Summary
कोशिका की सतह आसंजन, mechanotransduction में केंद्रीय हैं के रूप में वे यांत्रिक तनाव संचारित और संकेतन ऊतक homeostasis और विकास में शामिल रास्ते आरंभ करें। यहाँ, हम जैव रासायनिक मार्ग है कि तनाव के जवाब में सक्रिय कर रहे हैं विदारक, ligand लेपित चुंबकीय microbeads और आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए बल प्रयोग करने के लिए आवेदन एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Abstract
Mechanosensitive कोशिका की सतह आसंजन परिसरों कोशिकाओं वे अपने आसपास के यांत्रिक गुणों भावना के लिए अनुमति देते हैं। हाल के अध्ययनों से आसंजन स्थलों पर बल संवेदन अणुओं, और बल पर निर्भर प्रतिलेखन कारक है कि वंश विशेष जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने और प्ररूपी outputs ड्राइव दोनों की पहचान की है। हालांकि, जैव रासायनिक रास्ते में यांत्रिक तनाव परिवर्तित संकेतन नेटवर्क मायावी बनी हुई है। सिगनल कोशिका की सतह रिसेप्टर के लिए लागू यांत्रिक तनाव पर लगे हुए रास्ते का पता लगाने के लिए, superparamagnetic microbeads इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम कोशिका की सतह आसंजन प्रोटीन के लिए बलों को लागू करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, यह आसंजन ligand लिपटे मोतियों से जुड़ी परिसरों के चुंबकीय अलगाव द्वारा विभिन्न जैव रासायनिक दृष्टिकोण से न केवल बल पर निर्भर cytoplasmic संकेत दे रास्ते, लेकिन यह भी आसंजन remodeling जांच करने के लिए संभव है। इस प्रोटोकॉल ligand-सह की तैयारी भी शामिलपैदा superparamagnetic मोती, और के आवेदन जैव रासायनिक विश्लेषण के द्वारा पीछा तन्य बलों को परिभाषित। इसके अतिरिक्त, हम चाहते हैं कि तनाव इंटीग्रिन आधारित आसंजन के लिए आवेदन किया प्रदर्शन कर डेटा का एक प्रतिनिधि नमूने आसंजन remodeling से चलाता है और प्रोटीन tyrosine फोस्फोराइलेशन बदल प्रदान करते हैं।
Introduction
Metazoa में, यांत्रिक तनाव इस तरह के प्रसार, भेदभाव और अस्तित्व 1, 2 के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक बहुत बड़ी संख्या के विनियमन के माध्यम से ऊतक विकास और homeostasis निर्देशन। यांत्रिक तनाव बाह्य मैट्रिक्स से पैदा कर सकते हैं या पक्षपाती कोशिकाओं है, जो नमूना actomyosin सिकुड़ा मशीनरी है कि बाह्य मैट्रिक्स पर खींचती है और तनाव के प्रति संवेदनशील अणुओं के माध्यम से अपनी कठोरता जांच के माध्यम से अपने बाह्य वातावरण के द्वारा उत्पन्न की जा सकती है। तनाव के जवाब में, mechanosensitive आसंजन प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन है कि जटिल cascades संकेत ट्रिगर से गुजरना। बदले में, इन संकेत दे रास्ते कि बाह्य वातावरण के लिए सेलुलर व्यवहार समायोजित कर एक mechanoresponse शामिल प्रसार, भेदभाव और अस्तित्व आर्केस्ट्रा। ऐसी प्रक्रियाओं (मिनट के लिए सेकंड) एक अल्पकालिक समय अवधि में बसे जा सकता है जल्दी व्यवस्था के पाश पर वापस करने के लिए फ़ीड mechanosensitive संरचनाओं को संशोधित करके notransduction। उदाहरण के लिए, इंटीग्रिन आधारित adhesions रो GTPase की मध्यस्थता cytoskeletal remodeling 3, 4, 5 के माध्यम से तनाव के जवाब में सुदृढ़। समानांतर में, अन्य संकेत दे रास्ते घंटे और दिन आनुवंशिक प्रोग्राम है कि अंततः सेल भाग्य 6 प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए अधिक सक्रिय कर रहे हैं। जबकि, कई अध्ययनों सेल नियतिवाद और रोग के विकास 1, 2 पर मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव पर प्रकाश डाला है, आसंजन की मध्यस्थता mechanotransduction की सटीक आणविक तंत्र अभी भी मायावी रहते हैं।
