Summary
Se describe aquí un método para producir citoquina exógena en ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) mediante inyección intraperitoneal semanal de una línea celular de estroma transducida por citoquinas. Este método amplía la utilidad de PDX y proporciona la opción para el suministro transitorio o sostenido de citoquinas exógenas en una multitud de modelos PDX.
Abstract
Los ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) se producen trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. Estos modelos son una herramienta importante para el estudio de los mecanismos de la hematopoyesis normal y maligna y son el estándar de oro para la identificación de quimioterapia eficaz para muchos tumores malignos. PDX modelos son posibles porque muchas de las citoquinas de ratón también actúan sobre las células humanas. Sin embargo, este no es el caso para todas las citocinas, incluyendo muchas que son críticas para el estudio de la hematopoyesis normal y maligna en las células humanas. Técnicas que ingenieros ratones para producir citoquinas humanas (transgénicos y knock-in modelos) requieren un gasto significativo antes de la utilidad del modelo se ha demostrado. Otras técnicas son intensivas en mano de obra (inyección de citocinas recombinantes o lentivirus) y en algunos casos requieren altos niveles de experiencia técnica (inyección hidrodinámica de ADN). Este informe describe un método simple para la generación de ratones PDX que tienen células humanas exógenasTokina (TSLP, linfopoyetina estromal tímica) mediante inyección intraperitoneal semanal de estroma que se han transducido para sobreexpresar esta citocina. El uso de este método proporciona una fuente in vivo de producción continua de citoquinas que alcanza los niveles fisiológicos de citoquina humana circulante en el ratón. Los niveles plasmáticos de citoquina humana se pueden variar basándose en el número de células estromales inyectadas, y la producción de citoquinas puede iniciarse en cualquier punto del experimento. Este método también incluye ratones de control negativos a citoquinas que se producen de manera similar, pero a través de inyección intraperitoneal de estroma transducido con un vector de control. Hemos demostrado previamente que las células de leucemia recolectadas de PDX que expresa TSLP, en comparación con el control de PDX, muestran un patrón de expresión génica más parecido a la muestra original del paciente. Conjuntamente, los ratones PDX productores de citoquinas y negativos a citoquinas producidos por este método proporcionan un sistema modelo que hemos utilizado con éxito para estudiar laPapel de TSLP en hematopoyesis normal y maligna.
Introduction
Los xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX) son un poderoso modelo in vivo para estudiar la producción de células hematopoyéticas normales y malignas en un medio mamífero "nativo". La mayoría de las veces, PDX se producen inyectando o trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. La producción de PDX usando células madre hematopoyéticas humanas normales permite estudios in vivo de la sangre humana normal y el desarrollo de células inmunes. El PDX producido a partir de leucemia u otras células cancerosas hace posible estudiar mecanismos oncogénicos e identificar terapias eficaces en el contexto de la gama de paisajes genéticos y mutaciones presentes en la población humana. 1 Por lo tanto, PDX son el patrón oro actual para la investigación biomédica traslacional para identificar terapias eficaces y una herramienta importante para comprender los mecanismos de progresión del cáncer. Los modelos PDX son una herramienta esencial para ayudar a la investigación de enfermedades de disparidades de salud Lesiones genéticas o cualquier enfermedad en la que las variaciones del paisaje genético de un paciente puedan contribuir sustancialmente a la oncogénesis y los resultados del tratamiento.
Ratón-humano PDX modelos son posibles porque muchas citoquinas de ratón adecuadamente imitar sus análogos humanos en la activación de los receptores de citoquinas de las células humanas mientras están dentro del ratón. Por ejemplo, la interleucina-7 (IL-7) proporciona una señal crítica para el desarrollo de células B humanas. 2 En este caso, IL-7 de ratón tiene homología suficiente con IL-7 humana que la citoquina de ratón estimula vías de señalización en precursores de células B humanas. Sin embargo, este no es el caso de la linfopoyetina estromal tímica (TSLP) 5 , 6 que entre otras citoquinas (IL-3, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de células madre (SCF) ,Ref "> 7 es importante para la producción de células hematopoyéticas humanas normales y malignas Cuando las citoquinas humanas y de ratón muestran una baja homología, las citoquinas de ratón no activan sus respectivos receptores en células humanas Para superar este obstáculo se han utilizado varias estrategias Para diseñar la expresión de citoquinas humanas en ratones PDX.Estos incluyen la inyección de citoquinas humanas recombinantes, la inyección hidrodinámica de ADN, la expresión lentiviral, la expresión transgénica y la sustitución del gen knockin.7 Este informe describe un método para la ingeniería de PDX para producir citoquinas humanas a través de la medicación estromal Cytokine entrega ( Figura 1 ].
En el método demostrado aquí, los ratones PDX son modificados genéticamente para expresar la citoquina humana, TSLP, o para servir como controles de citoquinas negativas. Los PDX que expresan TSLP se consiguen mediante inyecciones intraperitoneales semanales de células estromales que se han transducido para expresar niveles elevados de TSLP humana.Los ratones "control" de PDX negativos para citoquinas están diseñados de forma similar; Aunque el estroma de control se transduce con un vector de control. Este método logra niveles fisiológicos normales de TSLP humano en ratones PDX inyectados con el estroma TSLP +. No se observa TSLP detectable en ratones PDX que reciben el estroma negativo de citoquina. Hemos seleccionado la línea de células estromales humanas HS-27A para nuestros estudios, ya que crece fuertemente en el cultivo y muestra muy bajo nivel de producción de citoquinas que no apoya la proliferación de células progenitoras aisladas en cocultures. 8 Para la expresión de TSLP humano, el estroma se transdujo con un vector lentiviral autoinactivante de generación avanzada derivado de un esqueleto previamente descrito 9 , e incluye el elemento cPPT / cts y el elemento regulador post-transcripcional de hepatitis de la marmota (WPRE) para aumentar la expresión del transgén. El gen TSLP humano se construyó en este vector bajo el control del factor de elongación-1(EF-1) para conseguir una expresión robusta, constitutiva y de largo plazo.
