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पेटी-व्युत्पन्न Xenografts में एक्सगोनेस साइटोकीन का अभिव्यक्ति एक साइटोकीन-ट्रांसडुस्ड स्ट्रॉम्मल सेल लाइन के साथ इंजेक्शन के माध्यम से

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55384
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

Summary

यहां वर्णित एक साइटोकाइन-ट्रांसडुस्ड स्ट्रॉम्बल सेल लाइन के साप्ताहिक इंट्राइटेरेटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से रोगी-व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) चूहों में एक्सोजेनस साइटोकिन बनाने के लिए एक विधि है। यह विधि पीडीएक्स की उपयोगिता को बढ़ाती है और पीडीएक्स मॉडलों की एक भीड़ में क्षणिक या निरंतर बहिर्जात साइटोकिन डिलीवरी के लिए विकल्प प्रदान करता है।

Abstract

रोगी-व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) चूहों को मानव कोशिकाओं को प्रतिरक्षा दोष की चूहों में प्रत्यारोपण द्वारा उत्पादित किया जाता है। ये मॉडल सामान्य और घातक हेमटोपोइजिस के तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं और कई दुर्दमताओं के लिए प्रभावी रसायन चिकित्सा की पहचान करने के लिए स्वर्ण मानक हैं। पीडीएक्स मॉडल संभव हैं क्योंकि कई माउस साइटोकिन्स भी मानव कोशिकाओं पर कार्य करते हैं। हालांकि, यह सभी साइटोकिन्स के लिए मामला नहीं है, जिनमें कई लोग मानव कोशिकाओं में सामान्य और घातक हेमटोपोईजिस के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं। तकनीकों की तकनीक जो मानव साइकोसिन (ट्रांसजेनिक और दस्तक-इन मॉडल्स) का उत्पादन करने के लिए चूहों को प्रदर्शित करती है, उससे पहले मॉडल की उपयोगिता का प्रदर्शन किया गया है। अन्य तकनीकों में श्रम गहन (पुनः संयोजक साइटोकिन या लैन्टीवायरस का इंजेक्शन) और कुछ मामलों में तकनीकी विशेषज्ञता (डीएनए के हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन) के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है। यह रिपोर्ट पीडीएक्स चूहों को उत्पन्न करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है जिसमें बाह्य मानव साइटॉकिने (टीएसएलपी, थायमीक स्ट्रॉम्मल लिम्फोपोइटिन) जो कि साइड इट्रेपेरटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से होता है जो कि इस साइटोकिन को ओवरेक्प्रेस करने के लिए ट्रांसडुस्ड कर दिया गया है। इस पद्धति का उपयोग लगातार साइटोकिन उत्पादन के विवो स्रोत प्रदान करता है जो माउस में मानव साइटोकिन को परिचालित करने के शारीरिक स्तर को प्राप्त करता है। इंजेक्शन में स्ट्रोकल कोशिकाओं की संख्या के आधार पर मानव साइटोकिन का प्लाज्मा स्तर अलग-अलग किया जा सकता है, और प्रयोग में किसी भी बिंदु पर साइटोकाइन उत्पादन शुरू किया जा सकता है। इस पद्धति में साइटोकिन-नकारात्मक नियंत्रण चूहों को भी शामिल किया गया है जो समान रूप से उत्पादित हैं, लेकिन एक नियंत्रण वेक्टर के साथ ट्रांसडाइज किए गए स्ट्रोमा के इंट्राइटिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से। हमने पहले यह दिखाया है कि पीडीएक्स नियंत्रण की तुलना में टीएसएलपी-व्यक्त पीडीएक्स से ल्यूकेमिया कोशिकाओं का उत्पादन होता है, मूल मरीज के नमूने की तरह एक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करता है। इस विधि द्वारा उत्पादित साइटोकिन-उत्पादक और साइटोकिन-नकारात्मक पीडीएक्स चूहों के साथ एक मॉडल प्रणाली प्रदान की गई है जिसे हमने सफलतापूर्वक अध्ययन करने के लिए उपयोग किया हैटीएसएलपी की भूमिका सामान्य और घातक हेमटोटोपीज में

Introduction

रोगी-व्युत्पन्न xenografts (पीडीएक्स) एक 'देशी' स्तनधारी वातावरण में सामान्य और घातक हेमटोटोपेटिक कोशिकाओं के उत्पादन का अध्ययन करने के लिए विवो मॉडल में एक शक्तिशाली हैं अक्सर, पीडीएक्स इंजेक्शन या मानव कोशिकाओं को प्रतिरक्षा उन्मूलन चूहों में इंजेक्शन या प्रत्यारोपण द्वारा निर्मित किया जाता है। पीडीएक्स का उत्पादन सामान्य मानव हेमटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं का उपयोग सामान्य मानव रक्त और प्रतिरक्षा सेल के विकास के विवो अध्ययन में अनुमति देता है । ल्यूकेमिया या अन्य कैंसर कोशिकाओं से उत्पन्न पीडीएक्स ने मानव जनसंख्या में उपस्थित आनुवंशिक परिदृश्य और म्यूटेशन की सीमा के संदर्भ में प्रभावी उपचार की पहचान करने के लिए ऑनकोजनिक तंत्र का अध्ययन करना और संभावित उपचार की पहचान करना है। 1 नतीजतन, पीडीएक्स, कैंसर की प्रगति के तंत्रों को समझने के लिए प्रभावी उपचारों की पहचान करने और एक महत्वपूर्ण उपकरण की पहचान करने के लिए अनुवादित जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए मौजूदा स्वर्ण मानक हैं। पीडीएक्स मॉडल विशिष्ट असर होने के कारण स्वास्थ्य असमानताओं के रोगों में शोध के लिए आवश्यक उपकरण हैं आनुवांशिक घावों, या किसी भी बीमारी जिसमें रोगी के आनुवंशिक परिदृश्य के विविधता ऑक्सोजेनेसिस और उपचार के परिणाम में काफी योगदान कर सकते हैं।

माउस-मानव पीडीएक्स मॉडल संभव हैं क्योंकि कई माउस साइटोकिन्स पर्याप्त रूप से मानव कोशिकाओं के साइटोकिन रिसेप्टर्स को सक्रिय करने में अपने मानव एनालॉग की नकल करते हैं जबकि वे माउस के अंदर हैं। उदाहरण के लिए, इंटरलीुकिन -7 (आईएल -7) मानव बी सेल विकास के लिए एक महत्वपूर्ण संकेत प्रदान करता है। 2 इस मामले में, माउस आईएल -7 में मानव आईएल -7 के साथ पर्याप्त समरूपता है, जो कि माउस साइटोकाइन मानव बी सेल के अग्रदूतों में संकेतन पथ को उत्तेजित करता है। 2 , 3 , 4 हालांकि, यह थैमीक स्ट्रॉम्मल लिम्फोपोइटिन (टीएसएलपी), 5 , 6 के मामले में नहीं है , जिसमें अन्य साइटोकिन्स (आईएल -3, ग्रैन्यूलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) ,सामान्य और घातक मानव हेमटोपोएटिक कोशिकाओं के उत्पादन के लिए 7 महत्वपूर्ण है। जब माउस और मानव साइटोकिन्स कम समालोचना दिखाते हैं तो माउस साइटोकिन्स अपने संबंधित रिसेप्टर्स को मानव कोशिकाओं पर सक्रिय नहीं करते हैं। इस बाधा को दूर करने के लिए, कई रणनीतियों का उपयोग किया गया है पीडीएक्स चूहों में मानव साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति करने के लिए अभिकरण करने के लिए। इसमें पुनः संयोजक मानव साइटोकिन्स का इंजेक्शन, डीएनए के हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन, लेन्टीवियरल अभिव्यक्ति, ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति और नॉकिन जीन प्रतिस्थापन शामिल हैं। 7 यह रिपोर्ट इंजीनियरिंग पीडीएक्स के लिए एक पद्धति का वर्णन करती है जो स्ट्रॉमल-मध्यस्थता के माध्यम से मानव साइटोकाइन साइटोकिन वितरण ( चित्रा 1 )।

यहां दिखाए गए विधि में, पीडीएक्स चूहों को मानव साइटोकिन, टीएसएलपी, या साइटोकिन नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए इंजीनियर किया गया है। टीएसएलपी-व्यक्त पीडीएक्स स्ट्रॉमल कोशिकाओं के साप्ताहिक इंट्राटेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किए जाते हैं जो मानव टीएसएलपी के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यूस कर दिया गया है।साइटोकाइन-नकारात्मक पीडीएक्स "नियंत्रण" चूहों की इसी तरह इंजीनियर हैं; हालांकि नियंत्रण stroma एक नियंत्रण वेक्टर के साथ transduced हैं पीडीएक्स चूहों में टीएसएलपी + स्ट्रॉमा के इंजेक्शन के साथ इस पद्धति को मानव टीएसएलपी के सामान्य शारीरिक स्तर प्राप्त होते हैं। पीडीएक्स चूहों में साइटेकिन-नकारात्मक स्ट्रोमा प्राप्त करने में कोई भी detectable टीएसएलपी नहीं देखा जाता है। हमने हमारे अध्ययन के लिए मानव स्ट्रॉम्मल सेल लाइन एचएस -27 ए चुना है क्योंकि यह संस्कृति में मजबूती से बढ़ता है और साइटोकिन उत्पादन का बहुत कम स्तर दिखाता है जो कि कोकल्चर में पृथक पूर्व कोशिकाओं के प्रसार को समर्थन नहीं करता है। 8 मानव टीएसएलपी अभिव्यक्ति के लिए, पहले से वर्णित रीढ़ की हड्डी से उत्पन्न एक उन्नत पीढ़ी के आत्म-निष्क्रिय करने वाले लेन्टीविरल वेक्टर के साथ stroma को ट्रांसड्यूस किया गया था, 9 और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए सीपीपीटी / सीटीएस तत्व और वुडचुक हेपेटाइटिस पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल नियामक तत्व (डब्ल्यूपीआरई) शामिल है। मानव टीएसएलपी जीन इस वेक्टर में बढ़ाव कारक-1 के नियंत्रण में बनाया गया था(ईएफ -1) अल्फा प्रमोटर मजबूत, गठन, और दीर्घकालिक अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए।