विभिन्न दृष्टिकोणों सेल व्यवहार पर सेल उत्पन्न बलों या बाहरी ताकतों प्रवाह प्रणाली, प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) -tension सेंसर 7 सहित, के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है,लड़की = "xref"> 8, आज्ञाकारी substrates 9, चुंबकीय चिमटी, ऑप्टिकल चिमटी 10 और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 11। यहाँ हम विशिष्ट आसंजन रिसेप्टर्स के लिए लागू खिंचाव या तनाव बलों के जवाब में mechanotransduction रास्ते को चिह्नित करने superparamagnetic मोती का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। Superparamagnetic मोती कणों जब एक चुंबकीय क्षेत्र में रखा गया है कि reversibly आकृष्ट कर रहे हैं। एक बार एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए एक ligand के साथ लेपित, इन मोतियों बाह्य बल आवेदन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं। इस विधि के कई अध्ययनों से 3, 5, 12 से मान्य किया गया है - 17 और लाभ पेश काफी हद तक पक्षपाती कोशिकाओं पर जैव रासायनिक विश्लेषण की सुविधा के लिए। इसी तरह के कोलेजन लेपित चुंबकीय जैव रासायनिक विश्लेषण के बाद मोती का प्रयोग, जल्दी काम में वृद्धि की सूचना दीप्रोटीन tyrosine फोस्फोराइलेशन और तनाव 5, 18, 19 के जवाब में RhoA सक्रियण। नीचे वर्णित विधि भी इंटेग्रिन 3 के लिए लागू तनाव से नीचे की ओर संकेत दे रास्ते को चिह्नित करने फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन) लेपित मोतियों के साथ इस्तेमाल किया गया है। इस अध्ययन में, Guilluy एट अल। पता चला है कि तनाव दो गुआनिन न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारकों (GEFs), LARG और जीईएफ-एच 1, इंटीग्रिन आसंजन परिसरों की भर्ती के माध्यम से RhoA को सक्रिय करता है। उस के बाद से, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि जीईएफ-H1 विभिन्न तरीकों 20, 21 का उपयोग कर, कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित की मजबूती का प्रदर्शन सेल उत्पन्न तनाव के जवाब में आसंजन परिसरों के लिए भर्ती किया गया है। नतीजतन, सक्रिय RhoA cytoskeletal remodeling के माध्यम से, आसंजन सुदृढीकरण बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था। इस प्रणाली को भी लागू किया तनाव टी पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया थाओ सेल / सेल आसंजन रिसेप्टर्स। ई cadherin के बाह्य डोमेन इंटीग्रिन जुड़े आसंजन परिसरों 12 को इसी तरह से vinculin भर्ती में वृद्धि प्रेरित साथ लेपित चुंबकीय मोती पर बलों के आवेदन। कोलिन्स और उनके सहयोगियों PECAM-1 इंटीग्रिन बढ़ावा देता है और RhoA सक्रियण से 13 तनाव की है कि आवेदन मनाया। चुंबकीय मोतियों का उपयोग एक और प्रयोगात्मक दृष्टिकोण तनाव का अध्ययन पृथक नाभिक के लिए आवेदन किया है। परमाणु लिफाफा प्रोटीन nesprin -1 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लिपटे मोतियों का उपयोग करना, परमाणु लिफाफा परिसरों को दिखाने के लिए कि वे गतिशील यांत्रिक तनाव 22 के जवाब में विनियमित रहे हैं शुद्ध किया गया। इन परिणामों के mechanotransduction रास्ते के अध्ययन में इस विधि का powerfulness समर्थन करते हैं। इसके अलावा, जबकि प्रवाह या कर्षण बल सिस्टम सामान्य सेलुलर प्रक्रियाओं को बढ़ावा, चुंबकीय मोती विशेष रूप से एक कोशिका आसंजन रिसेप्टर या तो रिसेप्टर ligands का उपयोग करके लक्ष्य