La ingeniería de este modelo PDX humano-citocina mejorada consta de 4 pasos principales. Primero, el estroma transducido se expande in vitro y se evalúa mediante el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para una producción de citoquinas estable y de alto nivel. En segundo lugar, se verifica la actividad de la citoquina humana producida por las células estromales transducidas (y la falta de actividad de citoquinas del estroma de control) usando citometría de flujo fosfórico. Las líneas celulares conocidas por ser sensibles a citoquinas de interés (en este caso, TSLP) se incuban con sobrenadante de células estromales y se ensayan para la fosforilación inducida por citoquinas. En tercer lugar, los ratones se inyectan con estroma humano transducido y luego el plasma de ratón se evalúa por ELISA para los niveles de citoquina humana sobre una base semanal. Cuarto, las células hematopoyéticas humanas se transplantan y los efectos funcionales in vivo de la citoquina humana se evalúan sobre un objetivo conocido ( La administración de citoquinas humanas a través de células estromales ofrece ventajas y desventajas cuando se compara con otros métodos de liberación / producción de citoquinas humanas en ratones PDX. Comparado con la inyección de citoquina humana recombinante, el parto mediado por estroma es generalmente menos costoso (el costo del cultivo de células estromales es menor que el costo de la citocina recombinante) y menos intensivo de mano de obra (una inyección por semana versus múltiples inyecciones por semana). La cuestión de la vida media de citoquinas corto también se mitiga ya que el estroma produce continuamente la citoquina exógena. La administración de citoquina mediante inyección hidrodinámica de ADN puede ser menos costosa que la administración a través del estroma. Sin embargo, es similarmente transitorio y puede requerir más habilidad técnica que la simple inyección intraperitoneal semanal requerida para la administración mediada por estroma. La expresión del gen lentiviral en el ratón puedeNsient método de entrega de citoquinas; Sin embargo, en nuestras manos no se lograron niveles fisiológicos de TSLP. Además, este método es de mano de obra intensiva, que requiere la producción continua de vector lentiviral. Ratones transgénicos o knock-in ofrecen expresión a largo plazo estable de citoquina y pueden ser diseñados para la expresión específica de tejido, lo que puede ser una ventaja. Por otra parte, la expresión transgénica del gen de citoquina humana en el fondo de ratón inmunodeficiente requerido para ratones PDX, requiere una inmensa inversión de recursos antes de que se haya establecido el valor del modelo. Además, los modelos transgénicos generalmente no permiten la opción de variar el tiempo de iniciación de citoquinas o el nivel de producción de citoquinas in vivo . Estos pueden lograrse con la administración mediada por estroma simplemente cambiando el punto de tiempo para la iniciación de la inyección de células estromales o la dosis de células estromales inyectadas. El método de suministro de citocinas mediado por células estromalesOd detallado aquí se utilizó para desarrollar PDX para evaluar el papel de TSLP en el desarrollo de células B humanas normales 4 , 6 y de alto riesgo de células B leucemia linfoblástica aguda. 6 Este método proporciona un método alternativo de administración de citoquinas para su uso en la generación de modelos similares con citocinas humanas distintas de TSLP. Este modelo también puede ser útil para generar datos preliminares que pueden ayudar a determinar si el valor de una citoquina transgénica o citoquina knock-in PDX modelo sería digno de la inversión de tiempo y dinero sustancial. 
Figura 1: Modelo PDX diseñado para producir citoquina humana exógena en ratones. ( 1B ) Obtención de células humanas (células madre hematopoyéticas, células leucémicas, etc. ) para generar ratones PDX (xenoinjerto derivado del paciente). ( 2A ) Inyectar el estroma de ingeniería y ( 2B ) transplantar células humanas en ratones inmunodeficientes según el programa experimental. ( 3A-B ) Monitorear las concentraciones de citoquinas en el sobrenadante de estroma y el plasma de ratón mediante ELISA. ( 4 ) Cosecha de células humanas y evaluar los efectos funcionales in vivo de la citocina humana presente en el PDX. Haga clic aquíPara ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Los estudios se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Loma Linda y de acuerdo con todas las directrices federales.
PRECAUCIÓN: El PDX y los tejidos humanos deben ser manipulados de acuerdo con los procedimientos de seguridad para prevenir la transmisión de patógenos transmitidos por la sangre.
1. Cultivo y Expansión de Células Estromales Transducidas por Citoquinas
NOTA: Cada vez que se pasa el estroma, se recolecta el sobrenadante del cultivo (alícuota de 1 ml) y se almacena a -80 ° C para la cuantificación futura del nivel de citoquinas mediante el ensayo ELISA.
- Preparar el medio de cultivo R10 y el medio de congelación como se describe en la Tabla de Materiales.
- Generar 10 , 11 u obtener el estroma de control (transducido con vector vacío) y el estroma productor de citocinas (TSLP +)."> 6 Almacenar en nitrógeno líquido (LN 2 ) hasta su uso Descongelar las células del estroma según se describe 12 y plancharlas en 5 ml de medio R10 en matraces de cultivo celular T-25 separados Las células de cultivo en una incubadora a 37ºC con 5% CO 2. Esto es post-thaw "paso # 1".
- Una vez que el estroma es confluente (24-48 h), se pasan las células por tripsinización usando 1 x tripsina EDTA (0,25%) y se vuelve a depositar en un matraz de cultivo T-150. Esto es post-thaw "paso # 2".
- Cuando el estroma alcanza la confluencia en los frascos T-150 (3-4 días más tarde), pasa las células por tripsinización. Utilice esta suspensión celular para las necesidades experimentales.
- Expansión celular a múltiples frascos
- Dividir las células cosechadas entre tres matraces T-150 y cultivar hasta confluir. Repita este paso si la expansión del estroma es necesaria. El recuento de células típicas del estroma humano (HS-27A) en la confluencia en un matraz T-150 es ~ 5 x 10 6 .
- CélulasTortura
- Transferir la suspensión de células cosechadas a un tubo cónico y centrifugar a 500 xg durante 5 min, decantar el sobrenadante y resuspender las células en medio de congelación. Congelar y almacenar en LN 2 ~ 1,5 x 10 6 células por vial.
- Para las inyecciones de estroma intra-periotoneal en ratones, proceda al paso 4.1.