इस मानव-साइटोकिन बढ़ाया पीडीएक्स मॉडल की इंजीनियरिंग में 4 प्रमुख कदम हैं। सबसे पहले, ट्रांस्डस्ड स्ट्रोमा को इन विट्रो में विस्तारित किया गया है और स्थिर, उच्च स्तरीय साइटोकिन उत्पादन के लिए एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेट परख (एलिसा) द्वारा मूल्यांकन किया गया है। दूसरा, transduced stromal कोशिकाओं (और नियंत्रण stroma से साइटोकिन गतिविधि की कमी) द्वारा उत्पादित मानव साइटोकिन की गतिविधि phospho-flow cytometry का उपयोग करके सत्यापित है। साइटोकिन की रुचि के लिए उत्तरदायी जाने वाली सेल लाइनें (इस उदाहरण में, टीएसएलपी) स्ट्रॉमल सेल सतह पर तैरने वाले के साथ होती हैं और साइटोकाइन प्रेरित फॉस्फोरेलेशन के लिए एटाईड होती हैं। तीसरा, चूहों transduced मानव stroma के साथ अंतःक्षिप्त होते हैं और फिर माउस प्लाज्मा साप्ताहिक आधार पर मानव साइटोकाइन के स्तर के लिए एलिसा द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। चौथा, मानव हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जाता है और मानव साइटोकिन के विवो कार्यात्मक प्रभाव का एक ज्ञात लक्ष्य पर मूल्यांकन किया जाता है (

आकृति 1
चित्रा 1: पीईडीएक्स मॉडल एक्सीोजेनीस मानव साइटोकीन को चूहे में तैयार करने के लिए इंजीनियर। ( 1 ए ) डिज़ाइन प्रयोग और ट्रांसडुस्ड मानव स्ट्रॉम्बल कोशिकाएं ( 1 बी ) पीडीएक्स (रोगी-व्युत्पन्न xenograft) चूहों को उत्पन्न करने के लिए मानव कोशिकाओं (हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं, ल्यूकेमिया कोशिकाओं, आदि ) प्राप्त करते हैं। ( 2 ए ) प्रयोगात्मक अनुसूची के अनुसार प्रतिरक्षा दोष में चूहों में इंजीनियर स्ट्रॉमा और ( 2 बी ) प्रत्यारोपण मानव कोशिकाओं को इंजेक्षन। ( 3 ए-बी ) एलआईएसए द्वारा स्ट्रॉमा तैरनेवाला और माउस प्लाज्मा में साइटोकिन सांद्रता की निगरानी करें। ( 4 ) हार्वेस्ट मानव कोशिकाओं और पीडीएक्स में मौजूद मानव साइटोकिन के विवो कार्यात्मक प्रभावों का मूल्यांकन। आप यहाँ क्लिक करेंइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए

पीडीएक्स चूहों में मानव साइटोकिन्स देने / उत्पादन करने के अन्य तरीकों की तुलना में, स्ट्रोकल कोशिकाओं के माध्यम से मानव साइटोकाइन की डिलीवरी फायदे और नुकसान प्रदान करती है। 7 पुनः संयोजक मानव साइटोकिन के इंजेक्शन के मुकाबले, स्ट्रोमा-मध्यस्थता की डिलीवरी आमतौर पर कम खर्चीली है (स्ट्रॉम्मल सेल संस्कृति की लागत पुनः संयोजी साइटोकिन की लागत से कम है) और कम श्रम गहन (प्रति सप्ताह प्रति इंजेक्शन प्रति सप्ताह कई इंजेक्शन)। अल्कोहोल साइटोकिन का आधा जीवन का मुद्दा भी कम हो जाता है क्योंकि स्ट्रोमा लगातार बाहरी कोशिकायन का उत्पादन करती है। डीएनए के हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन के माध्यम से साइटोकिन की डिलीवरी स्ट्रॉमा द्वारा डिलीवरी से कम महंगा हो सकती है। हालांकि, यह समान रूप से क्षणिक है और स्ट्रॉमा-मध्यस्थता वितरण के लिए आवश्यक सरल साप्ताहिक इंट्राटेरेटोनियल इंजेक्शन से अधिक तकनीकी कौशल की आवश्यकता हो सकती है। माउस में लेंटिवायरल जीन की अभिव्यक्ति एक कम टीआरए प्रदान कर सकती हैसाइटोकिन वितरण की nsient विधि; हालांकि, हमारे हाथों में शारीरिक टीएसएलपी स्तर हासिल नहीं हुए थे। इसके अतिरिक्त, इस पद्धति का श्रम गहन होता है, जिसे लेन्टीवायरल वेक्टर के निरंतर उत्पादन की आवश्यकता होती है। ट्रांसजेनिक या दस्तक इन चूहों साइटोकिन की स्थिर दीर्घकालिक अभिव्यक्ति की पेशकश और ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर हो सकते हैं, जो एक लाभ हो सकता है। दूसरी ओर, पीडीएक्स चूहों के लिए जरूरी इम्यून की कमी माउस पृष्ठभूमि पर मानव साइटोकिन जीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति, मॉडल के मूल्य से पहले स्थापित किया गया है संसाधनों का एक विशाल निवेश की आवश्यकता है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक मॉडल आम तौर पर साइटोकिन की शुरुआत या विवो साइटोकिन उत्पादन के स्तर के स्तर को बदलने के विकल्प के लिए अनुमति नहीं देते हैं। ये स्ट्रोमा-मध्यस्थत प्रसव के साथ प्राप्त की जा सकती है ताकि केवल स्ट्रॉमल सेल इंजेक्शन की शुरूआत के लिए समय बिंदु बदल कर या इंजेक्शन वाले स्ट्रोबल कोशिकाओं की खुराक हो।

स्ट्रोमाल सेल मध्यस्थताय साइटोकिन डिलीवरी मेथओडी का विश्लेषण सामान्य मानव बी सेल विकास 4 , 6 और उच्च जोखिम वाले बी-सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक लेकिमिया में टीएसएलपी की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए पीडीएक्स को विकसित करने के लिए किया गया था। 6 यह पद्धति टीएसएलपी के अलावा मानव साइकोसिन के साथ समान मॉडलों को बनाने में उपयोग के लिए वैकल्पिक साइटोकिन वितरण पद्धति प्रदान करती है। यह मॉडल प्रारंभिक आंकड़ों को पैदा करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है जो यह निर्धारित करने में सहायता कर सकता है कि क्या साइटोकिन ट्रांसजेनिक या पीडीएक्स मॉडल में साइनोकिन का मूल्य पर्याप्त समय और धन के निवेश के योग्य होगा या नहीं।

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Protocol

अध्ययनों के अनुसार लोमा लिंडा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) के अनुमोदित प्रोटोकॉल और सभी संघीय दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे।

सावधानी: पीडीएक्स और मानव के ऊतकों को रक्त जनित रोगजनकों के संचरण को रोकने के लिए सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला जाना चाहिए।

1. सिटोकिन-ट्रांसडुस्ड स्ट्रॉम्मल सेल की संस्कृति और विस्तार

नोट: हर बार स्ट्रोमा पारित हो जाता है, संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (1 एमएल विभाज्य) काटा जाता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ताकि एलीसा परख के माध्यम से साइटोकिन स्तर के भविष्य मात्रा का ठहराव हो।

  1. सामग्री तालिका में वर्णित के रूप में R10 संस्कृति माध्यम और ठंड माध्यम तैयार करें।
  2. 10 , 11 उत्पन्न करें या नियंत्रण stroma (खाली वेक्टर के साथ ट्रांसडुस्ड) और साइटोकाइन-उत्पादन (टीएसएलपी +) स्ट्रॉमा प्राप्त करें।"6 उपयोग करने तक तरल नाइट्रोजन (एल एन 2 ) में स्टोर। 12 वर्णित के रूप में स्ट्रॉबल कोशिकाओं को पिघलते हैं और उन्हें अलग-अलग टी -25 सेल संस्कृति फ्लास्क में आरएलआई माध्यम के 5 एमएल में डालते हैं। इनक्यूबेटर में संस्कृति कोशिका 37 डिग्री सेल्सियस से 5% सीओ 2. यह पोस्ट पिघलना "बीतने # 1" है।
  3. एक बार स्ट्रोमा (24-48 घंटे), उत्तरार्द्ध कोशिकाओं द्वारा 1 × ट्रिप्सिन ईडीटीए (0.25%) का उपयोग करके ट्रिप्सिनिंग करके टी-150 कल्चर फ्लास्क में फिर से चढ़ाना। यह पोस्ट पिघलना "पारगमन # 2" है
  4. जब टी -550 फ्लास्क (3-4 दिनों के बाद) में स्ट्रोमा को सहसंबद्धता मिलती है, तो कोशिकाएं ट्रिप्सिनिज़िंग द्वारा उत्तीर्ण करती हैं प्रायोगिक आवश्यकताओं के लिए इस सेल निलंबन का उपयोग करें
    1. एकाधिक फ्लास्क के लिए सेल विस्तार
      1. कन्फ्यूज तक तीन टी -105 बोतल और संस्कृति के बीच कटा हुआ कोशिकाओं को विभाजित करें। यदि स्प्रोमा विस्तार की आवश्यकता होती है तो इस चरण को दोहराएं। टी -50 फ्लास्क में संगम पर विशिष्ट मानवीय स्ट्रॉमल (एचएस -27 ए) सेल की गणना ~ 5 x 10 6 है
    2. सेल एसग़ुस्सा करना
      1. 500 मिलीग्राम पर 5 मिनट के लिए एक शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कटा हुआ सेल निलंबन स्थानांतरित करें, सतह पर तैरनेवाला छानना और ठंड मध्यम में कोशिकाओं को पुन: resuspend। एलएन 2 ~ 1.5 x 10 6 कोशिकाओं प्रति शीशी में रुकें और स्टोर करें।
    3. चूहों में अंतर-प्रतिओटोऑनियल स्ट्रॉमा इंजेक्शन के लिए, चरण 4.1 पर आगे बढ़ें।

2. ट्रांससाइज्ड स्ट्रोमा से विट्रो साइटोकीन प्रोडक्शन में मॉनिटर करने के लिए एलिसा एसेस

