Summary
Beskrevet her er en metode for fremstilling av eksogent cytokin i pasient-avledede xenograftmus (PDX) -mus via ukentlig intraperitoneal injeksjon av en cytokin-transduced stromalcellelinje. Denne metoden utvider bruken av PDX og gir muligheten for forbigående eller vedvarende eksogen cytokinlevering i en rekke PDX-modeller.
Abstract
Pasient-avledede xenograftmus (PDX) produseres ved transplantasjon av humane celler til immundefekte mus. Disse modellene er et viktig verktøy for å studere mekanismer for normal og ondartet hematopoiesis og er gullstandarden for å identifisere effektive kjemoterapier for mange maligniteter. PDX-modeller er mulige fordi mange av mus cytokiner også virker på humane celler. Dette er imidlertid ikke tilfelle for alle cytokiner, inkludert mange som er kritiske for å studere normal og ondartet hematopoiesis i humane celler. Teknikker som konstruerer mus for å produsere humane cytokiner (transgene og inntaksmodeller) krever betydelig kostnad før bruken av modellen har blitt påvist. Andre teknikker er arbeidsintensive (injeksjon av rekombinant cytokin eller lentivirus) og krever i noen tilfeller høye tekniske ferdigheter (hydrodynamisk injeksjon av DNA). Denne rapporten beskriver en enkel metode for å generere PDX-mus som har eksogen menneskelig cyTokin (TSLP, tymisk stromal lymfopoietin) via ukentlig intraperitoneal injeksjon av stroma som er blitt transdusert for å overuttrykke dette cytokinet. Bruk av denne metoden gir en in vivo kilde til kontinuerlig cytokinproduksjon som oppnår fysiologiske nivåer av sirkulerende humant cytokin i musen. Plasmanivåer av humant cytokin kan varieres basert på antall stromalceller som injiseres, og cytokinproduksjon kan påbegynnes på et hvilket som helst tidspunkt i forsøket. Denne metoden inkluderer også cytokin-negative kontrollmus som er produsert på samme måte, men gjennom intraperitoneal injeksjon av stroma transdusert med en kontrollvektor. Vi har tidligere vist at leukemiceller høstet fra TSLP-uttrykkende PDX, sammenlignet med kontroll PDX, viser et genuttrykksmønster mer som den opprinnelige pasientprøven. Sammen produserer cytokin-produserende og cytokin-negative PDX-mus produsert ved denne metoden et modellsystem som vi har brukt med suksess til å studereTSLPs rolle i normal og ondartet hematopoiesis.
Introduction
Pasient-avledede xenografter (PDX) er en kraftig in vivo- modell for å studere produksjon av normale og ondartede hematopoietiske celler i et "naturlig" pattedyrsmiljø. Oftest produseres PDX ved å injisere eller transplantere humane celler til immundefekte mus. Produksjonen av PDX ved bruk av normale humane hematopoietiske stamceller tillater in vivo studier av normalt humant blod og utvikling av immuncelle. PDX produsert fra leukemi eller andre kreftceller gjør det mulig å studere onkogene mekanismer og identifisere effektive terapier i sammenheng med omfanget av genetiske landskaper og mutasjoner tilstede i den humane befolkningen. 1 PDX er derfor den nåværende gullstandarden for translasjonell biomedisinsk forskning for å identifisere effektive terapier og et viktig verktøy for å forstå mekanismer for kreftprogresjon. PDX-modeller er et viktig verktøy for å støtte forskning i helseforskjeller sykdommer på grunn av spesifikke Genetiske lesjoner, eller en hvilken som helst sykdom der variasjonene i pasientens genetiske landskap kan i vesentlig grad bidra til onkogenese og behandlingsresultat.
Mus-humane PDX-modeller er mulige fordi mange mus-cytokiner tilstrekkelig etterligner deres humane analoger ved aktivering av cytokinreceptorene av humane celler mens de er inne i musen. For eksempel gir interleukin-7 (IL-7) et kritisk signal for human B-celleutvikling. 2 I dette tilfelle har musen IL-7 tilstrekkelig homologi med human IL-7 at mus-cytokinet stimulerer signalveier i humane B-celleforløpere. 2 , 3 , 4 Dette er imidlertid ikke tilfelle for tymisk stromal lymfopoietin (TSLP), 5 , 6 som blant annet cytokiner (IL-3, granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), stamcellefaktor (SCF) ,Ref "> 7 er viktig for produksjon av normale og ondartede humane hematopoietiske celler. Når mus og humane cytokiner viser lav homologi, aktiverer muscytokinene ikke sine respektive reseptorer på humane celler. For å overvinne denne hindringen, har en rekke strategier blitt brukt For å konstruere ekspresjon av humane cytokiner i PDX-mus. Disse inkluderer injeksjon av rekombinante humane cytokiner, hydrodynamisk injeksjon av DNA, lentiviral ekspresjon, transgen ekspresjon og knockin-genutskiftning. 7 Denne rapporten beskriver en metode for konstruksjon av PDX for å produsere humant cytokin via stromal-mediert Cytokinlevering ( figur 1 ).
I metoden som er demonstrert her, er PDX-mus konstruert for å uttrykke det humane cytokinet, TSLP, eller å tjene som cytokin-negative kontroller. TSLP-uttrykkende PDX oppnås ved ukentlig intraperitoneal injeksjon av stromalceller som har blitt transdusert for å uttrykke høye nivåer av human TSLP.Cytokin-negative PDX "kontroll" -mus er på samme måte konstruert; Selv om kontrollstroma blir transdusert med en kontrollvektor. Denne metoden oppnår normale fysiologiske nivåer av human TSLP i PDX-mus injisert med TSLP + stroma. Ingen detekterbar TSLP blir observert i PDX-mus som mottar den cytokin-negative stroma. Vi valgte den humane stromalcellelinjen HS-27A for våre studier fordi den vokser robust i kultur og viser svært lavt nivå av cytokinproduksjon som ikke støtter proliferasjon av isolerte stamceller i kulturer. 8 For humant TSLP-uttrykk ble stroma transdusert med en avansert, selvinaktiverende lentiviral vektor avledet fra en tidligere beskrevet ryggrad 9 og inkluderer cPPT / cts-elementet og trichchip hepatitt post-transkripsjonell regulatorisk element (WPRE) for å øke transgenuttrykk. Det humane TSLP-genet ble konstruert i denne vektoren under kontroll av forlengelsesfaktoren-1(EF-1) alfa-promotor for å oppnå robust, konstitutivt og langsiktig uttrykk.