- Expansión celular a múltiples frascos
2. Ensayos ELISA para monitorizar la producción de citocinas in vitro a partir del estroma transducido
- Compre el kit de ensayo ELISA comercialmente disponible para detectar la citoquina de interés.
- Descongele el sobrenadante de las células del estroma del estroma productor de citocinas y productoras de citocinas (TSLP +) cosechado en los pasajes temprano, medio y tardío ( Figura 2 ).
- Determine la concentración de TSLP en muestras sobrenadantes usando un kit ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 13 Compilar estos datos en serie para controlar la estabilidad de la producción de citoquinas durante la célula cultur E ( Figura 2A - B ).
- Identificar y descartar el estroma productor de citoquinas con expresión de citoquinas reducida o subóptima, así como cualquier viales correspondientes almacenados ( Figura 2A-B ).
- Identificar y mantener un estroma productor de citocinas que demuestre concentraciones estables de citocinas de alto nivel. Utilice estos deshielos para experimentos.
- Utilizar el kit ELISA para monitorear rutinariamente el estroma a lo largo de la duración del cultivo celular (al menos 1 vez durante los pasos tempranos, medios y posteriores al descongelamiento) para asegurar la producción estable de citoquinas o, en el caso del estroma control, la ausencia de producción de citoquinas .
3. Ensayos de citometría de flujo fosfórico para evaluar la actividad de la citoquina producida por Stroma
NOTA: Evaluar el sobrenadante del estroma manipulado antes del primer experimento para verificar la bioactividad relevante de la citocina generada por estroma para el experimento individual.Ef "> 6 Una vez validado el estroma de ingeniería, no es necesario realizar más pruebas a menos que se introduzcan estromas que se hayan producido con un nuevo vector.
- Comprar líneas celulares de leucemia MUTZ5 y / o MHH-CALL4 (sensibles a TSLP), 14 citoquinas humanas recombinantes y anticuerpos aprobados para su uso en ensayos de citometría de flujo fosfórico para detectar dianas de fosforilación apropiadas aguas abajo.
- Descongelar el sobrenadante recogido del control y el estroma que expresa las citoquinas.
- Plantear las líneas celulares de leucemia en medio R20 (véase tabla de materiales ) a una concentración de 0,2 x 106 células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Placa 3 pozos por condición para permitir los ensayos triplicados. Incubar durante 2 h a 37 ° C. Este tiempo permite la pérdida de cualquier fosforilación que ocurrió durante las condiciones de cultivo anteriores.
NOTA: 12 pocillos por línea celular proporcionan ensayos triplicados para cada condición experimental mostrada en el paso 3.4. <Después de 2 h en cultivo, transferir las células de cada pocillo a tubos separados de 4 ml y centrifugar a 500 xg durante 5 min, a 4ºC. Decantar el sobrenadante. - Suspender de nuevo las células en 200 μl para cada una de las siguientes condiciones experimentales (realizar ensayos en triplicado): 1) medio de control negativo solo, 2) medio de control positivo con citoquina recombinante a concentración (s) saturada (TSLP a 15 ng / ML, etc. ), 3) control del estroma-sobrenadante del estroma de control, y 4) citoquina-estroma-sobrenadante del estroma productor de citoquina.
- Incubar las células durante la duración especificada por fosfo-ensayo comercial específico ( por ejemplo, 30 min para fosfo-STAT5 en MUTZ5 o MHH-CALL4 en respuesta a TSLP).
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C y decantar el sobrenadante.
- Efectúe una tinción con citometría de flujo fosfórico según el protocolo del fabricante y recoja los datos de citometría de flujo. 15
- Puerta sobre células intactas basadas en dispersión de luz directa (FSC, indica tamaño de célula) y lateral (SSC, indica granularidad celular).
- Determine la intensidad fluorescente mediana (MFI) de las células intactas en cada muestra. Comparar la IMF promedio obtenida a partir de los valores triplicados de sobrenadante de células estromales con el de controles de medios positivos y negativos.
4. Inyección de Stroma transducido por citoquinas en ratones
NOTA: Cultive el estroma HS-27A durante un mínimo de 3 post-deshielo antes de inyectarlos en ratones para asegurar células sanas y producción adecuada de citoquinas.
- Preparación del estroma
- Transferir la suspensión de células estromales cosechadas a un tubo cónico y una alícuota de 10 μl para el recuento de hemocitómetro; Obtener recuento de células vivas utilizando azul trypan. 16 Centrifugar el ce restanteL de suspensión a 500 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante de las células sedimentadas y resuspender suavemente las células en el volumen necesario de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) para inyección de ratón (dependiendo del número de ratones a inyectar).
NOTA Concentración típica de células estromales para la inyección de ratón: 0,5 x 10 6 -5 x 106 células por ratón en 200 μl de PBS. - Mantenga la suspensión de las células del estroma a 4 ° C (o sobre hielo) hasta inmediatamente antes de la inyección. Asegúrese de que la suspensión celular esté por lo menos a temperatura ambiente (RT) (~ 25 ° C) para la inyección de ratones.
- Inyección de células estromales
- Desinfecte la campana de seguridad biológica, monte los materiales para inyecciones y luego coloque la jaula del ratón dentro.
- Mezclar suavemente la suspensión de células por inversión antes de extraer 200 μl en una jeringa de tuberculina.
- Usando técnicas de inyección intraperitoneal estándar, 17Restringir el ratón y administrar la suspensión celular de 200 mu l en la cavidad peritoneal. Los detalles han sido previamente demostrados por Machholz et al. 18
5. Colección de sangre en serie y monitorización de plasma para citoquina humana exógena en ratones
- Recolección de sangre mediante el recorte de la cola
- Desinfecte la campana de seguridad de la biotecnología y ensamble el contenedor del ratón, las tijeras y otras herramientas / suministros para el procedimiento.
- Coloque el ratón en un contenedor y asegure el tubo para minimizar el movimiento del ratón.
- Desinfecte la cola y las tijeras quirúrgicas con alcohol isopropílico. Aplicar crema anestésica tópica en la cola.
- El uso de tijeras quirúrgicas muy afiladas recorta alrededor de 0,5 a 1 mm de la punta de la cola del ratón. Recoger aproximadamente 80 μl de sangre periférica usando tubos capilares heparinizados.