  1. ब्याज की साइटोकिनी का पता लगाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा परख किट खरीदें।
  2. प्रारंभिक, मध्य और देर से पारित होने पर चित्रा 2 ( चित्रा 2 ) में कटाई के नियंत्रण और साइटोकिन-उत्पादक (टीएसएलपी +) स्ट्रोमा से स्ट्रॉमल सेल सतह पर तैरनेवाला पिघलना।
  3. निर्माता की शिक्षा के अनुसार एलिसा किट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले नमूनों में टीएसएलपी एकाग्रता का निर्धारण करें। 13 सेल संकाय के दौरान साइटोकाइन उत्पादन की स्थिरता पर नजर रखने के लिए इन सीरियल डेटा को संकलित करें ई ( चित्रा 2 ए-बी )
    1. कम या उपोपाटिक साइटोकिन अभिव्यक्ति के साथ-साथ भंडारण में किसी भी संबंधित शीशियों ( चित्रा 2 ए-बी ) के साथ cytokine-producing stroma को पहचानें और त्यागें।
    2. स्थिर, उच्च स्तरीय साइटोकिन सांद्रता प्रदर्शित करने वाली साइटोकिन-उत्पादन वाली स्ट्रोका पहचानें और बनाए रखें। प्रयोगों के लिए इन अंगों का प्रयोग करें।
  4. सेलटाइकाइन उत्पादन के लिए स्थिर साइटोकाइन उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए या, सेलोकाइन उत्पादन के अभाव में, सेल संस्कृति के पूरे अवधि (कम से कम 1 बार प्रारंभिक, मध्यम और देर से पोस्ट पिघलना अंश के दौरान) को नियमित रूप से निगरानी करने के लिए एलिसा किट का प्रयोग करें ।

3. स्ट्रॉमा द्वारा उत्पादित साइटोकाइन की गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए फास्फो-फ्लो साइटोमैट्री ऐसे

नोट: व्यक्तिगत प्रयोग के लिए स्ट्रोमा जनित साइटोकिन की प्रासंगिक बायो-गतिविधि को सत्यापित करने के लिए पहले प्रयोग के पहले इंजीनियर फ्लोरोमा से सतह पर तैरनेवाला का आकलन करें।Ef "> 6 एक बार इंजीनियर स्ट्रॉमा मान्य हो जाने पर, आगे की जांच आवश्यक नहीं होती जब तक कि स्ट्रोडा पेश नहीं किया जाता है जो कि एक नया सदिश के साथ निर्मित किया गया था।

  1. MUTZ5 और / या MHH-CALL4 ख़रीदने वाले फास्फोराइलेशन लक्ष्य को पता लगाने के लिए फॉस्फो-प्रवाह साइटोमेट्री एनाल्स में उपयोग के लिए स्वीकृत एल्यूकेमिया सेल लाइन (टीएसएलपी उत्तरदायी), 14 पुनः संयोजक मानव साइटोकिन और एंटीबॉडी खरीदते हैं।
  2. नियंत्रण से नियंत्रण सतह पर तैरनेवाला काटा और cytokine-express stroma।
  3. एक अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में 0.2 x 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में R20 मध्यम (सामग्री की तालिका देखें) में ल्यूकेमिया सेल लाइन प्लेटें। प्लेट प्रति 3 कुओं प्रति शर्त के अनुसार तीन प्रतियों की अनुमति के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं इस समय पूर्व संस्कृति स्थितियों के दौरान हुई किसी भी फास्फोरियम के नुकसान की अनुमति है।
    नोट: प्रति सेल लाइन 12 कुओं चरण 3.4 में दिखाए गए प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए तीन प्रतियों को प्रदान करता है।
    4. <Li> संस्कृति में 2 घंटे के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर, 5 मिनट के लिए 500 ग्राम में 4 एमएल ट्यूबों और अपकेंद्रित्र को अलग करने के लिए प्रत्येक कुएं से कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। सतह पर तैरनेवाला decant
    1. निम्नलिखित प्रायोगिक परिस्थितियों में से प्रत्येक के लिए 200 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (1) नकारात्मक नियंत्रण-मीडिया केवल, 2) संतृप्त एकाग्रता पर पुनः संयोजक साइटोकिन युक्त सकारात्मक नियंत्रण-मीडिया (15 एनजी पर टीएसएलपी) / एमएल, आदि ), 3) नियंत्रण stroma से नियंत्रण stroma- सतह पर तैरनेवाला, और 4) साइटोकिन-उत्पादन stroma से cytokine-stroma- सतह पर तैरनेवाला।
  4. विशिष्ट व्यावसायिक फॉस्फो-परख द्वारा निर्धारित अवधि के लिए कोशिकाओं को सेते हैं ( उदाहरण के लिए 30 मिनट फॉस्फो-एसटीएटी 5 में एमयूटीजे 5 या एमएचएच-कॉल 4 टीएसएलपी के जवाब में)।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला छानना।
  6. प्रति निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार फास्फो-प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला करना और प्रवाह साइटमैट्री डेटा एकत्र करना। 15
  7. 15
    1. आगे पर आधारित अक्षत कोशिकाओं पर गेट (एफएससी, सेल आकार इंगित करता है) और पक्ष (एसएससी, सेल ग्रैन्युलैरिटी इंगित करता है) प्रकाश स्कैटर
    2. प्रत्येक नमूने में अक्षुण्ण कोशिकाओं की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) निर्धारित करें। औसत एमएफआई को स्ट्रॉमल सेल सतह पर तैरनेवाला के तीनों मूल्यों से प्राप्त सकारात्मक और नकारात्मक मीडिया नियंत्रणों की तुलना करें।

4. चूहे में साइटोकीन-ट्रांसडुस्ड स्ट्रोमा का इंजेक्शन

नोट: स्वस्थ कोशिकाओं और पर्याप्त साइटोकिन उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए उन्हें चूहों में इंजेक्शन लगाने से पहले, निम्न में से 3 पोस्ट-पिघलना के लिए संस्कृति एचएस -27 ए स्ट्रॉमा।

  1. स्ट्रॉमा की तैयारी
    1. हेक्साइटोमीटर गिनती के लिए एक शंक्वाकार ट्यूब और विभाज्य 10 μL में कटाई वाले स्ट्रॉम्मल सेल निलंबन को स्थानांतरित करें; Trypan नीले रंग के माध्यम से लाइव सेल गिनती प्राप्त करें 16 शेष सीई अपकेंद्रित्र5 मिनट के लिए 500 xg पर निलंबन
    2. Pelleted कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला महाप्राणित और धीरे से माउस इंजेक्शन (इंजेक्शन के लिए चूहों की संख्या के आधार पर) के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) की आवश्यक मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खोलना।
      नोट माउस इंजेक्शन के लिए विशिष्ट स्ट्रॉम्बल सेल एकाग्रता: 200 μL पीबीएस में माउस के अनुसार 0.5 x 10 6 -5 x 10 6 कोशिकाएं।
    3. इंजेक्शन के ठीक पहले 4 डिग्री सेल्सियस (या बर्फ पर) पर स्ट्रॉम्मल सेल निलंबन रखें। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन कमरे के तापमान (आरटी) (~ 25 डिग्री सेल्सियस) पर चूहों के इंजेक्शन के लिए कम से कम है।
  2. Stromal सेल इंजेक्शन
    1. बायो-सुरक्षा हुड कीटाणुरहित, इंजेक्शन के लिए सामग्री इकट्ठा करें और फिर माउस पिंजरे को अंदर रखें।
    2. धीरे-धीरे 200 μL को एक ट्यूबरकुलिन सिरिंज में खींचने से पहले उलटा द्वारा सेल निलंबन मिलाएं।
    3. मानक अंतर-पेरीटोनियल इंजेक्शन तकनीकों का उपयोग करना, 17माउस को रोकें और पेरिटोनियल गुहा में 200 μL सेल निलंबन का संचालन करें। विवरण पहले मैक्होल्ज एट अल द्वारा दिखाया गया है 18

5. सीरियल ब्लड कलेक्शन और एक्स्ोजेनस मानव साइटोकीन के लिए चूहों में प्लाज्मा मॉनिटरिंग

  1. पूंछ कटाव के माध्यम से रक्त संग्रह
    1. बायोसाफेटी हुड कीटाणुरहित करें और प्रक्रिया के लिए माउस कंट्रोलर, कैंची और अन्य टूल / सप्लाई को इकट्ठा करें।
    2. माउस को एक नियंत्रण में रखें और ट्यूब को माउस आंदोलन को कम करने के लिए सुरक्षित करें।
    3. पूंछ और शल्यचिकित्सा कैंची को आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ कीटनाशक करना। पूंछ पर सामयिक संवेदनाहारी क्रीम लागू करें।
    4. बहुत तेज शल्य कैंची का उपयोग करना बंद करें - माउस की पूंछ की नोक की 0.5 मिमी - 1 मिमी। हेपरिनाइज्ड केशिका ट्यूबों का इस्तेमाल करते हुए लगभग 80 μL परिधीय रक्त ले लीजिए।
      नोट: अगर इस पद्धति से छह से ज्यादा तिहाई से रक्त जमा किया जाएगामेस, पूंछ हटाने को पूंछ हटाने की मात्रा के संबंध में रूढ़िवादी होना चाहिए। जैसा कि पूंछ को बढ़ाते हुए पूंछ बढ़ाता है, यह तेज रक्तस्राव होता है, और उपचार में अधिक समय लगता है।
  2. प्लाज्मा जुदाई
    1. बल्ब सिरिंज (कैशिलरी ट्यूबों से इसे निष्कासित करने के लिए) का उपयोग करके लेबल को के 2 EDTA microtainer ट्यूब में स्थानांतरित करें; जमावट को रोकने के लिए 20 बार पलटना
      नोट: आमतौर पर पूंछ निप से रक्त के थक्के तेजी से होते हैं। हालांकि, यदि रक्तस्राव ~ 2 मिनट से अधिक लंबे समय तक रहता है तो स्टैप्टिक पेंसिल / पाउडर का उपयोग करने के लिए जमावट की सहायता के लिए।
    2. निर्माता की शिक्षा के अनुसार रक्त संग्रहण ट्यूबों को अपकेंद्रित्र और एलिजा के भंडारण के लिए प्लाजा (-20 डिग्री सेल्सियस) तक एलिसा परख के लिए तैयार नहीं है।
    3. अगर माउस-मानव सेल चिमेरिसम डेटा को माउस के खून से जरूरी है, तो चरण 6.3.1 में बताए अनुसार शेष गोली का इलाज करें। अन्यथा, रक्त कोशिका गोली त्यागें।
  3. माइक्रो-व्हॉल के लिए संशोधित एलिसामाउस प्लाजा की मात्रा
    नोट: निर्माता की ELISA प्रक्रिया को चूहों से एकत्र माइक्रो-वॉल्यूम को समायोजित करने के लिए अनुशंसित 100 μL नमूना मात्रा से 40 μL मात्रा में संशोधित किया गया था। इन सीमित संस्करणों के साथ vivo माउस प्लाज्मा नमूनों में तीन गुना चलाना संभव नहीं है। प्रयोग के अंत में ~ हृदय के पंचक के माध्यम से ~ 500 μL पोस्टमार्टम रक्त एकत्र किया जाता है। प्रत्येक माउस के लिए विवो आंकड़ों में 40 μL को मान्य करने के लिए 100 μL सुन्नुमेपण प्लाज्मा के मूल्यांकन के लिए साइटोकाइन सांद्रता का उपयोग किया जाता है।
    1. जमे हुए माउस प्लाज्मा नमूनों को पिघलना।
    2. एलआईएसए के मानक मानकों को धीरे-धीरे पतला करते हैं और उन्हें प्रति प्रति 40 μL प्रति अच्छी तरह से प्रति थैला में डालते हैं।
    3. एलिसा प्लेट में प्रत्येक माउस प्लाज्मा नमूना के 40 μL जोड़ें।
      नोट: यदि एक माउस का नमूना 40 μL से कम है, तो एलीसा बफर के साथ मात्रा 40 μL तक लाएं। इस पतला मात्रा को रिकॉर्ड करें और प्रत्येक पतला नमूना के लिए एक कमजोर पड़ने वाले कारक की गणना करने के लिए इसका उपयोग करें। कबएलिसा डेटा का विश्लेषण नमूना के कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा पतला नमूना एकाग्रता को मूल नमूने में वास्तविक साइटोकिन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए बढ़ाता है।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलिसा परख पूरा करें।