Konstruksjonen av denne human-cytokin-forbedrede PDX-modellen består av 4 hovedtrinn. Først ekspanderes stroma ekspandert in vitro og vurderes ved enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) for stabil, høyt nivå cytokinproduksjon. For det andre bekreftes aktiviteten av humant cytokin fremstilt av de transduserte stromaceller (og mangel på cytokinaktivitet fra kontrollstroma) ved bruk av fosfos-flowcytometri. Cellelinjer som er kjent for å være responsive mot cytokin av interesse (i dette tilfelle, TSLP) inkuberes med stromalcelle-supernatant og analyseres for cytokininducert fosforylering. For det tredje blir mus injisert med transduced human stroma, og deretter blir museplasma evaluert av ELISA for nivåer av humant cytokin på ukentlig basis. Fjerde menneskelige hematopoietiske celler transplanteres og in vivo funksjonelle effekter av det humane cytokinet blir evaluert på et kjent mål ( Levering av humant cytokin via stromaceller gir både fordeler og ulemper når det sammenlignes med andre metoder for å levere / produsere humane cytokiner i PDX-mus. 7 Sammenlignet med injeksjon av rekombinant humant cytokin er stroma-mediert tilførsel generelt billigere (kostnaden for stromalcellekultur er mindre enn kostnaden for rekombinant cytokin) og mindre arbeidsintensiv (en injeksjon per uke versus flere injeksjoner per uke). Spørsmålet om kort cytokinhalveringstid reduseres også siden stroma kontinuerlig produserer det eksogene cytokinet. Levering av cytokin via hydrodynamisk injeksjon av DNA kan være rimeligere enn levering via stroma. Det er imidlertid også forbigående og kan kreve mer teknisk ferdighet enn den enkle ukentlige intraperitoneale injeksjonen som kreves for stroma-mediert levering. Lentiviral genuttrykk i musen kan gi en mindre traNsient metode for cytokin levering; Men i våre hender ble fysiologiske TSLP-nivåer ikke oppnådd. I tillegg er denne metoden arbeidskrevende, og krever kontinuerlig produksjon av lentiviral vektor. Transgene eller knock-in-mus tilbyr stabilt langsiktig uttrykk for cytokin og kan konstrueres for vevsspesifikke uttrykk, noe som kan være en fordel. På den annen side, krever det transgene uttrykket av det humane cytokin-gen på den immundefekte musbakgrunnen som kreves for PDX-mus, en enorm investering av ressurser før verdien av modellen er blitt etablert. Videre tillater ikke transgene modeller generelt muligheten til å variere tidspunktet for cytokininitiering eller nivået av in vitro- cytokinproduksjon. Disse kan oppnås med stroma-mediert levering ved ganske enkelt å endre tidspunktet for initiering av stromalcelleinjeksjon eller dosen av injiserte stromalceller. Den stromal-cellemedierte cytokin-leveringsmetodenOd detaljert her ble brukt til å utvikle PDX for å evaluere rollen av TSLP i normal human B-celleutvikling 4 , 6 og høy risiko B-celle akutt lymfoblastisk leukemi. 6 Denne metoden gir en alternativ cytokin-leveringsmetode for bruk ved generering av lignende modeller med andre cytokiner enn TSLP. Denne modellen kan også være nyttig for å generere foreløpige data som kan bidra til å avgjøre om verdien av en cytokin-transgen eller cytokin-knappe PDX-modell ville være verdig til den betydelige investeringen i tid og penger. 
Figur 1: PDX-modell konstruert for å produsere eksogen human cytokin hos mus. ( 1A ) Designeksperiment og oppnå transduserte humane stromalceller ( 1B ) Oppnå humane celler (hematopoietiske stamceller, leukemiceller osv .) For å generere PDX (pasient-avledede xenograft) mus. ( 2A ) Injiser konstruerte stroma og ( 2B ) transplanterte humane celler til immundefekte mus i henhold til eksperimentell tidsplan. ( 3A-B ) Monitor cytokinkonsentrasjoner i stroma supernatanten og museplasmaet ved ELISA. ( 4 ) Harvest menneskelige celler og vurdere in vivo funksjonelle effekter av det humane cytokinet tilstede i PDX. Vennligst klikk herFor å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier ble utført i samsvar med Loma Linda Universitets Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC) og Institutional Review Board (IRB) godkjente protokoller og i henhold til alle føderale retningslinjer.
FORSIKTIG: PDX og humant vev skal håndteres i samsvar med sikkerhetsprosedyrer for å forhindre overføring av blodbårne patogener.
1. Kultur og utvidelse av cytokin-transduserte stromceller
MERK: Hver gang stroma passerer, høste kultursupernatanten (1 ml alikvot) og lagre ved -80 ° C for fremtidig kvantifisering av cytokinnivå via ELISA-analyse.
- Forbered R10 dyrkningsmedium og frysemedium som beskrevet i Materialetabellen.
- Generer 10 , 11 eller oppnå kontrollstroma (transdusert med tom vektor) og cytokin-produserende (TSLP +) stroma."> 6 Oppbevares i flytende nitrogen (LN 2 ) til bruk. Tør stromalceller som beskrevet 12 og plater dem i 5 ml R10 medium i separate T-25 cellekulturflaser. Kulturceller i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2. Dette er etter-tining "passasje # 1".
- Når stroma er sammenflytende (24-48 timer), passerer celler ved trypsinering ved bruk av 1 x trypsin EDTA (0,25%) og omplettering i en T-150 dyrkningskolbe. Dette er etter-tining "passasje # 2".
- Når stroma oppnår sammenflytelse i T-150-kolberne (3-4 dager senere), passerer cellene ved trypsinering. Bruk denne cellesuspensjonen til eksperimentelle behov.
- Celleutvidelse til flere kolber
- Del de høstede cellene mellom tre T-150 flasker og kultur til sammenløp. Gjenta dette trinnet hvis stroma ekspansjon er nødvendig. Typisk humanstromal (HS-27A) celletall ved sammenløp i en T-150-kolbe er ~ 5 x 106 .