NOTA: Si la sangre se recolecta con este método más de seis tiMes, la eliminación de la cola debe ser conservadora con respecto a la cantidad de cola eliminada. A medida que los cortes progresan hacia arriba de la cola, el diámetro aumenta, las hemorragias son más rápidas y la cicatrización tarda más.
- Separación de plasma
- Transferir la sangre con una jeringa de bulbo (para expulsarla de los tubos capilares) en un tubo de microtainer K 2 EDTA marcado; Invertir 20 veces para evitar la coagulación.
NOTA: Por lo general, la coagulación de la sangre por el pinchazo de la cola es rápida. Sin embargo, si la hemorragia persiste más de ~ 2 min use un lápiz o un polvo estéril para ayudar a la coagulación. - Centrifugue los tubos de recogida de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante y alícuota del plasma para su almacenamiento (-20 ° C) hasta que esté listo para el ensayo ELISA.
- Si se necesitan datos de quimerismo de células ratón-humanos de la sangre del ratón, entonces se trata el sedimento restante como se describe en el paso 6.3.1. De lo contrario, descarte el sedimento de células sanguíneas.
- Transferir la sangre con una jeringa de bulbo (para expulsarla de los tubos capilares) en un tubo de microtainer K 2 EDTA marcado; Invertir 20 veces para evitar la coagulación.
- ELISA modificado para microvolumeDe plasma de ratón
NOTA: El procedimiento de ELISA del fabricante se modificó desde el volumen de muestra recomendado de 100 mu l a un volumen de 40 mu l para acomodar los microvolúmenes recogidos de ratones. No es posible ejecutar las muestras de plasma de ratón in vivo por triplicado con estos volúmenes limitados. Al final del experimento se recogen 500 μL de sangre post-mortem mediante punción cardiaca. Las concentraciones de citoquinas evaluadas en 100 μl de plasma de eutanasia se utilizan para validar los datos in vivo de 40 μl para cada ratón.- Descongele las muestras congeladas de plasma de ratón.
- Se diluyen seriamente los patrones de ELISA y se plaquean por triplicado a 40 μL por pocillo.
- Añadir 40 μL de cada muestra de plasma de ratón a la placa ELISA.
NOTA: Si una muestra de ratón es inferior a 40 μL, a continuación, aumente el volumen hasta 40 μl con tampón ELISA. Registre este volumen de diluyente y utilícelo para calcular un factor de dilución para cada muestra diluida. CuandoEl análisis de los datos de ELISA multiplica la concentración de la muestra diluida por el factor de dilución de la muestra para determinar la concentración real de citocinas en la muestra original. - Ensayo ELISA completo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Trasplante de células hematopoyéticas en ratones
- Sublethal irradiación para condicionar la médula ósea para el trasplante
NOTA: La Universidad de Loma Linda (LLU) utiliza una fuente de radiación Cobalt-60. Los animales se colocan en un contenedor de pasteles que está situado a 80 cm de la fuente de radiación en un campo de 20 x 20 cm y con una capa de Lexan de 0,5 cm sobre la parte superior del dispositivo de retención. El tiempo de exposición se calcula para lograr una dosis de 225 cGy basada en la calibración más reciente de la fuente (actualmente 2-3 min para esta fuente).- Submetal irradian ratones (dosis de irradiación corporal total de 225 cGy máximo para ratones inmunodeficientes).
- Transplante de células hematopoyéticas ~ 24 h más tarde vía </ Em> inyección intravenosa de la vena de la cola.
- Trasplante de células hematopoyéticas intravenosas
- Preparar suspensiones de células humanas para trasplante en un volumen de 200 μl de PBS estéril por ratón: células madre hematopoyéticas CD34 + (HSC): 1 x 10 5 a 5 x 10 5 células por ratón y líneas de células de leucemia / muestras de pacientes: 1 x 10 6 a 5 x 106 células por ratón.
- Mantenga las células a 4 ° C (transporte en hielo) hasta inmediatamente antes del trasplante. Asegúrese de que las células estén al menos a RT antes del trasplante.
- Desinfecte la campana de bioseguridad y prepare el área de la campana para inyecciones de trasplante.
- Coloque el ratón en la jaula de calentamiento durante al menos 5 minutos para permitir la dilatación de las venas de la cola.
- Mezclar suavemente la suspensión celular y extraer 200 μl en una jeringa de tuberculina. Deje la aguja en un lugar seguro donde permanecerá estéril.
- Coloque el ratón en una restricción y desinfectar la cola con alcohol isopropílico. <Li
- Usando técnicas de inyección intravenosa estándar, 17 inyectan la suspensión de células humanas en la vena de la cola del ratón.
NOTA: Las inyecciones de vena de la cola pueden tomar varios intentos, especialmente para un manipulador de animales novatos. Kovacscics y el video JoVE de Raper 19 proporcionan una demostración detallada de esta técnica animal. - Supervise la recuperación del ratón durante ~ 5 min. Registre cualquier evento adverso durante la inyección ( por ejemplo , células derramadas, hemorragia mayor, trauma excesivo de la cola).
- Análisis del quimerismo celular humano en sangre periférica de ratón
- Obtener el sedimento de células sanguíneas que permanece en el tubo microtainer después de la separación del plasma (paso 5.2.3).
- Para la lisis de glóbulos rojos (RBC), resuspenda el sedimento de sangre restante en un volumen de PBS igual al plasma extraído (para reemplazar el volumen de plasma) y mezcle bien (vórtice / pipeta).
- Transferir cada muestra de sangre resuspendida a un tubo de 4 mL marcadoY luego a~nadir tampón de lisis de RBC a cada tubo en una proporción de 1: 9 (900 μl de tampón de lisis de RBC para 100 μl de sangre resuspendida). Incubar durante 5 min a RT. Centrifugar (5 min, 500 xg) y decantar.
- Realizar la segunda incubación del tampón de lisis de RBC (5 min a RT). Centrifugar y decantar como antes.
- Lave las células restantes en ~ 1 mL de PBS. Centrifugar y decantar como antes.
