Summary
Hier beschreven is een werkwijze voor het produceren van exogeen cytokine in patiënten afgeleide xenograftmuizen via wekelijkse intraperitoneale injectie van een cytokine-getransduceerde stromale cellijn. Deze methode verruimt het nut van PDX en biedt de mogelijkheid voor transiënte of langdurige exogene cytokine-afgifte in een groot aantal PDX-modellen.
Abstract
Patiëntgerelateerde xenograftmuizen (PDX) worden geproduceerd door transplantatie van menselijke cellen in immuun deficiënte muizen. Deze modellen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van de mechanismen van normale en kwaadaardige hematopoiesis en zijn de gouden standaard voor het identificeren van effectieve chemotherapieën voor veel kwaadaardigheden. PDX-modellen zijn mogelijk omdat veel van de cytokines van de muis ook op menselijke cellen optreden. Dit geldt echter niet voor alle cytokinen, waaronder veel die kritiek zijn voor het bestuderen van normale en kwaadaardige hematopoiesis in menselijke cellen. Technieken die muizen ontwerpen om menselijke cytokinen te produceren (transgene en inklapmodellen) vereisen aanzienlijke kosten voordat het nut van het model is aangetoond. Andere technieken zijn arbeidsintensief (injectie van recombinant cytokine of lentivirus) en vereisen in sommige gevallen een hoog niveau van technische expertise (hydrodynamische injectie van DNA). Dit rapport beschrijft een eenvoudige methode voor het genereren van PDX-muizen die exogene humane cy hebbenTokine (TSLP, thymische stromale lymfopoietine) via de wekelijkse intraperitoneale injectie van stroma die zijn getransduceerd om deze cytokine te overexpressie. Gebruik van deze methode verschaft een in vivo bron van continue cytokine productie die fysiologische niveaus van circulerend humaan cytokine in de muis bereikt. Plasmaniveaus van menselijk cytokine kunnen worden gevarieerd op basis van het aantal geïnjecteerde stromalcellen, en de productie van cytokine kan op elk moment in het experiment worden geïnitieerd. Deze methode omvat ook cytokine-negatieve controlemuizen die op dezelfde wijze worden geproduceerd, maar door intraperitoneale injectie van stroma getransduceerd met een controle vector. We hebben eerder aangetoond dat leukemacellen die zijn geoogst uit TSLP-expressie PDX, in vergelijking met controle PDX een genuitdrukkingspatroon meer tonen dan het oorspronkelijke patiëntmonster. Samen vormen de cytokine-producerende en cytokine-negatieve PDX-muizen die door deze methode worden geproduceerd, een model systeem dat we succesvol hebben gebruikt om de studie te bestuderenRol van TSLP bij normale en kwaadaardige hematopoiesis.
Introduction
Patiëntgerelateerde xenografen (PDX) zijn een krachtig in vivo model voor het bestuderen van de productie van normale en kwaadaardige hematopoietische cellen in een 'native' zoogdieromgeving. Meestal worden PDX geproduceerd door injectie of transplantatie van menselijke cellen in immuun deficiënte muizen. De productie van PDX met behulp van normale humane hematopoietische stamcellen maakt in vivo studies mogelijk van normaal menselijk bloed en immuuncelontwikkeling. PDX geproduceerd uit leukemie of andere kankercellen maakt het mogelijk om oncogene mechanismen te bestuderen en effectieve therapieën te identificeren in het kader van het bereik van genetische landschappen en mutaties die aanwezig zijn in de menselijke populatie. 1 PDX is daarom de huidige gouden standaard voor translatie biomedisch onderzoek om effectieve therapieën te identificeren en een belangrijk instrument om mechanismen van kankerprogressie te begrijpen. PDX-modellen zijn een essentieel instrument om onderzoek naar gezondheidsverschillen in ziekten te voorkomen door specifieke Genetische letsels of een ziekte waarin de variaties van het genetische landschap van een patiënt aanzienlijk kunnen bijdragen tot oncogenese en behandelingsuitkomst.
Muis-menselijke PDX-modellen zijn mogelijk omdat veel muiscytokines hun menselijke analogen adequaat nabootsen bij het activeren van de cytokine-receptoren van menselijke cellen terwijl zij in de muis zijn. Interleukine-7 (IL-7) geeft bijvoorbeeld een kritisch signaal voor humane B-celontwikkeling. 2 In dit geval heeft muis IL-7 voldoende homologie met menselijke IL-7 dat het muse cytokine signaalwegen in humane B-celprecursoren stimuleert. 2 , 3 , 4 Dit is echter niet het geval voor thymische stromale lymfopoietine (TSLP), 5 , 6 die onder andere cytokinen (IL-3, granulocyt-macrofage kolonie stimulerende factor (GM-CSF), stamcelfactor (SCF) ,Ref "> 7 is belangrijk voor de productie van normale en kwaadaardige humane hematopoietische cellen. Wanneer muizen en menselijke cytokinen een lage homologie hebben, laten de muse cytokines hun respectieve receptoren niet op menselijke cellen activeren. Om dit obstakel te overwinnen is een aantal strategieën gebruikt Om expressie van humane cytokinen in PDX-muizen te manipuleren. Deze omvatten injectie van recombinante humane cytokinen, hydrodynamische injectie van DNA, lentivirale expressie, transgene expressie en knockin-genvervanging. 7 Dit rapport beschrijft een methode voor het manipuleren van PDX om menselijk cytokine te produceren via stromale Cytokine-afgifte ( Figuur 1 ).
