Summary
клеточной поверхности спайки являются центральными в механотрансдукции, так как они передают механические напряжения и инициировать сигнальных путей, вовлеченных в гомеостаз ткани и развития. Здесь мы приводим протокол для рассечения биохимических путей, которые активируются в ответ на напряжение, используя лиганд покрытием магнитные микрогранулы и применение силы к адгезионных рецепторов.
Abstract
Механочувствительных адгезии комплексы клеточной поверхности позволяют клеткам ощущать механические свойства их окружения. Недавние исследования выявили как силы зондирования молекул на адгезионных участков, а сила-зависимых факторов транскрипции, которые регулируют экспрессию генов LINEAGE-специфических и драйвом фенотипические выходы. Однако сигнальные сети преобразующие механическую напряженность в биохимических путей, которые остаются неясными. Для изучения сигнальных путей, участвующих на механического напряжения, приложенного к рецептором клеточной поверхности, могут быть использованы суперпарамагнитныо микрогранулы. Здесь мы приводим протокол для использования магнитных шариков для применения силы на клеточной поверхности адгезии белков. Используя этот подход, можно исследовать не только силы-зависимых цитоплазматический сигнальных путей от различных биохимических подходов, но и адгезии ремоделирования магнитной изоляции адгезионных комплексов, присоединенных к лиганд-покрытием бусин. Этот протокол включает в себя подготовку лиганд-сотрудничестваованные суперпарамагнитныо бусы и применение определить силы растяжения с последующим биохимических анализов. Кроме того, мы предоставляем репрезентативную выборку данных, показывающих, что напряжение применяется к адгезии интегрина на основе триггеров адгезии ремоделирования и изменяет белковый фосфорилирования тирозина.
Introduction
В многоклеточных, механическое напряжение направляет развитие тканей и гомеостаз посредством регуляции множества клеточных процессов , таких как пролиферации, дифференцировки и выживания 1, 2. Механическое напряжение может возникать из внеклеточного матрикса или могут быть получены с помощью адгезивных клеток, которые образец их внеклеточную среду через актомиозиновом сократительной механизма, который вытягивает на внеклеточный матрикс и зонды его жесткость при натяжении чувствительных молекул. В ответ на напряжение, механочувствительных белки адгезии претерпевают конформационные изменения, которые вызывают сложные сигнальные каскады. В свою очередь, эти сигнальные пути оркестровать mechanoresponse охватывающую пролиферацию, дифференцировку и выживание, который регулирует клеточное поведение во внеклеточную среду. Такие процессы могут быть урегулированы в краткосрочном периоде времени (секунды до нескольких минут), чтобы быстро накормить обратно на петлю механиз notransduction путем модификации механочувствительных структур. Например, интегрин на основе спайки усиления в ответ на натяжение через Rho ГТФ-опосредованной цитоскелета ремоделирования 3, 4, 5. Параллельно с этим , другие сигнальные пути активируются в течение часов и дней , чтобы контролировать генетические программы , которые в конечном итоге повлиять на судьбу клеток 6. Принимая во внимание, многие исследования выявили влияние матрицы жесткости на клеточное детерминизма и развития болезни 1, 2, точные молекулярные механизмы адгезии опосредованной механотрансдукции до сих пор остаются неуловимыми.