- Resuspender el gránulo en un volumen de PBS apropiado para tinción con citometría de flujo estándar (esto varía de acuerdo con el fabricante y los protocolos de laboratorio individuales). 20 Utilizar anticuerpos de inmunofenotipificación validados para la citometría de flujo para identificar células de ratón (CD45 + de ratón) y células humanas (CD45 + humano) 6 , 21 Así como marcadores adicionales de leucocitos humanos específicos del linaje celular de interés.
NOTA: Se recomienda tomar un pequeño volumen (5 μL-20 μL) de cada muestra de ratón para crear "muestras agrupadas"; A utilizar para las muestras de control no teñidas, de viabilidad y de isotipo. Es la mejor práctica tener controles de isotipo y sin manchas para cada condición experimental.
7. Evaluación funcional de la actividad de las citoquinas in vivo
- Eutanasia y cosecha de tejidos
- Eutanasia de ratones vía asfixia con CO 2 en el punto de tiempo experimental designado.
- Cosecha de sangre mediante punción cardiaca y recolección de plasma según los pasos 5.2.1-5.2.2.
NOTA: Recoja la sangre antes de otros tejidos porque comienza a coagular inmediatamente después de la muerte. - Procesar la sangre del ratón, alícuota y almacenar el plasma como en el paso 5.2.2.
- En un momento posterior, evaluar la concentración de citoquinas exógenas en el plasma obtenido en la eutanasia mediante ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Evaluar y comparar las concentraciones de citoquinas exógenas en el plasma de ratón de la serie in vivoLa recolección de sangre y las muestras de plasma de eutanasia (descritas en la sección 5.3).
- Añada PBS a la muestra de sangre restante para reemplazar el volumen y proceso del plasma como se describe en los pasos 6.3.1 y 6.3.2. Realizar análisis de citometría de flujo de inmediato o resuspender las células en el medio de congelación para el almacenamiento de LN 2 .
- Cosecha de médula ósea (BM) y el bazo de ratones PDX y preparar suspensiones de células individuales como se describió anteriormente. 22
- Obtener el recuento de células para cada muestra de tejido de ratón PDX usando ácido acético al 3% con azul de metileno (lisa las membranas celulares y los glóbulos rojos dejando núcleos intactos de células vivas) en una dilución 1: 1 y cuente las células usando un hemocitómetro. Tabular los recuentos totales de células para muestras de médula ósea y bazo para cada animal.
- Centrifugar (500 xg, 15 min) suspensiones de células y decantar el sobrenadante. Realizar análisis de citometría de flujo de la médula ósea y / o células del bazo inmediatamente o resuspender en medio de congelación para LN <Sub> 2 almacenamiento.
NOTA: Congelar 10 alícuotas de BM (para futuros ensayos bioquímicos) y ~ 5 alícuotas de bazo (para futuros trasplantes de PDX) por ratón. - Inmunofenotipificación para identificar efectos funcionales in vivo
- Preparar una mezcla maestra (MM) de anticuerpos de citometría de flujo para inmunofenotipo de población (s) hematopoyética (s) que responden a la citoquina de interés y un segundo MM de anticuerpos de control de isotipo ( Figura 5 y Tabla de Materiales).
- Descongelar partes alícuotas de tejido PDX (baño de perlas a 37ºC) preparadas en la etapa 7.4.
- Lave las células descongeladas transfiriéndolas a un tubo cónico y añadiendo al menos 3 veces el volumen de PBS. Centrifugar (500 xg, 5 min) y decantar el sobrenadante.
- Repita el paso de lavado (7.5.3).
- Crear alícuotas agrupadas tomando ~ 10 μL-20 μL de células de cada muestra de PDX para el control sin teñir, el control de viabilidad, y los controles de isotipo (véase el paso 6.4.6 nota). Mancha todas las muestras, excepto el uCon un colorante de viabilidad fijable (marcador de células muertas), se incuba y se lava de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Mancha cada muestra de células PDX con fenotipificación-MM de acuerdo con el protocolo de tinción de citometría de flujo estándar; Manchan de manera similar la (s) muestra (s) de control de isotipo agrupada con el isotipo-MM. Incubar todas las muestras, lavar con PBS, y fijar las muestras por re-suspender en paraformaldehído al 1%.
- Recopilar datos de citometría de flujo y analizar los datos utilizando una estrategia adecuada para la (s) población (es) de células de interés ( Figura 5 ). Una puerta típica es la siguiente:
- Definir las células intactas mediante el dibujo de una puerta FSC y SSC que excluye los desechos.
- Identificar la población de células vivas gating en las células que son negativas para el marcador de células muertas (esto es el "total de células vivas").
- Utilizar sub-puertas dentro de las "células vivas totales" para definir las poblaciones de células con el inmunofenotipo deseado (ver Figura 5).
- Obtener elFrecuencia de las poblaciones de células de subconjuntos dentro del recuento de células vivas totales de análisis de citometría de flujo. 6 , 21
- Calcular el número de células diana en cada tejido multiplicando la frecuencia del subconjunto de células B, dentro de las células vivas totales (obtenidas en el paso 7.5.6.4) por el recuento de células vivas totales por tejido obtenido en el paso 7.3 (% del subconjunto de células B x " Hemocitómetro de células ", véase la Tabla 1 )
- Comparar los recuentos celulares de poblaciones de células diana entre ratones PDX de control y ratones PDX que expresan citocinas (TSLP +) para determinar los efectos funcionales in vivo de la citoquina humana exógena ( Tabla 1 ).
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Representative Results
En la Figura 1 se muestra una visión general del modelo. Una vez que se han obtenido citocinas productoras (TSLP + estroma) y estroma de control se expanden en cultivo. Antes de la inyección de estroma en ratones, el sobrenadante de células estromales se evalúa por ELISA para verificar la producción de citoquinas ( Figura 2 ) y la citometría de flujo fosfo (Protocolo # 3) se utiliza para verificar la actividad de la citoquina producida por el estroma. El sobrenadante se recoge a partir de cultivos de células estromales confluentes (estroma de control y TSLP + estroma) cuando se pasan las células. ELISA se usa para monitorear la concentración de TSLP en el sobrenadante al menos una vez durante los pasajes temprano, medio y tardío. Los datos representativos del estroma de control se muestran en la Figura 2A . Se deben descartar los cultivos de células estromales de control que muestren la expresión de TSLP (y cualquier viales congelados de ellos). Los cultivos de control con TSLP indetectable se expanden y se congelan para uso futuro.Como se muestra en la Figura 2B , se descartan cultivos de TSLP + estroma mostrando una producción de bajo nivel de TSLP (y viales congelados a partir de ellos). TSLP + estroma que muestra estable, de alto nivel de producción de la citoquina se seleccionan para la expansión y almacenamiento para su uso en futuros experimentos. Los niveles medios de TSLP en sobrenadante de múltiples cultivos de control y TSLP + estroma se muestran en la Figura 2C .