6. चूहे में हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं का ट्रांसप्लेन्शन

  1. प्रत्यारोपण के लिए अस्थि मज्जा की स्थिति में उप-विविकरण
    नोट: लोमा लिंडा विश्वविद्यालय (एलएलयू) कोबाल्ट -60 विकिरण स्रोत का उपयोग करता है जानवरों को एक पाई रिस्ट्रेनर में रखा जाता है जो कि 20 सेमी 20 सेमी के क्षेत्र में विकिरण स्रोत से 80 सेमी की दूरी पर स्थित होता है और नियंत्रक के ऊपर लेक्सन की 0.5 सेंटीमीटर परत के साथ होता है। स्रोत का सबसे हालिया कैलिब्रेशन के आधार पर 225 सीजीआई की खुराक हासिल करने के लिए एक्सपोज़र का समय माना जाता है (वर्तमान में इस स्रोत के लिए 2-3 मिनट)
    1. उप-मौलिक चूहों को विकिरण देना (कुल शरीर विकिरण की खुराक 225 सीजीआई अधिकतम प्रतिरक्षा कम चूहों के लिए)
    2. प्रत्यारोपण हेमटोपोएटिक कोशिकाओं ~ 24 घंटे बाद में </ Em> अंतःस्राव पूंछ नस इंजेक्शन।
  2. अंतर-शिरापरक हेमटोपोएटिक सेल प्रत्यारोपण
    1. 200 μL बाँझ पीबीएस प्रति माउस की मात्रा में प्रत्यारोपण के लिए मानव कोशिका निलंबन तैयार करें: CD34 + हेमटोपोएटिक स्टेम कोशिकाएं (एचएससी): 1 x 10 5 से 5 x 10 5 प्रति माउस और लेकिमिया सेल लाइनों / रोगी के नमूने: 1 x 10 6 से माउस के अनुसार 5 x 10 6 कोशिकाओं
    2. प्रत्यारोपण के तुरंत पहले 4 डिग्री सेल्सियस (बर्फ पर परिवहन) तक कोशिकाओं को रखें। प्रत्यारोपण से पहले सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को आरटी पर कम से कम किया गया है।
    3. जैव सुरक्षा हुड कीटाणुरहित और प्रत्यारोपण इंजेक्शन के लिए हुड क्षेत्र तैयार करें।
    4. पूंछ नसों के फैलाव की अनुमति देने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए वार्मिंग पिंजरे में माउस रखें।
    5. धीरे से सेल निलंबन मिश्रण और 200 μL एक tuberculin सिरिंज में आकर्षित। सुई को अलग से सेट करें, जहां यह बाँझ रह जाएगा।
    6. माउस को संयम में रखें और पूंछ को isopropyl alcohol। </ Li>
    7. मानक नसों की इंजेक्शन तकनीकों का उपयोग करना, 17 माउस पूंछ नस में मानव कोशिका निलंबन को इंजेक्ट करना।
      नोट: पूंछ शिरा इंजेक्शन कई प्रयासों को ले सकता है, खासकर नौसिखिया पशु हैंडलर के लिए। कोवैकसिफिक और रैपर के जॉव वीडियो 19 इस पशु तकनीक का विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करते हैं।
    8. ~ 5 मिनट के लिए माउस की वसूली की निगरानी करें इंजेक्शन के दौरान किसी भी प्रतिकूल घटनाओं को रिकॉर्ड करें ( जैसे स्पिल्स, प्रमुख रक्तस्राव, अत्यधिक पूंछ की आशंका)।
  3. माउस परिधीय रक्त में मानव कोशिका का चिमनी का विश्लेषण
    1. प्लाज्मा पृथक्करण के बाद माइक्रोप्रोएर ट्यूब में शेष ब्लड सेल गोली प्राप्त करें (चरण 5.2.3)।
    2. लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) के लिए, शेष रक्तलेट को प्लाज्मा निकाले जाने के बराबर पीबीएस के एक मात्रा में (प्लाज्मा की मात्रा बदलने के लिए) पुन: को फिर से खोलें और अच्छी तरह से मिश्रण करें (भंवर / विंदुक)।
    3. प्रत्येक फिर से निलंबित खून का नमूना लेबल 4 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करेंऔर फिर 1: 9 अनुपात (100 μL फिर से निलंबित रक्त के लिए 900 μL आरबीसी लसीस बफर) में प्रत्येक ट्यूब के लिए आरबीसी लसीस बफर जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं अपकेंद्रित्र (5 मिनट, 500 xg) और डिकैंट
    4. दूसरे आरबीसी लेसिस बफर इन्सुबेशन (आरटी पर 5 मिनट) करें अपकेंद्रित्र और पहले के रूप में छानना
    5. ~ 1 एमएल पीबीएस में शेष कोशिकाओं को धो लें अपकेंद्रित्र और पहले के रूप में छानना
    6. मानक प्रवाह cytometry धुंधला के लिए उपयुक्त पीबीएस के एक मात्रा में गोली resuspend (यह निर्माता और व्यक्तिगत प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार बदलता है) 20 मूत्र कोशिकाओं (माउस सीडी 45 +) और मानव कोशिकाओं (मानव सीडी 45 +) 6 , 21 की पहचान करने के लिए प्रवाह-साइोटमेटरी के लिए मान्यता प्राप्त इम्युनोफेनोटाइपिंग एंटीबॉडी का उपयोग करें साथ ही ब्याज की सेल वंश के लिए विशिष्ट मानव ल्यूकोसाइट मार्कर।
      नोट: "चूने के नमूने" बनाने के लिए प्रत्येक माउस नमूने से एक छोटी मात्रा (5 μL-20 μL) लेने की सलाह दी जाती है; अस्थिर, व्यवहार्यता, और आइसोटाइप नियंत्रण नमूने के लिए उपयोग करने के लिए प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए अस्थिर और आइसोटाइप नियंत्रण होना सर्वोत्तम अभ्यास है।

