Summary
Beskrevet her er en fremgangsmåde til fremstilling af eksogent cytokin i patient-afledte xenograftmus (PDX) via ugentlig intraperitoneal injektion af en cytokin-transduceret stromalcellelinie. Denne metode udvider anvendeligheden af PDX og giver mulighed for transient eller vedvarende eksogen cytokinlevering i en lang række PDX-modeller.
Abstract
Patientafledte xenograftmus (PDX) produceres ved transplantation af humane celler til immundeficente mus. Disse modeller er et vigtigt redskab til at studere mekanismerne for normal og malign hæmatopoiesis og er guldstandarden til at identificere effektive kemoterapier for mange maligniteter. PDX-modeller er mulige, fordi mange af muscytokinerne også virker på humane celler. Dette er imidlertid ikke tilfældet for alle cytokiner, herunder mange, der er kritiske for at studere normal og ondartet hæmatopoiesis i humane celler. Teknikker, der konstruerer mus for at fremstille humane cytokiner (transgene og indstiksmodeller) kræver betydelig udgift, før brugbarheden af modellen er blevet påvist. Andre teknikker er arbejdskrævende (indsprøjtning af rekombinant cytokin eller lentivirus) og i nogle tilfælde kræver højt niveau af teknisk ekspertise (hydrodynamisk injektion af DNA). Denne rapport beskriver en simpel metode til generering af PDX-mus med eksogen human cyTokin (TSLP, thymisk stromal lymfopoietin) via ugentlig intraperitoneal injektion af stroma, der er blevet transduceret for at overudtrykke dette cytokin. Anvendelse af denne metode tilvejebringer en in vivo kilde til kontinuerlig cytokinproduktion, der opnår fysiologiske niveauer af cirkulerende humant cytokin i musen. Plasmaniveauer af humant cytokin kan varieres baseret på antallet af injicerede stromalceller, og cytokinproduktion kan påbegyndes på et hvilket som helst tidspunkt i eksperimentet. Denne metode indbefatter også cytokin-negative kontrolmus, der fremstilles tilsvarende, men gennem intraperitoneal injektion af stroma transduceret med en kontrolvektor. Vi har tidligere vist, at leukæmiceller høstet fra TSLP-udtrykkende PDX, sammenlignet med kontrol PDX, udviser et genekspressionsmønster mere som den oprindelige patientprøve. Sammen fremstiller de cytokinproducerende og cytokin-negative PDX-mus produceret ved denne metode et model system, som vi har anvendt med succes til at studereTSLP's rolle i normal og ondartet hæmatopoiesis.
Introduction
Patientafledte xenotransplantater (PDX) er en kraftig in vivo model til undersøgelse af produktion af normale og ondartede hæmatopoietiske celler i et "indfødt" pattedyrsmiljø. Oftest produceres PDX ved at injicere eller transplantere humane celler til immundeficente mus. Produktionen af PDX ved anvendelse af normale humane hæmatopoietiske stamceller muliggør in vivo undersøgelser af normalt humant blod og immuncelleudvikling. PDX produceret af leukæmi eller andre kræftceller gør det muligt at studere onkogene mekanismer og identificere effektive terapier i sammenhæng med omfanget af genetiske landskaber og mutationer, der er til stede i den humane befolkning. 1 PDX er derfor den nuværende guldstandard for translationel biomedicinsk forskning for at identificere effektive terapier og et vigtigt redskab til at forstå mekanismerne for kræftprogression. PDX-modeller er et vigtigt redskab til at støtte forskning i sundhedsforskelle sygdomme som følge af specifikke Genetiske læsioner eller enhver sygdom, hvor variationerne af patientens genetiske landskab kan bidrage væsentligt til onkogenese og behandlingsresultat.
Mus-humane PDX-modeller er mulige, fordi mange muscytokiner efterligner passende deres humane analoger ved aktivering af cytokinreceptorerne af humane celler, mens de er inde i musen. For eksempel tilvejebringer interleukin-7 (IL-7) et kritisk signal for human B-celleudvikling. 2 I dette tilfælde har mus IL-7 tilstrækkelig homologi med humant IL-7, at musecytokinet stimulerer signalveje i humane B-celleprecursorer. 2 , 3 , 4 Dette er imidlertid ikke tilfældet for thymisk stromal lymfopoietin (TSLP), 5 , 6 som blandt andet cytokiner (IL-3, granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), stamcellefaktor (SCF) ,Ref "> 7 er vigtig for produktion af normale og maligne humane hæmatopoietiske celler. Når mus og humane cytokiner viser lav homologi, aktiverer muscytokinerne ikke deres respektive receptorer på humane celler. For at overvinde denne hindring er der blevet anvendt en række strategier Til at konstruere ekspression af humane cytokiner i PDX-mus. Disse indbefatter injektion af rekombinante humane cytokiner, hydrodynamisk injektion af DNA, lentiviral ekspression, transgen ekspression og knockin-genudskiftning. 7 Denne rapport beskriver en metode til konstruktion af PDX til fremstilling af humant cytokin via stromalt medieret Cytokin-afgivelse ( figur 1 ).
I den viste fremgangsmåde er PDX-mus konstrueret til at udtrykke det humane cytokin, TSLP eller at tjene som cytokin-negative kontroller. TSLP-udtrykkende PDX opnås ved ugentlige intraperitoneale injektioner af stromaceller, der er blevet transduceret for at udtrykke høje niveauer af human TSLP.Cytokin-negative PDX "kontrol" -mus er ligeledes konstrueret; Selvom kontrolstroma transduceres med en kontrolvektor. Denne metode opnår normale fysiologiske niveauer af human TSLP i PDX-mus injiceret med TSLP + stroma. Ingen detekterbar TSLP observeres i PDX-mus, der modtager den cytokin-negative stroma. Vi valgte den humane stromal cellelinie HS-27A for vores studier, fordi den vokser robust i kultur og viser meget lavt niveau af cytokinproduktion, der ikke understøtter proliferation af isolerede stamceller i kulturer. 8 For human TSLP-ekspression blev stroma transduceret med en avanceret generations selfinaktiverende lentiviral vektor afledt af en tidligere beskrevet rygrad 9 og indbefatter cPPT / cts-elementet og woodchuck hepatitis post-transkriptionel regulatorisk element (WPRE) for at forøge transgenekspression. Det humane TSLP-gen blev konstrueret i denne vektor under kontrol af forlængelsesfaktoren-1(EF-1) alfa-promotor for at opnå robust, konstitutivt og langsigtet udtryk.
