Summary
Описанный здесь способ получения экзогенного цитокина у мышей ксенотрансплантата (PDX), полученных от пациента, посредством еженедельной внутрибрюшинной инъекции линии стромальных клеток, трансдуцированной цитокинами. Этот метод расширяет полезность PDX и предоставляет возможность для временной или постоянной доставки экзогенного цитокина во множестве моделей PDX.
Abstract
Мышей, полученных из ксенотрансплантата (PDX), получают путем пересадки человеческих клеток на иммунодефицитных мышей. Эти модели являются важным инструментом для изучения механизмов нормального и злокачественного кроветворения и являются золотым стандартом для выявления эффективных химиотерапий для многих злокачественных новообразований. Модели PDX возможны, потому что многие мышиные цитокины также действуют на клетки человека. Однако это не относится ко всем цитокинам, включая многие, которые имеют решающее значение для изучения нормального и злокачественного кроветворения в клетках человека. Методы, которые инженерные мыши для производства человеческих цитокинов (трансгенных и детонационных моделей) требуют значительных затрат до того, как была продемонстрирована полезность модели. Другие методы трудоемки (инъекции рекомбинантного цитокина или лентивируса), а в некоторых случаях требуют высокого уровня технической экспертизы (гидродинамическая инъекция ДНК). В этом отчете описывается простой способ создания PDX-мышей с экзогенным человеческим циТокин (TSLP, тимусный стромальный лимфопоэтин) посредством еженедельной внутрибрюшинной инъекции стромы, которая была трансдуцирована с избыточной экспрессией этого цитокина. Использование этого метода обеспечивает источник in vivo непрерывного продуцирования цитокинов, который достигает физиологических уровней циркулирующего человеческого цитокина в мыши. Уровни плазмы человеческого цитокина могут варьироваться в зависимости от количества вводимых стромальных клеток и в любой момент эксперимента может быть инициировано производство цитокинов. Этот способ также включает в себя контрольных мышей с цитокином, которые получают аналогичным образом, но посредством внутрибрюшинной инъекции стромы, трансдуцированной контрольным вектором. Ранее мы продемонстрировали, что клетки лейкемии, полученные из TSXP-экспрессирующего PDX, по сравнению с контролем PDX, демонстрируют генную модель экспрессии, более похожую на исходный образец пациента. Вместе цитокин-продуцирующие и цитокин-негативные мыши PDX, полученные этим методом, обеспечивают модельную систему, которую мы успешно использовали для изученияРоль TSLP в нормальном и злокачественном кроветворении.
Introduction
Полученные пациентом ксенотрансплантаты (PDX) являются мощной моделью in vivo для изучения продуцирования нормальных и злокачественных гематопоэтических клеток в «естественной» среде млекопитающих. Чаще всего, PDX продуцируются путем инъекции или трансплантации клеток человека в иммунных дефицитных мышей. Производство PDX с использованием обычных гемопоэтических стволовых клеток человека позволяет исследовать естественную кровь человека и иммунные клетки in vivo. PDX, продуцируемый лейкозом или другими раковыми клетками, позволяет изучать онкогенные механизмы и определять эффективные методы лечения в контексте диапазона генетических ландшафтов и мутаций, присутствующих в популяции человека. 1 Следовательно, PDX являются текущим золотым стандартом для трансляционных биомедицинских исследований для выявления эффективных методов лечения и важным инструментом для понимания механизмов прогрессирования рака. Модели PDX являются важным инструментом, помогающим исследовать болезни здоровья, обусловленные Генетические повреждения или любое заболевание, при котором вариации генетического ландшафта пациента могут существенно способствовать онкогенезу и исходу лечения.
Модели PDX для мыши и человека возможны, потому что многие мышиные цитокины адекватно имитируют их человеческие аналоги в активации рецепторов цитокинов человеческих клеток, когда они находятся внутри мыши. Например, интерлейкин-7 (IL-7) обеспечивает критический сигнал для развития В-клеток человека. 2 В этом случае мышиный IL-7 обладает достаточной гомологией с человеческим IL-7, что цитокин мыши стимулирует сигнальные пути в предшественниках B-клеток человека. Однако это не относится к тимусу стромального лимфопоэтина (TSLP), 5,6, который среди других цитокинов (IL-3, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор стволовых клеток (SCF) ,Ref>> 7 играет важную роль в образовании нормальных и злокачественных гемопоэтических клеток человека.Когда цитокины мыши и человека демонстрируют низкую гомологию, цитокины мыши не активируют их соответствующие рецепторы на клетках человека.Чтобы преодолеть это препятствие, был использован ряд стратегий Для разработки экспрессии цитокинов человека у мышей PDX, которые включают инъекцию рекомбинантных человеческих цитокинов, гидродинамическую инъекцию ДНК, лентивирусную экспрессию, трансгенную экспрессию и замещение гена knockin.7 В этом докладе описывается способ конструирования PDX для продуцирования человеческого цитокина через опосредованный стромальными клетками Цитокинов ( рис. 1 ).
В методе, продемонстрированном здесь, мышей PDX сконструировали для экспрессии человеческого цитокина, TSLP или для того, чтобы служить в качестве отрицательных контролей для цитокинов. TSXP-экспрессирующие PDX достигаются еженедельными внутрибрюшинными инъекциями стромальных клеток, которые были трансдуцированы для экспрессии высоких уровней TSLP человека.Аналогичным образом сконструированы мыши с «отрицательным» цитокином PDX «контроля»; Хотя контрольную строму трансдуцируют контрольным вектором. Этот метод обеспечивает нормальные физиологические уровни человеческого TSLP у мышей PDX, инъецированных стромой TSLP +. Не обнаружено TSLP у мышей PDX, получающих цитокин-негативную строму. Мы выбрали линию стромальных клеток человека HS-27A для наших исследований, потому что она устойчиво растет в культуре и демонстрирует очень низкий уровень продуцирования цитокинов, который не поддерживает пролиферацию изолированных клеток-предшественников в сокультурах. 8 Для экспрессии TSLP человека строма была трансдуцирована с самоинтавивирующим лентивирусным вектором передового поколения, полученным из ранее описанной основной цепи, 9 и включает элемент cPPT / cts и посттранскрипционный регуляторный элемент лечаного гепатита (WPRE) для увеличения экспрессии трансгена. Ген человека TSLP был сконструирован в этот вектор под контролем фактора элонгации-1(EF-1) альфа-промотор для достижения устойчивой, конститутивной и долговременной экспрессии.
