Summary
Beskriven här är en metod för att producera exogent cytokin i patient-härledda xenograftmus (PDX) via veckovis intraperitoneal injektion av en cytokin-transducerad stromalcellinje. Denna metod breddar nyttan av PDX och ger möjlighet till övergående eller långvarig exogen cytokinleverans i en mängd PDX-modeller.
Abstract
Patient-härledda xenograftmus (PDX) produceras genom transplantation av humana celler till immundeficenta möss. Dessa modeller är ett viktigt verktyg för att studera mekanismerna för normal och malign hematopoiesis och är guldstandarden för att identifiera effektiva kemoterapier för många maligniteter. PDX-modeller är möjliga eftersom många av cytokinerna hos mus också verkar på mänskliga celler. Detta är emellertid inte fallet för alla cytokiner, inklusive många som är kritiska för att studera normal och malign hematopoiesis i humana celler. Tekniker som konstruerar möss för att producera humana cytokiner (transgena och inslagsmodeller) kräver betydande kostnader innan användbarheten av modellen har visats. Andra tekniker är arbetsintensiva (injektion av rekombinant cytokin eller lentivirus) och i vissa fall kräver hög teknisk expertis (hydrodynamisk injektion av DNA). Denna rapport beskriver en enkel metod för att generera PDX-möss som har exogen human cyTokin (TSLP, tymisk stromal lymfopoietin) via en vecka intraperitoneal injektion av stroma som har transducerats för att överuttrycka denna cytokin. Användning av denna metod ger en in vivo källa till kontinuerlig cytokinproduktion som uppnår fysiologiska nivåer av cirkulerande humant cytokin i musen. Plasmanivåerna av humant cytokin kan varieras baserat på antalet injicerade stromalceller, och cytokinproduktionen kan initieras vid vilken som helst punkt i experimentet. Denna metod innefattar även cytokin-negativa kontrollmöss som framställs på liknande sätt, men genom intraperitoneal injektion av stroma transducerad med en kontrollvektor. Vi har tidigare visat att leukemi-celler skördade från TSLP-uttryckande PDX, jämfört med kontroll PDX, uppvisar ett genuttrycksmönster mer som det ursprungliga patientprovet. Tillsammans tillhandahåller de cytokinproducerande och cytokin-negativa PDX-mössen som produceras med denna metod ett modellsystem som vi har använt framgångsrikt för att studeraTSLP: s roll i normal och malign hematopoiesis.
Introduction
Patient-härledda xenotransplantat (PDX) är en kraftfull in vivo- modell för att studera produktion av normala och maligna hematopoetiska celler i en "naturlig" däggdjursmiljö. Oftast produceras PDX genom att injicera eller transplantera humana celler i immundeficenta möss. Produktionen av PDX med användning av normala humana hematopoetiska stamceller möjliggör in vivo- studier av normalt humant blod och utveckling av immunceller. PDX som produceras från leukemi eller andra cancerceller gör det möjligt att studera onkogena mekanismer och identifiera effektiva terapier i sammanhanget med de olika genetiska landskapen och mutationer som finns i den mänskliga populationen. 1 PDX är därför den nuvarande guldstandarden för translationell biomedicinsk forskning för att identifiera effektiva terapier och ett viktigt verktyg för att förstå mekanismer för cancerprogression. PDX-modeller är ett viktigt verktyg för att stödja forskning om hälsofördelar sjukdomar på grund av specifika Genetiska skador eller någon sjukdom där variationerna i en patients genetiska landskap kan väsentligt bidra till onkogenes och behandlingsresultat.
Mus-humana PDX-modeller är möjliga eftersom många muscytokiner efterliknar efterliknande deras humana analoger vid aktivering av cytokinreceptorerna av humana celler medan de är inne i musen. Till exempel ger interleukin-7 (IL-7) en kritisk signal för humant B-cellutveckling. 2 I detta fall har musen IL-7 tillräcklig homologi med humant IL-7 att muscytokinet stimulerar signalvägar i humana B-cellprekursorer. 2 , 3 , 4 Detta är emellertid inte fallet för tymisk stromal lymfopoietin (TSLP), 5,6 som bland annat cytokiner (IL-3, granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), stamcellerfaktor (SCF) ,Ref "> 7 är viktigt för framställning av normala och maligna humana hematopoietiska celler. När mus och humana cytokiner uppvisar låg homologi aktiverar muscytokinerna inte sina respektive receptorer på humana celler. För att övervinna detta hinder har ett antal strategier använts Att manipulera expression av humana cytokiner i PDX-möss. Dessa inkluderar injektion av rekombinanta humana cytokiner, hydrodynamisk injektion av DNA, lentiviraluttryck, transgen expression och knockin-genutbyte. 7 Denna rapport beskriver en metod för att konstruera PDX för att producera humant cytokin via stromal-medierad Cytokinavgivning ( Figur 1 ).
I den metod som visas här konstrueras PDX-möss för att uttrycka den humana cytokinen, TSLP eller att fungera som cytokin-negativa kontroller. TSLP-uttryckande PDX uppnås genom veckovis intraperitoneal injektion av stromala celler som har transducerats för att uttrycka höga nivåer av human TSLP.Cytokin-negativa PDX "kontroll" möss är likadana konstruerade; Även om kontrollstroma transduceras med en kontrollvektor. Denna metod uppnår normala fysiologiska nivåer av humant TSLP i PDX-möss injicerade med TSLP + stroma. Ingen detekterbar TSLP observeras i PDX-möss som tar emot den cytokin-negativa stromen. Vi valde den mänskliga stromalcellinjen HS-27A för våra studier eftersom den växer kraftigt i kultur och visar en mycket låg nivå av cytokinproduktion som inte stöder proliferation av isolerade stamceller i kulturer. 8 För humant TSLP-uttryck transducerades stroma med en avancerad generationens självinaktiverande lentiviral vektor härledd från en tidigare beskriven ryggrad 9 och innefattar cPPT / cts-elementet och trichchip hepatit efter transkriptionellt regulatoriskt element (WPRE) för att öka transgenuttryck. Den humana TSLP-genen konstruerades i denna vektor under kontroll av förlängningsfaktorn-1(EF-1) alfa-promotorn för att uppnå robust, konstitutivt och långsiktigt uttryck.