7. विवो साइटोकीन गतिविधि में कार्यात्मक मूल्यांकन

  1. माउस इच्छामृत्यु और टिशू फसल
    1. निर्दिष्ट प्रायोगिक समय बिंदु पर सीओ 2 एस्फाइक्सिओशन के माध्यम से चूहों को कुचलना।
    2. कार्डियक पंचर के माध्यम से फसल का खंभा और चरण 5.2.1-5.2.2 के रूप में प्लाज्मा एकत्र करें।
      नोट: अन्य ऊतकों से पहले रक्त लीजिए क्योंकि यह मौत के तुरंत बाद जुटना शुरू होता है।
    3. चरण 5.2.2 के रूप में माउस रक्त, विभाज्य और स्टोर प्लाजा की प्रक्रिया करें।
      1. बाद में, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एलीसा के माध्यम से इच्छामृत्यु पर प्राप्त प्लाज्मा में बहिर्जात साइटोकिन एकाग्रता का आकलन करें। कैमरे में सीरियल से विवो में एक्सोजेनस साइटोकाइन सांद्रता का मूल्यांकन और तुलना करेंरक्त संग्रह और यूथनेसिया प्लाज्मा नमूनों (अनुभाग 5.3 में वर्णित)।
    4. 6.3.1 और 6.3.2 चरणों में वर्णित अनुसार प्लाज्मा की मात्रा और प्रक्रिया को बदलने के लिए शेष रक्त के नमूने के लिए पीबीएस जोड़ें एलएन 2 स्टोरेज के लिए फ्रीज़िंग माध्यम में तुरंत फ्लो साइमेट्रेट्री एशेज या रिजसेंड सेल को पेश करें।
  2. पीडीएक्स चूहों से हार्वेस्ट अस्थि मज्जा (बीएम) और प्लीहा और एकल कक्ष निलंबन तैयार करें जैसा कि पहले वर्णित है। 22
  3. प्रत्येक पीडीएक्स माउस टिश्यू नमूने के लिए 3% एसिटिक एसिड का उपयोग करके मैथिलीन नीले (लाइसे सेल कोशिकाएं और आरबीसी जीवित कोशिकाओं के अक्षत नाभिक छोड़कर) बी 1x 1 कमजोर पड़ने और एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर की जाने वाली कोशिकाओं के साथ सेल गणना प्राप्त करता है। प्रत्येक जानवर के लिए अस्थि मज्जा और प्लीहा के नमूनों के लिए कुल सेल की गणना करें।
  4. अपकेंद्रित्र (500 xg, 15 मिनट) सेल निलंबन और सतह पर तैरनेवाला छानना। अस्थि मज्जा और / या प्लीहा कोशिकाओं के प्रवाह-साइटमैट्रिनी एनासन को तत्काल या एलएन के लिए ठंड के माध्यम में पुन:उप> 2 भंडारण
    नोट: 10 बी.एम. अल्कोट्स (भविष्य में जैव रासायनिक एसेज के लिए) और ~ 5 स्पिलेन एलियोकॉट्स (भविष्य पीडीएक्स ट्रांसप्लांट्स के लिए) प्रति माउस फ्रीज करें।
  5. विवो कार्यात्मक प्रभावों में पहचानने के लिए इम्यूनोफेनोटाइपिंग
    1. ब्याज की साइटोकिनी के प्रति संवेदनशील और इम्योनोफेनोटाइप हेमेटोपोएटिक आबादी (इको) के लिए फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी के एक मास्टर-मिक्स (एमएम) तैयार करें और आइसोटाइप एंटीबॉडी ( चित्रा 5 और सामग्री की तालिका) का दूसरा एमएम तैयार करें।
    2. चरण 7.4 में तैयार पीडीएक्स ऊतक अलोकॉट्स (37 डिग्री सेल्सियस बीड बाथ) पिघलना।
    3. पिघला हुआ कोशिकाओं को एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करके और पीबीएस का कम से कम 3x मात्रा जोड़कर उन्हें धो लें। अपकेंद्रित्र (500 xg, 5 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला छानना
    4. वॉश चरण दोहराएं (7.5.3)
    5. अनियंत्रित नियंत्रण, व्यवहार्यता नियंत्रण और आइसोटाइप नियंत्रण (चरण 6.4.6 नोट देखें) के लिए प्रत्येक पीडीएक्स नमूने से ~ 10 μL-20 μL कोशिकाओं को ले जाकर जमा किए गए अल्कोट बनाएं। यू को छोड़कर, सभी नमूने दागेंएक स्थिर व्यवहार्यता डाई (मृत सेल मार्कर) के साथ, नियंत्रित नियंत्रण, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सेते और धो लें।
    6. मानक प्रूफ साइटोमेट्री स्टैनिंग प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक पीडीएक्स सेल नमूना को फेनोटाइपिंग-एमएम के साथ डालना; इसी तरह एसोसिएट-एमएम के साथ जुड़ा हुआ आइसोटाइप-नियंत्रण नमूना सभी नमूनों को सेते हैं, पीबीएस से धोएं, और 1% पैराफॉर्मालाहाइड में फिर से निलंबित करके नमूनों को ठीक करें।
    7. प्रवाह साइटमैट्री डेटा एकत्र करें और ब्याज की सेल आबादी ( चित्रा 5 ) के लिए उपयुक्त एक गेटिंग रणनीति का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें। एक ठेठ gating इस प्रकार है:
      1. एक एफएससी और एसएससी गेट को चित्रित करके बरकरार कोशिकाओं को परिभाषित करें जो मलबे को शामिल नहीं करता है।
      2. मृत सेल मार्कर (यह "कुल जीवित कोशिकाओं" है) के लिए ऋणात्मक कोशिकाओं पर जीटिंग द्वारा जीवित कोशिकाओं की आबादी की पहचान करें।
      3. वांछित इम्यूनोफेनोटाइप के साथ सेल लोकलुभावन को परिभाषित करने के लिए "कुल जीवित कोशिकाओं" के भीतर उप-फाटकों का प्रयोग करें (चित्रा 5 देखें)।
      4. प्राप्त करेंफ्लो साइटमैट्री विश्लेषण से कुल जीवित सेल गणना के भीतर सबसेट सेल आबादी की आवृत्ति 6 , 21
    8. चरण 4 में प्राप्त प्रति ऊतक प्रति कुल जीवित सेल गणना द्वारा कुल जीवित कोशिकाओं (चरण 7.5.6.4 में प्राप्त) के भीतर बी सेल सबसेट की आवृत्ति गुणा करके प्रत्येक ऊतक में लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। (% B सेल सबसेट x " हेमोसाइटोमीटर सेल गिनती ", तालिका 1 देखें)
    9. एक्सोजेनस मानव साइटोकिन ( तालिका 1 ) के विवो कार्यात्मक प्रभावों में निर्धारित करने के लिए नियंत्रण PDX चूहों और साइटोकिन-व्यक्त (टीएसएलपी +) पीडीएक्स चूहों के बीच लक्ष्य सेल आबादी के सेल की संख्या की तुलना करें।

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Representative Results

मॉडल का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। एक बार साइटोकाइन-प्रोडक्शन (टीएसएलपी + स्ट्रॉमा) और नियंत्रण स्ट्रॉमा प्राप्त हो जाने के बाद उन्हें संस्कृति में विस्तारित किया जाता है। चूहों में स्ट्रोमा इंजेक्शन से पहले, स्ट्रोक सेल द्वारा उत्पादित साइटोकिन की गतिविधि की पुष्टि के लिए साइटोकाइन उत्पादन ( चित्रा 2 ) और फास्फो-फ्लो साइटोमेट्री (प्रोटोकॉल # 3) को सत्यापित करने के लिए एलामा द्वारा स्ट्रॉमल सेल सतह पर तैरनेवाला का मूल्यांकन किया जाता है। जब पर कोशिकाओं को पारित किया जाता है, तो परमांगी संलयन स्ट्रॉमल सेल संस्कृतियों (नियंत्रण स्ट्रोमा और टीएसएलपी + स्ट्रॉमा) से एकत्र किया जाता है। एलिसा का उपयोग प्रारंभिक, मध्य और देर के दौरान कम से कम एक बार सतह पर तैरनेवाला में टीएसएलपी की एकाग्रता पर नजर रखने के लिए किया जाता है। नियंत्रण stroma से प्रतिनिधि डेटा चित्रा 2 ए में दिखाया गया है स्ट्रॉमल सेल संस्कृतियों को नियंत्रित करें जो कि टीएसएलपी अभिव्यक्ति (और उनसे नीचे जमी हुई किसी शीशियों को दिखाते हैं) को छोड़ा जाना चाहिए। भविष्य के उपयोग के लिए undetectable TSLP वाले नियंत्रण संस्कृतियों को विस्तारित और स्थिर कर दिया जाता है।जैसा कि टीएसएलपी + स्ट्रॉमा की चित्रा 2 बी संस्कृतियों में दिखाया गया है, निम्न-स्तर के टीएसएलपी उत्पादन (और उनसे नीचे से भरे शीशों) को त्याग दिया जाता है। टीएसएलपी + स्ट्रोमा स्थिर, उच्च-स्तरीय उत्पादन दिखा रहा है जो कि भविष्य के प्रयोगों में उपयोग के लिए विस्तार और भंडारण के लिए चुना जाता है। नियंत्रण और TSLP + stroma के कई संस्कृतियों से सतह पर तैरने वाले टीएसएलपी के औसत स्तर चित्रा 2 सी में दिखाए गए हैं।

मानव साइटोसिन के साथ नियंत्रण PDX चूहों के उत्पादन के लिए प्रयोगात्मक समयरेखा चित्रा 3 में दिखाया गया है। स्ट्रॉम्पल सेल संस्कृतियों को 3 सप्ताह पहले प्रत्यारोपण और इलिट्रो टीएसएलपी उत्पादन में संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में चित्रा 2 में वर्णित के रूप में पेश किया जाता है। माउस प्लाजा में विवो मानव टीएसएलपी में साप्ताहिक ( चित्रा 4 ) की निगरानी के लिए "संशोधित एलिसा प्रोटोकॉल # 4 में वर्णित "माउस प्लाज्मा का माइक्रो-वॉल्यूम" peripheraएल रक्त प्लाज्मा के साथ एकत्रित किया जाता है और प्रोटोकॉल # 6 में वर्णित है "माउस परिधीय रक्त में मानव कोशिका का चिमनी का विश्लेषण"। नियंत्रण stroma के साथ इंजेक्शन PDX ने प्लाज्मा इंसुलिन टीएसएलपी स्तर दिखाया जो पता लगाने के लिए सीमा से नीचे हैं ( चित्रा 4 ए )। टीएसएलपी + स्ट्रोडा के साथ इंजेक्ट किए गए पीडीएक्स माइस में टीएसएलपी का प्लाज्मा स्तर पूर्ववर्ती 1 से 2 सप्ताह के दौरान टीएसएलपी + स्ट्रॉम्मल कोशिकाओं की संख्या के बराबर है। टीएसएलपी के प्लाज्मा स्तर तेजी से बूंद हो जाते हैं अगर स्ट्रॉमल सेल इंजेक्शन बंद हो जाते हैं। 6 जैसा कि चित्रा 4 बी में देखा गया है, 0.5 x 10 6 टीएसएलपी + स्ट्रॉमा के साप्ताहिक इंजेक्शन (संस्कृति> सतह पर तैरने वाले में औसत> 1,000 पीजी / एमएल टीएसएलपी का उत्पादन) शारीरिक स्तर की निचली सीमा के निकट प्लाज्मा टीएसएलपी स्तर (~ 5-10 पीजी / एमएल )। पीडीएक्स चूहों में 5 x 10 6 टीएसएलपी + स्ट्रोका के साप्ताहिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप प्लाज्मा टीएसएलपी स्तर होते हैं जो उच्च शारीरिक स्तर तक पहुंचते हैं (~ 35 पीजी / एमएल) जैसा कि दिखाया गया है चित्रा 4 डी )। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस परख को संशोधित और सरल किया जाता है, इस प्रकार अकेले ले जाने वाले व्यक्तिगत डेटा बिंदु, प्लाज्मा साइटोकाइन स्तरों के विश्वसनीय संकेतक होने की संभावना नहीं है। उदाहरण के लिए चित्रा 4 बी में ऐसा लगता नहीं है कि एक पशु के लिए सप्ताह 2 में प्लाज्मा टीएसएलपी स्तर 60 पीजी / एमएल का सही मूल्यांकन होता है, विशेष रूप से अन्य सभी जानवरों के लिए बहुत कम मूल्य और अन्य जानवरों के अन्य बिंदुओं पर। अनुपयुक्त त्रिज्या एलिजा एलाइट प्लाज़मा टीएसएलपी सांद्रता युथानियास पर किया गया साप्ताहिक मूल्यांकन का एक मूल्यवान सत्यापन प्रदान करता है।