Разработка этой модели человеческих цитокинов с улучшенной PDX состоит из 4 основных этапов. Во-первых, трансдуцированная строма расширяется in vitro и оценивается с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) для стабильного высокого уровня продукции цитокинов. Во-вторых, активность человеческого цитокина, продуцируемого трансформированными стромальными клетками (и отсутствие активности цитокинов из контрольной стромы), проверяется с использованием фосфо-проточной цитометрии. Клеточные линии, которые, как известно, реагируют на цитокин, представляющий интерес (в данном случае, TSLP), инкубируют с супернатантом стромальных клеток и анализируют на индуцированное цитокинами фосфорилирование. В-третьих, мыши инъецируют трансдуцированную строму человека, и затем мышь плазма оценивается методом ELISA для уровней цитокинов человека еженедельно. В-четвертых, человеческие гемопоэтические клетки трансплантируют, и функциональные эффекты in vivo человеческого цитокина оценивают на известной мишени ( Доставка человеческого цитокина через стромальные клетки имеет как преимущества, так и недостатки по сравнению с другими методами доставки / продуцирования человеческих цитокинов у мышей PDX. 7 По сравнению с инъекцией рекомбинантного человеческого цитокина опосредованная стромой доставка обычно менее дорогостоящая (стоимость культуры стромальных клеток меньше, чем стоимость рекомбинантного цитокина) и менее трудоемкая (одна инъекция в неделю по сравнению с несколькими инъекциями в неделю). Проблема короткого периода полужизни цитокинов также смягчается, поскольку строма постоянно создает экзогенный цитокин. Доставка цитокина посредством гидродинамического введения ДНК может быть менее дорогостоящей, чем доставка через строму. Тем не менее, он аналогичен временному и может потребовать более технических навыков, чем простая еженедельная внутрибрюшинная инъекция, необходимая для опосредованной стромой доставки. Экспрессия гена лентивирусов в мыши может обеспечить меньшуюМетод доставки цитокинов; Однако, в наших руках физиологические уровни TSLP не были достигнуты. Кроме того, этот метод является трудоемким, требующим непрерывного получения лентивирусного вектора. Мыши с трансгенным или выбитым концом обладают стабильной долговременной экспрессией цитокина и могут быть сконструированы для тканеспецифичной экспрессии, что может быть преимуществом. С другой стороны, трансгенная экспрессия гена цитокина человека на фоне иммунодефицитных мышей, требуемая для мышей PDX, требует огромных инвестиций в ресурсы до того, как будет установлена ценность модели. Кроме того, трансгенные модели обычно не позволяют варьировать время начала цитокинов или уровень продукции цитокинов in vivo . Это может быть достигнуто с помощью опосредованной стромой доставки, просто изменяя временной момент для начала инъекции стромальных клеток или дозу вводимых стромальных клеток. Метод доставки цитокинов, опосредованный стромальными клеткамиOd, подробно описанная здесь, была использована для разработки PDX для оценки роли TSLP в развитии нормальной B-клетки человека 4,6 и острой лимфобластной лейкемии B-клеток высокого риска. 6 Этот метод обеспечивает альтернативный метод доставки цитокинов для использования при создании сходных моделей с человеческими цитокинами, отличными от TSLP. Эта модель также может быть полезна для создания предварительных данных, которые могут помочь определить, будет ли ценность модели PDX, трансгенной по цитокину или цитокину, достойной значительных временных и денежных инвестиций. 
Рисунок 1: Модель PDX, разработанная для производства экзогенного человеческого цитокина у мышей. ( 1A ) Проектный эксперимент и получение трансдуцированных человеческих стромальных клеток ( 1B ). Получают человеческие клетки (гемопоэтические стволовые клетки, клетки лейкемии и т . Д.) Для получения PDX (полученных пациентом ксенотрансплантатов) мышей. ( 2A ) Инжектируют сконструированную строму и ( 2B ) трансплантируют человеческие клетки в иммунодефицитных мышей согласно экспериментальному графику. ( 3A-B ) Контролировать концентрации цитокинов в супернатанте стромы и мышиной плазме с помощью ELISA. ( 4 ) Убирать человеческие клетки и оценивать функциональные эффекты in vivo человеческого цитокина, присутствующего в PDX. Пожалуйста, нажмите здесьДля просмотра увеличенной версии этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования проводились в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Лома-Линды (IACUC) и Советом институциональных обзоров (IRB), утвержденными протоколами и в соответствии со всеми федеральными руководящими принципами.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: PDX и ткани человека должны обрабатываться в соответствии с процедурами безопасности, чтобы предотвратить передачу переносимых кровью патогенов.
1. Культура и экспансия цитокин-трансдуцированных стромальных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый раз, когда строма пассируют, собирают супернатант культуры (1 мл аликвоты) и хранят при -80 ° С для будущей количественной оценки уровня цитокинов с помощью ELISA-анализа.
- Подготовьте культуральную среду R10 и среду для замораживания, как описано в таблице материалов.
- Генерируют 10 , 11 или получают контрольную строму (трансдуцированную с пустым вектором) и строму, продуцирующую цитокин (TSLP +)."> 6 Хранить в жидком азоте (LN 2 ) до использования. Оттаивать стромальные клетки, как описано 12, и высаживать их в 5 мл среды R10 в отдельных колбах для культуры клеток Т-25. Культурные клетки в инкубаторе при 37 ° С с 5% CO 2. Это пост-оттепель «проход № 1».
- После того, как строма сливается (24-48 ч), прохождение клеток путем трипсинизации с использованием 1 × трипсина ЭДТА (0,25%) и повторное покрытие в культуральной колбе Т-150. Это пост-оттепель «отрывок № 2».
- Когда строма достигает слияния в колбах Т-150 (3-4 дня спустя), прохождение клеток трипсином. Используйте эту суспензию клеток для экспериментальных нужд.
- Расширение клеток до нескольких колб
- Разбейте собранные клетки между тремя колбами Т-150 и культурой до конфлюэнтности. Повторите этот шаг, если расширение стромы необходимо. Типичный человеческий стромальный (HS-27A) подсчет клеток при слиянии в колбе Т-150 составляет ~ 5 × 10 6 .