Konstruktionen av denna human-cytokin-förstärkta PDX-modell består av 4 huvudsteg. Först expanderas transducerad stroma in vitro och utvärderas genom enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) för stabil cytokinproduktion på hög nivå. För det andra verifieras aktiviteten av humant cytokin som produceras av de transducerade stromacellerna (och brist på cytokinaktivitet från kontrollstroma) med användning av fosfosflödescytometri. Cellinjer som är kända för att vara mottagliga för cytokin av intresse (i detta fall, TSLP) inkuberas med stromalcells supernatant och analyseras för cytokininducerad fosforylering. För det tredje injiceras möss med transducerad human stroma och sedan utvärderas musplasma genom ELISA för nivåer av humant cytokin på veckovis basis. Fjärde humana hematopoietiska celler transplanteras och de in vivo funktionella effekterna av det humana cytokinet utvärderas på ett känt mål ( Leverans av humant cytokin via stromala celler erbjuder både fördelar och nackdelar jämfört med andra metoder för att leverera / producera humana cytokiner i PDX-möss. 7 Jämfört med injektion av rekombinant humant cytokin är stromemedierad leverans i allmänhet billigare (kostnaden för stromalcellodling är mindre än kostnaden för rekombinant cytokin) och mindre arbetsintensiv (en injektion per vecka jämfört med flera injektioner per vecka). Frågan om kort cytokinhalveringstid mildras också eftersom stroma kontinuerligt producerar det exogena cytokinet. Leverans av cytokin via hydrodynamisk injektion av DNA kan vara billigare än leverans via stroma. Det är emellertid likartat övergående och kan kräva mer teknisk skicklighet än den enkla, veckliga intraperitoneala injektionen som krävs för stroma-medierad leverans. Lentiviral-genuttryck i musen kan ge en mindre traNsient metod för cytokinavgivning; Men i våra händer uppnåddes inte fysiologiska TSLP-nivåer. Dessutom är denna metod arbetskrävande, vilket kräver kontinuerlig produktion av lentiviral vektor. Transgena eller knock-in-möss erbjuder stabilt långsiktigt uttryck av cytokin och kan konstrueras för vävnadsspecifik expression, som kan vara en fördel. Å andra sidan kräver det transgena uttrycket av den humana cytokingenen på den immunbristande musbakgrund som krävs för PDX-möss en enorm investering av resurser innan värdet av modellen har fastställts. Vidare tillåter transgena modeller generellt inte möjligheten att variera tidpunkten för cytokininitiering eller nivå av in vivo cytokinproduktion. Dessa kan uppnås med stroma-medierad leverans genom att helt enkelt ändra tidpunkten för initiering av stromalcellinjektion eller dosen av stromalceller som injiceras. Den stromalcellmedierade cytokinleveransmetodenOd detaljerad här användes för att utveckla PDX för att utvärdera rollen av TSLP vid normal human B-cellutveckling 4 , 6 och hög risk B-cell akut lymfoblastisk leukemi. 6 Denna metod tillhandahåller en alternativ cytokinleveransmetod för användning vid framställning av liknande modeller med andra humana cytokiner än TSLP. Denna modell kan också vara användbar för att generera preliminära data som kan hjälpa till att bestämma huruvida värdet av en cytokin-transgen eller cytokin-knock-in PDX-modell skulle vara värdig den betydande investeringen i tid och pengar. 
Figur 1: PDX-modell konstruerad för att producera exogen human cytokin hos möss. ( 1A ) Konstruktionsexperiment och erhålla transducerade humana stromaceller ( IB ) Erhålla mänskliga celler (hematopoetiska stamceller, leukemiceller, etc. ) för att generera PDX (patient-härledda xenograft) möss. ( 2A ) Injicera konstruerade stroma och ( 2B ) transplanterade humana celler i immundeficenta möss enligt experimentell schema. ( 3A-B ) Monitor cytokinkoncentrationer i strom-supernatanten och musplasma genom ELISA. ( 4 ) Skörda människa celler och bedöma in vivo funktionella effekter av den humana cytokin närvarande i PDX. Vänligen klicka härFör att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier genomfördes i enlighet med Loma Linda Universitys Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och Institutional Review Board (IRB) godkända protokoll och enligt alla federala riktlinjer.
VARNING: PDX och mänskliga vävnader ska hanteras i enlighet med säkerhetsförfaranden för att förhindra överföring av blodburna patogener.
1. Kultur och expansion av cytokin-transducerade stromceller
OBS: Varje gång stroma passeras, skörda kultursupernatanten (1 ml alikvot) och lagra vid -80 ° C för framtida kvantifiering av cytokinnivå via ELISA-analys.
- Förbered R10 odlingsmedium och frysmedium enligt beskrivningen i materialet.
- Generera 10 , 11 eller erhålla kontrollstroma (transducerad med tom vektor) och cytokinproducerande (TSLP +) stroma."> 6 Förvara i flytande kväve (LN 2 ) tills användning. Tina stromala celler enligt beskrivning 12 och plåta dem i 5 ml R10-medium i separata odlingsflaskor av T-25 celler. Kulturceller i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2. Detta är efter-tina "passage # 1".
- När stroma är sammanflytande (24-48 h), passagerar celler genom trypsinisering med användning av 1 x trypsin EDTA (0,25%) och omplätering i en T-150 odlingskolv. Detta är post-thaw "passage # 2".
- När stroma uppnår sammanflöde i T-150-kolvarna (3-4 dagar senare), passerar cellerna genom trypsinisering. Använd den här cellsuspensionen för experimentella behov.
- Cell expansion till flera flaskor
- Dela de skördade cellerna mellan tre T-150 flaskor och odling tills de är sammanflöde. Upprepa detta steg om stroma expansion är nödvändig. Typiskt humant stromalt (HS-27A) celltal vid sammanflöde i en T-150-kolv är ~ 5 x 106 .