इस पद्धति का एक और लाभ यह एक सीधा ligand आत्मीयता शुद्धि प्रक्रिया के माध्यम से आसंजन परिसरों के अलगाव है। यह सर्वविदित है कि कोशिकाओं के लिए ligand लिपटे मोतियों के अलावा आसंजन रिसेप्टर्स बांधता है और कई आसंजन प्रोटीन 23 की भर्ती लाती है। Ligand लेपित चुंबकीय मोतियों के लिए बलों के आगे आवेदन macromolecular प्लेटफॉर्म है कि विभिन्न तनाव पर निर्भर संकेत दे रास्ते 4 मध्यस्थता, 24 में इन आसंजन परिसरों बदल जाता है। सेल एक चुंबक का उपयोग मनका एकाग्रता के द्वारा पीछा आसंजन प्लेटफार्मों के अलगाव परमिट। आसंजन परिसरों को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों पहले से ही पक्षपाती कोशिकाओं में इस्तेमाल किया गया है। वे प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के संरक्षण के लिए रासायनिक crosslinking गठबंधनऔर डिटर्जेंट और कतरनी प्रवाह या sonication 20, 21, 25, 26, 27, 28 से एक सेल कदम है। अंतिम चरण के आसंजन परिसरों युक्त जिसके परिणामस्वरूप उदर प्लाज्मा झिल्ली का संग्रह है। इन विधियों के विपरीत, चुंबकीय मोती चुनिंदा आसंजन रिसेप्टर्स की एक विशिष्ट परिवार को निशाना द्वारा कोशिका आसंजन परिसरों का एक बड़ा शुद्धि स्तर अनुमति देते हैं। चुंबकीय मोती पहले से ही गैर-पक्षपाती ligand लेपित microbeads 29, 30 से जुड़ी कोशिकाओं में आसंजन परिसरों को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। विधि mimics जैविक स्थितियों नीचे वर्णित है, जहां सेना के एक छोटे से निरंतर अवधि (मिनट के लिए सेकंड) के लिए आवेदन किया है। इसलिए, यह दोनों शुद्ध आसंजन परिसरों की आणविक संरचना की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है औरनीचे की ओर mechanosensitive-संकेत दे रास्ते।
यहाँ हम आसंजन सतह प्रोटीन के लिए खिंचाव या तनाव बलों लागू करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। एक स्थायी neodymium चुंबक संस्कृति पकवान सतह के शीर्ष पर रखा गया है। चुंबक की पोल चेहरे 6 मिमी की ऊंचाई पर रखा गया है, ताकि एक भी 2.8 माइक्रोन चुंबकीय मनका पर बल निरंतर (लगभग 30-40 पीएन) 31 है। तनाव उत्तेजना की अवधि के लिए ब्याज और सक्रियण के अपने समय के पैमाने का अणु के आधार पर ऑपरेटर द्वारा निर्धारित किया जाता है। प्रकोष्ठों अंत में lysed रहे हैं, आसंजन परिसरों एक चुंबक का उपयोग मोती जुदाई से शुद्ध कर रहे हैं और जैव रासायनिक विश्लेषण कार्रवाई कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल ligand लेपित superparamagnetic मोतियों की तैयारी, और जैव रासायनिक विश्लेषण के द्वारा पीछा चुंबक के माध्यम से तनाव के आवेदन भी शामिल है। इसके अतिरिक्त, हम चाहते हैं कि तनाव का प्रदर्शन डेटा का एक प्रतिनिधि नमूने इंटीग्रिन आधारित ADH के लिए लागू प्रदानesions आसंजन remodeling लाती है और प्रोटीन tyrosine फोस्फोराइलेशन बदल।
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Protocol
1. Ligand संयुग्मन चुंबकीय मोती
नोट: Ligand विकार एक 2.8 माइक्रोन व्यास के साथ superparamagnetic Tosyl सक्रिय मनकों का उपयोग किया जाता है (शेयर समाधान एकाग्रता 10 8 मोती / एमएल, 30 मिलीग्राम मोती / एमएल)। निम्नलिखित प्रोटोकॉल लगभग 2 x 10 5 कोशिकाओं है, जो एमआरसी-5 एक 60 मिमी टिशू कल्चर प्लेट में 80% confluency करने के लिए विकसित कोशिकाओं के अनुरूप के नमूने पर आधारित है। तदनुसार अलग संगम पर अलग अलग आकार या कोशिकाओं की प्लेट का उपयोग करता है, तो माला और अभिकर्मकों की मात्रा समायोजित करें। आदेश में superparamagnetic मोती की राशि का उपयोग सेल प्रति 2 मोती है। इसलिए, 4 एक्स 10 5 मोती एक 60 मिमी प्लेट के लिए आवश्यक हैं।