Konstruktionen af denne human-cytokinforstærkede PDX-model består af 4 hovedtrin. Først ekspanderes transduceret stroma in vitro og vurderes ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) til stabil cytokinproduktion på højt niveau. For det andet verificeres aktiviteten af humant cytokin produceret af de transducerede stromaceller (og mangel på cytokinaktivitet fra kontrolstroma) ved anvendelse af phospho-flowcytometri. Cellelinjer, der vides at være reaktive over for cytokin af interesse (i dette tilfælde, TSLP) inkuberes med stromalcelle-supernatant og analyseres for cytokininduceret phosphorylering. For det tredje bliver mus injiceret med transduceret humanstroma og derefter bestemmes museplasma ved hjælp af ELISA for niveauer af humant cytokin på ugentlig basis. Fjerde humane hæmatopoietiske celler transplanteres, og de in vivo funktionelle virkninger af det humane cytokin evalueres på et kendt mål ( Levering af humant cytokin via stromaceller giver både fordele og ulemper ved sammenligning med andre fremgangsmåder til levering / produktion af humane cytokiner i PDX-mus. 7 Sammenlignet med injektion af rekombinant humant cytokin er stroma-medieret tilførsel generelt billigere (omkostningerne ved stromalcellekultur er mindre end omkostningerne ved rekombinant cytokin) og mindre arbejdskrævende (en injektion pr. Uge versus multiple injektioner pr. Uge). Spørgsmålet om kort cytokinhalveringstid reduceres også, da stroma kontinuerligt producerer det eksogene cytokin. Levering af cytokin via hydrodynamisk injektion af DNA kan være billigere end levering via stroma. Det er imidlertid ligeledes forbigående og kan kræve mere teknisk dygtighed end den enkle ugentlige intraperitoneale injektion, der kræves til stroma-medieret levering. Lentiviral genekspression i musen kan give en mindre traNsient metode til cytokin levering; Men i vores hænder blev fysiologiske TSLP-niveauer ikke nået. Desuden er denne metode arbejdskrævende, hvilket kræver kontinuerlig produktion af lentiviral vektor. Transgene eller knock-in-mus tilbyder et stabilt langsigtet udtryk for cytokin og kan konstrueres til vævsspecifik ekspression, hvilket kan være en fordel. På den anden side nødvendiggør den transgene ekspression af det humane cytokin-gen på den immundefekte musebaggrund, der kræves for PDX-mus, en enorm investering af ressourcer, før modellen er blevet etableret. Endvidere tillader transgene modeller generelt ikke muligheden for at variere timingen af cytokininitiering eller niveauet af in vivo cytokinproduktion. Disse kan opnås med stroma-medieret leverance ved simpelthen at ændre tidspunktet for initiering af stromalcelleinjektion eller dosen af injicerede stromalceller. Den stromal-celle-medierede cytokinafgivelsesmetodeOd detaljeret her blev brugt til at udvikle PDX til evaluering af TSLPs rolle i normal human B-celleudvikling 4 , 6 og høj risiko B-celle akut lymfoblastisk leukæmi. 6 Denne metode tilvejebringer en alternativ cytokin-leveringsmetode til brug ved generering af lignende modeller med andre humane cytokiner end TSLP. Denne model kan også være nyttig til at generere foreløbige data, der kan hjælpe med at bestemme, hvorvidt værdien af en cytokin-transgen eller cytokin-PD-model vil være værdig til den betydelige investering i tid og penge. 
Figur 1: PDX-model konstrueret til fremstilling af eksogent humant cytokin i mus. ( 1A ) Design eksperiment og opnå transducerede humane stromaceller ( 1B ) Hent humane celler (hæmatopoietiske stamceller, leukæmiceller osv .) Til dannelse af PDX (patient-afledte xenograft) mus. ( 2A ) Injicer konstruerede stroma og ( 2B ) transplantationsceller til immundeficente mus ifølge forsøgsplan. ( 3A-B ) Monitor cytokin koncentrationer i stroma supernatanten og mus plasma ved hjælp af ELISA. ( 4 ) Harvest humane celler og vurder de in vivo funktionelle virkninger af det humane cytokin til stede i PDX. Venligst klik herFor at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelser blev udført i overensstemmelse med Loma Linda University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Institutional Review Board (IRB) godkendte protokoller og i overensstemmelse med alle føderale retningslinjer.
FORSIGTIG: PDX og humane væv skal håndteres i overensstemmelse med sikkerhedsforanstaltninger for at forhindre overførsel af blodbårne patogener.
1. Kultur og ekspansion af cytokin-transducerede stromceller
BEMÆRK: Hver gang stroma passerer, høstes kultursupernatanten (1 ml alikvot) og opbevares ved -80 ° C til fremtidig kvantificering af cytokinniveau via ELISA-assay.
- Forbered R10 dyrkningsmedium og frysemedium som beskrevet i Materialetabellen.
- Generer 10 , 11 eller opnå kontrolstroma (transduceret med tom vektor) og cytokinproducerende (TSLP +) stroma."> 6 Opbevares i flydende nitrogen (LN 2 ) indtil brug. Tør stromalceller som beskrevet 12 og plader dem i 5 ml R10-medium i separate T-25 cellekolber. Kulturceller i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2. Dette er efter-thaw "passage # 1".
- Når stroma er sammenflydende (24-48 timer), passages celler ved trypsinering ved anvendelse af 1 x trypsin EDTA (0,25%) og omplettering i en T-150 dyrkningskolbe. Dette er efter-thaw "passage # 2".
- Når stroma opnår sammenflydelse i T-150-kolberne (3-4 dage senere), passerer cellerne ved trypsinering. Brug denne cellesuspension til forsøgsbehov.
- Celleudvidelse til flere kolber
- Opdele de høstede celler mellem tre T-150 kolber og kultur indtil sammenflugt. Gentag dette trin, hvis stroma ekspansion er nødvendig. Typisk humant stromalt (HS-27A) celletælling ved sammenflydelse i en T-150-kolbe er ~ 5 x 106 .