- Celleratt rasa
- Överför den skördade cellsuspensionen till ett koniskt rör och centrifugera vid 500 xg under 5 min, dekantera supernatanten och resuspendera cellerna i frysmedium. Frys och lagra i LN 2 ~ 1,5 x 10 6 celler per injektionsflaska.
- För intra-periotoneal stroma injektioner i möss, fortsätt till steg 4.1.
- Cell expansion till flera flaskor
2. ELISA-analyser för övervakning vid vitrocytokinproduktion från transducerad stroma
- Köp kommersiellt tillgängligt ELISA-analyspaket för att detektera cytokinet av intresse.
- Tina stromell-supernatant från kontroll och cytokinproducerande (TSLP +) stroma skördat vid tidiga, mellersta och sena passager ( Figur 2 ).
- Bestäm TSLP-koncentrationen i supernatantproverna med hjälp av ett ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner. 13 Kompilera dessa seriella data för att övervaka stabiliteten hos cytokinproduktionen under cellkultur E ( Figur 2A-B ).
- Identifiera och kasta cytokinproducerande stroma med reducerat eller suboptimalt cytokinuttryck, liksom alla motsvarande injektionsflaskor som lagras ( Figur 2A-B ).
- Identifiera och behålla cytokinproducerande stroma som visar stabila cytokinkoncentrationer på hög nivå. Använd dessa tina för experiment.
- Använd ELISA-kittet för att rutinmässigt övervaka stroma under hela cellkulturens längd (minst 1 gång under tidiga, mellersta och sena eftertiningskanaler) för att säkerställa stabil cytokinproduktion eller, i fallet med kontrollstroma, frånvaron av cytokinproduktion .
3. Fosforflödescytometrianalyser för att utvärdera aktiviteten av cytokin producerad av Stroma
ANMÄRKNING: Bedöm supernatanten från konstruerat stroma före det första experimentet för att verifiera den relevanta bioaktiviteten hos stroma-genererad cytokin för individuellt experiment.Ef "> 6 När den konstruerade stroma är validerad är ytterligare testning inte nödvändig om inte stroma införs som producerades med en ny vektor.
- Köp MUTZ5- och / eller MHH-CALL4 leukemicellinjer (TSLP-responsiva), 14 rekombinant humant cytokin och antikroppar godkända för användning i fosfosflödescytometrianalyser för att detektera lämpliga nedströms fosforyleringsmål.
- Tina skördad supernatant från kontroll och cytokin-uttryckande stroma.
- Placera leukemicellinjerna i R20-medium (se tabell över material ) vid en koncentration av 0,2 x 106 celler per brunn i en 96-brunns vävnadsodlingsplatta. Placera 3 brunnar per tillstånd för att möjliggöra trefaldiga analyser. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° C. Denna gång möjliggör förlusten av någon fosforylering som inträffade under tidigare odlingsbetingelser.
ANMÄRKNING: 12 brunnar per cellinje ger triplikatanalyser för varje försöksförhållande som visas i steg 3.4. <Li> Efter 2 timmar i odling överför cellerna från varje brunn för att separera 4 ml rör och centrifugera vid 500 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Dekantera supernatanten. - Re-suspendera cellerna i 200 μl för var och en av följande försöksbetingelser (utföra analyser i tre exemplar): 1) Endast negativa kontrollmedier, 2) Positiva kontrollmedia med rekombinant cytokin vid mättande koncentration (er) (TSLP vid 15 ng / Ml, etc. ), 3) kontrollstrom-supernatant från kontrollstrom och 4) cytokin-strom-supernatant från cytokinproducerande stroma.
- Inkubera cellerna under den tid som specificeras genom specifik kommersiell fosforanalys ( t ex 30 min för fosfor-STAT5 i MUTZ5 eller MHH-CALL4 som svar på TSLP).
- Centrifugera vid 500 xg i 5 min vid 4 ° C och dekantera supernatanten.
- Utför fosfatflödescytometrifärgning per tillverkarens protokoll och samla flödescytometri data. 15
- Gate på intakta celler baserat på framåtriktning (FSC, indikerar cellstorlek) och sida (SSC, indikerar cellgranularitet) ljusspridning.
- Bestäm den median fluorescerande intensiteten (MFI) av de intakta cellerna i varje prov. Jämför den genomsnittliga MFI som erhållits från triplikatvärdena av stromcellsupernatant till den för positiva och negativa mediekontroller.
4. Injicering av cytokin-transducerad stroma i möss
OBS! Kultur HS-27A stroma för minst 3 efter-tina passager innan de injiceras i möss för att säkerställa friska celler och tillräcklig cytokinproduktion.
- Framställning av stroma
- Överför den skördade stromcellsuspensionen till ett koniskt rör och alikvot 10 μl för hemocytometerräkning; Få en levande cellräkning med hjälp av trypanblå. 16 Centrifugera återstående ceLl suspension vid 500 xg i 5 min.
- Aspirera supernatanten från de pelleterade cellerna och försiktigt resuspendera cellerna i den nödvändiga volymen steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för musinsprutning (beroende på antalet möss att injicera).
ANMÄRKNING Typisk stromcellkoncentration för musinsprutning: 0,5 x 10 ^ -5 x 106 celler per mus i 200 | j, l PBS. - Förvara stromcellsuspensionen vid 4 ° C (eller på is) tills omedelbart före injektionen. Se till att cellsuspensionen är åtminstone vid rumstemperatur (RT) (~ 25 ° C) för mössinjektion.
- Strömcellsinjektion
- Desinficera biosäkerhetshuven, montera injektionsmaterial och placera sedan musburet inuti.
- Blanda försiktigt cellsuspensionen genom inversion innan du gör 200 μL i en tuberkulinspruta.
- Användning av standard intra-peritoneal injektionsteknik, 17Begränsa musen och administrera 200 μl cellsuspensionen i bukhålan. Detaljer har tidigare visats av Machholz et al. 18
5. Seriell blodinsamling och plasmamonitoring för exogen human cytokin hos möss
- Blodkollektion via svanssnip
- Desinficera biosäkerhetskåpan och montera mushållare, sax och andra verktyg / tillbehör för proceduren.
- Placera musen i en fasthållare och säkra röret för att minimera musrörelsen.
- Desinficera svansen och kirurgiska saxen med isopropylalkohol. Applicera aktuell bedövningsmedel på svansen.
- Använd mycket skarpa kirurgiska saxar snipa av ca 0,5 - 1 mm av musens svansspets. Samla ca 80 μl perifert blod med hjälp av hepariniserade kapillärrör.
OBS! Om blod samlas med denna metod mer än sex tiMes, borttagning av svansen bör vara konservativ med hänsyn till mängden av svansen borttagen. Som snips framåt i svansen ökar diametern, det blödar snabbare och läkning tar längre tid.
- Plasmaseparation
- Överför blodet med hjälp av en bulbspruta (för att utvisa den från kapillärrören) till ett märkt K2 EDTA mikrotainerrör. Invertera 20 gånger för att förhindra koagulering.
OBS: Vanligen är blodpropp från svansnyp snabb. Om blödningen fortsätter längre än ~ 2 minuter, använd en styptisk penna / pulver för att hjälpa koagulering. - Centrifugera bloduppsamlingsrör enligt tillverkarens instruktioner och alikvotera plasman för lagring (-20 ° C) tills den är klar för ELISA-analysen.
- Om data från mus-humant cellchimerism behövs från musblodet, behandla sedan kvarvarande pellet enligt beskrivningen i steg 6.3.1. Annars, kassera blodcellspelleten.
- Överför blodet med hjälp av en bulbspruta (för att utvisa den från kapillärrören) till ett märkt K2 EDTA mikrotainerrör. Invertera 20 gånger för att förhindra koagulering.
- Modifierad ELISA för mikrovolymUmes av musplasma
ANMÄRKNING: Tillverkarens ELISA-procedur ändrades från den rekommenderade 100 μl provvolymen till en volym av 40 pl för att rymma mikrovolymerna som samlats in från möss. Det är inte möjligt att köra in vivo- plasmaprover i tre gånger med dessa begränsade volymer. Vid slutet av försöket uppsamlas 500 μl blod efter mortem via hjärtpunktur. Cytokinkoncentrationer som utvärderas i 100 μl eutanasi-plasma används för att validera 40 μl in vivo- data för varje mus.- Tina frysta musplasma prov.
- Seriellt utspädda ELISA-standarder och plåta dem i triplicat vid 40 μL per brunn.
- Tillsätt 40 μl av varje musplasma prov till ELISA-plattan.
ANMÄRKNING: Om ett musprov är mindre än 40 μl, ta sedan volymen upp till 40 μl med ELISA-buffert. Notera denna spädningsvolym och använd den för att beräkna en utspädningsfaktor för varje utspätt prov. NärAnalysera ELISA-data multiplicera den utspädda provkoncentrationen med provets utspädningsfaktor för bestämning av den faktiska cytokinkoncentrationen i originalprovet. - Komplett ELISA-analys enligt tillverkarens instruktioner.
6. Transplantation av hematopoietiska celler i möss
- Sublethal strålning till tillstånd benmärg för transplantation
OBS: Loma Linda University (LLU) använder en Cobalt-60 strålningskälla. Djur placeras i en pajhållare som är placerad 80 cm från strålkällan i ett 20 x 20 cm fält och med ett 0,5 cm lager av Lexan ovanpå restriinen. Exponeringstid beräknas för att uppnå en 225 cGy-dos baserat på senaste kalibrering av källan (för närvarande 2-3 min för denna källa).- Sub-lethally irradiate möss (total bestrålningsdos på 225 cGy max för immundeficenta möss).
- Transplantat-hematopoietiska celler ~ 24 h senare via </ Em> intravenös svansinjektion.
- Intra venös hematopoietisk celltransplantation
- Förbered mänskliga cellsuspensioner för transplantation i en volym av 200 | il steril PBS per mus: CD34 + hematopoetiska stamceller (HSC): 1 x 10 5 till 5 x 10 ^ celler per mus och leukemicellinjer / patientprover: 1 x 10 ^ till 5 x 106 celler per mus.
- Förvara celler vid 4 ° C (transport på is) tills omedelbart före transplantation. Se till att cellerna är minst vid RT före transplantation.
- Desinficera bioskyddskåpan och förbered kåpan för transplantationsinjektioner.
- Placera musen i värmeburen i minst 5 minuter för att möjliggöra dilatering av svansvenerna.
- Blanda försiktigt cellsuspensionen och rita upp 200 μl i en tuberkulinspruta. Säkerställ nålen åt sidan, där den kommer att förbli steril.
- Placera musen i en fasthållning och desinficera svansen med isopropylalkohol. </ Li>
- Med hjälp av vanliga intravenösa injektionstekniker injicerar 17 cellcelsuspensionen i mus-svansvenen.
ANMÄRKNING: Injektioner av svansvener kan ta flera försök, speciellt för en nybörjare djurhanterare. Kovacscics och Raper's JoVE Video 19 ger en detaljerad demonstration av denna djurteknik. - Övervaka musens återhämtning i ~ 5 min. Notera några biverkningar under injektionen ( t.ex. spillda celler, stor blödning, överdriven trauma).
- Analys av humant cell-chimerism i mus perifert blod
- Hämta blodcellspelleten kvar i mikrotainerröret efter plasmaseparation (steg 5.2.3).
- För röd blodcells (RBC) lysis resuspenderar återstående blodpellets i en volym PBS lika med plasma som avlägsnats (för att ersätta plasmavolymen) och blanda väl (virvel / pipett).
- Överför varje återupptaget blodprov till ett märkt 4 ml rörOch sedan tillsätt RBC lysisbuffert till varje rör i ett 1: 9 förhållande (900 | il RBC lysisbuffert för 100 | il återuppslammat blod). Inkubera i 5 min vid RT. Centrifugera (5 min, 500 xg) och dekantera.
- Utför andra RBC lysisbuffert inkubation (5 min vid RT). Centrifugera och dekantera som tidigare.
- Tvätta de återstående cellerna i ~ 1 ml PBS. Centrifugera och dekantera som tidigare.
- Resuspendera pelleten i en volym PBS lämplig för standardflödescytometrifärgning (detta varierar enligt tillverkare och individuella laboratorieprotokoll). 20 Använd immunofenotypande antikroppar validerade för flödescytometern för att identifiera musceller (mus CD45 +) och humana celler (humant CD45 +) 6 , 21 Såväl som ytterligare humana leukocytmarkörer som är specifika för cellinriktningen av intresse.
OBS! Det rekommenderas att ta en liten volym (5 μL-20 μL) från varje musprov för att skapa "sammanslagna prover"; Att använda för obestämda, livskraftiga och isotypiska kontrollprover. Det är bästa praxis att ha obelagda och isotypiska kontroller för varje experimentellt tillstånd.
7. Funktionell utvärdering av in vivo cytokinaktivitet
- Mus eutanasi och vävnadsskörd
- Euthanisera möss via CO 2- kvävning vid utsetts experimentell tidpunkt.
- Skördblod via hjärtpunktur och samla plasma som i steg 5.2.1-5.2.2.
OBS: Samla blodet före andra vävnader eftersom det börjar koagulera omedelbart efter döden. - Behandla musblodet, alikvoten och lagra plasma som i steg 5.2.2.
- Vid en senare tid bedöma exogen cytokinkoncentration i plasma erhållen vid eutanasi via ELISA enligt tillverkarens protokoll. Utvärdera och jämföra exogena cytokinkoncentrationer i musplasma från seriell in vivoBloduppsamling och eutanasi-plasmaproverna (beskrivet i avsnitt 5.3).
- Tillsätt PBS till kvarvarande blodprov för att ersätta plasmavolymen och processen som beskrivs i steg 6.3.1 och 6.3.2. Utför flödescytometrianalyser omedelbart eller resuspendera celler i frysmedium för LN2-lagring.
- Skördbenmärg (BM) och mjälte från PDX-möss och bereda enkelcellssuspensioner som tidigare beskrivits. 22
- Hämta cellantal för varje PDX-muskelvävnadsprov med användning av 3% ättiksyra med metylenblått (lysescellmembran och RBC som lämnar intakta kärnor från levande celler) i en 1: 1 utspädning och räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Tabulera totala cellantal för benmärg och mjältprover för varje djur.
- Centrifugera (500 xg, 15 min) cellsuspensioner och dekantera supernatanten. Utför flödescytometriska analyser av benmärg och / eller mjältceller omedelbart eller resuspendera i frysmedium för LN <Sub> 2 lagring.
ANMÄRKNING: Frys 10 BM-alikvoter (för framtida biokemiska analyser) och 5 mjältealikvoter (för framtida PDX-transplantationer) per mus. - Immunofenotyping för att identifiera in vivo funktionella effekter
- Förbered en masterblandning (MM) av flödescytometriantikroppar mot immunofenotyphematopoietiska populationer som reagerar på cytokinet av intresse och en andra MM av isotypkontrollantikroppar ( figur 5 och tabell över material).
- Tina PDX-vävnadsalikvoter (37 ° C pärlsbad) framställd i steg 7.4.
- Tvätta de tinade cellerna genom att överföra dem till ett koniskt rör och tillsätta minst 3x volym PBS. Centrifugera (500 xg, 5 min) och dekantera supernatanten.
- Upprepa tvättsteget (7.5.3).
- Skapa poolade alikvoter genom att ta ~ 10 μL-20 μL-celler från varje PDX-prov för obestämd kontroll, livskraftskontroll och isotypkontrollerna (se steg 6.4.6-anteckning). Stain alla prov, utom uNstained kontroll, med ett fixerbart livskraftigt färgämne (dödcellsmarkör), inkubera och tvätta enligt tillverkarens protokoll.
- Stain varje PDX cell prov med fenotyping-MM enligt standard flödescytometri färgning protokoll; På liknande sätt fläckar det sammanslagna isotypkontrollprovet (erna) med isotypen MM. Inkubera alla prover, tvätta med PBS och fixa prov genom att suspendera i 1% paraformaldehyd.
- Samla flödescytometri data och analysera data med hjälp av en gatingstrategi som är lämplig för den eller de aktuella cellpopulationerna ( Figur 5 ). En typisk gating är som följer:
- Definiera intakta celler genom att dra en FSC- och SSC-grind som utesluter skräp.
- Identifiera levande cellpopulation genom att gata på celler som är negativa för dödcellsmarkören (detta är "totala levande celler").
- Använd sub-grindar i "totala levande celler" för att definiera cellpopultioner med önskad immunofenotyp (se figur 5).
- SkaffaFrekvensen av delmängdcellpopulationer inom den totala livscykelräkningen från flödescytometrianalys. 6 , 21
- Beräkna antalet målceller i varje vävnad genom att multiplicera frekvensen av B-cellsunderuppsättningen inom totala levande celler (erhållen i steg 7.5.6.4) med de totala levande cellantalen per vävnad erhållen i steg 7.3 (% B-cellsatsuppsättning x " Hemocytometercelltal ", se tabell 1 )
- Jämför cellantalet för målcellspopulationer mellan kontroll PDX-möss och cytokin-uttryckande (TSLP +) PDX-möss för att bestämma in vivo funktionella effekter av det exogena humana cytokinet ( Tabell 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt över modellen visas i Figur 1 . När en cytokinproducerande (TSLP + stroma) och kontrollstrom har erhållits expanderas de i kultur. Före stroma-injektion i möss utvärderas stromalcellsupernatanten med ELISA för att verifiera cytokinproduktion ( Figur 2 ) och fosfosflödescytometri (Protokoll nr 3) används för att verifiera aktiviteten hos cytokinet som produceras av stroma. Supernatanten uppsamlas från sammanflytande stromalcellkulturer (kontrollstroma och TSLP + stroma) när celler passeras. ELISA används för att övervaka koncentrationen av TSLP i supernatanten minst en gång under tidiga, mellersta och sena passager. Representativa data från kontrollstrom visas i figur 2A . Kontrollstromala cellkulturer som visar TSLP-uttryck (och alla flaskor fryst ned från dem) bör kasseras. Kontrollkulturer med odetekterbar TSLP expanderas och frysas ner för framtida användning.Som visas i Figur 2B kasseras kulturer av TSLP + stroma som visar lågprodukt TSLP-produktion (och injektionsflaskor frysta ner från dem) kasseras. TSLP + strom som visar stabil produktion av cytokin på hög nivå väljs för expansion och lagring för användning i framtida experiment. Genomsnittliga nivåer av TSLP i supernatant från flera kulturer av kontroll och TSLP + strom visas i Figur 2C .
Den experimentella tidslinjen för framställning av kontroll PDX-möss med humant cytokin visas i figur 3 . Stromalcellkulturer initieras 3 veckor före transplantation och ELISA-analys av in vitro- TSLP-produktion i odlingssupernatant utförs som beskrivet i figur 2. In vivo human TSLP i musplasma övervakas varje vecka ( Figur 4 ) med användning av "modifierad ELISA för Mikrovolymer av musplasma "som beskrivs i protokoll nr 4. PeripheraL blod samlas samtidigt med plasma och analyseras som beskrivet i protokoll nr 6 under "Analys av humant cell-chimerism i mus-perifert blod". PDX injicerad med kontrollstroma visade konsekvent plasma-humana TSLP-nivåer som ligger under tröskeln för detektering ( Figur 4A ). Plasmanivån för TSLP i PDX-möss injicerade med TSLP + stroma är proportionell mot antalet TSLP + stromalceller injicerade under de föregående 1-2 veckorna. Plasmanivåerna av TSLP faller snabbt om stromalcellinjektioner avbryts. 6 Såsom ses i figur 4B gav veckovisa injektioner av 0,5 x 106 TSLP + stroma (producerande i genomsnitt> 1000 pg / ml TSLP i odlingssupernatant) plasma-TSLP-nivåer nära den nedre gränsen för fysiologiska nivåer (~ 5-10 pg / ml ). Weeklig injektion av 5 x 10 6 TSLP + strom i PDX-möss resulterade i plasma-TSLP-nivåer som når höga fysiologiska nivåer (~ 35 pg / ml) såsom visas i
TSLP har visat sig öka produktionen av normala humana B-cellprekursorer. 23 För att utvärdera in vivo- funktionen hos TSLP jämförde vi produkten Jon av normala humana B-cellprekursorer i kontroll- och TSLP + PDX-möss transplanterade med hematopoetiska stamceller såsom visas i Figur 5 och i Tabell 1 . Figur 5A visar flödescytometrygating för immunofenotypning som användes för att identifiera delmängder av humana B-linjeceller. Provberäkningar för att räkna upp antalet celler i varje delmängd för en kontroll PDX och en TSLP + PDX visas i Tabell 1 . Såsom visas i figur 5B, ökar B-linjeceller signifikant i TSLP + jämfört med kontroll PDX och denna ökning börjar med de tidigaste B-cellprekursorerna (pro-B-celler). Antalet icke-B-linjeceller var inte signifikant olika mellan kontroll och TSLP + PDX (data ej visade). Denna analys ger ett sätt att verifiera att den humana TSLP som produceras in vivo i TSLP + PDX utövar in vivo funktionella effekter på en målcellpopulation.
Ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
Figur 2: ELISA för att övervaka TSLP-cytokinkoncentrationer i Stroma Supernatant. ELISA-analyser användes för att mäta TSLP-koncentrationer i supernatanten från kontrollstrom (transducerad med kontrollvektor) och TSLP + stroma (transducerad för att uttrycka human TSLP) åtminstone en gång under följande cellpassager: tidigt (passage 1-5), mitten 6-12) och sen (passager 13-20). Detektionsgränsen för den humana TSLP ELISA-analysen som användes här är 1,9 pg / ml (röd streckad linje). ( A ) Kontrollstroma producerar minimalt detekterbara humana TSLP-koncentrationer; Dessa nivåer ligger i allmänhet under ELISA-detekteringströskeln under försökets varaktighet. Kontrollstrom i kultur som visar ökande TSLP-koncentrationer (> 15 pg / ml) kasseras tillsammans med alla alikvoter fryst från den odlingen. ( B ) Mänskliga TSLP-produktion varierar mellan kulturer genererade från differenT tinade ampuller av TSLP + stroma ( n = 9) och under hela odlingsperioden. TSLP stroma som visar minskad eller instabil cytokinproduktion (TSLP <1000 pg / ml) kasseras också. ( C ) Genomsnittliga TSLP-koncentrationer för kontroll (grön) och TSLP + (blå) stroma (medel och 95% konfidensintervaller). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Experimentell tidslinje för att generera PDX-möss med exogen produktion av humant cytokin. In vitro och in vivo delar av experimentet fortskrider samtidigt. Kontroll och + TSLP stromacultur startas 2-3 veckor före hematopoetisk celltransplantation, vilket säkerställer minst 3 cellpassager före den första (vidWk-1) av de weekly-stromala injektionerna. Detta säkerställer att stromacellerna är friska, proliferativa och producerar adekvata cytokinnivåer. Supernatantalikvoter uppsamlas när celler passeras och ELISA-analyser används för att bestämma TSLP-koncentrationen (se figur 2 ) i stromsupernatanten. Djur bestrålas dag 0, en dag före humant hematopoietisk celltransplantation på dag 1. Varje vecka samlas blodsamling 1 till 2 veckor efter första strominjektioner. Vid denna tidpunkt bör exogena humana cytokinkoncentrationer detekteras i musplasma med användning av modifierade ELISA-analyser ( Figur 4 ). Experimentens slutpunkt är 5-16 veckor efter humant celltransplantation; Detta beror på mängden humant cell-chimerism som detekteras i perifert blod i mus. Normala hematopoieser är vanligtvis väl etablerade vid vecka 5-7, leukemicell-chimerism varierar mellan cellinjer och primära prover (3-16 veckor). PDX-transplantationssucces och progression beror också påPå antalet humana celler injicerade vid transplantation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Uppnå fysiologiska humana TSLP-cytokinkoncentrationer i musplasma. Möss mottar veckovis intraperitoneala injektioner (200 | il) av transducerade celler och deras plasma samlas för att utvärdera humana TSLP-koncentrationer (ELISA-analys) in vivo i möss över tiden. " Kontroll" -möss fick 5 x 10 ^ kontrollstromaceller, medan "TSLP + låg" (låg TSLP stroma dos) möss fick 0,5 x 10 6 TSLP + stromaceller och "TSLP + high" (hög TSLP stroma dos) möss fick 5 x 10 6 TSLP + stromaceller varje vecka. Den humana TSLP ELISA-analysen Detektionsgränsen är 1,9 pg / ml (röd streckad linje) och det humana fysiologiska intervallet av TSLP är ~ 5 till 35 pg / ml (grå skuggning). 