- अच्छी तरह से vortexing कम से कम 30 एस द्वारा मूल शीशी में मोती resuspend। अशेष 40 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब resuspended superparamagnetic मोती (4 x 10 6 मोती के लिए इसी) के μL।
- एक चुंबकीय separati पर ट्यूब रखेंआदेश समाधान से चुंबकीय मोतियों को अलग करने में स्टैंड पर। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, चुंबकीय जुदाई स्टैंड से ट्यूब को हटाने और 1 एमएल 0.1 एम ना-फॉस्फेट 7.4 पीएच में मोती resuspend।
- दोहराएँ धो 1 एमएल 0.1 एम ना-फॉस्फेट पीएच 7.4 के साथ दो बार कदम है।
- अंतिम धोने के बाद, 1 मिलीलीटर 0.1 एम ना-फास्फेट 7.4 पीएच में मोती resuspend।
- गठबंधन 100 माइक्रोग्राम गोजातीय fibronectin (एफ एन) या 1 मिलीलीटर 0.1 एम ना-फॉस्फेट 7.4 पीएच मोती युक्त करने के लिए किसी अन्य कोशिका आसंजन रिसेप्टर ligand और pipetting द्वारा मिश्रण।
- एफ एन या बीएसए, पाली डी lysine या नकारात्मक नियंत्रण के लिए APO-transferrin के साथ किसी भी अन्य विशिष्ट ligand जगह से पिछले चरणों को दोहराएँ।
- वैकल्पिक रूप से, जेल के विश्लेषण के लिए, crosslinking दक्षता के विश्लेषण के लिए ligand समाधान की एक 10 μL विभाज्य लेने और केंद्रित Laemmli नमूना बफर का एक उचित मात्रा के साथ मिश्रण।
- युक्त एक रोटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-24 घंटे के लिए समाधान ligand के साथ मोती सेते हैं।
- अगर मनका समुच्चय प्रतिक्रिया के बाद कोई अधिक से अधिक 10-20 एस के लिए हुआ है, sonicate (निरंतर 39 डब्ल्यू शक्ति) दिखाई देते हैं।
- चुंबकीय जुदाई स्टैंड का उपयोग मोतियों को अलग, शेष समाधान aspirate और पीबीएस के 1 एमएल / 0.2% बीएसए पीएच 7.6 समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रोटर पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- एक चुंबक का उपयोग मोती 1 एमएल पीबीएस / 0.2% बीएसए पीएच 7.6 के साथ दो बार धोएं। 1 एमएल पीबीएस में Resuspend मोती / 0.2% बीएसए पीएच 7.6।
- Sonicate मोती यदि समुच्चय से अधिक नहीं 20-30 एस के लिए दिखाई देते हैं।
- वैकल्पिक रूप से, पश्चिमी धब्बा द्वारा युग्मन दक्षता का विश्लेषण करने के लिए एक 10 μL विभाज्य हटाने के लिए (केंद्रित Laemmli नमूना बफर का एक उचित मात्रा के साथ मिक्स)।
- अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर assays या दुकान मोती सेल आगे बढ़ें।
- वैकल्पिक रूप से, चुंबकीय मोतियों को एफ एन crosslinking का विश्लेषण करने के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल और Coomassie नीले रंग के साथ दाग चलाते हैं।
Ligand-लिपटे मोतियों पृष्ठीय पर आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य पर खिंचाव या तनाव बलों के 2. आवेदनकोशिकाओं की सतह
- उचित मध्यम विकास में 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान पर संस्कृति पक्षपाती कोशिकाओं को 80% confluency तक पहुँचने तक (आमतौर पर DMEM 4.5 छ / एल डी ग्लूकोज के साथ एफसीएस 10% पूरक)।
- गैर denaturing गैर ईओण lysis बफर (20 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.6, 150 मिमी NaCl, 2 मिमी 2 MgCl, 0.1% एनपी 40) और सर्द microcentrifuge ट्यूबों तैयार करें।
- खंड 1.10 और resuspend से ligand लिपटे मोतियों गोली 1 एमएल पीबीएस में / 0.2% बीएसए पीएच 7.6। गर्म संस्कृति के माध्यम से और भंवर के 5 एमएल ligand लिपटे मोतियों समाधान के 100 μL जोड़ें।
- 60 मिमी संस्कृति डिश में महाप्राण मध्यम और 5 एमएल गर्म मध्यम विकास मोतियों के साथ पूरक जोड़ें।
- सेल संस्कृति शर्तों के तहत 20 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) मोती तलछट और कोशिकाओं का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए सेते हैं। यह महत्वपूर्ण है करने के लिए 20 मिनट से अधिक नहीं के बाद से मोती phagocytosis से भली भाँति जा सकता है।