In de hier getoonde werkwijze worden PDX-muizen ontworpen om het menselijke cytokine, TSLP uit te drukken of om te dienen als cytokine-negatieve controles. TSLP-expressie PDX worden bereikt door wekelijkse intraperitoneale injecties van stromale cellen die zijn getransduceerd om hoge niveaus van menselijke TSLP uit te drukken.Cytokine-negatieve PDX "control" muizen zijn op dezelfde manier ontworpen; Hoewel controle stroma worden getransduceerd met een controle vector. Deze methode behaalt normale fysiologische niveaus van menselijk TSLP in PDX-muizen die geïnjecteerd worden met de TSLP + stroma. Geen detecteerbare TSLP wordt waargenomen in PDX-muizen die de cytokine-negatieve stroma ontvangen. We hebben de menselijke stromal cellijn HS-27A geselecteerd voor onze studies omdat het robuust groeit in de cultuur en een zeer lage cytokineproductie toont die geen proliferatie van geïsoleerde stamcellen in coculturen ondersteunt. 8 Voor menselijke TSLP expressie werden stroma getransducteerd met een geavanceerde generatie zelfinactiverende lentivirale vector afgeleid van een eerder beschreven ruggengraat 9 en omvat het cPPT / cts-element en het post-transcriptie-regulatorisch element van de woodchuck hepatitis (WPRE) om transgene expressie te verhogen. Het menselijke TSLP-gen werd geconstrueerd in deze vector onder de controle van de verlengingsfactor-1(EF-1) alpha promotor om robuuste, constitutieve en lange termijn expressie te bereiken.
De techniek van dit human-cytokine versterkte PDX-model bestaat uit 4 hoofdstappen. Ten eerste worden getransformeerde stroma in vitro uitgebreid en beoordeeld door enzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA) voor stabiele cytokineproductie op hoog niveau. Ten tweede wordt de activiteit van humaan cytokine geproduceerd door de getransduceerde stromacellen (en het ontbreken van cytokine-activiteit van controle stroma) geverifieerd met behulp van fosfostroomcytometrie. Cellijnen die bekend zijn om te reageren op cytokine van belang (in dit geval, TSLP) worden geïncubeerd met stromale cel supernatant en geanalyseerd voor cytokine geïnduceerde fosforylering. Ten derde worden muizen geïnjecteerd met getransduceerde humane stroma en dan wordt muisplasma per week beoordeeld door ELISA voor niveaus van menselijk cytokine. Vierde humane hematopoietische cellen worden getransplanteerd en de in vivo functionele effecten van het humane cytokine worden geëvalueerd op een bekend doel ( Levering van menselijk cytokine via stromacellen biedt zowel voor- en nadelen als vergeleken met andere methoden voor het leveren / produceren van humane cytokinen in PDX-muizen. 7 In vergelijking met injectie van recombinant humaan cytokine is stroma-gemedieerde afgifte over het algemeen minder duur (de kosten van stromale celcultuur zijn minder dan de kosten van recombinant cytokine) en minder arbeidsintensief (één injectie per week versus meerdere injecties per week). De kwestie van korte halveringstijd van de cytokine wordt ook verminderd, aangezien stroma voortdurend de exogene cytokine produceert. Levering van cytokine via hydrodynamische injectie van DNA kan minder duur zijn dan afgifte via stroma. Het is evenwel ook voorbijgaande en kan meer technische vaardigheden vereisen dan de simpele wekelijkse intraperitoneale injectie die nodig is voor stroma-gemedieerde afgifte. Lentivirale genuitdrukking in de muis kan een minder traNsient methode van de levering van cytokine; In onze handen werden echter fysiologische TSLP niveaus niet bereikt. Bovendien is deze methode arbeidsintensief, waarbij de voortdurende productie van lentivirale vector vereist is. Transgene of knock-in muizen bieden stabiele langetermijnuitdrukking van cytokine en kunnen worden ontwikkeld voor weefselspecifieke expressie, die een voordeel kan zijn. Anderzijds vereist de transgene expressie van het humane cytokinegen op de immuun-deficiënte muisachtergrond die nodig is voor PDX-muizen een enorme investering van middelen voordat de waarde van het model is vastgesteld. Bovendien kunnen transgene modellen in het algemeen niet de mogelijkheid bieden om de timing van cytokine-initiatie of niveau van in vivo cytokineproductie te variëren. Deze kunnen worden bereikt met stroma-gemedieerde afgifte door gewoon het tijdstip te wijzigen voor het initiëren van stromale celinjectie of de dosis stromale cellen die geïnjecteerd zijn. De stromale cel gemedieerde cytokine afgifte methOD gedetailleerde hier werd gebruikt om PDX te ontwikkelen voor het evalueren van de rol van TSLP bij normale humane B-celontwikkeling 4 , 6 en B-cel acute lymfoblastische leukemie met hoge risico's. 6 Deze methode verschaft een alternatieve cytokine-leveringsmethode voor gebruik bij het opwekken van vergelijkbare modellen met andere cytokinen dan TSLP. Dit model kan ook nuttig zijn voor het genereren van voorlopige gegevens die kunnen helpen bepalen of de waarde van een cytokine transgene of cytokine inklapbare PDX-model de aanzienlijke tijd en geld investering zou waard zijn. 