- Cell storage
- Overfør den høstede cellesuspensjonen til et konisk rør og sentrifuge ved 500 xg i 5 minutter, dekanter supernatanten og resuspender cellene i frysemedium. Frys og lagre i LN 2 ~ 1,5 x 10 6 celler per hetteglass.
- For intraperiotoneale stroma-injeksjoner i mus, fortsett til trinn 4.1.
- Celleutvidelse til flere kolber
2. ELISA-analyser for å overvåke i vitro- cytokinproduksjon fra transformert stroma
- Kjøp kommersielt tilgjengelig ELISA analysesett for å oppdage cytokinet av interesse.
- Tør stromellcelle supernatant fra kontroll og cytokin-produserende (TSLP +) stroma høstet ved tidlig, mellom og sen passasjer ( Figur 2 ).
- Bestem TSLP-konsentrasjonen i supernatantprøver ved hjelp av et ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjon. 13 Kompilere disse serielle dataene for å overvåke stabiliteten av cytokinproduksjonen under cellekultur E ( figur 2A-B ).
- Identifisere og kaste cytokin-produserende stroma med redusert eller suboptimal cytokinuttrykk, samt eventuelle tilsvarende hetteglass lagret ( figur 2A-B ).
- Identifiser og vedlikehold cytokin-produserende stroma som viser stabile cytokinkonsentrasjoner på høyt nivå. Bruk disse tine for eksperimenter.
- Bruk ELISA-settet til rutinemessig å overvåke stroma gjennom varigheten av cellekulturen (minst 1 gang i tidlige, midtre og sente etter-tinepassasjer) for å sikre stabil cytokinproduksjon eller, i tilfelle kontrollstroma, fraværet av cytokinproduksjon .
3. Fosfor-flow-cytometrianalyser for å evaluere aktiviteten av cytokin Produsert av Stroma
MERK: Vurder supernatanten fra konstruert stroma før det første eksperimentet for å verifisere den relevante bioaktiviteten til stroma-generert cytokin for individuelle eksperimenter.Ef "> 6 Når den konstruerte stroma er validert, er det ikke nødvendig med ytterligere testing med mindre stroma er introdusert som ble produsert med en ny vektor.
- Kjøpe MUTZ5 og / eller MHH-CALL4 leukemicellelinjer (TSLP responsive), 14 rekombinant humant cytokin og antistoffer godkjent for bruk i fosfos-flow-cytometri-analyser for å oppdage passende nedstrøms fosforyleringsmål.
- Tine høstet supernatant fra kontroll og cytokin-uttrykkende stroma.
- Plasser leukemicellelinjene i R20 medium (se tabell over materialer ) ved en konsentrasjon på 0,2 x 106 celler per brønn i en 96-brønn vevskulturplate. Plate 3 brønner per tilstand for å tillate tre eksemplarer. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C. Denne gangen tillater tap av noen fosforylering som oppstod under tidligere dyrkningsbetingelser.
MERK: 12 brønner per cellelinje gir tre eksemplarer for hver eksperimentell tilstand som er vist i trinn 3.4. <Li> Etter 2 timer i kultur, overfør cellene fra hver brønn for å separere 4 ml rør og sentrifuge ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten. - Suspensere cellene i 200 μL for hver av de følgende eksperimentelle tilstandene (utfør analyser i tre eksemplarer): 1) Kun negative kontrollmedier, 2) Positive kontrollmedier med rekombinant cytokin ved mettet konsentrasjon (er) (TSLP ved 15 ng / ML, etc. ), 3) kontrollstrom-supernatant fra kontrollstroma og 4) cytokin-stromasupernatant fra cytokin-produserende stroma.
- Inkubere cellene i den varigheten som er spesifisert ved spesifikk kommersiell fosforanalyse ( f.eks. 30 min for fosfor-STAT5 i MUTZ5 eller MHH-CALL4 som svar på TSLP).
- Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C og dekanter supernatanten.
- Utfør phospho-flow-cytometri-farging pr produsentens protokoll og samle inn flyt-cytometri data. 15
- Gate på intakte celler basert på fremover (FSC, angir cellestørrelse) og side (SSC, indikerer cellegrannhet) lysdisplay.
- Bestem median fluorescensintensiteten (MFI) av de intakte cellene i hver prøve. Sammenlign den gjennomsnittlige MFI som er oppnådd fra treverdige verdier av stromellcelle supernatant til den med positive og negative medier kontroller.
4. Injeksjon av cytokin-transduced stroma i mus
MERK: Kultur HS-27A stroma for minst 3 etter-tine passasjer før de injiseres i mus for å sikre sunne celler og tilstrekkelig cytokinproduksjon.
- Fremstilling av stroma
- Overfør den høstede stromalcellesuspensjonen til et konisk rør og alikvot 10 μl for hemocytometertall; Få tak i levende celle ved hjelp av trypanblå. 16 Sentrifuger gjenværende ceLl suspensjon ved 500 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten fra de pelleterte cellene og forsiktig resuspender cellene i det nødvendige volumet sterilt fosfatbuffert saltvann (PBS) for musinjeksjon (avhengig av antall mus til injeksjon).
MERK Typisk stromalcellekonsentrasjon for musinjeksjon: 0,5 x 10 6 -5 x 106 celler per mus i 200 μl PBS. - Hold stromacellesuspensjonen ved 4 ° C (eller på is) til umiddelbart før injeksjonen. Kontroller at cellesuspensjonen er minst ved romtemperatur (RT) (~ 25 ° C) for mus-injeksjon.
- Stromalcelleinjeksjon
- Desinfiser biosikkerhets hette, monter inn materialer for injeksjoner og legg deretter musekassen innvendig.
- Bland forsiktig cellesuspensjonen ved inversjon før du tegner 200 μL i en tuberkulinsprøyte.
- Ved bruk av standard intraperitoneal injeksjonsteknikker, 17Hold musen på plass og administrer 200 μl cellesuspensjonen i bukhulen. Detaljer har tidligere blitt demonstrert av Machholz et al. 18
5. Seriell blodsamling og plasmaovervåking for eksogen human cytokin hos mus
- Blodkolleksjon via hale snip
- Desinfiser biosafety hette og monter musespenne, saks og andre verktøy / forsyninger for prosedyren.