- वैकल्पिक रूप से, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप एक 10X या 20X obje का उपयोग कर के तहत मोतियों का निरीक्षणctive और थोड़ा जुड़ी है और चल मोतियों के बीच भेदभाव करने के लिए पकवान झटकों से मनका आसंजन के लिए जाँच करें।
- इनक्यूबेटर में संस्कृति पकवान रखे हुए है, जबकि एक दौर 38 मिमी neodymium ऊपरी चेहरे पर जुड़ी चुंबक के साथ एक ढक्कन के लिए सामान्य डिश ढक्कन स्वैप। चुंबक जगह में दो छोटे 13 मिमी neodymium ढक्कन के निचले चेहरे पर तैनात मैग्नेट द्वारा आयोजित किया जाता है। चूंकि मैग्नेट बहुत शक्तिशाली हैं, उन्हें ध्यान में हेरफेर।
- सेल संस्कृति शर्तों पर वांछित समय बिंदुओं के लिए तनाव (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) के अधीन कोशिकाओं को सेते हैं।
- उपचार के बाद, बर्फ पर पकवान जगह और ध्यान से पकवान से पूरे मध्यम aspirate।
- सेल बफर के 300 μL जोड़ें, और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। lysate एक सेल खुरचनी और एक पूर्व ठंडा 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब हस्तांतरण का उपयोग कर लीजिए।
- चुंबकीय जुदाई स्टैंड का उपयोग चुंबकीय मोती गोली और एक नया पूर्व ठंडा करने के लिए कुल सेल lysate हस्तांतरणएड 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब। आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इस अंश स्टोर।
- मोती 1 मिलीलीटर ठंडा lysis बफर के साथ 3 बार धोएं। मनका गोली के लिए 50 μL Laemmli नमूना बफर जोड़ें, एक सूखी ब्लॉक हीटर का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर pipetting और उबाल द्वारा मिश्रण। यह अंश अलग आसंजन परिसरों में शामिल है। -20 डिग्री सेल्सियस पर जैव रासायनिक विश्लेषण या स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें।
- मोती जुदाई (लगभग 300 μL) के बाद प्राप्त कुल सेल lysate से, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक 50 μL विभाज्य को हटा दें।
नोट: 250 μL छोड़ दिया इस तरह के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत स्टडीज (immunoprecipitation, जीएसटी पुल से नीचे assays) या GTPase गतिविधि प्रयोगों के रूप में आगे जैव रासायनिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (lysis बफर बदलते ब्याज की GTPase के आधार पर आवश्यक हो सकता है)।
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Representative Results
तकनीक के योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में सचित्र है। ligand विकार के बाद, चुंबकीय मोती 20 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ incubated रहे हैं, और फिर एक स्थायी चुंबक समय के विभिन्न राशि के लिए 30-40 के बारे में पी.एन. की तन्यता बलों लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चित्रा 1 बी 2.8 माइक्रोन एफ एन लेपित चुंबकीय MRC5 कोशिका आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य मोती पता चलता है।
सेल के बाद superparamagnetic मोतियों की धोने कदम महत्वपूर्ण हैं और शुद्धि की डिग्री का निर्धारण। तीन washes के एक न्यूनतम सिफारिश की है। लंबे निवेश के साथ GADPH immunoblots आसंजन परिसरों की पवित्रता (चित्रा 2A) का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