La línea temporal temporal para la producción de ratones PDX de control con citoquina humana se muestra en la Figura 3 . Los cultivos de células estromales se inician 3 semanas antes del trasplante y el ensayo ELISA de la producción in vitro de TSLP en sobrenadante de cultivo se lleva a cabo como se describe en la Figura 2. El TSLP humano in vivo en el plasma de ratón se monitorea semanalmente ( Figura 4 ) Micro-volúmenes de plasma de ratón "descritos en el Protocolo # 4. PeripheraL de sangre se recoge simultáneamente con plasma y se ensaya como se describe en el Protocolo nº 6 bajo "Análisis del quimerismo de células humanas en sangre periférica de ratón". PDX inyectado con el estroma de control mostró consistentemente los niveles de TSLP humano en plasma que están por debajo del umbral para la detección ( Figura 4A ). El nivel plasmático de TSLP en ratones PDX inyectados con estroma TSLP + es proporcional al número de células estromales TSLP + inyectadas durante las 1 - 2 semanas anteriores. Los niveles plasmáticos de TSLP disminuyen rápidamente si se interrumpen las inyecciones de células estromales. 6 Como se observa en la Figura 4B , las inyecciones semanales de 0,5 x 10 6 TSLP + estroma (que producen en promedio> 1.000 pg / ml de TSLP en sobrenadante de cultivo) dieron niveles de TSLP en plasma cerca del límite inferior de niveles fisiológicos (~ 5-10 pg / mL ). La inyección semanal de 5 x 10 6 TSLP + estroma en ratones PDX dio como resultado niveles de TSLP en plasma que alcanzan altos niveles fisiológicos (~ 35 pg / mL) como se muestra en
Se ha demostrado que TSLP aumenta la producción de precursores de células B humanas normales. Por lo tanto, para evaluar la función in vivo de TSLP comparamos el producto De los precursores de células B humanas normales en ratones control y TSLP + PDX trasplantados con células madre hematopoyéticas como se muestra en la Figura 5 y en la Tabla 1 . La Figura 5A muestra el gating de citometría de flujo para inmunofenotipificación usado para identificar subconjuntos de células de linaje B humanas. Los cálculos de ejemplo para enumerar el número de células en cada subconjunto para un PDX de control y un TSLP + PDX se muestran en la Tabla 1 . Como se muestra en la Figura 5B, las células de linaje B están significativamente aumentadas en TSLP + en comparación con PDX de control y este aumento comienza con los precursores de células B más tempranas (células pro-B). El número de células de linaje no B no fue significativamente diferente entre el control y TSLP + PDX (datos no mostrados). Este ensayo proporciona una manera de verificar que la TSLP humana producida in vivo en TSLP + PDX ejerce efectos funcionales in vivo sobre una población de células diana.
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Figura 2: ELISA para monitorizar las concentraciones de citocinas TSLP en sobrenadante de Stroma. Los ensayos ELISA se usaron para medir las concentraciones de TSLP en el sobrenadante del estroma de control (transducido con el vector de control) y el estroma TSLP + (transducido para expresar TSLP humano) al menos una vez durante los siguientes pasajes celulares: temprano (paso 1-5), medio 6-12), y tarde (pasajes 13-20). El umbral de detección para el ensayo ELISA humano de TSLP usado aquí es de 1,9 pg / ml (línea roja discontinua). ( A ) El estroma de control produce concentraciones de TSLP humano mínimamente detectables; Estos niveles están generalmente por debajo del umbral de detección de ELISA durante la duración del experimento. Se descarta el estroma de control en cultivo que muestran concentraciones crecientes de TSLP (> 15 pg / mL) junto con todas las alícuotas congeladas de ese cultivo. ( B ) La producción de TSLP humano varía entre cultivos generados a partir de diferentesT descongelados de TSLP + estroma ( n = 9) ya lo largo del período de cultivo. TSLP que muestran disminución o inestabilidad de la producción de citoquinas (TSLP <1.000 pg / mL) también se descartan. ( C ) Concentraciones promedio de TSLP para el control (verde) y TSLP + (azul) estroma (medios y intervalos de confianza del 95%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Línea de tiempo experimental para generar ratones PDX con producción de citoquinas humanas exógenas. Las porciones in vitro e in vivo del experimento progresan simultáneamente. El cultivo de células de estroma control y + TSLP se inicia 2-3 semanas antes del trasplante de células hematopoyéticas, lo que asegura un mínimo de 3 pasajes celulares antes de la primera (aWk -1) de las inyecciones semanales de células estromales. Esto asegura que las células del estroma son sanas, proliferativas y producen niveles adecuados de citoquinas. Las alícuotas del sobrenadante se recogen cuando las células se pasan y los ensayos ELISA se usan para determinar la concentración de TSLP (véase la Figura 2 ) en el sobrenadante del estroma. Los animales se irradian al día 0, un día antes del trasplante de células hematopoyéticas humanas en el día 1. La recogida semanal de sangre comienza 1 a 2 semanas después de las primeras inyecciones de estroma. En este momento, las concentraciones exógenas de citoquinas humanas deberían ser detectables en el plasma de ratón usando ensayos ELISA modificados ( Figura 4 ). El punto final del experimento es de 5 a 16 semanas después del trasplante de células humanas; Esto depende de la cantidad de quimerismo de células humanas detectado en sangre periférica de ratón. La hematopoyesis normal suele estar bien establecida en la semana 5-7, el quimerismo de células de leucemia varía entre líneas celulares y muestras primarias (3-16 semanas). El éxito y progresión del trasplante PDX también dependeEn el número de células humanas inyectadas en el trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Obtención de concentraciones fisiológicas de citocinas TSLP humanas en plasma de ratón. Los ratones reciben inyecciones intraperitoneales semanales (200 μl) de células transducidas y su plasma se recoge para evaluar las concentraciones de TSLP humana (ensayo ELISA) in vivo en los ratones con el tiempo. Los ratones " Control" recibieron 5 x 106 células estroma de control, mientras que los ratones "TSLP + bajo" (dosis baja de estroma TSLP) recibieron 0,5 x 10 ^ { 6 } células TSLP + estroma y los ratones TSLP + alto recibieron 5 x 10 6 TSLP + células estromales cada semana. El ensayo ELISA humano de TSLP El umbral de detección es de 1,9 pg / mL (línea roja discontinua) y el rango fisiológico humano de TSLP es ~ 5 a 35 pg / mL (sombreado gris). 