- Plasser musen i en restrainer og fest tuben for å minimere musebevegelsen.
- Desinfiser halen og kirurgisk saks med isopropylalkohol. Påfør aktuell bedøvelse krem på halen.
- Ved å bruke veldig skarpe kirurgiske saks, kryss av ca. 0,5 - 1 mm av spissen av musens hale. Samle ca. 80 μl perifert blod ved hjelp av hepariniserte kapillærrør.
MERK: Hvis blod blir samlet inn med denne metoden mer enn seks tiMes, hale fjerning bør være konservativ med respekt mengden av halen fjernet. Som snips fremover halen øker diameteren, det bløder raskere, og healing tar lengre tid.
- Plasmaseparasjon
- Overfør blodet med en pæresprøyte (for å skille den ut av kapillærrørene) til et merket K 2 EDTA mikrotainerrør; Inverter 20 ganger for å forhindre koagulasjon.
MERK: Vanligvis er blodproppene fra hale nip rask. Men hvis blødning varer lenger enn ~ 2 min, bruk en stiftisk blyant / pulver for å hjelpe koagulasjon. - Sentrifuger blodoppsamlingsrørene i henhold til produsentens instruksjon og alikvot plasman for lagring (-20 ° C) til klar for ELISA-analysen.
- Hvis det er nødvendig med mus-humant celle-chimerismedata fra museblodet, behandler du den gjenværende pellet som beskrevet i trinn 6.3.1. Ellers kasserer blodcellepellet.
- Overfør blodet med en pæresprøyte (for å skille den ut av kapillærrørene) til et merket K 2 EDTA mikrotainerrør; Inverter 20 ganger for å forhindre koagulasjon.
- Modifisert ELISA for mikro-volUmes av musplasma
MERK: Produsentens ELISA-prosedyre ble modifisert fra det anbefalte 100 μl prøvevolumet til et 40 μl volum for å imøtekomme mikrovolumene samlet fra mus. Det er ikke mulig å kjøre in vivo- plasmaprøver i tre eksemplarer med disse begrensede volumene. Ved slutten av forsøket oppsamles 500 μL post mortem blod via hjertepunktur. Cytokinkonsentrasjoner evaluert i 100 μl eutanasi-plasma brukes til å validere 40 μL in vivo data for hver mus.- Tine frosne museplasma prøver.
- Seriefortynnet ELISA-standarder og plater dem i tre eksemplarer ved 40 μL per brønn.
- Tilsett 40 μL av hver museplasmaprøve til ELISA-platen.
MERK: Hvis en musprøve er mindre enn 40 μl, så ta volumet opp til 40 μl med ELISA-buffer. Ta opp dette fortynningsvolumet og bruk det til å beregne en fortynningsfaktor for hver fortynnet prøve. NårAnalysere ELISA-dataene, multipliserer den fortynnede prøvekonsentrasjonen med prøveens fortynningsfaktor for å bestemme den faktiske cytokinkonsentrasjonen i originalprøven. - Fullfør ELISA-analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
6. Transplantasjon av hematopoietiske celler til mus
- Sublethal bestråling til tilstanden benmarg for transplantasjon
MERK: Loma Linda University (LLU) bruker en kobolt-60 strålekilde. Dyrene er plassert i en pausesperrer som er plassert 80 cm fra strålekilden i et 20 x 20 cm felt og med et 0,5 cm lag av Lexan på toppen av restraineren. Eksponeringstid beregnes for å oppnå en 225 cGy dose basert på siste kalibrering av kilden (for tiden 2-3 minutter for denne kilden).- Sub-letisk bestrålte mus (total kroppsstrålingsdose på 225 cGy maksimum for immundefekte mus).
- Transplantat hematopoietiske celler ~ 24 timer senere via </ Em> intravenøs haleveininjeksjon.
- Intra-venøs hematopoietisk celletransplantasjon
- Forbered menneskelige celle suspensjoner for transplantasjon i et volum på 200 ul steril PBS per mus: CD34 + hematopoietiske stamceller (HSC): 1 x 10 5 til 5 x 10 5 celler per mus og leukemi cellelinjer / pasientprøver: 1 x 10 6 til 5 x 10 6 celler per mus.
- Hold celler ved 4 ° C (transport på is) til umiddelbart før transplantasjon. Sørg for at cellene er minst ved RT før transplantasjon.
- Desinfiser biosikkerhetsdekselet og klargjør hetteområdet for transplantasjonsinjeksjoner.
- Plasser musen i oppvarmingsburet i minst 5 minutter for å tillate utvidelse av svalevener.
- Bland forsiktig cellesuspensjonen og trekk 200 μL i en tuberkulinsprøyte. Sikkert sett nålen til side der den forblir steril.
- Plasser musen i en fastholding og desinfiser halen med isopropylalkohol. </ Li>
- Ved å bruke standard intravenøse injeksjonsteknikker injiserer 17 den humane celle-suspensjonen i musens halevein.
MERK: Injeksjon av halevev kan ta flere forsøk, spesielt for en nybegynner dyrehandler. Kovacscics og Raper's JoVE video 19 gir detaljert demonstrasjon av denne dyreteknikken. - Overvåk musens gjenoppretting i ~ 5 min. Ta opp eventuelle bivirkninger under injeksjonen ( f.eks . Spildte celler, større blødninger, overdreven hale traumer).
- Analyse av humant cellekimisme i mus perifert blod
- Oppnå blodcellepellet igjen i mikrotainerrøret etter plasmaseparasjon (trinn 5.2.3).
- For røde blodlegemer (RBC) lyser, resuspender gjenværende blodpellet i et volum PBS som er lik plasma fjernet (for å erstatte plasmavolum) og bland godt (vortex / pipette).
- Overfør hver gjentatt blodprøve til et merket 4 ml rørOg deretter tilsett RBC lysis buffer til hvert rør i et 1: 9 forhold (900 μL RBC lysis buffer for 100 μL re-suspendert blod). Inkuber i 5 minutter ved RT. Sentrifuge (5 min, 500 xg) og dekantering.
- Utfør andre RBC lysis buffer inkubering (5 min ved RT). Sentrifuger og dekanter som tidligere.
- Vask de gjenværende cellene i ~ 1 ml PBS. Sentrifuger og dekanter som tidligere.