Различные подходы были разработаны с целью изучения влияния клеточных генерируемых сил или внешних сил на поведение клеток, в том числе систем потока, флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) -tension датчиков 7,деваха = "Xref"> 8, совместимые подложки 9, пинцет, оптический пинцет 10 и атомно - силовой микроскопии (AFM) 11. Здесь мы приводим протокол, используя суперферромагнитных шарики для характеристики механотрансдукция путей в ответ на растягивающих сил, приложенных со специфическими рецепторами адгезии. Суперпарамагнитных шарики представляют собой частицы, которые обратимо обусловливающие намагничивание при помещении в магнитном поле. После того, как покрытые лигандом для конкретного рецептора, эти шарики обеспечивают мощный инструмент для изучения влияния внеклеточной приложения силы. Этот метод был подтверждено несколькими исследованиями 3, 5, 12 - 17 и представить преимущество в значительной степени облегчить биохимический анализ на прилипшие клетки. Используя аналогичные коллаген покрытием магнитных шариков с последующим биохимического анализа, ранние работы сообщили об увеличениипротеин - тирозин - фосфорилирование и активацию RhoA в ответ на натяжение 5, 18, 19. Описанный ниже метод был также использован с фибронектином (FN) -покрытие бусинок , чтобы охарактеризовать сигнальные пути вниз по течению от напряжения , приложенного к интегринов 3. В этом исследовании, Guilluy и др. показали, что напряженность активирует RhoA путем набора двух гуанин нуклеотид обменных факторов (GEFs), Ларг и ГЭФ-H1, с интегрином адгезионных комплексов. Так что, другие исследования показали , что ГЭФ-H1 рекрутируется на адгезионных комплексов в ответ на клеточной сгенерированных напряженности с использованием различных методов 20, 21, демонстрируя устойчивость методологии , описанной здесь. В результате, активированный RhoA было установлено, способствует усиление адгезии, через цитоскелета ремоделирования. Эта система была также использована для изучения натяжения применяется то клеточной адгезии / рецепторами клеток. Применение сил на магнитных шариков , покрытых внеклеточным доменом Е-кадгерина вызвало увеличение набора винкулина аналогично интегринассоциированный адгезионных комплексов 12. Коллинз и его коллеги наблюдали , что применение напряженности PECAM-1 способствует интегрин и активации RhoA 13. Другой экспериментальный подход с использованием магнитных шариков является изучение натяжения применительно к изолированных ядер. Используя шарики , покрытые антителами , направленными против белка ядерной оболочки nesprin-1, оболочечные комплексы ядерных очищались , чтобы показать , что они динамически регулируется в ответ на механическое натяжение 22. Эти результаты подтверждают всемогущество этого метода в изучении механотрансдукции путей. Кроме того, в то время как поток или тяговое усилие системы стимулируют общие клеточные процессы, магнитные шарики, специально нацелены на рецептор клеточной адгезии с использованием либо лиганды рецептора
Еще одним преимуществом этого метода является выделение адгезионных комплексов посредством простой процедуры очистки лиганда сродства. Хорошо известно , что добавление лиганда покрытием бус клеток связывается с рецепторами адгезии и вызывает набор нескольких адгезивных белков 23. Дальнейшее применение сил лиганд-покрытием магнитных шариков превращает эти адгезионные комплексы в макромолекулярных платформ, опосредует различные натяжные-зависимые сигнальные пути , 4, 24. Лизис клеток с последующей концентрацией шарик с помощью магнита позволяет выделить адгезионных платформ. Другие методы, используемые для очистки адгезии комплексы уже использовались в прикрепленных клетках. Они сочетают в себе химическое сшивание, чтобы сохранить белок-белковых взаимодействийи стадию лизиса клеток с помощью моющего средства и сдвига потока или обработки ультразвуком 20, 21, 25, 26, 27, 28. Последним шагом является сбор полученных брюшных плазменных мембран, содержащих адгезионных комплексов. В отличие от этих методов, магнитные шарики позволяют большую степень очистки клеточной адгезии комплексов путем селективного ориентации конкретного семейства рецепторов адгезии. Магнитные шарики уже используют для очистки адгезионные комплексов в неприлипающими клеток , прикрепленных к микрошариков лиганд-покрытием 29, 30. Метод, описанный ниже, имитирует биологических ситуациях, когда сила приложена в течение короткого периода (продолжительного секунд до минут). Таким образом, он представляет собой мощный инструмент для исследования как молекулярный состав очищенных адгезионных комплексов ивниз по течению механочувствительных-сигнальных путей.
Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для использования магнитных шариков, чтобы применить растягивающие силы на поверхности адгезии белков. Постоянный неодимовый магнит помещается на верхней части поверхности культуры блюдо. Поверхность полюса магнита помещают на высоте 6 мм , так что усилие на одной магнитной бусинки 2,8 мкм постоянна (около 30-40 Pn) 31. Длительность стимуляции натяжения определяется оператором в зависимости от интересующей молекулы и ее масштаб времени активации. Клетки в конце концов лизируют, адгезивные комплексы очищают с помощью разделения бусин с помощью магнита и биохимические анализы обрабатываются. Этот протокол включает в себя получение лиганда покрытием суперпарамагнит- шариков, а также применение напряженности с помощью магнита с последующим биохимических анализов. Кроме того, мы предоставляем репрезентативную выборку данных, показывающих, что напряжение применяется к интегрину на основе АДГesions индуцирует адгезию ремоделирования и изменяет белковый фосфорилирования тирозина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Лиганд Конъюгирование магнитные шарики
Примечание: Лиганд конъюгация осуществляется с использованием суперферромагнитных тозил активированные бусины диаметром 2,8 мкм (концентрация исходного раствора 10 8 бусин / мл, 30 мг бусин / мл). Следующий протокол основан на образцах приблизительно 2 х 10 5 клеток, которые соответствуют MRC-5 клеток , выращенных до 80% сплошности в тканевой культуральной пластины с 60 мм. Регулировка громкости шариков и реагентов соответственно при использовании пластин различных размеров или клеток при различных слияниях. Используйте количество суперпарамагнитных бусинок, чтобы иметь 2 шариков на клетку. Таким образом, 4 х 10 5 бусин необходимы для 60 мм пластины с.
- Тщательно ресуспендирования бусины в оригинальном флаконе встряхиванием по меньшей мере, 30 с. Аликвоты 40 мкл ресуспендировали суперпарамагнит- бусин ( что соответствует 4 - х 10 6 гранул) до 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Поместите пробирку на магнитную separatiна стенде для того чтобы отделить магнитных шариков из раствора. Удалите супернатант, снимите трубку с подставки магнитной сепарации и ресуспендируют бусины в 1 мл 0,1 М Na-фосфат, рН 7,4.
- Повторите стадию промывки дважды 1 мл 0,1 М Na-фосфат, рН 7,4.
- После последней промывки, ресуспендируют бусины в 1 мл 0,1 М Na-фосфат, рН 7,4.
- Смешайте 100 мкг бычьей фибронектина (FN), или любой другой рецептор клеточной адгезии лиганда к 1 мл 0,1 М Na-фосфатного с рН 7,4, содержащий бусинки и смешивают пипетированием.
- Повторите предыдущие шаги, заменив FN или любой другой специфический лиганд с БСА, поли-D-лизин или апо-трансферрина для отрицательных контролей.
- По желанию, для анализа в геле, возьмите 10 мкл аликвоты раствора лиганда для анализа эффективности сшивающего и смешивать с соответствующим объемом концентрированной Лэммли буфера выборок.
- Выдержите бусинки с лигандом, содержащим раствор в течение 12-24 ч при 37 ° С на роторе.
- Если шарик агрегаты появляются после того, как реакция произошла, соникатные (постоянная мощность 39 Вт) не более чем на 10-20 секунд.
- Изолировать шарики с помощью стенда магнитной сепарации, аспирация оставшийся раствор и добавьте 1 мл PBS / 0,2% BSA рН 7,6 раствора. Инкубировать в течение 1 ч на роторе при 37 ° C.
- Промыть бусин с помощью магнита дважды 1 мл PBS / 0,2% БСА рН 7,6. Ресуспендируют бисером в 1 мл PBS / 0,2% BSA рН 7,6.
- Соникатные шарики, если агрегаты появляются не более чем на 20-30 секунд.
- При желании, удалить 10 мкл аликвоты для анализа эффективности связывания с помощью Вестерн-блоттинга (смешать с соответствующим объемом концентрированного буфера выборок Laemmli).
- Перейдите к ячейке анализы или хранить шарики при 4 ° С в течение 1 месяца.
- По желанию, запустить гель SDS-PAGE и пятна кумасси синим, чтобы проанализировать FN сшивку с использованием магнитных шариков.
2. Применение растягивающих сил на шариках лигандами покрытием, привязанные к рецепторам спайки на спиннойПоверхность клеток
- Культура прилипшие клетки на 60 мм блюдо культуры ткани в соответствующей среде роста (обычно DMEM 4,5 г / л D-глюкозы не с добавлением FCS 10%) до достижения 80% слияния.
- Готовят неденатурирующих неионный буфер для лизиса (20 мМ Трис - HCl , рН 7,6, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2, 0,1% NP-40) и простуда микроцентрифужных пробирок.
- Гранул лиганд-покрытием бусин из раздела 1.10 и ресуспендируют в 1 мл PBS / 0,2% БСА рН 7,6. Добавьте 100 мкл раствора лиганд-покрытием бусин в 5 мл теплой культуральной среды и вихря.