- Cell storage
- Overfør den høstede cellesuspension til et konisk rør og centrifuge ved 500 xg i 5 minutter, dekanter supernatanten og resuspender cellerne i frysemedium. Frys og opbevar i LN 2 ~ 1,5 x 10 6 celler pr. Hætteglas.
- Til intraperiotoneal stroma injektioner i mus, fortsæt til trin 4.1.
- Celleudvidelse til flere kolber
2. ELISA-analyser til overvågning i Vitro Cytokin-produktion fra Transduced Stroma
- Køb et kommercielt tilgængeligt ELISA assay kit til at detektere cytokinet af interesse.
- Tør stromalcelle supernatant fra kontrol og cytokinproducerende (TSLP +) stroma høstet ved tidlige, midterste og senere passager ( Figur 2 ).
- Bestem TSLP-koncentrationen i supernatantprøver ved hjælp af et ELISA kit ifølge producentens anvisninger. 13 Kompilér disse serielle data for at overvåge stabiliteten af cytokinproduktion under cellekultur E ( figur 2A-B ).
- Identificer og kassér cytokinproducerende stroma med reduceret eller suboptimal cytokinekspression såvel som eventuelle tilsvarende opslagte hætteglas ( figur 2A-B ).
- Identificer og vedligeholde cytokinproducerende stroma, der viser stabile cytokinkoncentrationer på højt niveau. Brug disse tøer til forsøg.
- Brug ELISA-kittet til rutinemæssigt at overvåge stroma igennem varigheden af cellekulturen (mindst 1 gang i de tidlige, midterste og sene eftertøningspassager) for at sikre stabil cytokinproduktion eller, i tilfælde af kontrolstroma, fraværet af cytokinproduktion .
3. Fosforstrømningscytometriassays til evaluering af aktiviteten af cytokin Fremstillet af Stroma
BEMÆRK: Vurder supernatanten fra konstrueret stroma inden det første forsøg for at verificere den relevante bioaktivitet af det stroma-genererede cytokin til individuel eksperiment.Ef "> 6 Når den konstruerede stroma er valideret, er yderligere test ikke nødvendig, medmindre stroma introduceres, der blev fremstillet med en ny vektor.
- Køb MUTZ5 og / eller MHH-CALL4 leukæmi cellelinier (TSLP responsive), 14 rekombinant humant cytokin og antistoffer godkendt til anvendelse i phospho-flow cytometry analyser for at detektere passende downstream phosphorylation mål.
- Optøt høstet supernatant fra kontrol og cytokin-udtrykkende stroma.
- Plade leukæmicellelinierne i R20-medium (se tabel af materialer ) i en koncentration på 0,2 x 106 celler pr. Brønd i en 96-brønd vævskulturplade. Plad 3 brønde pr. Tilstand for at muliggøre triplikatanalyser. Inkubér i 2 timer ved 37 ° C. Denne gang tillader det tab af nogen phosphorylering, der forekom under tidligere dyrkningsbetingelser.
BEMÆRK: 12 brønde pr. Cellelinje giver triplikatanalyser for hver eksperimentelle tilstand, der er vist i trin 3.4. <Li> Efter 2 timer i dyrkning, overfør cellerne fra hver brønd for at separere 4 ml rør og centrifuge ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten. - Re-suspender cellerne i 200 μL for hver af de følgende forsøgsbetingelser (udfør analyser i tre eksemplarer): 1) Kun negative kontrolmedier, 2) Positive kontrolmedier med rekombinant cytokin ved mættende koncentration (er) (TSLP ved 15 ng / Ml osv .), 3) kontrolstrom-supernatant fra kontrolstroma og 4) cytokin-stroma-supernatant fra cytokinproducerende stroma.
- Inkubér cellerne i den varighed, der er specificeret ved specifik kommerciel phospho-analyse ( fx 30 minutter for phospho-STAT5 i MUTZ5 eller MHH-CALL4 som svar på TSLP).
- Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C og dekanterer supernatanten.
- Udfør phospho-flow cytometry farvning pr producentens protokol og indsamle flow cytometry data. 15
- Gate på intakte celler baseret på fremadgående (FSC, angiver cellestørrelse) og side (SSC, angiver cellegranularitet) lysdisplay.
- Bestem den median fluorescerende intensitet (MFI) af de intakte celler i hver prøve. Sammenlign den gennemsnitlige MFI opnået fra triplikatværdierne af stromacellens supernatant til den for positiv og negativ mediekontrol.
4. Injektion af cytokin-transduceret stroma i mus
BEMÆRK: Kultur HS-27A stroma for mindst 3 efter-tøvepassager før indsprøjtning i mus for at sikre sunde celler og tilstrækkelig cytokinproduktion.
- Fremstilling af stroma
- Overfør den høstede stromacelle suspension til et konisk rør og alikvot 10 μL for hæmocytometer tæller; Få levende celletælling ved hjælp af trypanblå. 16 Centrifug den resterende ceLl suspension ved 500 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten fra de pelleterede celler og forsigtigt resuspender cellerne i det nødvendige volumen steril phosphatpufret saltopløsning (PBS) til musinjektion (afhængigt af antallet af mus til injektion).
BEMÆRK Typisk stromalcellekoncentration for musinjektion: 0,5 x 10 6 -5 x 10 6 celler pr. Mus i 200 μl PBS. - Hold stromacellesuspensionen ved 4 ° C (eller på is) indtil umiddelbart før injektionen. Sørg for, at cellesuspensionen er mindst ved stuetemperatur (RT) (~ 25 ° C) til musinsprøjtning.
- Stromalcelleinjektion
- Desinficer bio-sikkerhedshætten, saml materialer til injektioner, og læg derefter musekassen inde.
- Bland forsigtigt cellesuspensionen ved inversion, før der udarbejdes 200 μL i en tuberkulinsprøjte.
- Ved anvendelse af standard intraperitoneal injektionsteknikker, 17Begræns musen og administrer 200 μl celle suspensionen i peritoneal hulrum. Detaljer er tidligere blevet demonstreret af Machholz et al. 18
5. Seriel blodindsamling og plasmaovervågning for eksogent humant cytokin hos mus
- Blodindsamling via hale snip
- Desinficer biosikkerhedshætten og monter musespænder, saks og andre redskaber / forsyninger til proceduren.