- Resuspender pelleten i et volum av PBS som er egnet for standard flytcytometrifarging (dette varierer i henhold til produsent og individuelle laboratorieprotokoller). 20 Bruk immunofenotyping antistoffer validert for flow-cyotmeteri for å identifisere musceller (mus CD45 +) og humane celler (human CD45 +) 6 , 21 Samt flere humane leukocyttmarkører som er spesifikke for cellelinjen av interesse.
MERK: Det anbefales å ta et lite volum (5 μL-20 μL) fra hvert museprøve for å lage "samleprøver"; Å bruke for ufarget, levedyktig og isotype kontrollprøver. Det er best praksis å ha ufarget og isotype kontroller for hver eksperimentell tilstand.
7. Funksjonell evaluering av in vivo cytokinaktivitet
- Mus eutanasi og vevshøst
- Euthanize mus via CO 2- kvælning ved utpekt eksperimentelt tidspunkt.
- Høstblod via hjertepunktur og samle plasma som i trinn 5.2.1-5.2.2.
MERK: Samle blodet før andre vev, fordi det begynner å koagulere umiddelbart etter døden. - Behandle museblod, alikvot og lagre plasma som i trinn 5.2.2.
- På et senere tidspunkt vurderer eksogen cytokinkonsentrasjon i plasma oppnådd ved eutanasi via ELISA i henhold til produsentens protokoll. Evaluer og sammenligne eksogene cytokinkonsentrasjoner i museplasmaet fra det serielle in vivoBlodsamling og eutanasi-plasmaprøver (beskrevet i pkt. 5.3).
- Legg PBS til gjenværende blodprøve for å erstatte plasmavolum og prosess som beskrevet i trinn 6.3.1 og 6.3.2. Utfør flyt-cytometri-analyser umiddelbart eller resuspender celler i frysemedium for LN 2- lagring.
- Harvest bone marrow (BM) og milt fra PDX-mus og fremstille enkeltcellesuspensjoner som tidligere beskrevet. 22
- Oppnå celleverdier for hver PDX-musvevannprøve ved bruk av 3% eddiksyre med metylenblått (lyses cellemembraner og RBC som forlater intakte kjerne av levende celler) i en 1: 1 fortynning og telle celler ved hjelp av et hemocytometer. Tabulere totale celleverdier for beinmarg og miltprøver for hvert dyr.
- Sentrifuger (500 xg, 15 min) cellesuspensjoner og dekanter supernatanten. Utfør flyt-cytometer-analyser av beinmarg og / eller miltceller umiddelbart eller resuspender i frysemedium for LN <Sub> 2 lagring.
MERK: Frys 10 BM alikvoter (for fremtidige biokjemiske analyser) og ~ 5 milt alikvoter (for fremtidige PDX transplantasjoner) per mus. - Immunofenotyping for å identifisere in vivo funksjonelle effekter
- Klargjør en masterblanding (MM) av strømningscytometriantistoffer mot hemofopoietiske populasjoner med immunofenotype som reagerer på cytokinet av interesse og en andre MM av isotype-kontrollantistoffer ( figur 5 og tabell over materialer).
- Tør PDX-vevsallikvoter (37 ° C perlebad) fremstilt i trinn 7.4.
- Vask de tintede cellene ved å overføre dem til et konisk rør og tilsett minst 3x volum PBS. Sentrifuger (500 xg, 5 min) og dekanter supernatanten.
- Gjenta vaske trinnet (7.5.3).
- Lag oppsamlede alikvoter ved å ta ~ 10 μL-20 μL celler fra hver PDX-prøve for ubestemt kontroll, levedyktighetskontroll og isotype-kontrollene (se trinn 6.4.6-notat). Stain alle prøver, unntatt uNstained kontroll, med en fixerbar levedyktighet fargestoff (død celle markør), inkuber og vask som pr produsentens protokoll.
- Stain hver PDX celle prøve med fenotyping-MM i henhold til standard flow cytometry farging protokoll; På samme måte flekker den sammenslåtte isotype-kontrollprøven (e) med isotypen-MM. Inkuber alle prøver, vask med PBS og lag prøver ved å suspendere i 1% paraformaldehyd.
- Samle strømningscytometri data og analysere data ved hjelp av en gating strategi som passer for cellepopulasjonen (er) av interesse ( Figur 5 ). En typisk gating er som følger:
- Definer intakte celler ved å tegne en FSC- og SSC-port som utelukker rusk.
- Identifiser levende celler-populasjonen ved å gate på celler som er negative for dødcellemarkøren (dette er "totale levende celler").
- Bruk under-portene i "totale levende celler" for å definere cellepopultjonene med ønsket immunfenotype (se figur 5).
- HentFrekvens av delmengde cellepopulasjoner innen total levende celletall fra strømningscytometrianalyse. 6 , 21
- Beregn antall målceller i hvert vev ved å multiplisere frekvensen av B-celle-undersettet, innenfor totale levende celler (oppnådd i trinn 7.5.6.4) med de totale levende celle-teller pr. Vev oppnådd i trinn 7.3 (% B-celle-subset x " Hemocytometercelletall ", se tabell 1 )
- Sammenlign celletallene for målcellepopulasjoner mellom kontroll PDX-mus og cytokin-uttrykkende (TSLP +) PDX-mus for å bestemme in vivo funksjonelle effekter av det eksogene humane cytokinet ( Tabell 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over modellen er vist i Figur 1 . Når cytokin-produserende (TSLP + stroma) og kontrollstroma er blitt oppnådd, blir de utvidet i kultur. Før stroma injeksjon i mus, vurderes stromalcelle-supernatanten ved hjelp av ELISA for å verifisere cytokinproduksjon ( Figur 2 ) og fosfostrømningscytometri (Protokol nr. 3) brukes til å verifisere aktiviteten til cytokinet produsert av stroma. Supernatant oppsamles fra sammenflytende stromalcellekulturer (kontrollstroma og TSLP + stroma) når celler passeres. ELISA brukes til å overvåke konsentrasjonen av TSLP i supernatanten minst en gang i løpet av de tidlige, midtre og sentrale delene. Representative data fra kontrollstroma er vist i figur 2A . Kontroll stromal celle kulturer som viser TSLP ekspresjon (og eventuelle hetteglass frosset ned fra dem) bør kasseres. Kontrollkulturer med uoppdagelig TSLP utvides og fryses ned for fremtidig bruk.Som vist i figur 2B blir kulturer av TSLP + stroma som viser lavt nivå TSLP-produksjon (og hetteglass frosset ned fra dem) kassert. TSLP + stroma som viser stabil produksjon på høyt nivå av cytokinet er valgt for utvidelse og lagring for bruk i fremtidige eksperimenter. Gjennomsnittlige nivåer av TSLP i supernatant fra flere kulturer av kontroll og TSLP + stroma er vist i figur 2C .