24 (Datos de referencia 11 y Coats inéditos) ( A ) El plasma de ratón "control" tiene consistentemente niveles de TSLP <5 pg / mL o por debajo del umbral de detección de ELISA. ( B ) El plasma de ratón "TSLP + bajo" muestra niveles fisiológicos bajos de TSLP; Mientras que ( C ) el plasma de ratón "TSLP + alto" muestra altos niveles fisiológicos. ( D ) Las concentraciones medias de TSLP para cada grupo experimental (media ± SEM de todos los ratones y puntos de tiempo) muestran que los niveles de TSLP detectados en plasma de ratón son proporcionales a la dosis de estroma recibida; Los niveles plasmáticos de ratones control están por debajo del umbral de detección de ELISA y los niveles plasmáticos "TSLP + altos" son cuatro veces mayores que los niveles plasmáticos de ratones "TSLP + bajos"."> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo de poblaciones de células B humanas normales Validar I n efectos funcionales Vivo de TSLP humana exógena en ratones PDX. Los ratones PDX fueron manipulados con control y estroma TSLP + y trasplantados con células CD34 + humanas aisladas de sangre de cordón umbilical. Se usó inmuno-fenotipificación por citometría de flujo para identificar subconjuntos de precursores de células B humanas en médula ósea cosechada del control y TSLP + PDX como sigue: medula espinal cosechada, descongelada y teñida con colorante de viabilidad fijable y teñida para citometría de flujo para detectar anticuerpos anti- Humana, CD45, CD19, CD34, κ y λ , y IgD de superficie e IgM o IgM intracelular (cμ). ( A ) Total living celLs fueron gated basado en un marcador de viabilidad. Las parcelas sucesivas muestran puertas subsiguientes para identificar subconjuntos de linaje B secuencialmente desarrollados (los datos mostrados son de TSLP + PDX). ( B ) La frecuencia de cada subconjunto dentro de las células vivas totales se determinó mediante software de citometría de flujo y se calculó el número de células en cada subconjunto de células B. (Ver Tabla 1). Se grafican los recuentos de células para cada subconjunto de células B en control (negro, n = 3) y TSLP + (azul, n = 5). (Media ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Población de células humanas | Freq. De Total de células vivas | Conteo de células vivas iNbm | # Células en la población |
| Control de ratón | |||
| Total de células vivas | 100,00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| HCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Total CD19 + | 27,20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24,20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Preb | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 10 6 |
| Inmaduro B | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Maduro B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 10 6 |
| TSLP + Ratón | |||
| Total de células vivas | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| HCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| Total CD19 + | 65,10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60,20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Preb | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Inmaduro B | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 10 6 |
| Maduro B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 10 6 |
Tabla 1: Frecuencia y Recuentos de Subgrupos de Células B humanas normales en médula ósea PDX. La frecuencia (%) de cada subconjunto de células B dentro de las células vivas totales se determinó por análisis de citometría de flujo (véase la Figura 5A para la estrategia de gating). Los datos representativos de médula ósea (BM) de un ratón PDX de control (recibieron inyecciones de estroma de control, 5 x 106 células / semana) y un ratón TSLP + PDX (recibieron inyecciones de estroma TSLP, 5 x 10 6 células / semana). Se registró el recuento total de células BM vivas en la eutanasia y se utilizó citometría de flujo de fenotipificación inmune para evaluar la frecuencia del subconjunto (%) y calcular el tamaño de cada población de subconjuntos de células B (subconjunto de células =Células vivas "x" frecuencia del subconjunto ").
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Discussion
Este manuscrito describe un método simple, rápido y relativamente rentable para la ingeniería de PDX para expresar la citoquina humana exógena. La estrategia descrita aquí se basa en inyecciones intraperitoneales semanales de una línea celular de estroma transducida para expresar la citocina humana, TSLP. Antes de realizar los métodos descritos aquí, se generó estroma manipulado para expresar altos niveles de la citoquina de interés (TSLP) y estroma control controlado de forma similar. En los protocolos presentados aquí, el estroma se expande en el cultivo y se examina la capacidad para proporcionar una producción estable de citoquinas de alto nivel a lo largo del tiempo (o para la ausencia de producción de citoquinas en el caso del estroma de control). Se realizaron ensayos para verificar la actividad de la citoquina generada por estroma y se desarrollaron cronologías experimentales para la inyección de células estromales para producir PDX con TSLP fisiológica humana (y ratones control que carecen de TSLP humano). Procedimientos para el monitoreo de los niveles plasmáticos de TSLPPara verificar sus efectos funcionales in vivo sobre las poblaciones de células que responden a citoquinas.