- Cell storage
- Передайте суспензию собранных клеток в коническую трубку и центрифугируйте при 500 xg в течение 5 минут, декантируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в замороженной среде. Заморозить и хранить в LN 2 ~ 1,5 х 10 6 клеток на флакон.
- Для интраперитонеальной инъекции стромы мышам переходите к шагу 4.1.
- Расширение клеток до нескольких колб
2. Анализы ELISA для контроля продукции цитокинов in vitro из трансдуцированной стромы
- Приобретите коммерчески доступный набор для анализа ELISA для выявления интересующего цитокина.
- Отсев оттаивания стромальных клеток от контрольной и строма цитокинов (TSLP +) стромы, собранной на ранних, средних и поздних проходах ( рис. 2 ).
- Определите концентрацию TSLP в супернатантных образцах с использованием набора ELISA в соответствии с инструкцией производителя. 13 Скомпилируйте эти серийные данные для контроля стабильности продукции цитокинов во время клеточного культивирования E ( фиг. 2A-B ).
- Определить и отменить строму, продуцирующую цитокин, с выраженной или субоптимальной экспрессией цитокинов, а также любые соответствующие флаконы в хранилище ( фиг. 2A-B ).
- Определите и поддерживайте цитокин-продуцирующую строму, которая демонстрирует стабильные концентрации цитокинов высокого уровня. Используйте эти оттепели для экспериментов.
- Используйте набор для ELISA для регулярного контроля стромы на протяжении всей клеточной культуры (по крайней мере, 1 раз во время ранних, средних и поздних послеоттаивающих проходов), чтобы обеспечить стабильное производство цитокинов или, в случае контрольной стромы, отсутствие продукции цитокинов ,
3. Фосфо-проточные цитометрические анализы для оценки активности цитокина, продуцируемого Stroma
ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените супернатант от сконструированной стромы перед первым экспериментом, чтобы проверить соответствующую биоактивность строма-генерируемого цитокина для индивидуального эксперимента.Ef "> 6 Как только спроектированная строма проверена, дальнейшее тестирование не требуется, если не ввести строму, которая была получена с новым вектором.
- Купите клеточные линии MUTZ5 и / или MHH-CALL4 лейкоза (TSLP responsive), 14 рекомбинантных человеческих цитокинов и антитела, одобренные для использования в тестах на фосфоточную цитометрию для обнаружения соответствующих мишеней фосфорилирования в нижнем течении.
- Оттепель убирают супернатант из контрольной и цитокин-экспрессирующей стромы.
- Пластины клеточных линий лейкемии в среде R20 (см. Таблицу материалов ) при концентрации 0,2 × 10 6 клеток на лунку в 96-луночном планшете для культуры ткани. Пластину 3 лунки на условие, чтобы провести трехкратное испытание. Инкубируйте в течение 2 ч при 37 ° C. Это время позволяет потерять любое фосфорилирование, которое произошло во время предшествующих условий культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: 12 лунок на клеточную линию обеспечивают тройные анализы для каждого экспериментального условия, показанного на этапе 3.4. <Li> Через 2 часа культивирования переносят клетки из каждой лунки для отделения 4 мл пробирок и центрифугирования при 500 xg в течение 5 мин при 4 ° C. Декантируют супернатант. - Повторно суспендируют клетки по 200 мкл для каждого из следующих экспериментальных условий (выполняют анализы в трех повторностях): 1) только отрицательные контрольные среды; 2) положительные контрольные среды с рекомбинантным цитокином при насыщающей концентрации (сек) (TSLP при 15 нг / Мл и т . Д.), 3) контролируют строма-супернатант из контрольной стромы и 4) супернатант цитокин-строма из стромы, продуцирующей цитокин.
- Инкубируйте клетки в течение времени, указанного в конкретном коммерческом фосфометрическом анализе ( например, 30 мин для фосфо-STAT5 в MUTZ5 или MHH-CALL4 в ответ на TSLP).
- Центрифугируйте при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и декантируйте супернатант.
- Проводят окрашивание по фосфорно-проточной цитометрии по протоколу изготовителя и собирают данные по проточной цитометрии. 15
- Ворота на интактных клетках на основе прямого (FSC, указывает размер ячейки) и стороны (SSC, указывает гранулярность ячейки) рассеивают свет.
- Определите среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) интактных клеток в каждом образце. Сравните среднюю MFI, полученную из тройных значений супернатанта стромальных клеток, с показателями положительного и отрицательного контроля среды.
4. Инъекция трансформированной цитокином стромы в мышей
ПРИМЕЧАНИЕ. Культура строма HS-27A для минимум 3 проходов после оттаивания перед инъекцией их в мышей для обеспечения здоровых клеток и адекватного продуцирования цитокинов.
- Приготовление стромы
- Передача собранной суспензии стромальных клеток в коническую трубку и аликвоту 10 мкл для подсчета гемоцитометра; Получить живой подсчет клеток с использованием трипанового синего. 16 Центрифуга оставшаяся частьЛ суспензии при 500 × g в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант из гранулированных клеток и осторожно ресуспендируйте клетки в необходимом объеме стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) для инъекции мыши (в зависимости от количества мышей для инъекции).
ПРИМЕЧАНИЕ Типичная концентрация стромальных клеток для инъекции мыши: 0,5 × 10 6 -5 × 10 6 клеток на мышь в 200 мкл PBS. - Держите суспензию стромальных клеток при 4 ° C (или на льду) до момента непосредственно перед инъекцией. Убедитесь, что клеточная суспензия, по крайней мере, при комнатной температуре (RT) (~ 25 ° C) для инъекции мышей.
- Инъекция стромальных клеток
- Продезинфицируйте капюшон для биозащиты, соберите материалы для инъекций и затем поместите клетку для мыши внутрь.
- Аккуратно смешайте клеточную суспензию путем инверсии перед составлением 200 мкл в туберкулиновый шприц.
- Используя стандартные методы внутрибрюшинной инъекции, 17Сдерживают мышь и вводят суспензию клеток 200 мкл в брюшную полость. Детали ранее были продемонстрированы Machholz et al. 18
5. Последовательный сбор крови и контроль плазмы для экзогенного человеческого цитокина у мышей
- Сбор крови через хвостовую часть
- Продезинфицируйте капюшон для биобезопасности и прикрепите фиксатор для мыши, ножницы и другие инструменты / принадлежности для процедуры.