टीएसएलपी सामान्य मानव बी सेल के अग्रदूतों के उत्पादन को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। 23 इस प्रकार, टीएसएलपी के विवो समारोह में मूल्यांकन करने के लिए हमने उत्पाद की तुलना की सामान्य मानव बी कोशिका के नियंत्रण में नियंत्रण और टीएसएलपी + पीडीएक्स चूहों का आयन जो हेमटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित होता है जैसा कि चित्रा 5 में और तालिका 1 में दिखाया गया है। चित्रा 5 ए मानव बी वंश कोशिकाओं के सबसेटों की पहचान करने के लिए प्रयुक्त इम्युनोफेनोटाईपिंग के लिए प्रवाह साइटमैट्री गैटिंग दिखाता है। एक नियंत्रण पीडीएक्स और एक टीएसएलपी + पीडीएक्स के लिए प्रत्येक सबसेट में कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए नमूना गणना तालिका 1 में दिखायी गई है जैसा कि चित्रा 5 बी में दिखाया गया है, बी वंश कोशिकाओं को पीडीएक्स नियंत्रण की तुलना में टीएसएलपी + में काफी वृद्धि हुई है और यह बढ़ोतरी बी सेल सेलर्स (समर्थक बी कोशिकाओं) के साथ शुरू होती है। गैर-बी वंश कोशिकाओं की संख्या नियंत्रण और टीएसएलपी + पीडीएक्स (डेटा नहीं दिखाया गया) के बीच काफी अलग नहीं थी। यह परख यह सत्यापित करने का एक तरीका प्रदान करता है कि टीएसएलपी + पीडीएक्स में विवो में उत्पादित मानव टीएसएलपी एक लक्षित सेल की आबादी पर विवो कार्यात्मक प्रभाव डालता है।

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चित्रा 2: स्ट्रोमा सुपरनेट में टीएसएलपी साइटोकाइन सांद्रता की निगरानी के लिए एलिसा। प्रारंभिक (मार्ग 1-5), मध्यम (मार्ग): एलिसा एडेज़ का प्रयोग सतह पर तैरने वाले में टीएसएलपी सांद्रता को नियंत्रित स्ट्रॉमा (ट्रांसमिशन वेक्टर) और टीएसएलपी + स्ट्रॉमा (मानव टीएसएलपी को व्यक्त करने के लिए ट्रांसडुस्ड) से कम से कम एक बार किया जाता है। 6-12), और देर से (पैराग्राफ 13-20)। यहां उपयोग किए जाने वाले मानव टीएसएलपी एलिसा परख के लिए पता लगाने की दहलीज 1.9 पीजी / एमएल (लाल डैश्ड लाइन) है। ( ए ) नियंत्रण स्ट्रोमा को न्यूनतम स्कैन करने योग्य मानव टीएसएलपी सांद्रता उत्पन्न होती है; इन स्तरों को आम तौर पर प्रयोग की अवधि के लिए एलिसा पहचान थ्रेशोल्ड नीचे दिया जाता है। संस्कृति में स्ट्रोडा को नियंत्रित करें जो बढ़ती टीएसएलपी सांद्रता (> 15 पीजी / एमएल) को उन संस्कृति से जमी हुई सभी अलिक्टुवों के साथ छोड़ दिया जाता है। ( बी ) मानव टीएसएलपी उत्पादन अलग-अलग से उत्पन्न संस्कृतियों के बीच बदलता रहता हैटीएसएलपी + स्प्रो ( एन = 9) और संस्कृति अवधि के दौरान थक गए शीशियों TSLP स्ट्रोमा जो कम या अस्थिर साइटोकिन उत्पादन (टीएसएलपी <1,000 पीजी / एमएल) को भी त्याग दिया जाता है। ( सी ) नियंत्रण के लिए औसत टीएसएलपी सांद्रता (हरा) और टीएसएलपी + (नीला) स्ट्रॉमा (मतलब और 95% आत्मविश्वास अंतराल)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: एक्सोजेनेस मानव साइटोकीन उत्पादन के साथ पीडीएक्स माइस पैदा करने के लिए प्रायोगिक टाइमलाइन। प्रयोग में प्रगति के इन विट्रो और विवो भागों में समवर्ती रूप से। नियंत्रण और + टीएसएलपी स्प्रोमा सेल संस्कृति को हेमटोपोएटिक सेल प्रत्यारोपण से 2-3 सप्ताह पहले शुरू किया जाता है, जो कि पहले से कम से कम 3 सेल मार्गों को सुनिश्चित करता है (पहलेसाप्ताहिक stromal सेल इंजेक्शन की Wk-1)। यह सुनिश्चित करता है कि stromal कोशिकाओं स्वस्थ, proliferative और पर्याप्त साइटोकिन स्तर का उत्पादन कर रहे हैं। सतह पर तैरने वाले अल्कोट्स एकत्र किए जाते हैं, जब कोशिकाएं पारित हो जाती हैं और एल्आईएसए एसेल्स का प्रयोग स्ट्रॉस तैरनेवाला में टीएसएलपी एकाग्रता ( चित्रा 2 देखें) के निर्धारण के लिए किया जाता है। दिन में मनुष्यों के हेमेटोपोएटिक कोशिका प्रत्यारोपण से एक दिन पहले दिन 0 पर विकिरणित किया जाता है। साप्ताहिक रक्त संग्रह पहली बार स्ट्रोमा इंजेक्शन के 1 से 2 सप्ताह के बाद शुरू होता है। इस समय, बहिर्जात मानव साइटोकिन सांद्रता को संशोधित एलिसा एशेज ( चित्रा 4 ) का उपयोग करके माउस प्लाज्मा में पता होना चाहिए। मानव अंतराल ट्रांसप्लांट के 5-16 सप्ताह बाद प्रयोग समापन बिंदु; यह माउस परिधीय रक्त में पाया गया मानव कोशिका चिमनी की मात्रा पर निर्भर करता है। आमतौर पर सामान्य हेमटोपोइजिस सप्ताह 5-7 तक स्थापित है, सेल लाइनों और प्राथमिक नमूनों (3-16 सप्ताह) के बीच ल्यूकेमिया सेल काइमारिज़्म भिन्न होता है। पीडीएक्स प्रत्यारोपण सफलता और प्रगति भी निर्भर करते हैंप्रत्यारोपण पर इंजेक्ट किए गए मानव कोशिकाओं की संख्या पर इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: माउस प्लाज्मा में भौतिक मानव टीएसएलपी साइटोकाइन सांद्रता प्राप्त करना। चूहों transduced कोशिकाओं के साप्ताहिक इंट्राटेरिटाइन इंजेक्शन (200 μL) प्राप्त करते हैं और समय के साथ चूहों में विवो में मानव टीएसएलपी सांद्रता (एलिसा परख) का मूल्यांकन करने के लिए उनके प्लाज्मा एकत्र किये जाते हैं। " नियंत्रण" चूहों में 5 x 10 6 नियंत्रक स्ट्रोमा कोशिकाएं प्राप्त हुईं, जबकि "टीएसएलपी + कम" (कम टीएसएलपी स्प्रोमा डोस) चूहों को 0.5 x 10 6 टीएसएलपी + स्ट्रॉमा कोशिकाएं प्राप्त हुईं, और "टीएसएलपी + उच्च" (उच्च टीएसएलपी स्प्रोमा डोस) चूहों को 5 x 10 प्राप्त हुआ 6 प्रत्येक सप्ताह टीएसएलपी + स्ट्रॉम्मल कोशिकाएं मानव टीएसएलपी एलिसा परख पता लगाने की दहलीज 1.9 पीजी / एमएल (लाल धराशायी रेखा) और टीएसएलपी की मानव शारीरिक सीमा ~ 5 से 35 पीजी / एमएल (ग्रे छायांकन) है। 24 (संदर्भ 11 और कोट अप्रकाशित डेटा) ( ए ) "नियंत्रण" माउस प्लाजा लगातार टीएसएलपी स्तर <5 पीजी / एमएल या नीचे एलिसा पहचान थ्रेशोल्ड है। ( बी ) "टीएसएलपी + कम" माउस प्लाज्मा टीएसएलपी के कम शारीरिक स्तरों को दिखाता है; जबकि ( सी ) "टीएसएलपी + हाई" माउस प्लाज्मा उच्च शारीरिक स्तरों को दर्शाता है। ( डी ) प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए औसत टीएसएलपी सांद्रता (सभी चूहों और टाइमपॉइंट का मतलब एसईएम) दर्शाते हैं कि माउस प्लाज्मा में टीएसएलपी का स्तर पता लगाया गया स्ट्रोमा डोस के आनुपातिक है; नियंत्रण कक्ष प्लाज्मा स्तर एलिसा पहचान सीमा से नीचे हैं और "टीएसएलपी + उच्च" प्लाज्मा स्तर "टीएसएलपी + कम" माउस प्लाज्मा स्तर से चार गुना अधिक हैं।"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सामान्य मानव बी सेल आबादी का आघात पीडीएक्स चूहों में एक्सोजेनस मानव टीएसएलपी के आई एन वीवो कार्यात्मक प्रभाव को मान्य करता है। पीडीएक्स चूहों को नियंत्रण और टीएसएलपी + स्ट्रॉमा के साथ इंजीनियर किया गया था और मानव सीडी 34 + कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया था जो नाभि गर्भनाल रक्त से अलग थे। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इम्यूनो-फेनोटाइपिंग का उपयोग मानव बी सेल के पूर्व-उपक्रमों की पहचान करने के लिए किया गया था जो नियंत्रण और टीएसएलपी + पीडीएक्स से काटा जाने वाले अस्थि मज्जा में निम्नानुसार है: काटा हुआ अस्थि मज्जा, थका हुआ और ठीक-ठाक व्यवहार्यता डाई के साथ रंगा हुआ था, और एंटी- मानव CD45, सीडी 1 9, सीडी 34, κ और λ लाइट चेन, और या तो सतह आईजीडी और आईजीएम या इंट्रासेल्युलर आईजीएम (सीओयू)। ( ए ) कुल रहने वाले सीएलएलएस एक व्यवहार्यता मार्कर के आधार पर gated थे आगामी भूखंड विकास के अनुक्रमिक बी वंश सबसेट (टीएसएलपी + पीडीएक्स से दिखाए गए डेटा) की पहचान करने के लिए बाद के फाटकों को दिखाते हैं। ( बी ) कुल जीवित कोशिकाओं के भीतर प्रत्येक सबसेट का आवृत्ति प्रवाह cytometry सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित किया गया था और प्रत्येक बी सेल सबसेट में कोशिकाओं की संख्या की गणना की गई थी। (तालिका 1 देखें)। नियंत्रण में प्रत्येक बी सेल सबसेट के लिए सेल की गणना (काला, एन = 3) और टीएसएलपी + (नीला, एन = 5) पीडीएक्स चूहों को गहराया जाता है। (मतलब ± SEM, * p <0.05, ** p <0.01, **** p <0.0001)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