- Отберите средних 60 мм культуры блюдо и добавить 5 мл теплой ростовой среде с добавлением бисера.
- Выдержите в течение 20 мин в условиях культивирования клеток (37 ° С и 5% CO 2) , чтобы позволить бусинки осаждаться и прилипать к клеткам. Крайне важно не превышать 20 мин, так как гранулы могут быть усвоены фагоцитоза.
- Необязательно соблюдать шарики под световым микроскопом с использованием 10X или 20X OBJEctive и проверьте шарик сцепления слегка встряхивая блюдо к различению прикрепленными и плавающих шариков.
- При сохранении культуры блюдо в инкубаторе, замещать нормальное блюдо крышкой для крышки с круглым неодимовым магнитом 38 мм, прикрепленной к верхней поверхности. Магнит удерживается на месте с помощью двух небольших неодимовых магнитов 13 мм, расположенных на нижней поверхности крышки. Так как магниты являются очень мощными, манипулировать ими тщательно.
- Инкубируйте клетки , подвергнутых растяжению для требуемых моментов времени в условиях культивирования клеток (37 ° C и 5% CO 2).
- После обработки, поместите блюдо на льду и тщательно аспирата всю среду от тарелки.
- Добавить 300 мкл буфера для лизиса клеток и инкубируют в течение 10 мин на льду. Собирают лизата с помощью скребка клеток и передачу в предварительно охлажденный 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Гранул магнитные гранулы с помощью стенда магнитной сепарации и передать общую Клеточный лизат в новую предварительно прохладыред 1,5 мл микроцентрифужных трубку. Хранить эту фракцию при -20 ° С для дальнейшего анализа.
- Вымойте бисером 3 раза с помощью 1 мл охлажденного льдом буфера для лизиса. Добавьте 50 мкл Laemmli буфера выборок в осадком из гранул, перемешать с помощью пипетки и кипения при температуре 95 ° С в течение 5 мин с помощью сухого блока нагревателя. Эта фракция содержит отдельные адгезионные комплексы. Перейдите к биохимическому анализу или хранить при температуре -20 ° C.
- Из общего клеточного лизата, полученного после того, как бусинами разделения (около 300 мкл), удалить 50 мкл аликвоты для Вестерн-блоттинга.
Примечание: 250 мкл слева может быть использован для дальнейших биохимических исследований, таких как исследования взаимодействия белок-белок (иммунопреципитации, GST ниспадающие анализы) или экспериментов активность ГТФ (изменение буфера для лизиса могут быть необходимы в зависимости от ГТФазы интереса).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема методики показана на рисунке 1a. После лиганда конъюгации, магнитные гранулы инкубировали с клетками в течение 20 мин, а затем постоянный магнит используется для применения сил растяжения около 30-40 пН для различного количества времени. Рисунок 1b показывает 2,8 мкм FN-покрытием магнитных шариков , связанные с MRC5 рецепторами клеточной адгезии.
Стадии мыть суперпарамагнитных бусинок после лизиса клеток имеют решающее значение, и определить степень очистки. Минимум трех промывок рекомендуется. GADPH иммуноблоты с длительной экспозицией могут быть полезны для проверки чистоты адгезии комплексов (рис 2а).
FN-покрытием шарики были использованы для исследования процессов механотрансдукция, которые происходят с течением времени на адгезионных комплексов в ответ на натяжение. После магнитной сепарации адгезионной сложной фракции, лизат и комплексная фракция адгезии анализировали методомвестерн-блот. Как и ожидалось, мы наблюдали Талин, винкулина и паксиллина, но не GAPDH в фракции адгезии комплексов даже в отсутствие механической стимуляции (рис 2b). В соответствии с предыдущими сообщениями 32, 33, напряжение вызвало набор винкулина к адгезии комплексов. В то время как напряжение не влияет на паксиллина набор к адгезии комплексов, фосфорилирование по тирозину 31 усиливалась в ответ на механическое натяжение как в общем лизата клеток и в адгезии комплексной фракции.