- Поместите мышь в ограничитель и закрепите трубу, чтобы минимизировать движение мыши.
- Продезинфицируйте хвост и хирургические ножницы изопропиловым спиртом. Нанесите местный анестетический крем на хвост.
- Использование очень острых хирургических ножниц срезает примерно 0,5 - 1 мм кончика хвоста мыши. Соберите приблизительно 80 мкл периферической крови, используя гепаринизированные капиллярные трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь будет собрана с помощью этого метода более шести тиMes, удаление хвоста должно быть консервативным по отношению к удалению хвоста. По мере продвижения ножниц диаметр увеличивается, кровоизлияние происходит быстрее, а заживление занимает больше времени.
- Отделение плазмы
- Перенесите кровь, используя шприц для луковицы (чтобы вытолкнуть его из капиллярных трубок) в пробирку с микропробиркой K 2 EDTA; Инвертировать 20 раз, чтобы предотвратить коагуляцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, свертывание крови из заднего зажима происходит быстро. Однако, если кровоизлияние сохраняется дольше, чем ~ 2 мин, используйте кровоостанавливающий карандаш / порошок для облегчения коагуляции. - Пробирки для сбора крови центрифугируют в соответствии с инструкцией производителя и аликвотуйте плазму для хранения (-20 ° C) до готовности к анализу ELISA.
- Если необходимы данные о химеризме мышь-человек от мышиной крови, затем обработайте оставшуюся таблетку, как описано на этапе 6.3.1. В противном случае, отказаться от гранул клеток крови.
- Перенесите кровь, используя шприц для луковицы (чтобы вытолкнуть его из капиллярных трубок) в пробирку с микропробиркой K 2 EDTA; Инвертировать 20 раз, чтобы предотвратить коагуляцию.
- Модифицированный ELISA для микрообъемУмы плазмы мыши
ПРИМЕЧАНИЕ. Процедура ELISA изготовителя была изменена с рекомендованного объема образца 100 мкл до объема 40 мкл для размещения микротомов, собранных у мышей. Невозможно запустить образцы плазмы крови in vivo в трех экземплярах с этими ограниченными объемами. В конце эксперимента ~ 500 мкл посмертной крови собирается через сердечную пункцию. Концентрации цитокинов, оцененные в 100 мкл эвтаназии плазмы, используются для проверки 40 мкл данных in vivo для каждой мыши.- Оттепель замороженных образцов плазмы мыши.
- Серийно разбавляют стандарты ELISA и помещают их в трех повторностях при 40 мкл на лунку.
- Добавить 40 мкл каждого образца плазмы мыши к ELISA пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если образец мыши составляет менее 40 мкл, то доведите объем до 40 мкл с помощью буфера для ELISA. Запишите объем разбавителя и используйте его для расчета коэффициента разбавления для каждого разбавленного образца. когдаАнализ данных ELISA умножают разведенную концентрацию образца на коэффициент разбавления образца для определения фактической концентрации цитокинов в исходном образце. - Полный анализ ELISA в соответствии с инструкциями производителя.
6. Трансплантация гематопоэтических клеток в мышей
- Сублетальное облучение до состояния костного мозга для трансплантации
ПРИМЕЧАНИЕ: Университет Лома-Линда (LLU) использует источник излучения кобальта-60. Животных помещают в ограничитель пирога, который располагается на расстоянии 80 см от источника излучения в поле размером 20 х 20 см и слоем Лексана толщиной 0,5 см поверх ограничителя. Время экспозиции рассчитывается таким образом, чтобы достичь дозы 225 сГy, основываясь на самой последней калибровке источника (в настоящее время это значение составляет 2-3 минуты).- Суб-летально облученных мышей (общая доза облучения тела 225 сГр максимум для иммунодефицитных мышей).
- Гематопоэтические клетки трансплантата через 24 ч через </ Em> внутривенная инъекция хвостовой вены.
- Внутривенная трансплантация гемопоэтических клеток
- Готовят суспензии клеток человека для трансплантации в объеме 200 мкл стерильного PBS на мышь: CD34 + гемопоэтические стволовые клетки (HSC): 1 × 10 5-5 × 10 5 клеток на мышь и лейкозные клеточные линии / образцы пациентов: 1 × 10 6 до 5 × 10 6 клеток на мышь.
- Держите клетки при 4 ° C (транспортировка на льду) до непосредственно перед пересадкой. Обеспечьте, чтобы клетки были как минимум в RT перед трансплантацией.
- Продезинфицируйте капюшон для биозащиты и подготовьте область капюшона для инъекций трансплантата.
- Поместите мышь в нагревательную клетку в течение как минимум 5 минут, чтобы позволить расширение вен хвоста.
- Аккуратно перемешайте суспензию клеток и добавьте 200 мкл в туберкулиновый шприц. Безопасно отложите иглу, где она останется стерильной.
- Поместите мышь в удерживающее устройство и продезинфицируйте хвост изопропиловым спиртом. </ Li>
- Используя стандартные методы внутривенной инъекции, 17 вводят суспензию клеток человека в хвостовую вену мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: инъекции хвостовых вен могут потребовать нескольких попыток, особенно для начинающего животного-обработчика. Kovacscics и Raper's JoVE video 19 детально демонстрируют эту технику животного. - Мониторинг восстановления мыши на ~ 5 мин. Записывайте любые неблагоприятные события во время инъекции ( например, пролитые клетки, крупные кровотечения, чрезмерная травма хвоста).
- Анализ химеризма клеток человека в периферической крови мыши
- Получите осадок клеток крови, оставшийся в микротрубочке после разделения плазмы (шаг 5.2.3).
- Для лизиса эритроцитов (RBC) ресуспендируйте остатки крови в объеме PBS, равном удаленной плазме (чтобы заменить объем плазмы) и хорошо перемешайте (вихрь / пипетка).
- Перенесите каждый ресуспендированный образец крови в пробирку с 4 мл меткойИ затем добавить буфер лизиса эритроцитов к каждой пробирке в соотношении 1: 9 (900 мкл буфера для лизиса эритроцитов для 100 мкл повторно суспендированной крови). Инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга (5 мин, 500 мкг) и декантат.
- Выполните вторую инкубацию буфера лизисного эритроцита (5 мин при комнатной температуре). Центрифуга и декантировать, как раньше.