मानव सेल जनसंख्या Freq। कुल जीवित कोशिकाओं का जीवित सेल की गणना IN BM जनसंख्या में # सेल
नियंत्रण माउस
कुल जीवित कोशिकाएं 100.00% 39.5 x 10 6 39.5 x 10 6
hCD45 + 98.50% 39.5 x 10 6 38.9 x 10 6
कुल सीडी 1 9 + 27.20% 39.5 x 10 6 10.7 x 10 6
प्रो-बी 24.20% 39.5 x 10 6 9.56 x 10 6
पूर्व बी 1.70% 39.5 x 10 6 0.68 x 10 6
अपरिपक्व बी 0.83% 39.5 x 10 6 0.33X 10 6
परिपक्व बी 0.68% 39.5 x 10 6 0.27 x 10 6
टीएसएलपी + माउस
कुल जीवित कोशिकाएं 100.00% 72.0 x 10 6 72.0 x 10 6
hCD45 + 99.30% 72.0 x 10 6 71.5 x 10 6
कुल सीडी 1 9 + 65.10% 72.0 एक्स 10 6 46.8 x 10 6
प्रो-बी 60.20% 72.0 x 10 6 43.3 x 10 6
पूर्व बी 2.70% 72.0 x 10 6 1. 9 2 x 10 6
अपरिपक्व बी 1.60% 72.0 x 10 6 0.11 x 10 6
परिपक्व बी 0.40% 72.0 x 10 6 0.2 9 x 10 6

तालिका 1: पीडीएक्स बोन मैरो में सामान्य मानव बी सेल सबसेट्स की आवृत्ति और गणना कुल जीवित कोशिकाओं के भीतर प्रत्येक बी सेल सबसेट का आवृत्ति (%) प्रवाह cytometry विश्लेषण (gating रणनीति के लिए चित्रा 5 ए देखें) द्वारा निर्धारित किया गया था। एक नियंत्रण PDX माउस (प्राप्त नियंत्रण स्ट्रोमा इंजेक्शन, 5 x 10 6 कोशिका / सप्ताह) और एक टीएसएलपी + पीडीएक्स माउस (प्राप्त टीएसएलपी स्ट्रोमा इंजेक्शन, 5 x 10 6 कोशिका / सप्ताह) से प्रतिनिधि अस्थि मज्जा (बीएम) डेटा स्यूसैट फ़्रीक्वेंसी (%) का आकलन करने के लिए प्रत्येक बी सेल सबसेट आबादी (सबसेट सेल काउंट = "टेटअल जीवित कोशिकाओं "x" सबसेट आवृत्ति ")।

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Discussion

यह पांडुलिपि एक्सजेन्सियस मानव साइटोकीन अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियरिंग पीडीएक्स के लिए एक सरल, त्वरित और अपेक्षाकृत लागत प्रभावी पद्धति का वर्णन करता है। यहां वर्णित रणनीति मानव साइटोकीन, टीएसएलपी को अभिव्यक्त करने के लिए ट्रांसडोल की गई एक स्ट्रॉम्मल सेल लाइन के साप्ताहिक इंट्राटेरिटाइन इंजेक्शन पर आधारित है। यहाँ वर्णित विधियों का प्रदर्शन करने से पहले, स्ट्रोमा ने ब्याज की साइटोकिनी (टीएसएलपी) और इसी तरह इंजीनियर नियंत्रण स्ट्रोमा के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर बनाया था। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, स्ट्रोमा को संस्कृति में विस्तारित किया जाता है और समय पर (या नियंत्रण स्ट्रोमा के मामले में साइटोकिन उत्पादन की अनुपस्थिति के लिए) स्थिर, उच्च स्तरीय साइटोकिनिन उत्पादन प्रदान करने की क्षमता के लिए जांच की जाती है। स्ट्रोमा से उत्पन्न साइटोकिन की गतिविधि को सत्यापित करने के लिए प्रदर्शन किया गया और स्ट्रॉमल सेल इंजेक्शन के लिए प्रायोगिक समयसीमाएं पीडीएक्स को शारीरिक मानव टीएसएलपी (और नियंत्रण चूहों जो मानव टीएसएलपी की कमी थी) के साथ विकसित करने के लिए विकसित की गईं। मानव टीएसएलपी के प्लाज्मा स्तर की निगरानी के लिए प्रक्रियाएं औरCytokine उत्तरदायी सेल आबादी पर इसके विवो कार्यात्मक प्रभावों की पुष्टि के लिए प्रदर्शन किया गया।

यहां पर प्रस्तुत प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले स्ट्रॉमल सेल और वैक्टर को चुनने में कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। Stromal सेल लाइनों endogenously साइटोकिन उच्च स्तर का उत्पादन नहीं होना चाहिए, और ब्याज की साइटोकिनी के लिए उत्तरदायी नहीं होना चाहिए। यहां अध्ययन के लिए, मानव अस्थि मज्जा स्ट्रॉम्मल सेल लाइन, एचएस -7 ए, का चयन किया गया क्योंकि यह निम्न-स्तर की साइटोकिन उत्पादन के साथ संस्कृति में मजबूती से बढ़ता है। 8 यहां वर्णित विधि में "नियंत्रण" पीडीएक्स भी शामिल है जो टीएसएलपी + पीडीएक्स के रूप में समान स्ट्रोमा के साथ इंजीनियर है, लेकिन टीएसएलपी के बिना अत्यधिक एक्सप्रेसन के। टीएसएलपी + और पीडीएक्स पर नतीजे की तुलना में अंतर्जात स्ट्रॉम्मल सेल साइटोकाइन उत्पादन के कारण किसी भी प्रभाव के लिए हमें नियंत्रित करने की अनुमति मिलती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन या अन्य चयनकर्ता मार्करों में शामिल वैक्टर वाले स्ट्रॉम्मल कोशिकाओं का पारगमन कोशिकाओं को अलग करने के लिए सहायक हो सकता हैपर ब्याज की साइटोकिनी overexpress की संभावना है। हालांकि, stromal कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन के स्तर को निर्धारित करने के लिए साइटोकिन सतह पर तैर परख करने के लिए आवश्यक है क्योंकि चूहों में विवो प्लाज्मा साइटोकिन स्तर में स्ट्रॉमल सेल सतह पर तैरनेवाला में साइटोकिन एकाग्रता के साथ, 6 और साथ ही साथ स्ट्रोमा की संख्या पर इंजेक्शन साप्ताहिक आधार ( चित्रा 4 )।

यह महत्वपूर्ण है कि पीडीएक्स अध्ययनों से पहले स्ट्रोमा द्वारा उत्पादित साइटोकिन की गतिविधि को सत्यापित किया गया है। टीएसएलपी के लिए उत्तरदायी कोशिकाओं में टीएसएलपी उत्तेजना के डाउसस्ट्रीम अणुओं के लिए हम परख के लिए फॉस्फो-फ्लो साइटमैट्री का इस्तेमाल करते थे। टीएसएलपी जेक-स्टेट 5 और पीआई 3 / एकेटी / एमटीओआर मार्गों को सक्रिय करता है। एमयूटीजे 5 और एमएचएच-कॉल 4 लेकिमिया सेल लाइन टीएसएलपी रिसेप्टर घटकों के उच्च स्तर को दर्शाती हैं और टीएसएलपी उत्तेजना के बाद डाउनस्ट्रीम STAT5, AKT और राइबोसोमल प्रोटीन S6 फास्फोराइलेशन दिखाती हैं। 14 यहाँ हम phopho प्रवाह cytometry इस्तेमाल कियाएसटीएटी 5 (पीएसटीएटीटी 5) के फास्फोरायलेशन का मूल्यांकन करने के लिए टीएसएलपी उत्तेजना के डाउनस्ट्रीम प्रेरित पिछले काम में हमने अतिरिक्त टीएसएलपी-उत्तेजित फॉस्फोरायलेशन इवेंट्स: फॉस्फो-एकेटी (पीएसीटी) और फॉस्फो-रिबोसोमल प्रोसेन एस 6 (पीएस 6, एमटीओआर के डाउनस्ट्रीम) के लिए मूल्यांकन किया था। परिणाम दिखाते हैं कि पीएटीटीटी परख कम संवेदनशील है और pS6 pSTAT5 परख की तुलना में अधिक संवेदनशील है। 6 जब फास्फो-एक्शन का प्रदर्शन किया जाता है, तो उत्तरदायी कोशिकाओं को पुनः संयोजक मानव टीएसएलपी के संतृप्त स्तरों के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और केवल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मीडिया (कोई साइटोकिन) के साथ सुसंस्कृत होना चाहिए। कंट्रोल स्ट्रॉमा से सतह पर तैरने वाले को एहसास किया जाना चाहिए कि TSLP + stroma से एल्आईएसए के अतिरिक्त (एआईआईएसए के अलावा) सत्यापन के दूसरे साधन के रूप में टीएसएलपी नियंत्रण स्ट्रोमा द्वारा उत्पादित नहीं किया गया है। यह यह आश्वस्त करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में भी काम करता है कि अंतर्जात साइटोकिन उत्पादन टीएसएलपी + कोशिकाओं के assays में पाया phosphorylation के लिए जिम्मेदार नहीं है। आदर्श रूप से साइटोकाइन-उत्पादन वाले स्ट्रोमा नमूनों से प्रेरित फास्फोराइलेशन समान होना चाहिएपुनः संयोजक साइटोकिन अवस्था के साथ निरीक्षण करने के लिए, हालांकि यह कम हो सकता है अगर सतह पर तैरनेवाला में साइटोकिन की एकाग्रता संतृप्त, सकारात्मक नियंत्रण से कम है पुनःसंयोजक टीएसएलपी स्तरों के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण जो एलआईएसए द्वारा टीएसएलपी + स्ट्रो के लिए मनाए गए स्तरों से मेल खाते हैं एक अच्छा विकल्प है