- Placer musen i en fastholdelsesanordning og fastgør røret for at minimere musens bevægelse.
- Desinficere halen og kirurgisk saks med isopropylalkohol. Anvend topisk anæstetisk creme på halen.
- Ved hjælp af meget skarpe kirurgiske saks skrue omkring 0,5 - 1 mm af spidsen af musens hale. Saml ca. 80 μl perifert blod ved hjælp af hepariniserede kapillarrør.
BEMÆRK: Hvis blod indsamles med denne metode mere end seks tiMes, hale fjernelse bør være konservativ med respekt mængden af hale fjernet. Som snips fremskynde halen øges diameteren, det blærer hurtigere, og helingen tager længere tid.
- Plasmaseparation
- Overfør blodet ved hjælp af en pæresprøjte (for at skille den ud af kapillarrørene) i et mærket K 2 EDTA mikrotainerrør; Inverter 20 gange for at forhindre koagulering.
BEMÆRK: Typisk blodkoagulering fra hale nip er hurtig. Men hvis blødning fortsætter længere end ~ 2 min, skal du bruge en styptisk blyant / pulver til hjælp til koagulering. - Centrifug blodopsamlingsrør i henhold til producentens anvisninger og alikvot plasmaet til opbevaring (-20 ° C), indtil det er klar til ELISA-analysen.
- Hvis der kræves data fra mus-humant cellechimisme fra museblodet, behandles den resterende pellet som beskrevet i trin 6.3.1. Ellers kasseres blodcellepellet.
- Overfør blodet ved hjælp af en pæresprøjte (for at skille den ud af kapillarrørene) i et mærket K 2 EDTA mikrotainerrør; Inverter 20 gange for at forhindre koagulering.
- Modificeret ELISA for mikro-volUmes af musplasma
BEMÆRK: Producentens ELISA-procedure blev ændret fra det anbefalede 100 μl prøvevolumen til et 40 μl volumen for at rumme mikrovolumerne opsamlet fra mus. Det er ikke muligt at køre in vivo- plasmaprøverne i tre eksemplarer med disse begrænsede mængder. Ved forsøgets afslutning opsamles 500 μL post mortem blod via hjertepunktur. Cytokinkoncentrationer evalueret i 100 μl eutanasi-plasma anvendes til at validere 40 μl in vivo data for hver mus.- Optø frosne museplasma prøver.
- Seriefortyndet ELISA-standarder og plader dem i triplicat ved 40 μl pr. Brønd.
- Tilsæt 40 μL af hver museplasma-prøve til ELISA-pladen.
BEMÆRK: Hvis en musemængde er mindre end 40 μl, så bring volumenet op til 40 μl med ELISA buffer. Optag dette fortyndingsvolumen og brug det til at beregne en fortyndingsfaktor for hver fortyndet prøve. HvornårAnalyse af ELISA-data multiplicerer den fortyndede prøvekoncentration med prøveens fortyndingsfaktor for at bestemme den faktiske cytokinkoncentration i originalprøven. - Komplet ELISA-analyse i henhold til producentens anvisninger.
6. Transplantation af hæmatopoietiske celler i mus
- Sublethal bestråling til tilstand knoglemarv til transplantation
BEMÆRK: Loma Linda University (LLU) bruger en Cobalt-60 strålingskilde. Dyrene er anbragt i en tætspærre, som er anbragt 80 cm fra strålekilden i et 20 x 20 cm felt og med et 0,5 cm lag af Lexan oven på restraineren. Eksponeringstid beregnes for at opnå en 225 cGy dosis baseret på den seneste kalibrering af kilden (i øjeblikket 2-3 minutter for denne kilde).- Sub-letbestrålede mus (total legemsbestrålingsdosis på 225 cGy maksimum for immundeficente mus).
- Transplantat hæmatopoietiske celler ~ 24 timer senere via </ Em> intravenøs haleveninjektion.
- Intra venøs hæmatopoietisk celletransplantation
- Forbered menneskelige cellesuspensioner til transplantation i et volumen på 200 μL sterilt PBS pr. Mus: CD34 + hæmatopoietiske stamceller (HSC): 1 x 10 5 til 5 x 10 5 celler pr. Mus- og leukæmicellelinjer / patientprøver: 1 x 10 6 til 5 x 106 celler pr. Mus.
- Opbevar celler ved 4 ° C (transport på is) indtil umiddelbart før transplantation. Sørg for, at cellerne er mindst ved RT før transplantation.
- Desinficer biosikkerhedshætten og tilbered hætteglasset for transplantationsinjektioner.
- Anbring musen i opvarmningsburet i mindst 5 min for at tillade udvidelse af svalevener.
- Bland forsigtigt cellesuspensionen og lav 200 μl i en tuberkulinsprøjte. Sæt nålen sikkert til side, hvor den forbliver steril.
- Placer musen i en fastholdelse og desinficere halen med isopropylalkohol. </ Li>
- Ved hjælp af standard intravenøse injektionsteknikker injicerer 17 den humane celle suspension i musesvalevenen.
BEMÆRK: Injektionssprøjter kan tage flere forsøg, især for en nybegynder dyrehandler. Kovacscics og Raper's JoVE video 19 giver en detaljeret demonstration af denne dyre teknik. - Overvåg musens opsving i ~ 5 min. Optag eventuelle bivirkninger under injektionen ( fx spildte celler, større blødninger, overdreven hale traume).
- Analyse af humant cellechimisme i mus perifert blod
- Få blodcellepellet tilbage i mikrotainerrøret efter plasmaseparation (trin 5.2.3).
- For rød blodcelle (RBC) lysis resuspender den resterende blodpellet i et volumen af PBS svarende til plasma fjernet (for at erstatte plasmavolumen) og bland godt (vortex / pipette).
- Overfør hver genopslået blodprøve til et mærket 4 ml rørOg derefter tilsæt RBC lysis buffer til hvert rør i et 1: 9 forhold (900 μL RBC lysis buffer for 100 μL re-suspenderet blod). Inkubér i 5 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge (5 min, 500 xg) og dekanter.
- Udfør anden RBC lysis buffer inkubation (5 min ved RT). Centrifuge og dekanter som tidligere.
- Vask de resterende celler i ~ 1 ml PBS. Centrifuge og dekanter som tidligere.
- Resuspender pelleten i et volumen af PBS, der er egnet til standard flowcytometrifarvning (dette varierer alt efter producent og individuelle laboratorieprotokoller). 20 Brug immunofenotyping antistoffer valideret til flow-cyotmetery til at identificere musceller (mus CD45 +) og humane celler (human CD45 +) 6 , 21 Såvel som yderligere humane leukocytmarkører specifikke for cellelinien af interesse.
BEMÆRK: Det anbefales at tage et lille volumen (5 μL-20 μL) fra hver museprøve for at skabe "samlede prøver"; At anvende til ufarvede, levedygtige og isotype kontrolprøver. Det er bedste praksis at have ufarvet og isotype kontrol for hver eksperimentelle tilstand.
7. Funktionel evaluering af in vivo cytokinaktivitet
- Mus eutanasi og vævshøst
- Euthaniser mus via CO 2- kvælning ved udpeget eksperimentelt tidspunkt.
- Høstblod via hjertepunktur og samle plasma som i trin 5.2.1-5.2.2.
BEMÆRK: Saml blodet forud for andre væv, fordi det begynder at koagulere umiddelbart efter døden. - Behandle museblod, alikvot og opbevar plasma som i trin 5.2.2.
- På et senere tidspunkt vurderer eksogen cytokinkoncentration i plasma opnået ved eutanasi via ELISA ifølge producentens protokol. Evaluere og sammenligne eksogene cytokinkoncentrationer i museplasmaet fra det serielle in vivoBlodindsamling og eutanasi-plasmaprøverne (beskrevet i afsnit 5.3).
- Tilsæt PBS til den resterende blodprøve for at erstatte plasmavolumen og -proces som beskrevet i trin 6.3.1 og 6.3.2. Udfør flowcytometri-analyser straks eller resuspender celler i frysemedium til LN2-opbevaring.
- Harvest bone marrow (BM) og milt fra PDX mus og forberede enkeltcellesuspensioner som tidligere beskrevet. 22
- Indhent celleantal for hver PDX-musevævsprøve ved anvendelse af 3% eddikesyre med methylenblåt (lyses cellemembraner og RBC'er, der efterlader intakte kerner af levende celler) i en 1: 1 fortynding og tæller celler ved anvendelse af et hæmocytometer. Tabulere samlede celleantal for knoglemarv og miltprøver for hvert dyr.
- Centrifuge (500 xg, 15 min) cellesuspensioner og dekanter supernatanten. Udfør flow-cytometer-analyser af knoglemarv og / eller miltceller straks eller resuspender i frysemedium for LN <Sub> 2 lagerplads.
BEMÆRK: Frys 10 BM alikvoter (til fremtidige biokemiske analyser) og ~ 5 milt alikvoter (til fremtidige PDX transplantationer) pr. Mus. - Immunofenotyping for at identificere in vivo funktionelle virkninger
- Forbered en masterblanding (MM) af flowcytometriantistoffer mod hæmopoietiske populationer af immunofenotype, der reagerer på cytokinet af interesse, og et andet MM af isotype-kontrolantistoffer ( Figur 5 og Materialetabell).
- Tør PDX-vævsalikvoter (37 ° C perlebad) fremstillet i trin 7.4.
- Vask de optøede celler ved at overføre dem til et konisk rør og tilsæt mindst 3x volumen PBS. Centrifuge (500 xg, 5 min) og dekanter supernatanten.
- Gentag vasketrin (7.5.3).
- Opret poolede alikvoter ved at tage ~ 10 μL-20 μL celler fra hver PDX-prøve til den ufarvede kontrol, levedygtighedskontrol og isotype-kontrollerne (se trin 6.4.6-note). Stain alle prøver, undtagen uNstained kontrol med en fixerbar levedygtig farve (døde celle markør), inkuber og vask som pr producentens protokol.
- Stain hver PDX celleprøve med fænotyping-MM ifølge standard flow cytometry farvning protokol; På samme måde plettere de samleprøvede isotype-kontrolprøver med isotypen MM. Inkuber alle prøver, vask med PBS og fiks prøver ved at suspendere i 1% paraformaldehyd.
- Indsamle flowcytometri data og analysere data ved hjælp af en gating strategi, der passer til den eller de cellepopulationer, der er af interesse ( Figur 5 ). En typisk gating er som følger:
- Definer intakte celler ved at tegne en FSC og SSC gate, der udelukker snavs.
- Identificer levende celler population ved at gating på celler, der er negative for den døde celle markør (dette er "samlede levende celler").
- Brug sub-porte i "total levende celler" til at definere cellepopultioner med ønsket immunfenotype (se figur 5).
- HentHyppigheden af delmængdecellepopulationer inden for den samlede levendecelle-tælling fra flowcytometrianalyse. 6 , 21
- Beregn antallet af målceller i hvert væv ved at multiplicere frekvensen af B-celle-subsætet inden for totale levende celler (opnået i trin 7.5.6.4) med de samlede levende celle-tællinger pr. Væv opnået i trin 7.3 (% B-celleundergruppe x " Hæmocytometer celleantal ", se tabel 1 )
- Sammenlign celletællinger af målcellepopulationer mellem kontrol PDX-mus og cytokin-ekspression (TSLP +) PDX-mus for at bestemme in vivo funktionelle effekter af det eksogene humane cytokin ( tabel 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over modellen er vist i figur 1 . Når først cytokinproducerende (TSLP + stroma) og kontrolstroma er blevet opnået, udvides de i kultur. Før stroma injektion i mus evalueres stromalcelle supernatant ved ELISA for at verificere cytokinproduktion ( Figur 2 ) og phospho-flowcytometri (protokol nr. 3) anvendes til at verificere aktiviteten af cytokinet produceret af stroma. Supernatant opsamles fra sammenflydende stromalcellekulturer (kontrolstroma og TSLP + stroma), når celler passeres. ELISA bruges til at overvåge koncentrationen af TSLP i supernatanten mindst en gang i løbet af de tidlige, midterste og forsinkede passager. Repræsentative data fra kontrolstroma er vist i figur 2A . Kontrolstromalcellekulturer, der viser TSLP-ekspression (og eventuelle hætteglas indefrosset fra dem) bør kasseres. Kontrolkulturer med uopdagelig TSLP udvides og nedfryses til fremtidig brug.Som vist i figur 2B kasseres kulturer af TSLP + stroma, der viser TSLP-produktion på lavt niveau (og hætteglas indefrosset fra dem) kasseres. TSLP + stroma, der viser stabil produktion af cytokin på højt niveau, vælges til ekspansion og opbevaring til brug i fremtidige eksperimenter. Gennemsnitlige niveauer af TSLP i supernatant fra flere kulturer af kontrol og TSLP + stroma er vist i figur 2C .
Den eksperimentelle tidslinje til fremstilling af kontrol PDX-mus med humant cytokin er vist i figur 3 . Stromalcellekulturer initieres 3 uger før transplantation og ELISA-analyse af in vitro TSLP-produktion i kultursupernatant udføres som beskrevet i figur 2. In vivo human TSLP i museplasmaet overvåges ugentligt ( figur 4 ) under anvendelse af "modificeret ELISA for Mikrovolumener af museplasma "beskrevet i protokol nr. 4. linjen adskilBlod opsamles samtidigt med plasma og analyseres som beskrevet i protokol nr. 6 under "Analyse af humant cellechimerisme i perifert blod i mus." PDX injiceret med kontrolstroma viste konsistent plasma-humane TSLP niveauer, der er under tærsklen for detektion ( Figur 4A ). Plasmaniveauet af TSLP i PDX-mus injiceret med TSLP + stroma er proportional med antallet af TSLP + stromalceller injiceret i de foregående 1-2 uger. Plasmaniveauerne af TSLP falder hurtigt, hvis stromalcelleinjektioner seponeres. 6 Som vist i figur 4B gav ugentlige injektioner af 0,5 x 106 TSLP + stroma (producerende i gennemsnit> 1.000 pg / ml TSLP i kultursupernatant) plasma-TSLP-niveauer nær den nedre grænse for fysiologiske niveauer (~ 5-10 pg / ml ). Ugentlig injektion af 5 x 10 6 TSLP + stroma hos PDX-mus resulterede i plasma-TSLP-niveauer, der nåede høje fysiologiske niveauer (~ 35 pg / mL) som vist i
TSLP har vist sig at øge produktionen af normale humane B-celleprecursorer. 23 For at evaluere in vivo- funktionen af TSLP sammenlignede vi således produktet Ion af normale humane B-celleprecursorer i kontrol- og TSLP + PDX-mus transplanteret med hæmatopoietiske stamceller som vist i figur 5 og i tabel 1 . Figur 5A viser flowcytometri-gating for immunopheneotyping anvendt til at identificere delmængder af humane B-linieceller. Prøveberegninger for at opregne antallet af celler i hver delmængde for en kontrol PDX og en TSLP + PDX er vist i tabel 1 . Som vist i figur 5B øges B-linjeceller signifikant i TSLP + sammenlignet med kontrol PDX, og denne forøgelse begynder med de tidligste B-celleprecursorer (pro-B-celler). Antallet af ikke-B-linjeceller var ikke signifikant forskelligt mellem kontrol og TSLP + PDX (data ikke vist). Dette assay tilvejebringer en måde at verificere, at den humane TSLP produceret in vivo i TSLP + PDX udøver in vivo funktionelle effekter på en målcellepopulation.
Ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
Figur 2: ELISA til overvågning af TSLP-cytokinkoncentrationer i Stroma Supernatant. ELISA-analyser blev anvendt til at måle TSLP-koncentrationer i supernatanten fra kontrolstroma (transduceret med kontrolvektor) og TSLP + stroma (transduceret til ekspression af human TSLP) mindst en gang under de følgende cellepassager: tidligt (passage 1-5) 6-12) og sent (passager 13-20). Påvisningstærsklen for det humane TSLP ELISA-assay anvendt her er 1,9 pg / ml (rød stiplet linje). ( A ) Control stroma producerer minimalt detekterbare humane TSLP koncentrationer; Disse niveauer er generelt under ELISA-detektionsgrænsen for eksperimentets varighed. Kontrolstroma i kultur, der viser stigende TSLP koncentrationer (> 15 pg / ml) kasseres sammen med alle alikvoter, der er frosset fra den pågældende kultur. ( B ) Menneskelig TSLP produktion varierer mellem kulturer genereret af differenT optøede hætteglas af TSLP + stroma ( n = 9) og i hele dyrkningsperioden. TSLP stroma, der viser nedsat eller ustabil cytokinproduktion (TSLP <1000 pg / ml) kasseres også. ( C ) Gennemsnitlige TSLP koncentrationer for kontrol (grøn) og TSLP + (blå) stroma (midler og 95% konfidensintervaller). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksperimentelt tidslinje til generering af PDX-mus med eksogen human cytokinproduktion. In vitro og in vivo dele af forsøget skrider frem samtidigt. Kontrol og + TSLP stromacellekultur initieres 2-3 uger før hæmatopoietisk celletransplantation, hvilket sikrer mindst 3 cellepassager før den første (vedWk -1) af de ugentlige stromcelleinjektioner. Dette sikrer, at stromacellerne er sunde, proliferative og producerer tilstrækkelige cytokinniveauer. Supernatantalikvoter opsamles, når celler passeres, og ELISA-assays anvendes til bestemmelse af TSLP-koncentration (se figur 2 ) i stroma-supernatanten. Dyr bestråles på dag 0, en dag forud for human hæmatopoietisk celletransplantation på dag 1. Ugentlig blodindsamling begynder 1 til 2 uger efter første stroma-injektioner. På dette tidspunkt bør eksogene humane cytokinkoncentrationer være detekterbare i museplasmaet under anvendelse af modificerede ELISA assays ( Figur 4 ). Eksperimentendipunktet er 5-16 uger efter humant celle-transplantation; Dette afhænger af mængden af human celle chimerisme detekteret i mus perifer blod. Normal hæmatopoiesis er typisk veletableret i uge 5-7, leukæmicellechimisme varierer mellem cellelinier og primære prøver (3-16 uger). PDX-transplantationssucces og progression afhænger ogsåPå antallet af humane celler injiceret ved transplantation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Opnåelse af fysiologiske humane TSLP-cytokinkoncentrationer i museplasma. Mus modtager ugentlige intraperitoneale injektioner (200 μl) transducerede celler, og deres plasma opsamles for at evaluere humane TSLP-koncentrationer (ELISA-assay) in vivo i musene over tid. " Control" -mus fik 5 x 10 6 kontrolstromaceller, mens mus "TSLP + low" (low TSLP stroma dose) modtog 0,5 x 10 6 TSLP + stromaceller og "TSLP + high" (høj TSLP stroma dosis) mus fik 5 x 10 6 TSLP + stromaceller hver uge. Det humane TSLP ELISA assay Detektionstærskelværdien er 1,9 pg / ml (rød punkteret linje), og det humane fysiologiske område af TSLP er ~ 5 til 35 pg / ml (grå skygger). 24 (Reference 11 og Coats upublicerede data) ( A ) "Control" museplasma har konsekvent TSLP-niveauer <5 pg / ml eller under ELISA-detektionsgrænsen. ( B ) "TSLP + lav" musplasma viser lave fysiologiske niveauer af TSLP; Hvorimod ( C ) "TSLP + høj" musplasma viser høje fysiologiske niveauer. ( D ) Gennemsnitlige TSLP koncentrationer for hver forsøgsgruppe (middel ± SEM for alle mus og tidspunkter) viser, at TSLP niveauer detekteret i mus plasma er proportional med modtaget stroma dosis; Plasmakoncentrationer i kontrolmusen er under ELISA-detektionsgrænsen, og plasma-niveauerne "TSLP + high" er fire gange større end "TSLP + lave" musplasma niveauer."> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Analyse af normale humane B-cellepopulationer Validere I n Vivo- funktionelle virkninger af eksogen humant TSLP i PDX-mus. PDX-mus blev konstrueret med kontrol og TSLP + stroma og transplanteret med humane CD34 + -celler isoleret fra navlestrengsblod. Immunofenotyping ved hjælp af flowcytometri blev anvendt til at identificere delmængder af humane B-celleprecursorer i knoglemarv høstet fra kontrol og TSLP + PDX som følger: Høstet knoglemarv blev optøet og farvet med fixerbart levedygtighedsfarvestof og farvet for flowcytometri for at detektere anti- Human CD45, CD19, CD34, K & A lette kæde og enten overflade IgD og IgM eller intracellulær IgM (cμ). ( A ) Total levende celleJeg blev gated baseret på en levedygtighedsmarkør. Efterfølgende plotter viser efterfølgende porte for at identificere udviklingsmæssigt sekventielle B lineage subsets (data vist er fra TSLP + PDX). ( B ) Frekvensen af hver delmængde inden for totale levende celler blev bestemt ved hjælp af flowcytometri-software og antallet af celler i hver B-celle-undergruppe blev beregnet. (Se tabel 1). Celltællinger for hver B-celleundergruppe i kontrol (sort, n = 3) og TSLP + (blå, n = 5) PDX-mus er graferet. (Middel ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Humane cellebefolkning | Freq. Af total levende celler | Living Cell Count IN BM | # Celler i befolkningen |
| Control Mouse | |||
| Samlede levende celler | 100,00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| hCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| I alt CD19 + | 27.20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24.20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Præ-B | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 10 6 |
| Umodne b | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Ældre B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 10 6 |
| TSLP + Mouse | |||
| Samlede levende celler | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| I alt CD19 + | 65,10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60.20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Præ-B | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Umodne b | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 10 6 |
| Ældre B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 10 6 |
Tabel 1: Frekvens og tællinger af normale humane B-celleundergrupper i PDX-knoglemarv. Frekvensen (%) af hver B-celle-subgruppe inden for de samlede levende celler blev bestemt ved flowcytometrianalyse (se figur 5A for gatingstrategi). Repræsentative knoglemarv (BM) data fra en kontrol PDX-mus (modtaget kontrolstrominjektioner, 5 x 10 6 celler / uge) og en TSLP + PDX-mus (modtaget TSLP stroma injektioner, 5 x 106 celler / uge). De samlede levende BM-celletællinger blev registreret ved eutanasi, og immune-fænotypeflow-cytometri blev anvendt til at vurdere subsetfrekvens (%) og beregne størrelsen af hver B-celle-subsætpopulation (delmængde celleantal = "totAl levende celler "x" delmængdefrekvens ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver en enkel, hurtig og relativt omkostningseffektiv metode til konstruktion af PDX til ekspression af eksogent humant cytokin. Den her beskrevne strategi er baseret på ugentlige intraperitoneale injektioner af en stromalcellelinje transduceret for at udtrykke det humane cytokin, TSLP. Før udførelse af de her beskrevne fremgangsmåder blev stroma konstrueret til at udtrykke høje niveauer af cytokinet af interesse (TSLP) og lignende konstrueret kontrolstroma genereret. I de her præsenterede protokoller udvides stroma i kultur og screenes for evnen til at tilvejebringe stabil cytokinproduktion på højt niveau over tid (eller for fraværet af cytokinproduktion i tilfælde af kontrolstroma). Assays for at verificere aktiviteten af stroma-genereret cytokin blev udført, og eksperimentelle tidslinier for stromalcelleinjektion blev udviklet til fremstilling af PDX med fysiologisk human TSLP (og kontrolmus, der mangler human TSLP). Procedurer til overvågning af plasmakoncentrationer af human TSLP ogTil verifikation af dets in vivo funktionelle virkninger på cytokin-responsive cellepopulationer blev udført.
Flere faktorer bør overvejes ved udvælgelse af stromaceller og vektorer, som vil blive anvendt i protokollerne, der præsenteres her. Stromale cellelinier bør ikke endogent producere høje niveauer af cytokin og bør ikke være reaktive over for cytokinet af interesse. Til undersøgelser her blev den humane knoglemarvsstrømcellelinie, HS-27A, udvalgt, fordi den vokser robust i kultur med lavt niveau cytokinproduktion. 8 Metoden beskrevet her indbefatter også "kontrol" PDX konstrueret med samme stroma som TSLP + PDX, men uden overekspression af TSLP. Sammenligninger af resultater i TSLP + og kontrol PDX tillader os at kontrollere for eventuelle virkninger på grund af endogen stromalcellecytokinproduktion. Transduktion af stromaceller med vektorer, der indbefatter fluorescerende proteiner eller andre selekterbare markører, kan være nyttige til isolering af celler thVed sandsynligvis overudtrykker cytokinet af interesse. Det er imidlertid vigtigt at analysere cytokinsupernatant for at bestemme niveauet af cytokin produceret af stromacellerne, fordi in vivo plasmacytokinniveauerne hos mus korrelerer med cytokinkoncentrationen i stromalcelle supernatant, 6 såvel som antallet af stroma injiceret på en Ugentligt ( figur 4 ).
Det er vigtigt, at aktiviteten af cytokinet produceret af stroma er verificeret forud for PDX-undersøgelser. Vi anvendte phospho-flowcytometri til analyse af molekyler phosphoryleret nedstrøms for TSLP-stimulering i celler, der reagerer på TSLP. TSLP aktiverer JAK-STAT5 og PI3 / AKT / mTOR-stierne. MUTZ5- og MHH-CALL4-leukæmicellelinjerne udtrykker høje niveauer af TSLP-receptorkomponenterne og viser nedstrøms STAT5-, AKT- og ribosomalprotein-S6-phosphorylering efter TSLP-stimulering. 14 Her anvendte vi phopho-flowcytometriAt evaluere phosphorylering af STAT5 (pSTAT5) induceret nedstrøms for TSLP-stimulering. I tidligere arbejde vurderede vi for yderligere TSLP-stimulerede fosforyleringshændelser: phospho-AKT (pAKT) og phospho-ribosomalt protein S6 (pS6, nedstrøms for mTOR). Resultater viste, at pAKT-assayet er mindre følsomt og pS6 mere følsomt end pSTAT5-assayet. 6 Når phospho-analyser udføres, skal responsive celler dyrkes med mættende niveauer af rekombinant human TSLP som en positiv kontrol og kun med medier (ingen cytokin) som en negativ kontrol. Supernatant fra kontrolstroma bør analyseres langs siden fra TSLP + stroma som et andet middel til at verificere (ud over ELISA), at TSLP ikke produceres af kontrolstroma. Dette tjener også som en kontrol for at sikre, at endogen cytokinproduktion ikke er ansvarlig for phosphoryleringen observeret i assays af TSLP + -celler. Ideelt set bør phosphorylering induceret fra cytokinproducerende stroma prøver være ensEr at observere med rekombinant cytokin tilstand, selv om den kan være lavere, hvis koncentrationen af cytokin i supernatanten er lavere end i den mættende, positive kontrol. En positiv kontrol med rekombinante TSLP niveauer, der matcher niveauerne observeret af ELISA for TSLP + stroma, er et godt alternativ.
Identifikation af kendte funktionelle indikatorer for in vivo cytokinaktivitet kan være en udfordring. Analyser af phosphorylering er muligvis ikke mulige, fordi phosphorylering induceret af det eksogene humane cytokin in vivo hurtigt kan gå tabt under vævshøst. Da TSLP har vist sig at øge produktionen af humane B-celleprecursorer, blev 23 den funktionelle virkning af TSLP i PDX verificeret ved at analysere for in vivo stigninger i den humane B-celleprecursorpopulation ved anvendelse af flowcytometriimmunofenotyping. En alternativ strategi kunne analysere specifikke cytokin-inducerede ændringer i genekspression og compariNg-ekspression i celler høstet fra cytokin-udtrykkende PDX til celler fra kontrol PDX. 6
Det ultimative mål for humant cytokinekspression i PDX er at generere en præklinisk model, der mere nøje modellerer det in vivo- miljø, der er til stede hos patienterne. Dette blev testet ved at sammenligne helgenekspression i humane væv isoleret fra kontrol PDX og fra cytokin-ekspression (TSLP +) PDX til de oprindelige patientprøver. Disse undersøgelser viste, at genekspression i patientprøver er signifikant tættere på leukæmiceller fra TSLP + PDX end kontroller. 6 Men vores studier fokuserede på lymfopoisis. En række myeloidfremmende cytokiner produceret i musen aktiverer ikke deres humane receptor-modparter. Der er humane cytokin knockin mus (NSGS mus og andre) der løser dette problem. Faktisk er en værdi af modellen, vi beskriver her, at den kan bruges i NSGS-mus for at skabe en model, der mere lukkerEly modellerer det humane in vivo miljø ved at udtrykke TSLP ud over myeloidfremmende humane cytokiner. På den anden side kunne et cytokin +/- system genereres i NSG-mus ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her for hver af disse myeloidfremmende cytokiner. Denne model kan bruges til at studere den præcise in vivo rolle af hver af dem i myelopoieis og / eller myeloid leukæmi.
Engineered PDX, der producerer fysiologiske niveauer af human TSLP, tilvejebringer en præklinisk model, der mere efterligner det in vivo miljø, der findes hos patienter end klassisk PDX. 4 Produktionen af kontrol PDX-mus, der er ligeledes konstrueret, beskrives også. Sammen styring og cytokinproducerende PDX oprette et humant TSLP +/- model system, som vi med succes har brugt til at evaluere TSLPs rolle i in vivo produktion af normale og maligne humane B-celler. 4 , 6 DetteModellen er yderst relevant for undersøgelser af en særlig højrisikopræmie af B-celle akut lymfoblastisk leukæmi (B-ALL), der er kendetegnet ved genetiske ændringer, der fører til overekspression af CRLF2. CRLF2 er en receptor til TSLP-cytokinet, og således bidrager TSLP-induceret CRLF2-signalering sandsynligvis til onkogenese og progression af CRLF2 + B-ALL. Anvendelsen af PDX til at studere denne sygdom er særlig kritisk, fordi PDX tillader os at studere leukæmi i forbindelse med patientens genetiske landskab. Genetisk landskab som bidragsyder er stærkt impliceret i CRLF2 + B-ALL, hvilket forekommer fem gange oftere hos Hispanic / Latino børn end andre og udgør halvdelen af alle B-ALL-tilfælde hos Downs syndrom patienter. PDX-modeller, der udtrykker menneskelig TSLP som den her beskrevne, vil være et vigtigt redskab til at identificere terapier og forståelse af sygdomsmekanismer i CRLF2 + B-ALL samt for at forstå normal hæmatopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