- Промыть оставшиеся клетки в ~ 1 мл PBS. Центрифуга и декантировать, как раньше.
- Ресуспендируют осадок в объеме PBS, подходящем для окрашивания стандартной проточной цитометрией (это варьируется в зависимости от изготовителя и индивидуальных лабораторных протоколов). 20 Используйте антитела иммунофенотипирования, подтвержденные для проточной цитометрии, для идентификации клеток мыши (CD45 + мыши) и клеток человека (CD45 + человека) 6 , 21 А также дополнительные маркеры лейкоцитов человека, специфичные для интересующей линии клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется брать небольшой объем (5 мкл-20 мкл) из каждого образца мыши для создания «пустых образцов»,; Для использования в образцах с контрольным образцом с неокрашенными, жизнеспособными и изотипическими свойствами. Лучше всего иметь неокрашенные и изотипные контрольные образцы для каждого экспериментального условия.
7. Функциональная оценка активности цитокинов in vivo
- Эвтаназия и уборка тканей мыши
- Усыпляют мышей через асфиксию CO 2 в назначенный экспериментальный момент времени.
- Убирают кровь через сердечную пункцию и собирают плазму, как на этапах 5.2.1-5.2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ. Соберите кровь перед другими тканями, потому что она начинает коагулировать сразу после смерти. - Обработайте кровь мыши, аликвоту и сохраните плазму, как на этапе 5.2.2.
- В более позднее время оценивают концентрацию экзогенных цитокинов в плазме, полученной при эвтаназии с помощью ELISA, в соответствии с протоколом производителя. Оценить и сравнить концентрации экзогенных цитокинов в плазме мышей из серийных in vivoСбор крови и образцы эвтаназии плазмы (описано в разделе 5.3).
- Добавить PBS к оставшемуся образцу крови, чтобы заменить объем и процесс в плазме, как описано в шагах 6.3.1 и 6.3.2. Выполните анализ проточной цитометрии немедленно или ресуспендируйте клетки в среде для замораживания для хранения LN 2 .
- Убирают костный мозг (BM) и селезенку у мышей PDX и готовят суспензии отдельных клеток, как описано выше. 22
- Получают количество клеток для каждого образца ткани мыши PDX, используя 3% уксусную кислоту с метиленовым синим (мембраны клеток лизиса и эритроциты, оставляющие интактные ядра живых клеток) в разведении 1: 1 и подсчет клеток с использованием гемоцитометра. Составьте таблицы общего количества клеток для образцов костного мозга и селезенки для каждого животного.
- Центрифуга (500 xg, 15 мин) клеточных суспензий и декантировать супернатант. Выполните анализ проточной цитометрии клеток костного мозга и / или селезенки немедленно или ресуспендируйте в замораживающей среде для LN <Sub> 2 storage.
ПРИМЕЧАНИЕ: заморозить 10 аликвот BM (для будущих биохимических анализов) и ~ 5 аликвот селезенки (для будущих трансплантаций PDX) на мышь. - Иммунофенотипирование для определения функциональных эффектов in vivo
- Подготовьте один микс (ММ) антител к проточной цитометрии к популяции (гематопоэтических) иммунофенотипа, реагирующей на интересующий цитокин, и вторую ММ изотипических контрольных антител ( рис. 5 и таблица материалов).
- Разморозьте аликвоты ткани PDX (ванна с шариками 37 ° C), приготовленная на этапе 7.4.
- Промойте оттаявшие клетки, переложив их в коническую трубку и добавив минимум 3х объемов PBS. Центрифуга (500 мкг, 5 мин) и декантировать супернатант.
- Повторите этап промывки (7.5.3).
- Создайте объединенные аликвоты, взяв ~ 10 мкл-20 мкл клеток из каждого образца PDX для контроля без окраски, контроля жизнеспособности и контроля изотипа (см. Примечание этапа 6.4.6). Окрашивают все образцы, кроме uС фиксированным жизнеспособным красителем (маркером мертвых клеток), инкубируют и промывают в соответствии с протоколом производителя.
- Окрашивают каждый образец PDX-клеток фенотипированием-MM в соответствии со стандартным протоколом окрашивания методом проточной цитометрии; Аналогичным образом окрашивают объединенный образец (ы) изотипического контроля с изотипом-ММ. Инкубируйте все образцы, промывайте PBS и фиксируйте образцы повторным суспендированием в 1% параформальдегиде.
- Собирают данные по проточной цитометрии и анализируют данные, используя стратегию стробирования, подходящую для интересующей популяции клеток ( рисунок 5 ). Типичная стробирование выглядит следующим образом:
- Определите неповрежденные ячейки, рисуя FSC и SSC-ворота, которые исключают обломки.
- Определите популяцию живых клеток, стробируя клетки, которые отрицательны для маркера мертвой клетки (это «полные живые клетки»).
- Используйте суб-ворота в «живых клетках», чтобы определить клеточные популяции с нужным иммунофенотипом (см. Рисунок 5).
- ПолучитеЧастота популяций подмножества клеток в общем количестве живых клеток из анализа проточной цитометрии. 6 , 21
- Рассчитайте количество клеток-мишеней в каждой ткани, умножив частоту поднабора В-клеток в пределах общих живых клеток (полученных на этапе 7.5.6.4) на общее число живых клеток на ткань, полученную на этапе 7.3 (подмножество% В-клеток х " Количество гемоцитометрических клеток ", см. Таблицу 1 )
- Сравните подсчеты клеток популяций целевых клеток между контрольными мышами PDX и мышами, экспрессирующими цитокин (TSLP +), для определения in vivo функциональных эффектов экзогенного цитокина человека ( таблица 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор модели показан на рисунке 1 . После получения цитокинов (TSLP + строма) и контрольной стромы они размножаются в культуре. Перед инъецированием стромы в мышей супернатант стромальных клеток оценивают с помощью ELISA для подтверждения продукции цитокинов ( фиг. 2 ), а фосфопоточную цитометрию (протокол № 3) используют для проверки активности цитокина, продуцируемого стромой. Супернатант собирают из сливных культур стромальных клеток (контрольная строма и строма TSLP +), когда клетки пассируют. ELISA используется для мониторинга концентрации TSLP в супернатанте, по крайней мере, один раз в ранних, средних и поздних проходах. Репрезентативные данные из контрольной стромы показаны на рисунке 2А . Контрольные культуры стромальных клеток, которые показывают экспрессию TSLP (и любые пузырьки, замороженные из них), должны быть отброшены. Контрольные культуры с необнаружимым TSLP расширяются и замораживаются для дальнейшего использования.Как показано на рисунке 2B, культуры TSLP + стромы, показывающие низкое образование TSLP (и пузырьки, замороженные вниз от них), отбрасываются. Строма TSLP +, показывающая стабильное высокоуровневое продуцирование цитокина, отбирается для расширения и хранения для использования в будущих экспериментах. Средние уровни TSLP в супернатанте из множественных культур контроля и стромы TSLP + показаны на рисунке 2C .