Se deben considerar varios factores en la selección de células estromales y vectores que se utilizarán en los protocolos presentados aquí. Las líneas celulares estromales no deben producir endógenamente altos niveles de citoquina, y no deben responder a la citoquina de interés. Para estudios aquí, la línea celular de estroma de médula ósea humana, HS-27A, fue seleccionada porque crece robustamente en cultivo con producción de citoquinas de bajo nivel. 8 El método descrito aquí también incluye PDX de "control" diseñado con el mismo estroma como TSLP + PDX, pero sin sobreexpresión de TSLP. Las comparaciones de los resultados en TSLP + y PDX control nos permiten controlar para cualquier efecto debido a la producción endógena de citoquinas de células estromales. La transducción de células estromales con vectores que incluyen proteínas fluorescentes u otros marcadores seleccionables puede ser útil para aislar célulasSon susceptibles de sobreexpresar la citoquina de interés. Sin embargo, es esencial ensayar el sobrenadante de citoquinas para determinar el nivel de citoquina producida por las células estromales porque los niveles de citoquinas plasmáticas in vivo en ratones se correlacionan con la concentración de citoquinas en el sobrenadante de células estromales 6 , así como el número de estroma inyectado en una Semanalmente ( Figura 4 ).
Es importante que la actividad de la citoquina producida por el estroma se verifique antes de los estudios PDX. Se utilizó citometría de flujo fosfórico para analizar las moléculas fosforiladas aguas abajo de la estimulación TSLP en células que son sensibles a TSLP. TSLP activa las vías JAK-STAT5 y PI3 / AKT / mTOR. Las líneas celulares de leucemia MUTZ5 y MHH-CALL4 expresan altos niveles de los componentes del receptor de TSLP y muestran la fosforilación de STAT5, AKT y ribosomal de proteína S6 aguas abajo después de la estimulación de TSLP. 14 Aquí se utilizó citometría de flujo phophoPara evaluar la fosforilación de STAT5 (pSTAT5) inducida aguas abajo de la estimulación TSLP. En trabajos previos se evaluaron eventos adicionales de fosforilación estimulada por TSLP: fosfo-AKT (pAKT) y proteína fosfo-ribosómica S6 (pS6, cadena abajo de mTOR). Los resultados mostraron que el ensayo de pAKT es menos sensible y el pS6 más sensible que el ensayo de pSTAT5. 6 Cuando se realizan ensayos de fosfato, las células sensibles deben cultivarse con niveles de saturación de TSLP humana recombinante como control positivo y con medios solamente (no citoquina) como control negativo. El sobrenadante del estroma de control debe ensayarse a lo largo del lado de TSLP + estroma como un segundo medio de verificar (además de ELISA) que TSLP no es producido por el estroma de control. Esto también sirve como un control para asegurar que la producción de citoquinas endógenas no es responsable de la fosforilación observada en ensayos de células TSLP +. Idealmente, la fosforilación inducida a partir de muestras de estroma productoras de citoquinas debe ser similarAr que se observan con la condición de citoquina recombinante, aunque puede ser menor si la concentración de citoquina en el sobrenadante es menor que en el control positivo saturante. Un control positivo con niveles de TSLP recombinantes que coinciden con los niveles observados por ELISA para TSLP + estroma son una buena alternativa.
La identificación de indicadores funcionales conocidos de la actividad de citoquinas in vivo puede ser un reto. Los ensayos de fosforilación pueden no ser posibles porque la fosforilación inducida por la citoquina humana exógena in vivo puede perderse rápidamente durante la cosecha de tejidos. Dado que se ha demostrado que TSLP aumenta la producción de precursores de células B humanas, 23 se verificó el efecto funcional de TSLP en PDX mediante el ensayo de incrementos in vivo en la población de precursores de células B humanas usando inmunofenotipificación de citometría de flujo. Una estrategia alternativa podría ser el ensayo de específicos inducida por citoquinas cambios en la expresión génica y compariNg en células recolectadas de PDX que expresan citoquinas a células de PDX de control. 6
El objetivo final de la expresión de citoquinas humanas en PDX es generar un modelo preclínico que modelos más estrechamente el ambiente in vivo presente en los pacientes. Esto se ensayó comparando la expresión del genoma entero en tejidos humanos aislados del PDX de control y del PDX que expresa citocinas (TSLP +) PDX a las muestras de pacientes originales. Estos estudios mostraron que la expresión génica en muestras de pacientes está significativamente más cerca de las células de leucemia de TSLP + PDX que los controles. Sin embargo, nuestros estudios se centraron en la linfopoyesis. Un número de citoquinas promotoras de mieloides producidas en el ratón no activan sus homólogos de receptores humanos. Existen ratones knockin de citoquinas humanas (ratones NSGS y otros) que abordan este problema. De hecho, un valor del modelo que describimos aquí es que puede ser utilizado en ratones NSGS para crear un modelo que más closEly modela el ambiente humano in vivo expresando TSLP además de las citocinas humanas promotoras de mieloides. Por otra parte, se podría generar un sistema de citoquina +/- en ratones NSG usando el método descrito aquí para cada una de estas citoquinas promotoras de mieloides. Este modelo puede usarse para estudiar el papel in vivo preciso de cada uno de ellos en mielopoyesis y / o leucemia mieloide.
Engineered PDX que producen niveles fisiológicos de TSLP humano proporciona un modelo preclínico que imita más de cerca el ambiente in vivo presente en los pacientes de PDX clásico. 4 También se describen la producción de ratones PDX de control que están diseñados de forma similar. Juntos, el control y el PDX productor de citoquinas crean un sistema TSLP +/- modelo humano que hemos utilizado con éxito para evaluar el papel de TSLP en la producción in vivo de células B humanas normales y malignas. 4 , 6 EstoEs muy relevante para los estudios de una forma particular de alto riesgo de leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) que se caracteriza por alteraciones genéticas que conducen a la sobreexpresión de CRLF2. CRLF2 es un receptor de la citocina TSLP y por lo tanto, señalización CRLF2 inducida por TSLP probablemente contribuye a la oncogénesis y la progresión de CRLF2 + B-ALL. El uso de PDX para estudiar esta enfermedad es particularmente crítico porque PDX nos permite estudiar la leucemia en el contexto del paisaje genético del paciente. El paisaje genético como contribuyente de la enfermedad está fuertemente implicado en CRLF2 + B-ALL, que ocurre cinco veces más a menudo en niños hispanos / latinos que otros y compone la mitad de todos los casos de B-ALL en pacientes con síndrome de Down. PDX modelos que expresan TSLP humano como el que aquí se describe será una herramienta importante en la identificación de terapias y la comprensión de los mecanismos de la enfermedad de CRLF2 + B-ALL, así como para la comprensión de la hematopoyesis normal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
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