Den eksperimentelle tidslinjen for produksjon av kontroll PDX-mus med humant cytokin er vist i figur 3 . Stromalcellekulturer initieres 3 uker før transplantasjon og ELISA-analyse av in vitro TSLP-produksjon i kultursupernatant utføres som beskrevet i figur 2. In vivo human TSLP i museplasmaet overvåkes ukentlig ( Figur 4 ) ved å bruke "modifisert ELISA for Mikrovolumer av museplasma "beskrevet i protokoll nr. 4. perifereBlod oppsamles samtidig med plasma og analyseres som beskrevet i protokol nr. 6 under "Analyse av humant celle-chimerisme i perifert blod i mus." PDX injisert med kontrollstroma viste konsistent plasma human TSLP nivåer som er under terskelen for deteksjon ( Figur 4A ). Plasmanivået av TSLP i PDX-mus injisert med TSLP + stroma er proporsjonalt med antall TSLP + stromalceller injisert i løpet av de foregående 1 - 2 uker. Plasma nivåene av TSLP faller raskt dersom stromalcelleinjeksjoner avbrytes. 6 Som vist i figur 4B ga ukentlige injeksjoner av 0,5 x 10 6 TSLP + stroma (produserer i gjennomsnitt> 1000 pg / ml TSLP i kultursupernatant) plasma TSLP nivåer nær den nedre grensen av fysiologiske nivåer (~ 5-10 pg / ml ). Ukentlig injeksjon av 5 x 10 6 TSLP + stroma i PDX-mus ga plasma TSLP-nivåer som når høye fysiologiske nivåer (~ 35 pg / mL) som vist i
TSLP har vist seg å øke produksjonen av normale humane B-celleforløpere. 23 For å evaluere in vivo- funksjonen i TSLP sammenlignet vi produktet Ion av normale humane B-celleforløpere i kontroll og TSLP + PDX-mus transplantert med hematopoietiske stamceller som vist i figur 5 og i tabell 1 . Figur 5A viser strømningscytometri-gating for immunofenotyping som brukes til å identifisere delsett av humane B-linjeceller. Eksempelberegninger for å telle antall celler i hver delmengde for en kontroll PDX og en TSLP + PDX er vist i tabell 1 . Som vist i figur 5B, økes B-linjeceller betydelig i TSLP + sammenlignet med kontroll PDX, og denne økningen begynner med de tidligste B-celleprecursorene (pro-B-celler). Antall ikke-B-linjeceller var ikke signifikant forskjellig mellom kontroll og TSLP + PDX (data ikke vist). Denne analysen gir en måte å verifisere at den menneskelige TSLP produsert in vivo i TSLP + PDX utøver in vivo funksjonelle effekter på en målcellepopulasjon.
Ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
Figur 2: ELISA for å overvåke TSLP-cytokinkoncentrasjoner i Stroma Supernatant. ELISA-analyser ble brukt til å måle TSLP-konsentrasjoner i supernatanten fra kontrollstroma (transdusert med kontrollvektor) og TSLP + stroma (transdusert for å uttrykke human TSLP) minst en gang i løpet av følgende cellepassasjer: tidlig (passasje 1-5), midt 6-12) og sent (passasjer 13-20). Påvisningstærskelen for den humane TSLP ELISA-analysen som brukes her er 1,9 pg / ml (rød prikkelinje). ( A ) Kontrollstroma produserer minimalt detekterbare humane TSLP-konsentrasjoner; Disse nivåene er vanligvis under ELISA-deteksjonsgrensen for eksperimentets varighet. Kontrollstroma i kultur som viser økende TSLP-konsentrasjoner (> 15 pg / mL) kastes sammen med alle alikvoter frosset fra den kulturen. ( B ) Menneskelig TSLP-produksjon varierer mellom kulturer generert fra differenT tappede hetteglass med TSLP + stroma ( n = 9) og gjennom kulturperioden. TSLP stroma som viser redusert eller ustabil cytokinproduksjon (TSLP <1000 pg / ml) kasseres også. ( C ) Gjennomsnittlig TSLP-konsentrasjon for kontroll (grønn) og TSLP + (blå) stroma (middel og 95% konfidensintervaller). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksperimentell tidslinje for generering av PDX-mus med eksogen human cytokinproduksjon. In vitro og in vivo deler av eksperimentet utvikles samtidig. Kontroll og + TSLP stromacellkultur er initiert 2-3 uker før hematopoietisk celletransplantasjon, noe som sikrer minimum 3 cellepassasjer før den første (vedWk -1) av de ukentlige stromcelleinjeksjonene. Dette sikrer at stromaceller er sunne, proliferative og produserer tilstrekkelige cytokinnivåer. Supernatantalikvoter oppsamles når celler passeres og ELISA-analyser blir brukt for å bestemme TSLP-konsentrasjonen (se figur 2 ) i stroma-supernatanten. Dyr bestråles på dag 0, en dag før human hematopoietisk celletransplantasjon på dag 1. Ukentlig blodoppsamling starter 1 til 2 uker etter første stroma-injeksjoner. På dette tidspunkt bør eksogene humane cytokinkonsentrasjoner være påviselige i museplasma ved bruk av modifiserte ELISA-analyser ( Figur 4 ). Eksperimentendipunktet er 5-16 uker etter humant celletransplantasjon; Dette avhenger av mengden av menneskelig cellekimerisme oppdaget i perifert blod i mus. Normal hematopoiesis er vanligvis godt etablert i uke 5-7, leukemicellekimerisme varierer mellom cellelinjer og primære prøver (3-16 uker). PDX-transplantasjonssuksess og progresjon er også avhengigPå antall humane celler injisert ved transplantasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oppnå fysiologiske humane TSLP-cytokinkoncentrasjoner i museplasma. Mus mottar ukentlig intraperitoneal injeksjon (200 μl) transduserte celler og deres plasma samles for å evaluere humane TSLP-konsentrasjoner (ELISA-analyse) in vivo i musene over tid. " Control" -mus fikk 5 x 10 6 kontrollstromaceller, mens mus "TSLP + low" (low TSLP stroma dose) mottok 0,5 x 10 6 TSLP + stromaceller og "TSLP + high" (høy TSLP stroma dose) mus mottok 5 x 10 6 TSLP + stromalceller hver uke. Den menneskelige TSLP ELISA-analysen Deteksjonsgrense er 1,9 pg / ml (rød strekklinje) og det humane fysiologiske området TSLP er ~ 5 til 35 pg / ml (grå skygging). 