एफ एन लिपटे मोतियों mechanotransduction प्रक्रियाओं तनाव के जवाब में आसंजन परिसरों पर समय के साथ होती है कि जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया। आसंजन जटिल अंश के चुंबकीय जुदाई के बाद, lysate और आसंजन जटिल अंश से विश्लेषण किया गयापश्चिमी धब्बा। जैसी कि उम्मीद थी, हम भी यांत्रिक उत्तेजना (चित्रा 2 बी) के अभाव में Talin, आसंजन परिसरों अंश में vinculin और paxillin, लेकिन नहीं GAPDH मनाया। पिछली रिपोर्टों 32 के अनुरूप, 33, तनाव आसंजन परिसरों को vinculin भर्ती शुरू हो गया। तनाव आसंजन परिसरों को paxillin भर्ती को प्रभावित नहीं किया है, जबकि tyrosine 31 पर अपने फोस्फोराइलेशन दोनों कुल सेल lysate में और आसंजन जटिल अंश में यांत्रिक तनाव के जवाब में बढ़ाया गया था।
चित्रा 1. विधि का विवरण। (ए) तकनीक का योजनाबद्ध चित्रण। प्रकोष्ठों सबसे पहले मध्यम संस्कृति में सुसंस्कृत हैं जब तक वांछित confluency तक पहुँच जाता है। फिर, superparamagnetic मोती 15-20 मिनट के लिए जोड़ रहे हैं। खिंचाव या तनाव बलों के बारे में 30-40 पी.एन. हैंफिर समय के अलग-अलग राशि के लिए calibrated चुंबक का उपयोग कर लागू होता है। (बी) fibronectin लेपित superparamagnetic मोती कोशिका आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य है। प्रकोष्ठों के माध्यम में superparamagnetic मोती (सफेद तीर) जोड़ने के बाद प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी 15 मिनट में चरण विपरीत द्वारा imaged हैं। (ऊपर छवि: स्केल बार = 25 माइक्रोन, नीचे की छवि: स्केल बार = 100 माइक्रोन) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. यांत्रिक तनाव आसंजन परिपक्वता लाती है। (ए) आसंजन परिसरों की शुद्धि। GAPDH immunoblotting आसंजन परिसरों की शुद्धता की जांच के लिए कुल सेल lysate के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। nitrocellulose झिल्ली वें प्रदर्शित करने के लिए एक लंबे समय जोखिम का उपयोग imaged किया गया हैआसंजन जटिल अंश में संकेत के अभाव ई। (बी) तनाव आसंजन परिपक्वता लाती है। लोड हो रहा है नियंत्रण (GAPDH) और उम्मीदवारों (vinculin, Talin और paxillin) यांत्रिक तनाव के जवाब में भर्ती या आसंजन परिसरों पर phosphorylated होने के लिए जाना immunoblotted रहे हैं। इस प्रयोग MRC5 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
विधि यहाँ वर्णित कोशिका की सतह आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए तनाव लागू करते हैं और उनके बाद शुद्धि की अनुमति के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण का गठन किया। हालांकि, कुछ चरणों को पूरा करने के लिए कुशल आसंजन शुद्धि और संभावित अनुकूलन किया जा सकता है लक्षित आसंजन रिसेप्टर्स के आधार पर महत्वपूर्ण हैं। हम संभावित मुद्दों उपयोगकर्ता नीचे मुठभेड़ हो सकता है प्रस्तुत करते हैं।
हम 2.8 मीटर व्यास चुंबकीय मोतियों का इस्तेमाल किया लेकिन बड़े मोतियों जैसे 4.5 मीटर व्यास का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, मनका व्यास 2-5 माइक्रोन के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए phagocytosis 30-60 मिनट ऊष्मायन के दौरान और अधिक तेजी से हो सकता है और बड़ा मोती मजबूत आसंजन है इतना है कि मनका विस्थापन चुंबकीय क्षेत्र 34, 35 के तहत प्रतिबंधित किया जाएगा के बाद से। इसलिए, यह कम समय के लिए ऊष्मायन समय सीमा और उचित मनका आकार का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल प्रति incubated मोतियों की संख्या एफ की राशि पर असर पड़ेगाएक एकल कोशिका से orce अनुभव। एक कुशलता से तनाव के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करना चाहता है, वहीं सेल प्रति भी कई मोती अप्रासंगिक संकेत दे रास्ते के सक्रियण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हम आम तौर पर एफ एन लिपटे मोतियों के लिए सेल प्रति दो मोतियों की औसत सेते हैं, लेकिन इस मात्रा समायोजित किया जा सकता है [सेल प्रति 1 से 5 मोती] सेल प्रकार और कोशिका की सतह रिसेप्टर पर निर्भर करता है। चुंबक के बारे में, विधि यहाँ वर्णित एक चुंबक है, जिसके लिए एक 2.8 माइक्रोन पर जिसके परिणामस्वरूप बल मापा गया है (लगभग 30-40 पी.