Рисунок 1. Описание метода. (А) Схематическое изображение техники. Клетки, во-первых культивировали в среде культуры, пока желаемый конфлуэнтности не будет достигнута. Затем суперпарамагнитныо шарики добавляют в течение 15-20 мин. Растягивающие силы около 30-40 ПНзатем наносили с помощью калиброванного магнит для различного количества времени. (B) , покрытой фибронектином суперпарамагнитныо бусин связываются с рецепторами клеточной адгезии. Клетки изображаются с помощью фазового контраста в проходящем-световой микроскопии 15 мин после добавления суперферромагнитных шарики (белая стрелка) в среде. (Верхнее изображение: Шкала бар = 25 мкм, нижнее изображение: Шкала бар = 100 мкм) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Механическое натяжение вызывает адгезию созреванию. (А) Очистка адгезионных комплексов. GAPDH иммуноблоттинг используется в качестве контроля загрузки для общего клеточного лизата и проверить чистоту адгезии комплексов. Нитроцеллюлозная мембрана была визуализируют с помощью длительной экспозиции, чтобы продемонстрировать тысе отсутствие сигнала в спаек комплексной фракции. (В) Напряжение индуцирует адгезию созреванию. Контроль Loading (GAPDH) и кандидатов (винкулин, Талин и паксиллина), как известно, нанятые или фосфорилируется в адгезионных комплексов в ответ на механическое натяжение являются иммуноблоттинг. Этот эксперимент был выполнен на MRC5 клетках. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод представляет собой простой подход, чтобы применить напряжение к клеточной поверхности рецепторов адгезии и позволяют их последующую очистку. Тем не менее, некоторые шаги имеют решающее значение для выполнения эффективной очистки адгезии и потенциал оптимизации можно сделать в зависимости от целевых рецепторов адгезии. Мы представляем потенциальные проблемы, пользователь может столкнуться ниже.
Мы использовали диаметр 2,8 мкм магнитных шариков, но более крупные шарики могут быть использованы, такие как диаметр 4,5 мкм. Тем не менее, диаметр шарика должен быть ограничен до 2-5 мкм , так как фагоцитоз может происходить более быстро в течение 30-60 мин инкубации и более крупные шарики имеют более сильную адгезию , так что смещение шарика будет ограничен в соответствии с магнитным полем 34, 35. Таким образом, важно ограничить время инкубации на короткие периоды и использовать правильный размер шарика. Количество шариков инкубировали на клетку будет влиять на количество FОпыт Orce одной клеткой. В то время как кто-то хочет, чтобы эффективно стимулировать клетки с напряжением, слишком много шариков на клетку может привести к активации неуместных сигнальных путей. Как правило, мы инкубировать в среднем два шариков на ячейку для бусин FN-покрытием, но эта величина может быть отрегулирована [1 до 5 шариков на ячейку] в зависимости от типа клетки и рецептора на поверхности клетки. Что касается магнита, способ , описанный здесь использован магнит , для которого результирующее усилие на 2,8 мкм , которая была измерена (около 30-40 пН путем измерения смещения магнитных шариков в неразбавленном глицерином, ньютоновской жидкости с известной вязкостью 31, хотя можно использовать более крупные магниты, чтобы применить большее количество силы, если это необходимо. важно отметить, что эти магниты являются чрезвычайно мощным и тщательно манипулировать ими.
После 12-24 часов инкубации с ЕСМ лиганда (этап 1.7), а также через 1 ч инкубации (стадия 1,9) с PBS / 0,2% БСА рН 7,6 буфера, то мagnetic микросферы может образовывать агрегаты. Именно тогда важно отделить бусинки как можно больше, чтобы соблюдать соотношение 2 шариков на ячейку. Тем не менее, это все еще приемлемо, чтобы иметь соотношение 5: 1. Бусинки разделение может быть достигнуто либо путем смешивания и пипеткой или с помощью ультразвука, хотя в течение короткого периода (20-30 с).
Различные белки могут быть конъюгированы с бортами, в том числе интегрин-лиганд (FN, коллаген), рекомбинантные белки или антитела, направленные на определенные рецепторы клеточной поверхности. Присоединение лиганда покрытием магнитных шариков на дорсальной поверхности клетки может быть ослаблено низкой эффективность связывания лиганда на гранулы. Рекомендуется, чтобы проверить наличие связывания лиганда с гранулами, собирая аликвоты разбавленного раствора лиганда перед добавлением к шарикам и аликвоты бусин в конце процесса связывания. Эти аликвоты могут быть обработаны для анализа SDS-PAGE и Кумасси синего окрашивания.