24 (Referanse 11 og Coats upubliserte data) ( A ) "Kontroll" museplasma har konsekvent TSLP-nivåer <5 pg / ml eller under ELISA-deteksjonsgrensen. ( B ) "TSLP + lav" musplasma viser lave fysiologiske nivåer av TSLP; Mens ( C ) "TSLP + høy" musplasma viser høye fysiologiske nivåer. ( D ) Gjennomsnittlig TSLP-konsentrasjon for hver eksperimentell gruppe (gjennomsnitt ± SEM av alle mus og tidspunkter) viser at TSLP-nivåer oppdaget i museplasma er proporsjonal med mottatt stromdosis; Kontrollmusplasma nivåer er under ELISA deteksjonstærskelen og "TSLP + høye" plasmanivåer er fire ganger større enn "TSLP + lave" museplasmanivåer."> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av normale humane B-cellepopulasjoner Validere I n Vivo Funksjonseffekter av eksogen human TSLP i PDX-mus. PDX-mus ble konstruert med kontroll og TSLP + stroma og transplantert med humane CD34 + -celler isolert fra navlestrengsblod. Immunofenotyping ved hjelp av flytcytometri ble brukt til å identifisere delsett av humane B-celleforløpere i benmarg høstet fra kontroll og TSLP + PDX som følger: høstet benmarg, ble tint og farget med fikserbar levedyktighetsfarging og farget for flytcytometri for å oppdage anti- Human CD45, CD19, CD34, K & λ lettkjede og enten overflate IgD og IgM eller intracellulær IgM (cμ). ( A ) Total levende celJeg ble gated basert på en levedyktighetsmarkør. Etterfølgende grenser viser etterfølgende portene å identifisere utviklingsmessig sekvensielle B-linjestykker (data vist er fra TSLP + PDX). ( B ) Frekvensen av hver delmengde innen totale levende celler ble bestemt ved hjelp av flowcytometri-programvare og antall celler i hver B-celle-undergruppe ble beregnet. (Se tabell 1). Celltall for hver B-cellesubset i kontroll (svart, n = 3) og TSLP + (blå, n = 5) PDX-mus er grafet. (Middel ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Human Cell Population | Freq. Av totalt levende celler | Levende Cell Count IN BM | # Celler i befolkning |
| Kontroll Mus | |||
| Totalt levende celler | 100,00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| hCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Totalt CD19 + | 27.20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24.20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Pre-B | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 10 6 |
| Umodne b | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Eldre B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 10 6 |
| TSLP + Mus | |||
| Totalt levende celler | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| Totalt CD19 + | 65.10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60.20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Pre-B | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Umodne b | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 10 6 |
| Eldre B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 10 6 |
Tabell 1: Frekvens og telling av normale humane B-celledeler i PDX-benmarg. Frekvensen (%) av hver B-celle-undergruppe i de totale levende celler ble bestemt ved hjelp av flowcytometrianalyse (se figur 5A for gatingstrategi). Representative beinmarg (BM) data fra en kontroll PDX-mus (mottatt kontrollstroma injeksjoner, 5 x 10 6 celler / uke) og en TSLP + PDX-mus (mottatt TSLP stroma injeksjoner, 5 x 10 6 celler / uke). De totale levende BM-celletallene ble registrert ved eutanasi og immune-fenotyping-flowcytometri ble brukt til å vurdere delmengdefrekvens (%) og beregne størrelsen på hver B-celle-subsettpopulasjon (delmengdecelleantall = "totAl levende celler "x" delmengdefrekvens ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver en enkel, rask og relativt kostnadseffektiv metode for konstruksjon av PDX for å uttrykke eksogent humant cytokin. Strategien beskrevet her er basert på ukentlige intraperitoneale injeksjoner av en stromalcellelinje transdusert for å uttrykke det humane cytokin, TSLP. Før utførelse av metodene beskrevet her, ble stroma konstruert for å uttrykke høye nivåer av cytokinet av interesse (TSLP) og tilsvarende konstruert kontrollstroma generert. I protokollene som presenteres her, blir stroma utvidet i kultur og screenet for evnen til å gi stabil, høyt nivå cytokinproduksjon over tid (eller for fravær av cytokinproduksjon i tilfelle kontrollstroma). Analyser for å verifisere aktiviteten av stroma-generert cytokin ble utført, og eksperimentelle tidslinjer for stromalcelleinjeksjon ble utviklet for å produsere PDX med fysiologisk human TSLP (og kontrollmus som mangler human TSLP). Prosedyrer for overvåkning av plasma nivåer av menneskelig TSLP ogFor å verifisere dets in vivo funksjonelle effekter på cytokin-responsive cellepopulasjoner ble utført.
Flere faktorer bør vurderes ved valg av stromaceller og vektorer som vil bli brukt i protokollene presentert her. Stromale cellelinjer bør ikke endogent gi høye nivåer av cytokin, og bør ikke være responsive mot cytokinet av interesse. For studier her ble den humane benmargstromcellelinjen, HS-27A, valgt fordi den vokser robust i kultur med lavt nivå cytokinproduksjon. 8 Metoden beskrevet her inkluderer også "kontroll" PDX konstruert med samme stroma som TSLP + PDX, men uten overekspresjon av TSLP. Sammenligninger av resultater i TSLP + og kontroll PDX tillater oss å kontrollere for eventuelle effekter på grunn av endogen stromalcellecytokinproduksjon. Transduksjon av stromalceller med vektorer som inkluderer fluorescerende proteiner eller andre selekterbare markører kan være nyttig for å isolere celler thVed sannsynligvis overexpress cytokinet av interesse. Imidlertid er det essensielt å analysere cytokin-supernatant for å bestemme nivået av cytokin fremstilt av stromaceller fordi in vivo plasmakytokinnivåene i mus korrelerer med cytokinkonsentrasjonen i stromalcelle-supernatanten, 6 samt antallet stroma injisert på en Ukentlig basis ( figur 4 ).