एन. इस्तेमाल किया undiluted ग्लिसरॉल, ज्ञात चिपचिपापन 31 के साथ एक न्यूटोनियन तरल में चुंबकीय मोतियों के विस्थापन को मापने के द्वारा, यह हालांकि बड़े चुंबक का उपयोग करने के लिए संभव है, यदि आवश्यक बल की बड़ी राशि लागू करने के लिए। यह ध्यान रखें कि इन मैग्नेट अत्यंत शक्तिशाली हैं और उन्हें ध्यान में हेरफेर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
बाद ईसीएम ligand (1.7 कदम) के साथ ही 1 घंटे ऊष्मायन (कदम 1.9) पीबीएस / 0.2% बीएसए पीएच 7.6 बफर के साथ के बाद, मीटर के साथ 12-24 ज ऊष्मायनagnetic microbeads समुच्चय के रूप में हो सकता है। यह तो जितना संभव हो उतना मोती अलग करने के लिए सेल प्रति 2 मोतियों के अनुपात का सम्मान करने के लिए महत्वपूर्ण है। : 1 के अनुपात हालांकि, यह अभी भी एक 5 है करने के लिए स्वीकार्य है। मोती जुदाई, या तो मिश्रण और pipetting द्वारा या sonication का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि एक छोटी अवधि (20-30 रों)।
विभिन्न प्रोटीन इंटीग्रिन ligand (एफ एन, मज्जा), पुनः संयोजक प्रोटीन या एंटीबॉडी विशिष्ट कोशिका की सतह रिसेप्टर्स को निशाना सहित मोती, संयुग्मित जा सकता है। पृष्ठीय कोशिका की सतह के लिए ligand लेपित चुंबकीय मोतियों की कुर्की मोती पर ligand के कम युग्मन दक्षता से कमजोर किया जा सकता है। यह ligand माला और युग्मन प्रक्रिया के अंत में मोतियों की एक विभाज्य में जोड़ने से पहले पतला ligand समाधान के एक विभाज्य इकट्ठा करके मोती के लिए बाध्य करने के लिए जाँच करने के लिए सिफारिश की है। ये aliquots एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और Coomassie नीले धुंधला करने के लिए कार्रवाई की जा सकती।
अगर में कोई बदलाव नहींरास्ते या उम्मीद mechanosensing प्रक्रियाओं का पता चला रहे संकेत है, यह विभिन्न संभावनाओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक तरह से इस मुद्दे की पहचान करने के लिए चुंबक के साथ प्रयोग की अवधि मिलाना है। यह सर्वविदित है कि सेलुलर प्रक्रियाओं के वेग सेल इस्तेमाल किया प्रकार पर निर्भर करता है। (उदाहरण के paxillin फोस्फोराइलेशन या FAK फोस्फोराइलेशन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है) एक अन्य विकल्प के नाम से जाना जाता तनाव के प्रति संवेदनशील अणुओं का परीक्षण और सोख्ता पश्चिमी द्वारा अपने पद translational संशोधनों की जांच करने के लिए किया जाएगा। बल की राशि भी महत्वपूर्ण है और एक मोटा चुंबक (एक ही ग्रेड N52) या बड़े मनकों का उपयोग कर एक विकल्प हो सकता है हो सकता है। इसके अतिरिक्त, ligand / रिसेप्टर बंधन दक्षता का विश्लेषण आसंजन जटिल से पता लगाया जा सकता है और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स (जैसे cadherin या इंटीग्रिन के रूप में) के लिए देखो। सेल confluency भी तनाव के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। ऐसा नहीं है कि सेल / सेल आसंजन सेल व्यवहार और cystokeletal prestress प्रभावित कर सकते हैं देखा गया है के रूप में, यह importan हैटी ध्यान दें कि confluency तनाव के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है। हालांकि हम इंटीग्रिन आधारित adhesions के लिए तनाव के आवेदन के लिए 80% confluency सलाह देते हैं, अलग अलग परिस्थितियों के क्रम में प्रायोगिक प्रणाली का अनुकूलन करने में परीक्षण किया जा सकता है।