Если никаких изменений впути или ожидаемые процессы mechanosensing обнаруженные сигнализации, важно рассмотреть различные возможности. Один из способов определить вопрос состоит в модуляции продолжительности эксперимента с магнитом. Хорошо известно, что скорость клеточных процессов изменяется в зависимости от типа клеток, используемых. Другим вариантом было бы, чтобы испытать известные натяжных чувствительные молекулы и проверить их модификаций посттрансляционных Вестерн-блоттингом (например, паксиллина фосфорилирования или FAK фосфорилирования можно анализировать). Величина силы может быть также имеет важное значение и использовать более толстый магнит (тот же сорт N52) или более крупные шарики могут быть одним из вариантов. Кроме того, эффективность связывания лиганд / рецептор могут быть изучены с помощью анализа адгезии комплекса и искать рецепторов клеточной поверхности (например, кадгерину или интегрина). Ячейка конфлуэнтности также может влиять на клеточный ответ на напряженность. Как уже было отмечено, что клетка / клеточной адгезии могут влиять на поведение клеток и cystokeletal предварительное напряжение, это importanт отметить, что конфлуэнтности может влиять на клеточный ответ на натяжение. Несмотря на то, мы рекомендуем 80% сплошности для применения напряжения к интегрина на основе спаек, различные условия могут быть проверены с целью оптимизации экспериментальной системы.
Хотя этот метод представляет собой мощный инструмент для расшифровки прижимную чувствительной adhesome, а также связанные с ними сигнальные пути, он также имеет некоторые ограничения. Во-первых, так как основная проблема с использованием таких малых размеров магнитных шариков является риск их интернализации клетками, этот метод не может быть использован для изучения долгосрочных механочувствительных сигнализации клеточные реакции, которые изменяют судьбу клеток, таких как пролиферации и дифференцировки. Еще одно ограничение заключается в способе, как силы прикладываются к слою клеток в культуральном планшете. Действительно, так как магнитное поле всегда выше на периферии магнита, силы могут изменяться на поверхности культурального планшета с уменьшающимся градиентом клеткипростирающейся от периферии к центру и может привести к гетерогенным клеточных реакций.
Процедура, описанная здесь, представляет собой простой и экономически эффективный метод, который позволяет изучать механочувствительных клеточных путей, а также исследования молекулярного состава адгезии комплексов, подвергнутых растяжению. Другие подходы, такие как растяжение устройства, которые применяются к циклической деформации клеток, приводит к применению напряжения на всех рецепторов клеточной поверхности, взаимодействующих с внеклеточным матриксом. Описанный здесь метод имеет то преимущество, что позволяет силы стимуляции определенного подмножества рецепторов клеточной поверхности и большое разнообразие лигандов могут быть использованы, например, интегрин лиганды или антитела, направленные рецепторы клеточной поверхности, что позволяет изучение многих различных механочувствительных систем. Еще одним преимуществом этого метода является то, что оно приводит к очистке белков комплексов, которые испытывали напряжение и работать на Несущие остаетсNTS , которые , как известно, играют центральную роль в механотрансдукции 36. Очищенный адгезией комплекс также может быть использован для различных биохимических подходов 14, таких как киназы анализов для исследования активности киназы в ответ на растяжение, или актина анализе полимеризации. Кроме того, эта экспериментальная система может быть соединена с магнитным пинцетом, чтобы исследовать клеточный ответ и механическую соотнести эту реакцию с идентифицированным сигнальных путей. Интересно, что magnetoplasmonic наночастицы были использованы недавно для механического Notch нагрузки и Е-кадгерина с точным контролем во времени и пространстве 37. Это недавнее развитие может помочь исследовать механочувствительных сигнальных путей с различными пространственных, временных и механических входов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
CG поддерживается за счет грантов от Национального агентства-де-ла-Recherche (ANR-13-JSV1-0008), из седьмой рамочной программы Европейского союза (Мари Кюри Карьера интеграции n˚8304162) и от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Horizon Европейского Союза 2020 исследований и инноваций программы (ERC Запуск Грант n˚639300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al.
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J.
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , San Diego, Calif. (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