Det er viktig at aktiviteten til cytokinet produsert av stroma er verifisert før PDX-studier. Vi brukte fosfos-strømningscytometri til analyse for molekyler fosforylert nedstrøms for TSLP-stimulering i celler som reagerer på TSLP. TSLP aktiverer JAK-STAT5 og PI3 / AKT / mTOR-banene. MUTZ5- og MHH-CALL4 leukemicellelinjer uttrykker høye nivåer av TSLP-reseptorkomponentene og viser nedstrøms STAT5-, AKT- og ribosomalprotein-S6-fosforylering etter TSLP-stimulering. 14 Her brukte vi phopho-flowcytometriFor å evaluere fosforylering av STAT5 (pSTAT5) indusert nedstrøms for TSLP-stimulering. I tidligere arbeid vurderte vi for ytterligere TSLP-stimulerte fosforyleringshendelser: fosfat AKT (pAKT) og fosfos-ribosomalt protein S6 (pS6, nedstrøms for mTOR). Resultater viste at pAKT-analysen er mindre følsom og pS6-følsomere enn pSTAT5-analysen. 6 Når fosforanalyser utføres, skal responsive celler dyrkes med mettende nivåer av rekombinant human TSLP som en positiv kontroll og kun med medier (ikke cytokin) som en negativ kontroll. Supernatant fra kontrollstroma skal analyseres langs siden fra TSLP + stroma som et annet middel for å verifisere (i tillegg til ELISA) at TSLP ikke produseres av kontrollstroma. Dette tjener også som en kontroll for å sikre at endogen cytokinproduksjon ikke er ansvarlig for fosforyleringen observert i analyser av TSLP + -celler. Ideelt fosforylering indusert fra cytokin-produserende stroma prøver bør være likEr det som observerer med rekombinant cytokin tilstand, selv om det kan være lavere hvis konsentrasjonen av cytokin i supernatanten er lavere enn i den mettende, positive kontroll. En positiv kontroll med rekombinante TSLP nivåer som samsvarer med nivåene observert av ELISA for TSLP + stroma er et godt alternativ.
Identifisering av kjente funksjonelle indikatorer for in vivo cytokinaktivitet kan være en utfordring. Analyser av fosforylering kan ikke være mulig fordi fosforylering indusert av det eksogene humane cytokinet in vivo kan bli fortapt under vevshøst. Siden TSLP har blitt vist å øke produksjonen av humane B-celleforløpere, ble 23 den funksjonelle effekten av TSLP i PDX verifisert ved å analysere for in vivo økninger i den humane B-celleprecursorpopulasjonen ved bruk av flowcytometriimmunofenotyping. En alternativ strategi kan analyseres for spesifikke cytokin-induserte endringer i genuttrykk og sammenligningNg-ekspresjon i celler høstet fra cytokin-uttrykkende PDX til celler fra kontroll PDX. 6
Det endelige målet med humant cytokinuttrykk i PDX er å generere en preklinisk modell som nærmere modellerer in vivo- miljøet tilstede hos pasienter. Dette ble testet ved å sammenligne helgenuttrykk i humant vev isolert fra kontroll PDX og fra cytokin-uttrykkende (TSLP +) PDX til de opprinnelige pasientprøver. Disse studiene viste at genuttrykk i pasientprøver er betydelig nærmere leukemiceller fra TSLP + PDX enn kontroller. 6 Men våre studier fokuserte på lymphopoiesis. En rekke myeloidfremmende cytokiner som produseres i musen, aktiverer ikke deres humane reseptormodeller. Det er humane cytokin knockin-mus (NSGS-mus og andre) som adresserer dette problemet. Faktisk er en verdi av modellen vi beskriver her at den kan brukes i NSGS-mus for å skape en modell som lukker merEly modellerer det humane in vivo miljøet ved å uttrykke TSLP i tillegg til myeloidfremmende humane cytokiner. På den annen side kan et cytokin +/- system bli dannet i NSG-mus ved å anvende fremgangsmåten beskrevet her for hver av disse myeloidfremmende cytokiner. Denne modellen kan brukes til å studere den nøyaktige in vivo rollen til hver av dem i myelopoieis og / eller myeloid leukemi.
Utviklet PDX som produserer fysiologiske nivåer av menneskelig TSLP, gir en preklinisk modell som mer nøyaktig etterligner det in vivo miljøet som er tilstede hos pasienter enn klassisk PDX. 4 Produksjonen av kontroll PDX-mus som også er konstruert, er også beskrevet. Sammen kontroll og cytokin-produserende PDX skaper et menneskelig TSLP +/- modell system som vi har brukt til å evaluere rollen av TSLP i in vivo produksjon av normale og ondartede humane B-celler. 4 , 6 DetteModellen er svært relevant for studier av en bestemt høyrisikobild av B-celle akutt lymfoblastisk leukemi (B-ALL) som er preget av genetiske endringer som fører til overekspresjon av CRLF2. CRLF2 er en reseptor for TSLP-cytokinet og dermed TSLP-indusert CRLF2-signalering bidrar trolig til onkogenese og progressjon av CRLF2 + B-ALL. Bruk av PDX til å studere denne sykdommen er spesielt kritisk fordi PDX tillater oss å studere leukemi i sammenheng med pasientens genetiske landskap. Genetisk landskap som en sykdomsbidragsyter er sterkt involvert i CRLF2 + B-ALL, som forekommer fem ganger oftere hos Hispanic / Latino-barn enn andre, og utgjør halvparten av alle B-ALL-tilfeller hos Downs syndrom-pasienter. PDX-modeller som uttrykker menneskelig TSLP som den som beskriver her, vil være et viktig verktøy for å identifisere terapier og forståelse av sykdomsmekanismer i CRLF2 + B-ALL, samt for å forstå normal hematopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