विवो साइटोकिन गतिविधि में कार्यात्मक संकेतक की पहचान करना एक चुनौती हो सकती है। फॉस्फोरेलेशन का असर संभव नहीं हो सकता है क्योंकि विवो में बहिर्जात मानव साइटोकिन द्वारा प्रेरित फास्फोरायलेशन तेजी से टिशू फसल के दौरान खो सकता है। चूंकि टीएसएलपी को मानव बी सेल के अग्रदूतों के उत्पादन में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है, 23 पीडीएक्स में टीएसएलपी का कार्यात्मक प्रभाव प्रवाह cytometry immunophenotyping के उपयोग से मानव बी सेल अग्रदूत आबादी में विवो वृद्धि के लिए परख द्वारा सत्यापित किया गया था। जीन की अभिव्यक्ति और तुलना में विशिष्ट साइटोकिन-प्रेरित परिवर्तनों के लिए एक वैकल्पिक रणनीति परख हो सकती हैकोशिका कोशिका-व्यक्त पीडीएक्स से कोशिकाओं में नियंत्रण पीडीएक्स से कोशिकाओं में एनजी एक्सप्रेशन। 6

पीडीएक्स में मानव साइटोकिन अभिव्यक्ति का अंतिम लक्ष्य एक प्रीक्लेक्निक मॉडल तैयार करना है जो मरीजों में विवो वातावरण में अधिक बारीकी से मॉडल पेश करता है। मानव जीवाश्म नियंत्रण पीडीएक्स और साइटोकिन-व्यक्त (टीएसएलपी +) पीडीएक्स से लेकर मूल मरीज के नमूनों तक पृथक जीनोम अभिव्यक्ति की तुलना करके इसका परीक्षण किया गया। इन अध्ययनों से पता चला है कि रोगियों के नमूनों में जीन की अभिव्यक्ति नियंत्रणों की तुलना में टीएसएलपी + पीडीएक्स से ल्यूकेमिया कोशिकाओं के काफी करीब है। 6 हालांकि, हमारे अध्ययन लिम्फोपोइजिस पर केंद्रित थे। माउस में निर्मित कई मायलोइड-प्रोटेक्ट साइटोकिन्स अपने मानव रिसेप्टर समकक्षों को सक्रिय नहीं करते हैं। इस मुद्दे को संबोधित करने वाले मानव साइटोकिन नॉकिन चूहों (एनएसजीएस चूहों और अन्य) हैं। दरअसल, हम जिस मॉडल का वर्णन करते हैं, उसका एक मान यह है कि इसे एनएसजीएस चूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि एक मॉडल बनाया जा सके जो कि अधिक करीबमानव साइकोसिन को बढ़ावा देने के अलावा टीएसएलपी को व्यक्त करके विवो पर्यावरण में मानव को मॉडल करता है। दूसरी तरफ, इन मायलोयड-प्रोमोक्टिंग साइटोकिन्स के लिए वर्णित विधि का उपयोग करते हुए एनएसजी चूहों में एक साइटोकिन +/- सिस्टम तैयार किया जा सकता है। इस मॉडल का इस्तेमाल मायलोपियो और / या मायलोइड ल्यूकेमिया में उनमें से प्रत्येक के vivo भूमिका में सटीक अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

इंजीनियर पीडीएक्स, जो मानव टीएसएलपी के शारीरिक स्तर का उत्पादन करता है, एक प्रीक्लेक्निक मॉडल प्रदान करता है जो क्लासिक पीडीएक्स के मुकाबले रोगियों में विवो वातावरण में अधिक निकटता की नकल करता है । 4 नियंत्रण पीडीएक्स चूहों के उत्पादन, जो इसी तरह इंजीनियर होते हैं, उन्हें भी वर्णित किया जाता है। एक साथ नियंत्रण और साइटोकिन उत्पादक पीडीएक्स एक मानव टीएसएलपी + / मॉडल प्रणाली बनाते हैं, जिसे हमने सामान्य और घातक मानव बी कोशिकाओं के विवो उत्पादन में टीएसएलपी की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया है। 4 , 6 यहमॉडल बी-सेल एसिट लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (बी-एएल) के एक विशेष उच्च जोखिम वाले फॉर्म के अध्ययन के लिए बेहद प्रासंगिक है जो सीआरएलएफ 2 के अत्यधिक विषमता के कारण आनुवांशिक परिवर्तनों की विशेषता है। सीआरएलएफ 2 टीएसएलपी साइटोकिन के लिए एक रिसेप्टर है और इस प्रकार टीएसएलपी प्रेरित CRLF2 संकेत की संभावना सीआरएलएफ 2 + बी-ऑल की ऑकोजेनेसिस और प्रगति के लिए योगदान देती है। इस बीमारी का अध्ययन करने के लिए पीडीएक्स का उपयोग विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि पीडीएक्स हमें रोगी के आनुवंशिक परिदृश्य के संदर्भ में ल्यूकेमिया का अध्ययन करने की अनुमति देता है। बीमारी योगदानकर्ता के रूप में जेनेटिक लैंडस्केप को सीआरएलएफ 2 + बी-एएल में जोरदार रूप से फंसाया जाता है, जो कि हिस्पैनिक / लातीनी बच्चों में पांच गुना अधिक बार दूसरों की तुलना में होता है और नीचे सिंड्रोम के मरीजों में बी-सभी मामलों में से आधे से ज्यादा होता है। मानव टीएसएलपी व्यक्त करने वाले पीडीएक्स मॉडलों जैसे कि यहाँ वर्णन किया गया है, यह उपचार के लिए पहचान करने और सीआरएलएफ 2 + बी-ए एल के बीमारी तंत्रों के साथ-साथ सामान्य हेमटोपोसीज को समझने में महत्वपूर्ण उपकरण होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wet lab reagents 
T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity,  25cm² culture area Thermo Scientific / Fisher 156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap Corning Inc. / Fisher 353136
T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap Corning Inc. / Fisher 355001
10 mL serological pipettes Falcon 357551
15 mL  polypropylene conical tubes Fisher 05-539-12
5 mL round-bottom polystyrene tubes Falcon 352054
50 mL polypropylene conical tubes Falcon 352098
2.0 mL cryogenic vials, externally threaded Corning Inc. / Fisher 4230659
1 mL pipette tips Fisher 2707509
200 μL pipette tips  Denville Scientific P3020-CPS
10 μL pipette tips Denville Scientific P-1096-CP
Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow Fisher 09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend 423001
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× Corning cellgro/ Mediatech 21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe Set BioLegend 434204
3% Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060
Trypan Blue  Corning 25-900-Cl
"Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS ThermoFisher 25-053
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P-7949
“R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) - - Lab Recipe
RPMI, 88.5% (500 mL)  Mediatech 10-040-CV  
FBS, 9.9% (56 mL)  Mediatech 35-011-CV
L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL)  Mediatech 25-005-Cl
Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL)  Mediatech 30-002-Cl
2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL)  MP 190242
“R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) - - Lab Recipe
     RPMI, 76.84% (150  mL) see above see above
     FBS, 20.49% (40 mL) see above see above
     2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) see above see above
     1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) see above see above
     Penicillin-Streptomycin,  0.51% (1 mL) see above see above
     2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M),  0.10% (200 µL) see above see above
“Freezing medium”, % of total volume - - Lab Recipe
“R10” medium, 45% see "R10" recipe -
FBS, 20% see above 35-011-CV
DMSO, 10% Corning 25-950-CQC
D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% Fisher Scientific BP2687-100
Name Company Catolog Number Comments
Biologics 
"HS-27" HS-27A human stroma line ATCC CRL-2496
"CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia DSMZ ACC 337
“NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks JAX Mice  # 005557
MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia DSMZ ACC 490
Recombinant Human TSLP protein R&D Systems 1398-TS-010
Name Company Catolog Number Comments
Flow cytomery antibodies (clone)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11) Miltenyi Biotec 130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) Miltenyi Biotec 130-098-094
CD34 APC (8G12) BD Biosciences 340667
CD45 PE-Cy7  (HI30) eBioscience 25-0459
"FVD" Fixable viability dye  eFluor 780  eBioscience 65-0865
Ig κ light chain FITC  (G20-193) BD Pharmingen 555791
Ig λ light chain FITC (JDC-12) BD Pharmingen 561379
IgD PE (IA6-2) BioLegend 348203
IgM PE-Cy5 (G20-127) BD Biosciences 551079
pSTAT5 PE,  mouse anti-STAT5 (pY694) BD PhosphoFlow 612567
Name Company Catolog Number Comments
Other materials & equipment 
Animal Implantable Nano Transponder with Canula Trovan  ID-100B(1.25)
EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) perscription perscription
BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½  BD #329461
BD Microtainer Tubes with K2EDTA BD  #365974
Centrifuge Beckman Coulter Alegra X-15R 
FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) Fisher Scientific 22-260-950
Hemocytometer Fisher 02-671-6
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
Mouse Pie Cage Braintree Scientific, Inc. MPC-1
Mouse Tail Illuminator Restrainer Braintree Scientific, Inc. MTI STD
Pistol Grip Implanter Trovan  IM-300(1.25)
µQuant  Bio-Tek Instruments Inc. MQX200
FlowJo flow cytometry analysis software FlowJo, LLC Version 10
*All antibodies are anti-human unless otherwise stated.

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References

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मेडिसिन अंक 123 एक्सनोग्राफ्ट प्रीक्लिनिनिकल मॉडल ल्यूकेमिया मरीज से व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट (पीडीएक्स), थायमिक स्ट्रॉम्मल लिम्फोपोइटिन (टीएसएलपी)
पेटी-व्युत्पन्न Xenografts में एक्सगोनेस साइटोकीन का अभिव्यक्ति एक साइटोकीन-ट्रांसडुस्ड स्ट्रॉम्मल सेल लाइन के साथ इंजेक्शन के माध्यम से
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Coats, J. S., Baez, I., Stoian, C.,… More

Coats, J. S., Baez, I., Stoian, C., Milford, T. A. M., Zhang, X., Francis, O. L., Su, R., Payne, K. J. Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line. J. Vis. Exp. (123), e55384, doi:10.3791/55384 (2017).

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