem bu, ligandları veya hücre yüzey reseptörlerini hedefleyen antikorları integrin çok belirgin mechanosensitive sistemlerinin çalışma izin olarak kullanılabilir hücre yüzeyi reseptörlerinin özel bir alt-grup ve ligandların büyük bir çeşitlilik kuvveti uyarımını sağlamak gibi bir avantajı vardır. Bu yöntemin diğer bir avantajı, bu gerilim deneyimli eleme yük taşıyıcı üzerinde çalışmak için proteinlerin kompleksleri saflaştırma yol açmasıdırbilinen NTS mechanotransduction 36 merkezi bir rol oynamaktadır. Saflaştırılmış yapışma kompleksi de gerilim ya da aktin polimerizasyon deneyinde yanıt olarak kinaz aktivitesini araştırmak örneğin kinaz tahlilleri gibi çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar 14 için kullanılabilir. Ek olarak, bu deney sistemi selüler mekanik yanıtını keşfetmek için ve belirlenen sinyal yolları ile yanıt ilişkili manyetik cımbız ile akuple edilebilir. İlginçtir, magnetoplasmonic nanopartiküller zaman ve mekan 37 hassas kontrolü ile yük Notch ve E-kaderin mekanik olarak son zamanlarda kullanılmıştır. Bu son gelişme, farklı, uzamsal zamansal ve mekanik girişli mechanosensitive sinyal yollar keşfetmek yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.

Acknowledgments

CG, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), (Marie Curie Kariyer Entegrasyon n˚8304162) ve Avrupa Birliği'nin Horizon kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) hibe tarafından desteklenmektedir 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC Başlangıç ​​Hibe n˚639300).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) K&J Magnetics, Inc DX88-N52 grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) K&J Magnetics, Inc D84PC-BLK grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated 
Dynabeads M280 Tosylactivated Thermofisher 14203 superparamagnetic beads 
DynaMag-2 Magnet Thermofisher 12321D
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG
Apo-Transferrin Sigma-Aldrich T1428-50MG Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate  Life Technologies 31966-021 DMEM+GlutaMAX-I 500 ml 
60*15 mm culture dish Falcon 353004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
  3. Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
  4. Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
  5. Zhao, X. -H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
  6. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  7. Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
  8. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  9. Pelham, R. J., Wang, Y. l Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  10. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  11. Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
  12. Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
  13. Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
  14. Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
  15. Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
  16. Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
  17. Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
  18. Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
  19. Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
  20. Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
  21. Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
  22. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
  23. Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
  24. Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
  25. Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
  26. Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
  27. Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
  28. Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
  29. Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
  30. Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
  31. Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , San Diego, Calif. (2015).
  32. Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
  33. Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
  34. Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
  35. Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
  36. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  37. Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 121 Mechanostransduction yapışma kompleksi manyetik boncuklar kuvvet integrin mekanik gerilim hücre dışı matriks
Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Millon-Frémillon, A., Aureille, … More

Millon-Frémillon, A., Aureille, J., Guilluy, C. Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads. J. Vis. Exp. (121), e55330, doi:10.3791/55330 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter