Summary
On décrit ici un procédé pour produire une cytokine exogène chez des souris de xénogreffe (PDX) dérivées du patient par injection intrapéritonéale hebdomadaire d'une lignée cellulaire stromale transduit par cytokine. Cette méthode élargit l'utilité de PDX et fournit l'option pour la distribution de cytokines exogènes transitoires ou prolongées dans une multitude de modèles PDX.
Abstract
Les souris dérivées de xénogreffe (PDX) sont produites par transplantation de cellules humaines dans des souris immunodéficientes. Ces modèles sont un outil important pour étudier les mécanismes de l'hématopoïèse normale et maligne et constituent l'étalon-or pour l'identification de chimiothérapies efficaces pour de nombreuses tumeurs malignes. Les modèles PDX sont possibles car beaucoup de cytokines de souris agissent également sur des cellules humaines. Cependant, ce n'est pas le cas pour toutes les cytokines, y compris celles qui sont essentielles pour l'étude de l'hématopoïèse normale et maligne dans les cellules humaines. Les techniques qui engendrent des souris pour produire des cytokines humaines (modèles transgéniques et knock-in) nécessitent des dépenses importantes avant que l'utilité du modèle ne soit démontrée. D'autres techniques nécessitent beaucoup de travail (injection de cytokine recombinante ou lentivirus) et, dans certains cas, nécessitent des connaissances techniques élevées (injection hydrodynamique d'ADN). Ce rapport décrit une méthode simple pour générer des souris PDX qui ont une cyan humaine exogèneTokine (TSLP, lymphopoïétine stromale thymique) par injection hebdomadaire intraperitoneale de stroma qui a été transduit pour surexprimer cette cytokine. L'utilisation de cette méthode fournit une source in vivo de production continue de cytokines qui atteint des niveaux physiologiques de cytokine humaine circulante dans la souris. Les niveaux plasmatiques de cytokine humaine peuvent varier en fonction du nombre de cellules stromales injectées et la production de cytokines peut être initiée à n'importe quel moment de l'expérience. Cette méthode comprend également des souris témoins négatives pour les cytokines qui sont produites de manière similaire, mais par injection intraperitoneale de stroma transduit avec un vecteur témoin. Nous avons déjà démontré que les cellules de leucémie récoltées à partir de la PDX exprimant le TSLP, par rapport au PDX de contrôle, présentent un modèle d'expression génique plus semblable à l'échantillon original du patient. Ensemble, les souris PDX produisant des cytokines et des souris cytokines négatives produites par cette méthode fournissent un système modèle que nous avons utilisé avec succès pour étudier laRôle de TSLP dans l'hématopoïèse normale et maligne.
Introduction
Les xénogreffes dérivées de patients (PDX) sont un puissant modèle in vivo pour étudier la production de cellules hématopoïétiques normales et malignes dans un environnement de mammifère "natif". Le plus souvent, la PDX est produite par injection ou transplantation de cellules humaines dans des souris immunodéficientes. La production de PDX à l'aide de cellules souches hématopoïétiques humaines normales permet des études in vivo du sang humain normal et du développement de cellules immunitaires. La PDX produite à partir de leucémie ou d'autres cellules cancéreuses permet d'étudier les mécanismes oncogènes et d'identifier des thérapies efficaces dans le contexte de la gamme des paysages génétiques et des mutations présentes dans la population humaine. 1 Par conséquent, PDX est l'étalon-or actuel pour la recherche biomédicale translationnelle pour identifier les thérapies efficaces et un outil important pour comprendre les mécanismes de progression du cancer. Les modèles PDX sont un outil essentiel pour faciliter la recherche sur les disparités en matière de santé en raison de maladies spécifiques Les lésions génétiques ou toute maladie dans laquelle les variations du paysage génétique d'un patient peuvent contribuer de manière substantielle à l'oncogenèse et aux résultats du traitement.
Les modèles PDX souris-humains sont possibles car de nombreuses cytokines de souris imitent de manière adéquate leurs analogues humains dans l'activation des récepteurs de cytokines des cellules humaines alors qu'ils se trouvent à l'intérieur de la souris. Par exemple, l'interleukine-7 (IL-7) fournit un signal critique pour le développement des cellules B humaines. 2 Dans ce cas, l'IL-7 de souris a une homologie suffisante avec l'IL-7 humaine que la cytokine de souris stimule les voies de signalisation dans les précurseurs de cellules B humaines. 2 , 3 , 4 Cependant, ce n'est pas le cas pour la lymphopoïétine stromale thymique (TSLP), 5 , 6 qui, parmi d'autres cytokines (IL-3, facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF) ,La cytokine de souris et humaine présente une faible homologie, les cytokines de souris n'activent pas leurs récepteurs respectifs sur les cellules humaines. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de stratégies ont été utilisées Pour englober l'expression de cytokines humaines chez les souris PDX, notamment l'injection de cytokines humaines recombinantes, l'injection hydrodynamique de l'ADN, l'expression lentivirale, l'expression transgénique et le remplacement du gène knockin. 7 Ce rapport décrit une méthode pour l'ingénierie de PDX pour produire une cytokine humaine par médiation par le stromal Distribution de cytokines ( figure 1 ).
Dans la méthode démontrée ici, les souris PDX sont conçues pour exprimer la cytokine humaine, la TSLP, ou pour servir de témoins négatifs à la cytokine. TSLP-exprimant PDX sont réalisés par des injections intrapéritonéales hebdomadaires de cellules stromales qui ont été transduites pour exprimer des niveaux élevés de TSLP humaine.Les souris "contrôle" PDX "anti-cytokine négatives" sont conçues de manière similaire; Bien que le stroma de contrôle soit transduit avec un vecteur témoin. Cette méthode atteint des taux physiologiques normaux de TSLP humaine chez des souris PDX injectées avec le stroma TSLP +. Aucune TSLP détectable n'est observée chez les souris PDX recevant le stroma négatif des cytokines. Nous avons sélectionné la ligne cellulaire stromale humaine HS-27A pour nos études, car elle se développe de manière robuste en culture et affiche un très faible taux de production de cytokines qui ne supporte pas la prolifération de cellules progénitrices isolées dans les cultures de cultures. 8 Pour l'expression TSLP humaine, le stroma a été transduit avec un vecteur lentiviral auto-inactif à génération avancée dérivé d'un squelette décrit précédemment, 9 et comprend l'élément cPPT / cts et l'élément régulateur post-transcriptionnel hépatite de la marbrure (WPRE) pour augmenter l'expression du transgène. Le gène TSLP humain a été construit dans ce vecteur sous le contrôle du facteur d'allongement-1(EF-1) alpha pour obtenir une expression solide, constitutive et à long terme.
L'ingénierie de ce modèle PDX amélioré par les cytokines humaines se compose de 4 étapes majeures. Tout d'abord, le stroma transduit est développé in vitro et évalué par dosage immunosorbant enzymatique (ELISA) pour une production stable et à haute teneur en cytokines. Deuxièmement, l'activité de la cytokine humaine produite par les cellules stromales transduites (et le manque d'activité de la cytokine à partir du stroma témoin) est vérifiée à l'aide de la cytométrie à flux phosphore. Les lignées cellulaires connues pour réagir à la cytokine d'intérêt (dans ce cas, TSLP) sont incubées avec un surnageant de cellules stromales et testées pour la phosphorylation induite par les cytokines. Troisièmement, les souris sont injectées avec un stroma humain transduit, puis le plasma de souris est évalué par ELISA pour des taux de cytokines humains sur une base hebdomadaire. Quatrièmement, les cellules hématopoïétiques humaines sont transplantées et les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine sont évalués sur une cible connue ( La délivrance de cytokines humaines par l'intermédiaire de cellules stromales offre à la fois des avantages et des inconvénients par rapport à d'autres procédés de délivrance / production de cytokines humaines chez des souris PDX. 7 Par rapport à l'injection de cytokine humaine recombinante, la délivrance à médiation par le stroma est généralement moins coûteuse (le coût de la culture de cellules stromales est inférieur au coût de la cytokine recombinante) et moins de travail intensif (une injection par semaine par injection multiple par semaine). La question de la demi-vie courte des cytokines est également atténuée puisque le stroma produit continuellement la cytokine exogène. La délivrance de cytokine par injection hydrodynamique d'ADN peut être moins coûteuse que la délivrance par stroma. Cependant, il est également transitoire et peut nécessiter plus de compétences techniques que l'injection intrapéritonéale hebdomadaire simple requise pour l'administration par stimulation du stroma. L'expression du gène lentiviral chez la souris peut fournir moins de traMéthode de distribution de cytokines; Cependant, dans nos mains, les niveaux de TSLP physiologiques n'ont pas été atteints. En outre, cette méthode nécessite beaucoup de travail, nécessitant une production continue de vecteur lentiviral. Les souris transgéniques ou knock-in offrent une expression stable à long terme de la cytokine et peuvent être conçues pour une expression spécifique des tissus, ce qui peut être un avantage. D'autre part, l'expression transgénique du gène de la cytokine humaine sur le fond de souris immunodépendant requis pour les souris PDX nécessite un immense investissement de ressources avant que la valeur du modèle ne soit établie. En outre, les modèles transgéniques ne permettent généralement pas l'option de modifier le moment de l'initiation des cytokines ou le niveau de production de cytokines in vivo . Ceux-ci peuvent être atteints avec une distribution stimulée par le stroma en modifiant simplement le point de temps pour l'initiation de l'injection de cellules stromales ou la dose de cellules stromales injectées. La méthodologie de distribution de cytokines médiée par une cellule stromaleOd détaillé ici a été utilisé pour développer PDX pour évaluer le rôle du TSLP dans le développement normal des cellules B humaines 4 , 6 et la leucémie lymphoblastique aiguë des cellules B à haut risque. 6 Cette méthode fournit une méthode de distribution de cytokine alternative utilisée pour générer des modèles similaires avec des cytokines humaines autres que TSLP. Ce modèle peut également être utile pour générer des données préliminaires qui peuvent aider à déterminer si la valeur d'un cytokine transgénique ou cytokine knock-in PDX modèle serait digne de l'investissement en temps et en argent important. 
Figure 1: Modèle PDX conçu pour produire des cytokines humaines exogènes chez les souris. ( 1A ) Expérience de conception et obtention de cellules stromales humaines transduites ( 1B ) Obtenir des cellules humaines (cellules souches hématopoïétiques, cellules de leucémie, etc. ) pour générer des souris PDX (xénogreffe dérivée du patient). ( 2A ) Injecter le stroma manipulé et ( 2B ) transplanter des cellules humaines dans des souris immunodéficientes selon le calendrier expérimental. ( 3A-B ) Surveiller les concentrations de cytokines dans le surnageant de stroma et le plasma de souris par ELISA. ( 4 ) Récolter des cellules humaines et évaluer les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine présente dans la PDX. Cliquez ici s'il vous plaitPour afficher une version plus grande de cette figure.
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Protocol
Des études ont été menées conformément aux protocoles approuvés par la Commission de révision institutionnelle (IRB) de l'Université de Loma Linda et les règlements approuvés par l'IRSC et selon toutes les lignes directrices fédérales.
ATTENTION: le PDX et les tissus humains doivent être manipulés conformément aux procédures de sécurité pour prévenir la transmission des agents pathogènes transmissibles par le sang.
1. Culture et expansion des cellules stromales transduites par la cytokine
REMARQUE: Chaque fois que le stroma est passé, récolter le surnageant de culture (1 ml d'aliquote) et stocker à -80 ° C pour la quantification future du niveau de cytokines par dosage ELISA.
- Préparer le milieu de culture R10 et le milieu de congélation comme décrit dans la Table des matières.
- Générer 10 , 11 ou obtenir un stroma de contrôle (transduit avec un vecteur vide) et un stroma produisant des cytokines (TSLP +)."> 6 Stocker dans de l'azote liquide (LN 2 ) jusqu'à l'utilisation. Décongeler les cellules stromales comme décrit 12 et les plaquer dans 5 mL de milieu R10 dans des flacons de culture de cellules T-25 séparés. Cellules de culture dans un incubateur à 37 ° C avec 5% CO 2. Il s'agit du "passage # 1" post-décongelage.
- Une fois que le stroma est confluent (24-48 h), les cellules de passage en trypsinisant en utilisant 1 × trypsine EDTA (0,25%) et rechapage dans un flacon de culture T-150. Il s'agit du "passage # 2" post-décongelage.
- Lorsque le stroma atteint la confluence dans les flacons T-150 (3-4 jours plus tard), passage des cellules par trypsinisation. Utilisez cette suspension cellulaire pour les besoins expérimentaux.
- Expansion cellulaire à plusieurs flacons
- Diviser les cellules récoltées entre trois flacons T-150 et la culture jusqu'à confluent. Répétez cette étape si l'extension du stroma est nécessaire. Le nombre de cellules stromales humaines (HS-27A) typiques à la confluence dans un ballon T-150 est de ~ 5 x 10 6 .
- Celluless'emporter
- Transférer la suspension cellulaire récoltée dans un tube conique et centrifuger à 500 xg pendant 5 min, décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de congélation. Geler et stocker dans LN 2 ~ 1,5 x 10 6 cellules par flacon.
- Pour les injections de stroma intra-périotoneal chez la souris, passez à l'étape 4.1.
- Expansion cellulaire à plusieurs flacons
2. Essais ELISA pour surveiller la production de cytokines in vitro à partir de Stroma transducteur
- Achetez un kit de dosage ELISA disponible dans le commerce pour détecter la cytokine d'intérêt.
- Décongeler le surnageant de cellules stromales à partir du stroma de contrôle et de production de cytokines (TSLP +) récolté aux passages tôt, moyen et tardif ( figure 2 ).
- Déterminer la concentration de TSLP dans les échantillons de surnageant en utilisant un kit ELISA selon les instructions du fabricant. 13 Compilez ces données en série pour surveiller la stabilité de la production de cytokines pendant la culture cellulaire E ( Figure 2A-B ).
- Identifier et éliminer le stroma produisant des cytokines avec une expression de cytokines réduite ou moins optimale, ainsi que les flacons correspondants en stockage ( Figure 2A-B ).
- Identifiez et maintenez le stroma produisant des cytokines qui démontrent des concentrations de cytokines stables et à haut niveau. Utilisez ces décongélations pour des expériences.
- Utilisez le kit ELISA pour surveiller systématiquement le stroma pendant toute la durée de la culture cellulaire (au moins 1 fois pendant les passages post-décongélation tôt, moyen et tardif) pour assurer une production stable de cytokines ou, dans le cas du stroma de contrôle, l'absence de production de cytokines .
3. Tests de cytométrie à flux phosphore pour évaluer l'activité de la cytokine produite par Stroma
NOTE: Évaluez le surnageant du stroma modifié avant la première expérience pour vérifier la bio-activité pertinente de la cytokine générée par le stroma pour une expérience individuelle.Ef "> 6 Une fois que le stroma manipulé est validé, d'autres tests ne sont pas nécessaires, à moins que des stroma ne soient introduits avec un nouveau vecteur.
- Achetez les lignées cellulaires de la leucémie MUTZ5 et / ou MHH-CALL4 (TSLP réactive), 14 cytokines humaines recombinantes et des anticorps approuvés pour une utilisation dans des analyses de cytométrie phospho-flux pour détecter des cibles appropriées de phosphorylation en aval.
- Décongeler le surnageant récolté du contrôle et du stroma exprimant les cytokines.
- Placer les lignées cellulaires de leucémie dans un milieu R20 (voir le tableau des matériaux ) à une concentration de 0,2 x 10 6 cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits. Plaque 3 puits par condition pour permettre des essais en triple. Incuber pendant 2 h à 37 ° C. Cette fois permet de perdre toute phosphorylation qui s'est produite pendant les conditions de culture antérieures.
NOTE: 12 puits par ligne cellulaire fournissent des essais en triple pour chaque condition expérimentale indiquée à l'étape 3.4. <Li> Après 2 h de culture, transférez les cellules de chaque puits pour séparer les tubes de 4 mL et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant. - Réinstaller les cellules dans 200 μL pour chacune des conditions expérimentales suivantes (effectuer des analyses en trois exemplaires): 1) média de contrôle négatif, 2) milieu de contrôle positif avec cytokine recombinante à la (des) concentration (s) saturante (TSLP à 15 ng / ML, etc. ), 3) contrôle du stroma-surnageant du stroma de contrôle, et 4) surnageant de cytokine-stroma du stroma producteur de cytokines.
- Incuber les cellules pendant la durée spécifiée par un phospho-dosage commercial spécifique ( par exemple 30 min pour phospho-STAT5 dans MUTZ5 ou MHH-CALL4 en réponse à TSLP).
- Centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C et décanter le surnageant.
- Effectuer une coloration par cytométrie à flux phosphore par protocole du fabricant et recueillir des données de cytométrie en flux. 15
- Portez sur des cellules intactes en fonction de la dispersion de l'avant (FSC, indique la taille de la cellule) et côté (SSC, indique la granularité cellulaire).
- Déterminer l'intensité médiane de fluorescence (IMF) des cellules intactes dans chaque échantillon. Comparez l'IMF moyenne obtenue à partir des valeurs tripartites du surnageant de cellules stromales par rapport aux contrôles médiatiques positifs et négatifs.
4. Injection de stroma transducteur de cytokine en souris
REMARQUE: stroma HS-27A de culture pour un minimum de 3 passages post-décongélation avant de les injecter dans des souris pour assurer des cellules saines et une production adéquate de cytokines.
- Préparation du stroma
- Transférer la suspension de cellules stromales récoltées à un tube conique et une aliquote de 10 μL pour le nombre d'hémocytomètres; Obtenir un nombre de cellules vivantes en utilisant du bleu trypan. 16 Centrifugez le resteLl de suspension à 500 xg pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant des cellules granulées et resuspendre doucement les cellules dans le volume nécessaire de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour l'injection de souris (selon le nombre de souris à injecter).
NOTE Concentration typique des cellules stromales pour l'injection de souris: 0,5 x 10 6 -5 x 10 6 cellules par souris dans 200 ul de PBS. - Gardez la suspension de la cellule stromale à 4 ° C (ou sur la glace) jusqu'à immédiatement avant l'injection. Assurez-vous que la suspension cellulaire est au moins à température ambiante (RT) (~ 25 ° C) pour l'injection de souris.
- Injection cellulaire stromale
- Désinfectez la hotte de sécurité biologique, assemblez les matériaux pour les injections, puis placez la cage de la souris à l'intérieur.
- Mélanger délicatement la suspension cellulaire par inversion avant d'établir 200 μL dans une seringue de tuberculine.
- En utilisant des techniques d'injection intrapéritonéale standard, 17Retenir la souris et administrer la suspension cellulaire de 200 μL dans la cavité péritonéale. Les détails ont déjà été démontrés par Machholz et al. 18
5. Collecte de sang en série et surveillance du plasma pour la cytokine humaine exogène chez les souris
- Collecte de sang par collage de queue
- Désinfectez le capot de biosécurité et assemblez le dispositif de retenue de la souris, les ciseaux et autres outils / fournitures pour la procédure.
- Placez la souris dans un dispositif de retenue et fixez le tube pour minimiser le mouvement de la souris.
- Désinfectez la queue et les ciseaux chirurgicaux avec de l'alcool isopropylique. Appliquer une crème anesthésique topique sur la queue.
- En utilisant des ciseaux chirurgicaux très pointues, retirez environ 0,5 à 1 mm de la pointe de la queue de la souris. Recueillir environ 80 μl de sang périphérique à l'aide de tubes capillaires héparinés.
NOTE: Si le sang est collecté avec cette méthode, plus de six tiMes, l'élimination de la queue doit être conservatrice en ce qui concerne la quantité de queue enlevée. Au fur et à mesure que les poinçons progressent dans la queue, le diamètre augmente, il hémorragie plus rapidement et la guérison prend plus de temps.
- Séparation plasmatique
- Transférer le sang à l'aide d'une seringue à bulbe (pour l'expulser des tubes capillaires) dans un tube de microtain K2 EDTA marqué; Inverser 20 fois pour éviter la coagulation.
REMARQUE: En règle générale, la coagulation du col de la queue est rapide. Cependant, si l'hémorragie persiste plus de ~ 2 minutes, utilisez un crayon / poudre styptique pour faciliter la coagulation. - Centrifuger les tubes de collecte de sang selon les instructions du fabricant et allumer le plasma pour le stockage (-20 ° C) jusqu'à ce qu'il soit prêt pour le dosage ELISA.
- Si des données de chimère de cellule souris-humain sont nécessaires à partir du sang de souris, puis traiter la pastille restante comme décrit à l'étape 6.3.1. Sinon, jeter la pastille de cellules sanguines.
- Transférer le sang à l'aide d'une seringue à bulbe (pour l'expulser des tubes capillaires) dans un tube de microtain K2 EDTA marqué; Inverser 20 fois pour éviter la coagulation.
- ELISA modifié pour micro-volUn plasma de souris
REMARQUE: La procédure ELISA du fabricant a été modifiée du volume d'échantillon recommandé de 100 μL à un volume de 40 μL pour tenir compte des micro-volumes recueillis auprès des souris. Il n'est pas possible d'exécuter les échantillons de plasma de souris in vivo en trois exemplaires avec ces volumes limités. À la fin de l'expérience, 500 μL de sang post-mortem sont recueillis par ponction cardiaque. Les concentrations de cytokines évaluées dans 100 μL de plasma d'euthanasie sont utilisées pour valider les données in vivo de 40 μL pour chaque souris.- Décongeler les échantillons de plasma de souris congelés.
- Diluer les normes ELISA en série et les plaquer par triplicat à 40 μL par puits.
- Ajouter 40 μL de chaque échantillon de plasma souris à la plaque ELISA.
REMARQUE: si un échantillon de souris est inférieur à 40 μL, augmentez le volume jusqu'à 40 μL avec un tampon ELISA. Notez ce volume de diluant et utilisez-le pour calculer un facteur de dilution pour chaque échantillon dilué. QuandL'analyse des données ELISA multiplie la concentration d'échantillon dilué par le facteur de dilution de l'échantillon pour déterminer la concentration réelle de cytokine dans l'échantillon d'origine. - Compléter le dosage ELISA selon les instructions du fabricant.
6. Transplantation de cellules hématopoïétiques en souris
- L'irradiation sublimale pour conditionner la moelle osseuse pour transplanter
NOTE: Loma Linda University (LLU) utilise une source de rayonnement Cobalt-60. Les animaux sont placés dans un dispositif de retenue de tarte qui est positionné à 80 cm de la source de rayonnement dans un champ de 20 x 20 cm et avec une couche de 0,5 cm de Lexan au dessus du dispositif de retenue. Le temps d'exposition est calculé pour obtenir une dose de 225 cGy basée sur l'étalonnage de source le plus récent (actuellement 2 à 3 minutes pour cette source).- Souris sous-létalement irradiées (dose totale d'irradiation corporelle de 225 cGy maximum pour les souris immunodéficientes).
- Transplanter les cellules hématopoïétiques ~ 24 h plus tard via </ Em> injection intraveineuse de veine de queue.
- Transplantation intraveineuse de cellules hématopoïétiques
- Préparer des suspensions de cellules humaines pour la transplantation dans un volume de 200 μL de PBS stérile par souris: CD34 + cellules souches hématopoïétiques (HSC): 1 x 10 5 à 5 x 10 5 cellules par lignée cellulaire de la souris et de la leucémie / échantillons de patients: 1 x 10 6 à 5 x 10 6 cellules par souris.
- Garder les cellules à 4 ° C (transport sur glace) jusqu'à immédiatement avant la transplantation. Assurez-vous que les cellules sont au moins à la RT avant la transplantation.
- Désinfectez la hotte de protection biologique et prépare la zone du capot pour les injections de transplantation.
- Placez la souris dans la cage de réchauffement pendant au moins 5 minutes pour permettre la dilatation des veines de la queue.
- Mélanger doucement la suspension cellulaire et étirer 200 μL dans une seringue de tuberculine. Saisissez l'aiguille de façon sûre là où elle restera stérile.
- Placez la souris dans un dispositif de retenue et désinfectez la queue avec de l'alcool isopropylique. </ Li>
- En utilisant des techniques d'injection intraveineuses standard, 17 injecte la suspension de cellules humaines dans la veine de queue de souris.
REMARQUE: les injections de veine de queue peuvent prendre plusieurs tentatives, en particulier pour un manipulateur d'animaux débutants. La vidéo JoVE de Kovacscics et Raper 19 fournit une démonstration détaillée de cette technique animale. - Surveillez la récupération de la souris pendant environ 5 min. Enregistrer les effets indésirables lors de l'injection ( p. Ex. Cellules renversées, hémorragie majeure, traumatisme excessif).
- Analyse du chimérisme des cellules humaines dans le sang périphérique de souris
- Obtenir la pastille de cellules sanguines restant dans le tube de microtainer après séparation par plasma (étape 5.2.3).
- Pour la lyse des globules rouges (RBC), réinsérez la pastille de sang restante dans un volume de PBS égal au plasma éliminé (pour remplacer le volume de plasma) et mélangez bien (vortex / pipette).
- Transférer chaque échantillon de sang ré-suspendu à un tube de 4 mL étiquetéEt ensuite ajouter un tampon de lyse RBC à chaque tube dans un rapport 1: 9 (900 μL de tampon de lyse RBC pour 100 μL de sang ré-suspendu). Incuber pendant 5 min à la RT. Centrifugeuse (5 min, 500 xg) et décantation.
- Effectuer une deuxième incubation du tampon de lyse RBC (5 min à la RT). Centrifuger et décanter comme précédemment.
- Laver les cellules restantes dans ~ 1 mL de PBS. Centrifuger et décanter comme précédemment.
- Resuspendre la pastille dans un volume de PBS approprié pour la coloration par cytométrie à flux standard (cela varie en fonction du fabricant et des protocoles de laboratoire individuels). 20 Utiliser des anticorps immunophénotypés validés pour la cyotérérité de flux pour identifier les cellules de souris (souris CD45 +) et les cellules humaines (CD45 + humain) 6 , 21 Ainsi que d'autres marqueurs de leucocytes humains spécifiques à la lignée cellulaire d'intérêt.
REMARQUE: Il est recommandé de prendre un petit volume (5 μL-20 μL) de chaque échantillon de souris pour créer des "échantillons groupés"; À utiliser pour les échantillons non contrôlés, viables et isotypiques. Il est préférable d'avoir des contrôles non conservés et des isotypes pour chaque condition expérimentale.
7. Evaluation fonctionnelle de l'activité Cytokine In vivo
- Euthanasie de la souris et récolte des tissus
- Éuthaniser les souris par asphyxie au CO 2 au point de temps expérimental désigné.
- Récolte le sang par ponction cardiaque et collectez le plasma comme indiqué aux étapes 5.2.1-5.2.2.
REMARQUE: Recueillir le sang avant d'autres tissus car il commence à coaguler immédiatement après la mort. - Traiter le sang de la souris, l'aliquote et stocker le plasma comme à l'étape 5.2.2.
- A plus tard, évaluer la concentration exogène de cytokines dans le plasma obtenu à l'euthanasie par ELISA selon le protocole du fabricant. Évaluer et comparer les concentrations exogènes de cytokines dans le plasma de souris de la série in vivoLa collecte de sang et les échantillons de plasma d'euthanasie (décrits à la section 5.3).
- Ajouter le PBS à l'échantillon de sang restant pour remplacer le volume et le processus du plasma comme décrit aux étapes 6.3.1 et 6.3.2. Effectuer des analyses de cytométrie de flux immédiatement ou ré-endiguer les cellules dans un milieu de congélation pour le stockage de LN 2 .
- Ramasser la moelle osseuse (BM) et la rate à partir de souris PDX et préparer des suspensions de cellules simples comme décrit précédemment. 22
- Obtenez le nombre de cellules pour chaque échantillon de tissu de souris PDX en utilisant de l'acide acétique à 3% avec du bleu de méthylène (les membranes cellulaires de lyses et les globules rouges quittant les noyaux intacts de cellules vivantes) dans une dilution 1: 1 et comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre. Tabuler le nombre total de cellules pour les échantillons de moelle osseuse et de rate pour chaque animal.
- Centrifuger (500 xg, 15 min) des suspensions de cellules et décanter le surnageant. Effectuer des analyses de cytométrie de flux de cellules de la moelle osseuse et / ou des cellules de la rate immédiatement ou resuspendre dans un milieu de congélation pour LN <Sub> 2 de stockage.
REMARQUE: congéluez 10 portions aliquotes BM (pour les futurs essais biochimiques) et ~ 5 portions aléatoires de rate (pour les futures transplantations PDX) par souris. - Immunophénotypage pour identifier les effets fonctionnels in vivo
- Préparez un mélange maître (MM) d'anticorps anti-cytométrie en flux pour une population hématopoïétique immunophénotype répondant à la cytokine d'intérêt et un deuxième MM d'anticorps anti-isotype ( Figure 5 et Tableau des Matériaux).
- Découper les aliquotes de tissus PDX (bain de talon à 37 ° C) préparé à l'étape 7.4.
- Lavez les cellules décongelées en les transférant dans un tube conique et en ajoutant au moins 3x de volume de PBS. Centrifugeuse (500 xg, 5 min) et décantez le surnageant.
- Répétez l'étape de lavage (7.5.3).
- Créez des aliquotes groupées en prenant des cellules ~ 10 μL-20 μL de chaque échantillon PDX pour le contrôle non contrôlé, le contrôle de viabilité et les contrôles d'isotype (voir la note 6.4.6). Tenez tous les échantillons, à l'exception de vousContrôle intrinsèque, avec un colorant de viabilité fixable (marqueur de cellules mortes), incubation et lavage selon le protocole du fabricant.
- Tacher chaque échantillon de cellules PDX avec phénotypage-MM selon le protocole de coloration par cytométrie de flux standard; Tache également le (s) échantillon (s) d'isotype-contrôle mis en commun avec l'isotype-MM. Incuber tous les échantillons, laver avec du PBS et corriger les échantillons en les replaçant dans du paraformaldéhyde à 1%.
- Collectez des données de cytométrie de flux et analysez les données en utilisant une stratégie de verrouillage appropriée pour la (les) population (s) cellulaire (s) d'intérêt ( Figure 5 ). Un déclenchement typique est le suivant:
- Définissez les cellules intactes en dessinant une porte FSC et SSC qui exclut les débris.
- Identifiez la population des cellules vivantes en gating sur les cellules qui sont négatives pour le marqueur de la cellule morte (il s'agit des «cellules vivantes totales»).
- Utilisez des sous-portes dans les «cellules vivantes totales» pour définir les populations de cellules avec l'immunophénotype désiré (voir la figure 5).
- Obtenir leFréquence des populations de cellules sous-jacentes dans le nombre total de cellules vivantes provenant de l'analyse par cytométrie en flux. 6 , 21
- Calculer le nombre de cellules cibles dans chaque tissu en multipliant la fréquence du sous-ensemble de cellules B, dans les cellules vivantes totales (obtenues à l'étape 7.5.6.4) par le nombre total de cellules vivantes par tissu obtenu à l'étape 7.3 (% sous-ensemble de cellules B x " Nombre de cellules d'hémocytomètre ", voir le tableau 1 )
- Comparer les comptes cellulaires des populations de cellules cibles entre les souris PDX témoins et les souris PDX exprimant les cytokines (TSLP +) pour déterminer les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine exotique ( tableau 1 ).
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Representative Results
Un aperçu du modèle est illustré à la figure 1 . Une fois que la production de cytokine (TSLP + stroma) et le stroma de contrôle ont été obtenus, ils sont développés en culture. Avant l'injection de stroma chez la souris, le surnageant de cellules stromales est évalué par ELISA pour vérifier la production de cytokines ( Figure 2 ) et la cytométrie à flux phosphore (Protocole n ° 3) est utilisée pour vérifier l'activité de la cytokine produite par le stroma. Le surnageant est recueilli à partir de cultures de cellules stromales confluentes (stroma témoin et stroma TSLP +) lorsque les cellules sont passées. ELISA est utilisé pour surveiller la concentration de TSLP dans le surnageant au moins une fois pendant les passages tôt, moyen et tardif. Les données représentatives du stroma de contrôle sont illustrées à la figure 2A . Les cultures de cellules stromales de contrôle qui montrent l'expression de TSLP (et les flacons congelés à partir d'elles) doivent être jetées. Les cultures de contrôle avec TSLP indétectable sont développées et gelées pour une utilisation future.Comme le montrent les cultures de la figure 2B du stroma TSLP + montrant la production de TSLP à faible niveau (et les flacons congelés à partir d'eux) sont éliminés. TSLP + stroma montrant une production stable et à haut niveau de la cytokine sont sélectionnés pour l'expansion et le stockage pour une utilisation dans les expériences futures. Les niveaux moyens de TSLP dans le surnageant provenant de cultures multiples de contrôle et le stroma TSLP + sont présentés à la Figure 2C .