24 (Referens 11 och Coats opublicerade data) ( A ) "Control" musplasma har konsekvent TSLP-nivåer <5 pg / ml eller under ELISA-detekteringströskeln. ( B ) "TSLP + låg" musplasma visar låga fysiologiska nivåer av TSLP; Medan ( C ) "TSLP + hög" musplasma visar höga fysiologiska nivåer. ( D ) Genomsnittliga TSLP-koncentrationer för varje experimentgrupp (medelvärde ± SEM hos alla möss och tidpunkter) visar att TSLP-nivåer som detekteras i musplasma är proportionella mot mottagen stromdos; Plasmakoncentrationerna hos kontrollmusen ligger under ELISA-detektionsgränsen och "TSLP + höga" plasmanivåer är fyra gånger större än "TSLP + låg" musplasmanivåer."> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Analys av normala humana B-cellpopulationer Validera I n Vivo- funktionella effekter av exogen human TSLP i PDX-möss. PDX-möss konstruerades med kontroll och TSLP + stroma och transplanterades med humana CD34 + -celler isolerade från navelsträngsblod. Immunofenotypning med flödescytometri användes för att identifiera delmängder av humana B-cellprekursorer i benmärg skördad från kontroll och TSLP + PDX enligt följande: skördad benmärg, tinas och färgades med fixerbar livskraftstvätt och färgades för flödescytometri för att detektera anti- Human CD45-, CD19-, CD34-, K & A- lätta kedja, och antingen ytan IgD och IgM eller intracellulär IgM (cμ). ( A ) Total levande cellDet var gated baserat på en lönsamhetsmarkör. Efterföljande tomter visar efterföljande grindar för att identifiera utvecklingsrelaterade sekventiella B-radenheter (data som visas är från TSLP + PDX). ( B ) Frekvensen för varje delmängd inom totala levande celler bestämdes av flödescytometri-mjukvaran och antalet celler i varje B-cellsundergrupp beräknades. (Se tabell 1). Cellantal för varje B-cellsatsuppsättning i kontroll (svart, n = 3) och TSLP + (blå, n = 5) PDX-möss är graferade. (Medelvärde ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Humant cellbefolkning | Freq. Av totala levande celler | Levande cellräkning iN BM | # Celler i befolkningen |
| Kontrollmus | |||
| Totala levande celler | 100,00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| hCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Totalt CD19 + | 27,20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24,20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Pre-B | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 106 |
| Omogen B | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Äldre B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 106 |
| TSLP + Mouse | |||
| Totala levande celler | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| Totalt CD19 + | 65,10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60,20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Pre-B | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Omogen B | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 106 |
| Äldre B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 106 |
Tabell 1: Frekvens och räkningar av normala humana B-cellundergrupper i PDX-benmärg. Frekvensen (%) av varje B-cellsundergrupp inom de totala levande cellerna bestämdes genom flödescytometrianalys (se Figur 5A för gatingstrategi). Representativ benmärgs (BM) data från en kontroll PDX-mus (mottagna kontrollstrominjektioner, 5 x 10 6 celler / vecka) och en TSLP + PDX-mus (mottagna TSLP stroma-injektioner, 5 x 10 6 celler / vecka). De totala levande BM-celltalen registrerades vid eutanasi och immunfenotyp-flödescytometri användes för att bedöma subsetfrekvens (%) och beräkna storleken av varje B-cellsundergruppsbefolkning (delmängdcelltal = "totAl levande celler "x" subset frekvens ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver en enkel, snabb och relativt kostnadseffektiv metod för att konstruera PDX för att uttrycka exogent humant cytokin. Strategin som beskrivs här är baserad på veckovis intraperitoneala injektioner av en stromalcellinje transducerad för att uttrycka den humana cytokinen, TSLP. Före utförandet av de metoder som beskrivs här genererades strom som konstruerades för att uttrycka höga nivåer av cytokinet av intresse (TSLP) och liknande konstruerat kontrollstrom. I de protokoll som presenteras här expanderas stroma i kultur och screenas för förmågan att tillhandahålla stabil cytokinproduktion på hög nivå över tid (eller för frånvaro av cytokinproduktion vid kontrollstroma). Analyser för att verifiera aktiviteten för stroma-genererad cytokin utfördes och experimentella tidslinjer för stromalcellinjektion utvecklades för att producera PDX med fysiologisk human TSLP (och kontrollmöss som saknar human TSLP). Procedurer för övervakning av plasmakoncentrationer av human TSLP ochFör att verifiera dess in vivo funktionella effekter på cytokin-responsiva cellpopulationer utfördes.
Flera faktorer bör beaktas vid val av stromceller och vektorer som kommer att användas i de protokoll som presenteras här. Stromala cellinjer bör inte endogent producera höga halter av cytokin och bör inte vara mottagliga för cytokinet av intresse. För studier här valdes den mänskliga benmärgsströmcellinjen, HS-27A, eftersom den växer robust i kultur med lågnivå cytokinproduktion. 8 Metoden som beskrivs här inkluderar även "kontroll" PDX konstruerad med samma stroma som TSLP + PDX, men utan överuttryck av TSLP. Jämförelser av resultat i TSLP + och kontroll PDX tillåter oss att kontrollera för eventuella effekter på grund av endogen stromalcellcytokinproduktion. Transduktion av stromceller med vektorer som inkluderar fluorescerande proteiner eller andra selekterbara markörer kan vara till hjälp för att isolera celler thVid sannolikt överuttrycker cytokinet av intresse. Det är emellertid väsentligt att analysera cytokinsupernatant för att bestämma nivån av cytokin som produceras av stromacellerna eftersom in vivo -plasmakytokinhalterna hos möss korrelerar med cytokinkoncentrationen i stromalcellsupernatanten, 6 liksom antalet stroma injicerade på en Varje vecka ( Figur 4 ).
Det är viktigt att aktiviteten hos cytokinet producerad av stroma verifieras före PDX-studier. Vi använde fosfosflödescytometri för analys av molekyler som fosforylerades nedströms TSLP-stimulering i celler som svarar mot TSLP. TSLP aktiverar JAK-STAT5 och PI3 / AKT / mTOR-banorna. MUTZ5- och MHH-CALL4-leukemacellinjerna uttrycker höga nivåer av TSLP-receptorkomponenterna och visar nedströms STAT5-, AKT- och ribosomalprotein-S6-fosforylering efter TSLP-stimulering. 14 Här använde vi phopho-flödescytometriFör att utvärdera fosforylering av STAT5 (pSTAT5) inducerad nedströms TSLP-stimulering. I tidigare arbete utvärderades för ytterligare TSLP-stimulerade fosforyleringshändelser: fosfat AKT (pAKT) och fosfos-ribosomalt protein S6 (pS6, nedströms mTOR). Resultaten visade att pAKT-analysen är mindre känslig och pS6 är mer känslig än pSTAT5-analysen. 6 När fosforanalyser utförs, bör responsiva celler odlas med mättande nivåer av rekombinant human TSLP som en positiv kontroll och endast med medier (ingen cytokin) som en negativ kontroll. Supernatant från kontrollstroma bör analyseras längs sidan det från TSLP + stroma som ett andra medel för att verifiera (förutom ELISA) att TSLP inte produceras av kontrollstroma. Detta tjänar också som en kontroll för att säkerställa att endogen cytokinproduktion ej är ansvarig för fosforyleringen observerad vid analys av TSLP + -celler. Idealt sett bör fosforylering inducerad från cytokinproducerande stromprover vara liknandeAr att observera med rekombinant cytokin tillstånd, även om det kan vara lägre om koncentrationen av cytokin i supernatanten är lägre än i den mättande, positiva kontrollen. En positiv kontroll med rekombinanta TSLP-nivåer som matchar de nivåer som observeras av ELISA för TSLP + stroma är ett bra alternativ.
Identifiering av kända funktionella indikatorer för in vivo cytokinaktivitet kan vara en utmaning. Analyser av fosforylering är kanske inte möjliga eftersom fosforylering inducerad av det exogena humana cytokinet in vivo snabbt kan förloras under vävnadsskörden. Eftersom TSLP har visat sig öka produktionen av humana B-cellprekursorer, 23 verifierades den funktionella effekten av TSLP i PDX genom att analysera för in vivo ökning i den humana B-cellprekursorpopulationen med användning av flödescytometriimmunofenotypning. En alternativ strategi kan analysera specifika cytokininducerade förändringar i genuttryck och jämförelseNg uttryck i celler skördade från cytokin-uttryckande PDX till celler från kontroll PDX. 6
Det ultimata målet med humant cytokinuttryck i PDX är att skapa en preklinisk modell som närmare modellerar in vivo- miljön närvarande hos patienter. Detta testades genom att jämföra helgenuttryck i humana vävnader isolerade från kontroll PDX och från cytokin-uttryckande (TSLP +) PDX till de ursprungliga patientproverna. Dessa studier visade att genuttryck i patientprover är betydligt närmare leukemiceller från TSLP + PDX än kontroller. 6 Men våra studier fokuserade på lymfopoisis. Ett antal myeloid-främjande cytokiner som produceras i musen aktiverar inte deras humana receptor-motsvarigheter. Det finns humana cytokinknockin-möss (NSGS-möss och andra) som behandlar denna fråga. Faktum är att ett värde av modellen vi beskriver här är att den kan användas i NSGS-möss för att skapa en modell som mer stängerEly modellerar den humana in vivo- miljön genom att uttrycka TSLP förutom myeloid-främjande humana cytokiner. Å andra sidan kan ett cytokin +/- system genereras i NSG-möss med användning av metoden som beskrivs här för var och en av dessa myeloid-främjande cytokiner. Denna modell kan användas för att studera den exakta in vivo rollen hos var och en av dem i myelopoieis och / eller myeloid leukemi.
Engineered PDX som producerar fysiologiska nivåer av human TSLP ger en preklinisk modell som mer efterliknar in vivo- miljön närvarande hos patienter än klassisk PDX. 4 Produktionen av kontroll PDX-möss som likaså konstrueras beskrivs också. Tillsammans ger kontroll och cytokinproducerande PDX ett mänskligt TSLP +/- modellsystem som vi framgångsrikt har använt för att utvärdera rollen av TSLP vid in vivo- produktion av normala och maligna humana B-celler. 4 , 6 DettaModellen är mycket relevant för studier av en särskild högriskform av akut lymfoblastisk leukemi (B-ALL) av B-celler som kännetecknas av genetiska förändringar som leder till överuttryck av CRLF2. CRLF2 är en receptor för TSLP-cytokin och således bidrar TSLP-inducerad CRLF2-signalering sannolikt till onkogenes och progression av CRLF2 + B-ALL. Användningen av PDX för att studera denna sjukdom är särskilt kritisk eftersom PDX tillåter oss att studera leukemi i samband med patientens genetiska landskap. Genetiskt landskap som en bidragsgivare för sjukdomen är starkt inblandad i CRLF2 + B-ALL, vilket uppträder fem gånger oftare hos latinamerikanska / latinska barn än andra och utgör hälften av alla B-ALL-fall i Downs syndrom-patienter. PDX-modeller som uttrycker mänsklig TSLP, såsom den som beskrivs här, kommer att vara ett viktigt verktyg för att identifiera terapier och förståelse av sjukdomsmekanismer hos CRLF2 + B-ALL samt för att förstå normal hematopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