Экспериментальный график производства контрольных мышей PDX с человеческим цитокином показан на рисунке 3 . Культуры стромальных клеток начинают за 3 недели до трансплантации, и анализ ELISA in vitro продуцирования TSLP в супернатанте культуры осуществляют, как описано на фиг.2. In vivo TSLP человека в мышиной плазме контролируют еженедельно ( фиг. 4 ), используя «модифицированный ELISA для Микротомов мышей плазмы ", описанных в Протоколе № 4. PeripheraЛ крови собирают одновременно с плазмой и анализируют, как описано в Протоколе # 6 в разделе «Анализ химеризма клеток человека в периферической крови мыши». PDX, инъецированный стромой контроля, последовательно показывал уровни TSLP в плазме человека, которые были ниже порогового значения для обнаружения ( рисунок 4A ). Уровень плазмы TSLP у мышей PDX, инъецированных TSLP + стромой, пропорционален количеству TSLP + стромальных клеток, инъецированных в течение предшествующих 1 - 2 недель. Плазменные уровни TSLP быстро падают, если инъекции стромальных клеток прекращаются. 6 Как видно из рисунка 4В , еженедельные инъекции 0,5 × 10 6 TSLP + стромы (продуцирующей в среднем> 1000 пг / мл TSLP в культуральном супернатанте) дали уровни TSLP в плазме вблизи нижней границы физиологических уровней (~ 5-10 пг / мл ). Еженедельная инъекция 5 × 10 6 TSLP + стромы у мышей PDX приводила к достижению уровня TSLP в плазме, который достигает высоких физиологических уровней (~ 35 пг / мл), как показано в
Было показано, что TSLP увеличивает производство нормальных предшественников В-клеток человека. Таким образом, для оценки функции in vivo TSLP мы сравнили продукт Иона нормальных человеческих предшественников В-клеток в контроле и мышей TSLP + PDX, трансплантированных гемопоэтическими стволовыми клетками, как показано на фиг.5 и в таблице 1 . На фиг. 5A показано строение проточной цитометрии для иммунофенотипирования, используемое для идентификации подмножеств клеток линии B человека. Примеры расчетов для перечисления количества ячеек в каждом подмножестве для одного управляющего PDX и одного TSLP + PDX показаны в таблице 1 . Как показано на фиг. 5В, клетки В линии значительно увеличены в TSLP + по сравнению с контролем PDX, и это увеличение начинается с самых ранних предшественников В-клеток (про-В-клетки). Количество клеток линии не-B не значительно отличалось между контролем и TSLP + PDX (данные не показаны). Этот анализ обеспечивает способ проверки того, что человеческий TSLP, продуцируемый in vivo в TSLP + PDX, оказывает in vivo функциональные эффекты на популяцию клеток-мишеней.
Ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
Рисунок 2: ELISA для мониторинга концентраций цитокинов TSLP в супернатанте Stroma. Анализы ELISA использовали для измерения измеренных концентраций TSLP в супернатанте из контрольной стромы (трансдуцированной контрольным вектором) и TSLP + стромы (трансдуцированной для экспрессии TSLP человека), по меньшей мере, один раз во время следующих клеточных проходов: ранний (переход 1-5), средний (проходы 6-12) и позднее (отрывки 13-20). Порог обнаружения для человеческого ELL-анализа TSLP, используемого здесь, составляет 1,9 пг / мл (красная пунктирная линия). ( A ) Контрольная строма продуцирует минимально определяемые концентрации TSLP человека; Эти уровни, как правило, ниже порога обнаружения ELISA в течение всего эксперимента. Контрольную строму в культуре, которая показывает увеличение концентраций TSLP (> 15 пг / мл), отбрасываются вместе со всеми аликвотами, замороженными из этой культуры. ( B ) Производство TSLP человека варьирует между культурами, полученными из разныхT размороженные флаконы TSLP + строма ( n = 9) и на протяжении всего периода культивирования. Строма TSLP, которая показывает снижение или нестабильное производство цитокинов (TSLP <1000 пг / мл), также отбрасывается. ( C ) Средние концентрации TSLP для контрольной (зеленой) и TSLP + (голубой) стромы (означает и 95% доверительные интервалы). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспериментальная шкала для генерации PDX мышей с экзогенным образованием цитокинов человека. Эксперименты in vitro и in vivo протекают одновременно. Культура клеток стромы Control и + TSLP запускается за 2-3 недели до трансплантации гемопоэтических клеток, которая обеспечивает минимум 3 прохода клеток до первого (приWk -1) недельных инъекций стромальных клеток. Это гарантирует, что стромальные клетки здоровы, пролиферативны и продуцируют адекватные уровни цитокинов. Аликвоты надосадочной жидкости собирают, когда клетки пассируют, и анализы ELISA используют для определения концентрации TSLP (см . Фиг.2 ) в супернатанте стромы. Животных облучают в день 0, за день до трансплантации гемопоэтических клеток человека в день 1. Еженедельный сбор крови начинается через 1-2 недели после первой инъекции стромы. В это время экзогенные концентрации цитокинов человека должны быть обнаружены в плазме мыши с использованием модифицированных ELISA-анализов ( рисунок 4 ). Конечная точка эксперимента составляет 5-16 недель после трансплантации клеток человека; Это зависит от количества человеческих клеточных химеризм, обнаруженных в периферической крови мыши. Обычный нормальный гемопоэз, как правило, хорошо развивается на 5-7 неделе, химеризм клеток лейкемии варьирует между клеточными линиями и первичными образцами (3-16 недель). Успех и прогрессия трансплантата PDX также зависятОт количества человеческих клеток, инъецированных при трансплантации. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Достижение концентраций цитокинов TSLP в плазме мышей. Мыши получают еженедельные внутрибрюшинные инъекции (200 мкл) трансдуцированных клеток и их плазму собирают для оценки концентраций TSLP человека (ELISA assay) in vivo у мышей с течением времени. « Контрольные» мыши получали 5 × 10 6 контрольных клеток стромы, тогда как мышей линии «TSLP + low» (низкая доза строгой TSLP) получали 0,5 × 10 6 клеток TSLP + стромы, а мышей линии «TSLP + high» (высокие дозы строма TSLP) получали 5 × 10 6 TSLP + стромальных клеток каждую неделю. Человеческий TSLP ELISA анализ Порог обнаружения составляет 1,9 пг / мл (красная пунктирная линия), а физиологический диапазон человека для TSLP составляет ~ 5-35 пг / мл (серое затенение). 24 (ссылка 11 и неопубликованные данные Coats) ( A ) «Контрольная» плазма мыши последовательно имеет уровни TSLP <5 пг / мл или ниже порога обнаружения ELISA. ( B ) «TSLP + low» мышиная плазма показывает низкие физиологические уровни TSLP; Тогда как ( C ) «TSLP + high» плазмы мыши показывает высокие физиологические уровни. ( D ) Средние концентрации TSLP для каждой экспериментальной группы (среднее ± SEM всех мышей и временных точек) показывают, что уровни TSLP, обнаруженные в мышиной плазме, пропорциональны полученной дозе стромы; Уровни контрольной мышиной мыши ниже порога обнаружения ELISA, а уровни «TSLP + high» в плазме в четыре раза больше, чем уровни «TSLP + low» мышиных плазмы."> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ нормальных популяций клеток человека В подтверждают функциональные эффекты I n Vivo экзогенного человеческого TSLP у мышей PDX. Мыши PDX были сконструированы с контролем и строкой TSLP + и трансплантированы с человеческими CD34 + клетками, выделенными из пуповинной крови. Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии использовали для идентификации подмножеств предшественников В-клеток человека в костном мозге, собранном из контрольного и TSLP + PDX, следующим образом: собирали костный мозг, оттаивали и окрашивали фиксируемым жизнеспособным красителем и окрашивали для проточной цитометрии для определения анти- Человеческую CD45, CD19, CD34, легкую цепь & kappa ; и либо поверхностный IgD и IgM, либо внутриклеточный IgM (сμ). ( A ) Общая жилая площадьLs были построены на основе маркера жизнеспособности. Последовательные графики показывают последующие ворота для идентификации последовательных поднаборов линии B (данные показаны из TSLP + PDX). ( B ). Частоту каждого подмножества в живых клетках определяли с помощью программного обеспечения проточной цитометрии и рассчитывали количество клеток в каждом поднаборе В-клеток. (См. Таблицу 1). Количество клеток для каждого поднабора В-клеток в контроле (черный, n = 3) и TSLP + (синий, n = 5) PDX мышей графически. (Среднее ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Клетка человека | Freq. От общего количества живых клеток | Счетчик живых клеток iN BM | # Ячейки в популяции |
| Контрольная мышь | |||
| Всего живых клеток | 100,00% | 39,5 х 10 6 | 39,5 х 10 6 |
| hCD45 + | 98,50% | 39,5 х 10 6 | 38,9 х 10 6 |
| Всего CD19 + | 27,20% | 39,5 х 10 6 | 10,7 х 10 6 |
| Pro-B | 24,20% | 39,5 х 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Pre-B | 1,70% | 39,5 х 10 6 | 0,68 х 10 6 |
| Незрелые B | 0,83% | 39,5 х 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Зрелые B | 0,68% | 39,5 х 10 6 | 0,27 х 10 6 |
| TSLP + Mouse | |||
| Всего живых клеток | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 х 10 6 |
| Всего CD19 + | 65,10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60,20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 х 10 6 |
| Pre-B | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Незрелые B | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 х 10 6 |
| Зрелые B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 х 10 6 |
Таблица 1: Частота и количество нормальных клеток В человека в PDX костном мозге. Частота (%) каждого поднабора В-клеток в живых клетках определялась методом проточной цитометрии (см. Рисунок 5A для стратегии стробирования). Представлены репрезентативные данные костного мозга от одной контрольной мыши PDX (полученные контрольные стромальные инъекции, 5 x 10 6 клеток в неделю) и одна мышь TSLP + PDX (полученные инъекции стромы TSLP, 5 × 10 6 клеток в неделю). Общее число живых клеток ВМ регистрировалось при эвтаназии, а для оценки частоты поднабора (%) использовалась проточная цитометрия с иммунофенотипированием и вычислялся размер каждой популяции подмножества В-клеток (подсчет подмножества клеток = «totAl живых клеток "x" подмножества частот ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает простой, быстрый и относительно недорогой способ разработки PDX для экспрессии человеческого цитокина. Стратегия, описанная здесь, основана на еженедельных внутрибрюшинных инъекциях линии стромальных клеток, трансдуцированных для экспрессии человеческого цитокина TSLP. Перед выполнением описанных здесь способов строма, сконструированная так, чтобы выражать высокие уровни цитокина, представляющего интерес (TSLP), и генерируется подобным образом сконструированная контрольная строма. В представленных здесь протоколах строма расширяется в культуре и проверяется на способность обеспечивать стабильное продуцирование цитокинов высокого уровня с течением времени (или для отсутствия продуцирования цитокинов в случае контрольной стромы). Были проведены анализы для проверки активности продуцируемого стромы цитокина и были разработаны экспериментальные сроки для инъекции стромальных клеток для получения PDX с физиологическим TSLP человека (и контрольных мышей, у которых отсутствует TSLP человека). Процедуры для контроля уровней плазмы человеческого TSLP иДля проверки его in vivo функциональных эффектов на популяции клеток, чувствительных к цитокинам.