La chronologie expérimentale pour la production de souris PDX témoins avec des cytokines humaines est illustrée à la figure 3 . Les cultures de cellules stromales sont initiées 3 semaines avant la transplantation et le dosage ELISA de la production de TSLP in vitro dans le surnageant de culture est effectué comme décrit dans la Figure 2. La TSLP humaine in vivo dans le plasma de souris est surveillée chaque semaine ( Figure 4 ) en utilisant le "ELISA modifié pour Micro-volumes de plasma de souris "décrit dans le protocole n ° 4. PeripheraL le sang est recueilli simultanément avec le plasma et est analysé comme décrit dans le protocole n ° 6 sous "Analyse du chimérisme des cellules humaines dans le sang périphérique de la souris". Le PDX injecté avec le stroma de contrôle a constamment montré des niveaux plasmatiques de TSLP humains qui sont inférieurs au seuil de détection ( Figure 4A ). Le taux plasmatique de TSLP chez les souris PDX injectées avec le stroma TSLP + est proportionnel au nombre de cellules stromales TSLP + injectées au cours des 1 à 2 semaines précédentes. Les taux plasmatiques de TSLP diminuent rapidement si les injections de cellules stromales sont interrompues. 6 Comme on l'a vu à la figure 4B , des injections hebdomadaires de 0,5 x 10 6 TSLP + stroma (produisant en moyenne> 1000 pg / mL de TSLP dans un surnageant de culture) ont donné des taux plasmatiques de TSLP près de la limite inférieure des niveaux physiologiques (~ 5-10 pg / mL ). L'injection hebdomadaire de 5 x 10 6 TSLP + stroma chez les souris PDX a entraîné des taux de TSLP plasmatique qui atteignent des niveaux physiologiques élevés (~ 35 pg / mL) comme indiqué dans
Le TSLP a montré qu'il augmentait la production de précurseurs normaux de cellules B humaines. 23 Ainsi, pour évaluer la fonction in vivo de TSLP, nous avons comparé le produit Ion des précurseurs de cellules B humains normaux dans le contrôle et des souris TSLP + PDX transplantées avec des cellules souches hématopoïétiques, comme le montre la figure 5 et dans le tableau 1 . La figure 5A montre le passage de la cytométrie de flux pour l'immunophénotypage utilisé pour identifier des sous-groupes de cellules de lignée humaine B. Des exemples de calculs pour énumérer le nombre de cellules dans chaque sous-ensemble pour un contrôle PDX et un TSLP + PDX sont indiqués dans le tableau 1 . Comme le montre la figure 5B, les cellules de lignée B sont significativement augmentées dans TSLP + par rapport à la PDX de contrôle et cette augmentation commence par les précurseurs de cellules B les plus anciens (cellules pro-B). Le nombre de cellules de lignée non-B n'était pas significativement différent entre le contrôle et TSLP + PDX (données non affichées). Ce dosage fournit une manière de vérifier que le TSLP humain produit in vivo dans TSLP + PDX exerce des effets fonctionnels in vivo sur une population de cellules cibles.
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Figure 2: ELISA pour surveiller les concentrations de cytokines TSLP dans le surnageant Stroma. Les tests ELISA ont été utilisés pour mesurer les concentrations de TSLP dans le surnageant à partir du stroma témoin (transducé avec le vecteur témoin) et du stroma TSLP + (transducé pour exprimer la TSLP humaine) au moins une fois pendant les passages cellulaires suivants: début (passage 1-5), milieu (passages 6-12) et tard (passages 13-20). Le seuil de détection pour le test humain ELISA TSLP utilisé ici est de 1,9 pg / mL (ligne pointillée rouge). ( A ) Le stroma de contrôle produit des concentrations de TSLP humaine minimisablement détectables; Ces niveaux sont généralement inférieurs au seuil de détection ELISA pour la durée de l'expérience. Le sté stro de contrôle en culture qui montre des concentrations croissantes de TSLP (> 15 pg / mL) est éliminé avec toutes les aliquotes gelées de cette culture. ( B ) La production humaine de TSLP varie entre les cultures générées par differenT des flacons décongelés de TSLP + stroma ( n = 9) et tout au long de la période de culture. Le stroma TSLP qui montre une production de cytokines diminuée ou instable (TSLP <1000 pg / mL) est également rejeté. ( C ) Concentrations moyennes de TSLP pour le contrôle (vert) et le stroma TSLP + (bleu) (intervalles de confiance et 95%). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Chronologie expérimentale pour la génération de souris PDX avec la production de cytokines humaines exogènes. Les parties in vitro et in vivo de l'expérience progressent simultanément. La culture cellulaire de stroma de contrôle et + TSLP est initiée 2-3 semaines avant la transplantation de cellules hématopoïétiques, ce qui assure un minimum de 3 passages de cellules avant la première (àWk -1) des injections de cellules stromales hebdomadaires. Cela garantit que les cellules stromales sont saines, prolifératives et produisent des niveaux adéquats de cytokines. Des portions aliquotes de surnageant sont recueillies lorsque les cellules sont passées et les tests ELISA sont utilisés pour déterminer la concentration de TSLP (voir la figure 2 ) dans le surnageant du stroma. Les animaux sont irradiés au jour 0, un jour avant la transplantation de cellules hématopoïétiques humaines le 1er jour. La collecte hebdomadaire du sang commence 1 à 2 semaines après les premières injections de stroma. À cette époque, des concentrations de cytokines humaines exogènes devraient être détectables dans le plasma de souris en utilisant des tests ELISA modifiés ( Figure 4 ). Le critère d'évaluation de l'expérience est de 5 à 16 semaines après la transplantation de cellules humaines; Cela dépend de la quantité de chimérisme des cellules humaines détecté dans le sang périphérique de la souris. L'hématopoïèse normale est généralement bien établie à la semaine 5-7, le chimérisme des cellules de leucémie varie entre les lignées cellulaires et les échantillons primaires (3-16 semaines). La réussite et la progression de la transplantation PDX dépendent égalementSur le nombre de cellules humaines injectées à la transplantation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Atteindre les concentrations de cytokines TSLP humaines physiologiques dans le plasma de souris. Les souris reçoivent des injections intrapéritonéales hebdomadaires (200 μL) de cellules transduites et leur plasma est collecté pour évaluer les concentrations humaines de TSLP (dosage ELISA) in vivo chez la souris dans le temps. Les souris " Control" ont reçu 5 x 10 6 cellules de stroma de contrôle, tandis que les souris "TSLP + low" (faible dose de stroma TSLP) ont reçu 0,5 x 10 6 cellules de stroma TSLP + et les souris "TSLP + high" (dose de stroma TSLP élevée) ont reçu 5 x 10 6 TSLP + cellules stromales chaque semaine. Le test humain ELISA TSLP Le seuil de détection est de 1,9 pg / mL (ligne pointillée rouge) et la gamme physiologique humaine de TSLP est de ~ 5 à 35 pg / mL (sombre gris). 24 (Référence 11 et Coats données non publiées) ( A ) Le plasma de souris "Control" a toujours des niveaux de TSLP <5 pg / mL ou moins du seuil de détection ELISA. ( B ) Le plasma de souris "TSLP + faible" présente des niveaux physiologiques faibles de TSLP; Alors que ( C ) le plasma de souris "TSLP + haut" présente des niveaux physiologiques élevés. ( D ) Les concentrations moyennes de TSLP pour chaque groupe expérimental (moyenne ± SEM de toutes les souris et points de temps) montrent que les niveaux de TSLP détectés dans le plasma de souris sont proportionnels à la dose de stroma reçue; Les niveaux plasmatiques de la souris de contrôle sont inférieurs au seuil de détection ELISA et les niveaux plasmatiques "TSLP + haut" sont quatre fois supérieurs aux niveaux plasmatiques de la souris "TSLP + low"."> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Dosage des populations de cellules B humaines normales Valider les effets fonctionnels de la TSLP humaine exogène chez les souris PDX. Les souris PDX ont été manipulées avec contrôle et TSLP + et ont été transplantées avec des cellules CD34 + humaines isolées à partir du sang du cordon ombilical. L'immuno-phénotypage par cytométrie de flux a été utilisé pour identifier des sous-groupes de précurseurs de cellules B humaines dans la moelle osseuse récoltées à partir du témoin et TSLP + PDX comme suit: la moelle osseuse récoltée, a été décongelée et colorée avec un colorant de viabilité fixable et colorée pour la cytométrie en flux pour détecter les anticorps anti- CD45 humaine, CD19, CD34, chaîne légère κ & λ , et soit IgD de surface et IgM, soit IgM intracellulaire (cμ). ( A ) Total vivant celIls ont été fermés en fonction d'un marqueur de viabilité. Les tracés successifs montrent les portes suivantes pour identifier les sous-ensembles linéaires B séquentiellement séquentiels (les données affichées proviennent de TSLP + PDX). ( B ) La fréquence de chaque sous-ensemble dans les cellules vivantes totales a été déterminée par un logiciel de cytométrie de flux et le nombre de cellules dans chaque sous-ensemble de cellules B a été calculé. (Voir le tableau 1). Le nombre de cellules pour chaque sous-ensemble de cellules B dans le contrôle (noir, n = 3) et les souris PDL TSLP + (bleu, n = 5) sont représentés graphiquement. (Moyenne ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Population cellulaire humaine | Freq. Des cellules vivantes totales | Live Cell Count iN BM | # Cellules dans la population |
| Souris de contrôle | |||
| Cellules vivantes totales | 100,00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| HCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Total CD19 + | 27,20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24,20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Pre-B | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 10 6 |
| Immature B | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Mature B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 10 6 |
| TSLP + Souris | |||
| Cellules vivantes totales | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| HCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| Total CD19 + | 65,10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60,20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Pre-B | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Immature B | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 10 6 |
| Mature B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 10 6 |
Tableau 1: Fréquence et nombre de sous-ensembles cellulaires humains humains normaux dans la moelle osseuse PDX. La fréquence (%) de chaque sous-ensemble de cellules B dans les cellules vivantes totales a été déterminée par analyse de cytométrie de flux (voir la figure 5A pour la stratégie de gating). Données représentatives de la moelle osseuse (BM) d'une souris PDX de contrôle (injections de stroma de contrôle reçues, 5 x 10 6 cellules / semaine) et une souris TSLP + PDX (injections de stroma TSLP reçues, 5 x 10 6 cellules / semaine). Le nombre total de cellules vivantes ont été enregistrés à l'euthanasie et la cytométrie de flux de phénotypage immunologique a été utilisée pour évaluer la fréquence des sous-ensembles (%) et calculer la taille de chaque sous-population de cellules B (nombre de cellules de sous-ensemble = "totCellules vivantes "x" fréquence de sous-ensemble ").
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Discussion
Ce manuscrit décrit une méthode simple, rapide et relativement rentable pour l'ingénierie PDX pour exprimer des cytokines humaines exogènes. La stratégie décrite ici est basée sur des injections intrapéritonéales hebdomadaires d'une lignée cellulaire stromale transduites pour exprimer la cytokine humaine, TSLP. Avant d'exécuter les méthodes décrites ici, le stroma conçu pour exprimer des niveaux élevés de cytokine d'intérêt (TSLP) et un stroma de contrôle de même ingénierie ont été générés. Dans les protocoles présentés ici, le stroma est développé en culture et testé pour la capacité à fournir une production de cytokines stable et à haut niveau dans le temps (ou pour l'absence de production de cytokines dans le cas du stroma de contrôle). Des essais pour vérifier l'activité de la cytokine générée par le stroma ont été effectués et des délais expérimentaux pour l'injection de cellules stromales ont été développés pour produire de la PDX avec une TSLP physiologique humaine (et des souris témoins qui n'ont pas de TSLP humaine). Procédures pour surveiller les niveaux plasmatiques de TSLP humaine etPour vérifier ses effets fonctionnels in vivo sur les populations de cellules sensibles aux cytokines.
Plusieurs facteurs devraient être pris en considération lors du choix des cellules stromales et des vecteurs qui seront utilisés dans les protocoles présentés ici. Les lignées cellulaires Stromal ne devraient pas produire de façon endogène des taux élevés de cytokines et ne devraient pas répondre à la cytokine d'intérêt. Pour les études ici, la lignée cellulaire stromale de la moelle osseuse humaine, HS-27A, a été choisie parce qu'elle pousse de façon robuste en culture avec une production de cytokines à bas niveau. 8 La méthode décrite ici comprend également le «contrôle» PDX conçu avec le même stroma que TSLP + PDX, mais sans surexpression de TSLP. La comparaison des résultats dans TSLP + et le contrôle PDX nous permettent de contrôler tout effet dû à la production de cytokines de cellules stromales endogènes. La transduction de cellules stromales avec des vecteurs qui incluent des protéines fluorescentes ou d'autres marqueurs sélectionnables peut être utile pour isoler des cellules.Sont susceptibles de surexprimer la cytokine d'intérêt. Cependant, il est essentiel d'analyser le surnageant de cytokines pour déterminer le niveau de cytokine produit par les cellules stromales car les taux de cytokines plasmatiques in vivo chez la souris sont en corrélation avec la concentration de cytokines dans le surnageant de cellules stromales, 6 ainsi que le nombre de stroma injecté sur un Chaque semaine ( figure 4 ).
Il est important que l'activité de la cytokine produite par le stroma soit vérifiée avant les études PDX. Nous avons utilisé la cytométrie phospho-débit pour analyser les molécules phosphorylées en aval de la stimulation TSLP dans des cellules qui répondent à la TSLP. TSLP active les chemins JAK-STAT5 et PI3 / AKT / mTOR. Les lignées de cellules de leucémie MUTZ5 et MHH-CALL4 expriment des niveaux élevés de composants du récepteur TSLP et montrent la phosphorylation de la protéine ribosomale S5 STAT5, AKT et de la protéine ribosomale suite à la stimulation TSLP. 14 Nous avons utilisé la cytométrie Phopho-flowPour évaluer la phosphorylation de STAT5 (pSTAT5) induite en aval de la stimulation TSLP. Dans les travaux précédents, nous avons évalué les événements supplémentaires de phosphorylation stimulés par la TSLP: phospho-AKT (pAKT) et protéine phospho-ribosomale S6 (pS6, en aval de mTOR). Les résultats ont montré que le dosage de pAKT est moins sensible et le pS6 plus sensible que le test pSTAT5. 6 Lorsque des essais phospho-actifs sont effectués, les cellules sensibles doivent être cultivées avec des taux saturants de TSLP humain recombinant comme témoin positif et avec des médias uniquement (pas de cytokine) comme témoin négatif. Le surnageant du stroma de contrôle doit être testé le long de celui du TSLP + stroma comme un deuxième moyen de vérification (en plus d'ELISA) que le TSLP n'est pas produit par le stroma de contrôle. Cela sert également de contrôle pour s'assurer que la production endogène de cytokines n'est pas responsable de la phosphorylation observée dans les tests de cellules TSLP +. Idéalement, la phosphorylation induite par les échantillons de stroma produisant des cytokines devrait être similaireÀ ce que l'on observe avec un état de cytokine recombinant, bien qu'il soit plus faible si la concentration de cytokine dans le surnageant est inférieure à celle du témoin positif saturant. Un contrôle positif avec des niveaux de TSLP recombinants qui correspondent aux niveaux observés par ELISA pour TSLP + stroma sont une bonne alternative.
L'identification des indicateurs fonctionnels connus de l'activité cytokine in vivo peut constituer un défi. Les essais de phosphorylation peuvent ne pas être possibles car la phosphorylation induite par la cytokine humaine exogène in vivo peut être rapidement perdue lors de la récolte tissulaire. Étant donné que la TSLP a montré qu'il augmentait la production de précurseurs de cellules B humaines23, l'effet fonctionnel de la TSLP dans PDX a été vérifié en analysant les augmentations in vivo de la population de précurseurs de cellules B humaines en utilisant un immunophénotypage de cytométrie en flux. Une autre stratégie pourrait être le dosage de modifications spécifiques de l'expression des gènes induites par les cytokines et compariNg dans les cellules récoltées à partir de la PDX exprimant les cytokines aux cellules du contrôle PDX. 6
Le but ultime de l'expression de la cytokine chez l'homme dans PDX est de générer un modèle préclinique qui modélise plus étroitement l'environnement in vivo présent chez les patients. Ceci a été testé en comparant l'expression du génome entier dans les tissus humains isolés du PDX témoin et de la PDX exprimant les cytokines (TSLP +) aux échantillons originaux du patient. Ces études ont montré que l'expression des gènes dans les échantillons de patients est significativement plus proche des cellules de leucémie de TSLP + PDX que les témoins. Cependant, nos études portaient sur la lymphopoïèse. Un certain nombre de cytokines favorisant la myéloïde produites chez la souris n'activent pas leurs homologues humains. Il existe des souris knockin de cytokines humaines (souris NSGS et autres) qui traitent de ce problème. En effet, une valeur du modèle que nous décrivons ici est qu'elle peut être utilisée chez les souris NSGS pour créer un modèle qui plus procheEly modélise l'environnement humain in vivo en exprimant le TSLP en plus des cytokines humaines favorisant la myéloïde. D'autre part, un système cytokine +/- pourrait être généré chez des souris NSG en utilisant la méthode décrite ici pour chacune de ces cytokines favorisant la myéloïde. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle in vivo précis de chacun d'entre eux dans les myélopoie et / ou la leucémie myéloïde.
Le PDX Engineered qui produit des niveaux physiologiques de TSLP humain fournit un modèle préclinique qui imite plus étroitement l'environnement in vivo présent dans les patients que le PDX classique. 4 La production de souris PDX de contrôle qui sont également conçues, sont également décrites. Le contrôle ensemble et la production de cytokines PDX créent un système modèle TSLP +/- humain que nous avons utilisé avec succès pour évaluer le rôle du TSLP dans la production in vivo de cellules B humaines normales et malignes. 4 , 6 CeciLe modèle est très pertinent pour les études d'une forme particulière à risque élevé de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL) qui se caractérise par des modifications génétiques conduisant à une surexpression de CRLF2. Le CRLF2 est un récepteur pour la cytokine TSLP et, par conséquent, la signalisation CRLF2 induite par TSLP contribue probablement à l'oncogenèse et à la progression de CRLF2 + B-ALL. L'utilisation de PDX pour étudier cette maladie est particulièrement critique car PDX nous permet d'étudier la leucémie dans le contexte du paysage génétique du patient. Le paysage génétique en tant que contributeur de la maladie est fortement impliqué dans CRLF2 + B-ALL, ce qui se produit cinq fois plus souvent chez les enfants hispaniques et latins que d'autres et représente la moitié de tous les cas de B-ALL chez les patients atteints de syndrome de Down. Les modèles PDX exprimant le TSLP humain tels que celui décrit ici seront un outil important pour identifier les thérapies et comprendre les mécanismes de la maladie de CRLF2 + B-ALL ainsi que pour comprendre l'hématopoïèse normale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
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