हालांकि इस पद्धति तनाव संवेदनशील adhesome के साथ ही जुड़े संकेत दे रास्ते समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, यह भी कुछ सीमाओं था। सबसे पहले, के बाद से मुख्य इस तरह के छोटे आकार के चुंबकीय मोतियों का उपयोग चिंता कोशिकाओं द्वारा उनके internalization का खतरा है, इस विधि लंबे समय तक mechanosensitive सिगनल सेलुलर प्रतिक्रियाओं में इस तरह के भेदभाव और प्रसार के रूप में सेल भाग्य को संशोधित कि अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। एक और सीमा कैसे बलों संस्कृति की थाली में कोशिकाओं की परत करने के लिए लागू कर रहे हैं के रास्ते में निहित है। दरअसल, जब से चुंबकीय क्षेत्र हमेशा चुंबक की परिधि में अधिक है, बलों संस्कृति की थाली की सतह पर सेल की एक कम ढाल के साथ भिन्न हो सकता हैपरिधि से केंद्र के लिए खींच और विषम सेलुलर प्रतिक्रियाओं को जन्म दे सकता है।
प्रक्रिया यहाँ वर्णित एक सरल और लागत प्रभावी तरीका है कि mechanosensitive सेलुलर रास्ते का अध्ययन करने के साथ-साथ तनाव के अधीन आसंजन परिसरों की आणविक संरचना की जांच की अनुमति देता है का गठन किया। ऐसी युक्ति है कि कोशिकाओं के लिए चक्रीय तनाव लागू खींच रूप में अन्य तरीकों, सभी कोशिका की सतह रिसेप्टर्स बाह्य मैट्रिक्स के साथ बातचीत करने के लिए तनाव के आवेदन करने के लिए नेतृत्व। विधि यहाँ वर्णित इस तरह, ligands या कोशिका की सतह रिसेप्टर्स को निशाना एंटीबॉडी इंटीग्रिन कई अलग mechanosensitive प्रणालियों के अध्ययन की अनुमति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की एक विशिष्ट सबसेट और ligands की एक विशाल विविधता के बल उत्तेजना को सक्षम करने का फायदा है। इस पद्धति का एक और लाभ यह है कि यह प्रोटीन परिसरों की शुद्धि कि तनाव का अनुभव है और Eleme loadbearing पर काम करने के लिए ले जाता हैएनटीएस जो जाना जाता है mechanotransduction 36 में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। शुद्ध आसंजन परिसर में भी तनाव है, या actin polymerization परख के जवाब में काइनेज गतिविधि की जांच करने के लिए इस तरह के काइनेज assays के रूप में विभिन्न जैव रासायनिक दृष्टिकोण 14, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। साथ ही, इस प्रायोगिक प्रणाली चुंबकीय चिमटी के साथ मिलकर किया जा सकता सेलुलर यांत्रिक प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए और पहचान संकेत दे रास्ते के साथ इस प्रतिक्रिया सहसंबंधी। दिलचस्प बात यह है magnetoplasmonic नैनोकणों हाल ही में समय और स्थान 37 में सटीक नियंत्रण के साथ लोड पायदान और ई cadherin यंत्रवत् करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह हाल ही में विकास अलग, स्थानिक लौकिक और यांत्रिक आदानों के साथ mechanosensitive संकेत दे रास्ते की खोज में मदद कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।
Acknowledgments
तटरक्षक एजेसीं राष्ट्रीय डी ला Recherche (ANR-13-JSV1-0008), यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से (मैरी क्यूरी कैरियर एकता n˚8304162) से और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) यूरोपीय संघ के क्षितिज के नीचे से अनुदान द्वारा समर्थित है 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ईआरसी शुरू अनुदान n˚639300)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
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