При выборе стромальных клеток и векторов, которые будут использоваться в протоколах, представленных здесь, следует учитывать несколько факторов. Стромальные клеточные линии не должны эндогенно продуцировать высокие уровни цитокина и не должны реагировать на интересующий цитокин. Для исследований здесь была выбрана стромальная клеточная линия костного мозга человека HS-27A, потому что она устойчиво растет в культуре с низким уровнем образования цитокинов. 8 Описанный здесь метод также включает «контрольный» PDX, спроектированный с той же стромой, что и TSLP + PDX, но без сверхэкспрессии TSLP. Сравнение результатов в TSLP + и контроле PDX позволяет нам контролировать любые эффекты, вызванные производством эндогенных цитокинов стромальных клеток. Трансдукция стромальных клеток с векторами, которые включают флуоресцентные белки или другие селективные маркеры, может быть полезна для выделения клеток thAt, вероятно, сверхэкспрессируют интересующий цитокин. Однако важно проанализировать супернатант цитокинов для определения уровня цитокина, продуцируемого стромальными клетками, потому что уровни цитокинов в плазме in vivo у мышей коррелируют с концентрацией цитокинов в супернатанте стромальных клеток 6 , а также количеством стромы, инъецированной на Еженедельно ( рисунок 4 ).
Важно, чтобы активность цитокина, продуцируемого стромой, проверялась до исследования PDX. Мы использовали фосфо-проточную цитометрию для анализа на молекулы, фосфорилированные после стимуляции TSLP в клетках, которые реагируют на TSLP. TSLP активирует пути JAK-STAT5 и PI3 / AKT / mTOR. Клеточные линии MUTZ5 и MHH-CALL4 лейкемии экспрессируют высокие уровни компонентов рецептора TSLP и показывают фосфорилирование STAT5, AKT и рибосомального протеина S6 после стимуляции TSLP. 14 Здесь мы использовали phopho-flow cytometryДля оценки фосфорилирования STAT5 (pSTAT5), индуцированного после стимуляции TSLP. В предыдущей работе мы оценивали дополнительные TSLP-стимулированные события фосфорилирования: phospho-AKT (pAKT) и фосфорибосомный белок S6 (pS6, ниже mTOR). Результаты показали, что анализ pAKT менее чувствителен и pS6 более чувствителен, чем анализ pSTAT5. 6 При проведении фосфометрических анализов чувствительные клетки следует культивировать с насыщающими уровнями рекомбинантного человеческого TSLP в качестве положительного контроля и только с средой (без цитокина) в качестве отрицательного контроля. Надосадочную жидкость из контрольной стромы следует анализировать вдоль стороны, что из TSLP + стромы в качестве второго средства проверки (в дополнение к ELISA), что TSLP не продуцируется контрольной стромой. Это также служит в качестве контроля для обеспечения того, что продуцирование эндогенных цитокинов не отвечает за фосфорилирование, наблюдаемое в анализах TSLP + клеток. В идеале фосфорилирование, вызванное образцами стромы цитокинов, должно быть сходнымКоторые наблюдаются с условием рекомбинантных цитокинов, хотя он может быть ниже, если концентрация цитокина в надосадочной жидкости ниже, чем в насыщающем положительном контроле. Хорошей альтернативой является положительный контроль с рекомбинантными уровнями TSLP, которые соответствуют уровням, наблюдаемым при ELISA для стромы TSLP +.
Выявление известных функциональных показателей активности цитокинов in vivo может быть проблемой. Анализы фосфорилирования могут быть невозможны, поскольку фосфорилирование, индуцированное экзогенным цитокином человека in vivo, может быстро теряться во время уборки ткани. Поскольку было показано, что TSLP увеличивает продукцию предшественников В-клеток человека 23 , функциональный эффект TSLP в PDX был проверен путем анализа in vivo увеличения популяции предшественников В-клеток человека с использованием иммунофенотипирования с проточной цитометрией. Альтернативная стратегия может быть анализом специфических индуцированных цитокинами изменений экспрессии генов и сопоставленийNg в клетках, собранных из экспрессирующих цитокин PDX в клетки из контрольного PDX. 6
Конечной целью экспрессии человеческого цитокина в PDX является создание доклинической модели, которая более точно моделирует среду in vivo, присутствующую у пациентов. Это было проверено путем сравнения экспрессии всего генома в тканях человека, выделенных из контрольного PDX и экспрессирующего цитокин (TSLP +) PDX, в исходные образцы пациентов. Эти исследования показали, что экспрессия гена в образцах пациентов значительно ближе к клеткам лейкемии из TSLP + PDX, чем к контрольным. Однако наши исследования были направлены на лимфопоэз. Ряд миелоид-стимулирующих цитокинов, продуцируемых в мыши, не активирует их человеческие рецепторные копии. Существуют человеческие мыши-нотки мышей цитокинов (мышей NSGS и другие), которые решают эту проблему. Действительно, одно значение модели, которую мы здесь описываем, состоит в том, что ее можно использовать у мышей NSGS для создания модели, которая более близкаEly моделирует среду in vivo человека, экспрессируя TSLP в дополнение к миелоид-стимулирующим человеческим цитокинам. С другой стороны, цитокин +/- система может быть сгенерирована у мышей NSG, используя способ, описанный здесь для каждого из этих миелоид-стимулирующих цитокинов. Эта модель может быть использована для изучения точной роли in vivo каждого из них в миелопоэзе и / или миелоидном лейкозе.
Разработанный PDX, который вырабатывает физиологические уровни человеческого TSLP, обеспечивает доклиническую модель, которая более точно имитирует среду in vivo, существующую в пациентах, чем классический PDX. 4 Также описано производство контрольных мышей PDX, которые подобным образом сконструированы. Вместе контроль и продуцирующий цитокины PDX создают человеческую TSLP +/- модельную систему, которую мы успешно использовали для оценки роли TSLP в in vivo продуцировании нормальных и злокачественных В-клеток человека. 4 , 6 ЭтоМодель очень важна для исследований конкретной формы высокого риска В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL), которая характеризуется генетическими изменениями, приводящими к гиперэкспрессии CRLF2. CRLF2 является рецептором цитокина TSLP, и, таким образом, индуцированная TSLP передача сигналов CRLF2, вероятно, способствует онкогенезу и прогрессированию CRLF2 + B-ALL. Использование PDX для изучения этого заболевания особенно важно, потому что PDX позволяет нам исследовать лейкемию в контексте генетического ландшафта пациента. Генетический ландшафт как фактор, вызывающий заболевание, сильно вовлечен в CRLF2 + B-ALL, который встречается в пять раз чаще у латиноамериканских детей, чем у других, и составляет половину всех случаев B-ALL у пациентов с синдромом Дауна. Модели PDX, экспрессирующие TSLP человека, такие как описанные здесь, будут важным инструментом для идентификации терапии и понимания механизмов болезни CRLF2 + B-ALL, а также для понимания нормального кроветворения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