Figuur 1: PDX Model dat is ontworpen om exogene humane cytokine in muizen te produceren. ( 1A ) Ontwerp experiment en getransduceerde humane stromale cellen ( 1B ) verkrijgen. Verkrijg menselijke cellen (hematopoietische stamcellen, leukemacellen, enz .) Om PDX (patiënten afgeleide xenograft) muizen te genereren. ( 2A ) Injecteerde gemanipuleerde stroma en ( 2B ) transplantatie menselijke cellen in immuun deficiënte muizen volgens experimentele schema. ( 3A-B ) Monitor cytokine concentraties in het stroma supernatant en het muis plasma door ELISA. ( 4 ) Menselijke cellen van de oogst en analyseer de in vivo functionele effecten van het aanwezige humaan cytokine in de PDX. Klik hier alsjeblieftOm een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studies zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Loma Linda University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocollen en volgens alle federale richtlijnen.
VOORZICHTIG: PDX en menselijk weefsel moeten worden behandeld in overeenstemming met veiligheidsprocedures om de overdracht van bloedgedragen pathogenen te voorkomen.
1. Cultuur en Uitbreiding van Cytokine-Transduced Stroomcellen
OPMERKING: Telkens wanneer stroma doorgaat, haal het kweek supernatant (1 ml aliquot) op en berg bij -80 ° C voor toekomstige kwantificering van cytokine niveau via ELISA assay.
- Bereid R10 kweekmedium en vriesmedium zoals beschreven in de Tafel van Materialen.
- Genereer 10 , 11 of geef controle stroma (getransduceerd met lege vector) en cytokine producerende (TSLP +) stroma."> 6 Bewaar in vloeibare stikstof (LN 2 ) tot het gebruik. Doe stromale cellen zoals beschreven 12 op en plak ze in 5 ml R10-medium in afzonderlijke T-25-celkweekflessen. Cultuurcellen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO 2. Dit is post-thaw "passage # 1".
- Zodra stroma confluent zijn (24-48 uur), worden de cellen door trypsiniseren gebruikt met 1 x trypsine EDTA (0,25%) en opnieuw plating in een T-150 kweekfles. Dit is post-thaw "passage # 2".
- Wanneer stroma confluentie in de T-150 flessen bereikt (3-4 dagen later), passeren de cellen door trypsiniseren. Gebruik deze celsuspensie voor experimentele behoeften.
- Celuitbreiding naar meerdere flessen
- Verdeel de geoogste cellen tussen drie T-150 flessen en cultuur tot confluent. Herhaal deze stap als stroma uitbreiding nodig is. Typische humane stromale (HS-27A) celtelling bij confluentie in een T-150 fles is ~ 5 x 106.
- Cellentorage
- Breng de geoogste celsuspensie over op een conische buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten, dek de supernatant af en breng de cellen opnieuw in het vriesmedium. Bevriezen en opslaan in LN 2 ~ 1,5 x 10 6 cellen per injectieflacon.
- Voor intra-periotoneale stroma injecties in muizen, ga verder met stap 4.1.
- Celuitbreiding naar meerdere flessen
2. ELISA analyseert de productie van vitrocytokine uit getransduceerde stroma
- Koop in de handel verkrijgbare ELISA assay kit om de cytokine van belang te detecteren.
- Dooi stromale cel supernatant van controle en cytokine producerende (TSLP +) stroma geoogst bij vroege, midden en late passages ( Figuur 2 ).
- Bepaal de TSLP-concentratie in supernatantmonsters met behulp van een ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant. 13 Stel deze seriële data samen om de stabiliteit van cytokineproductie tijdens celcultuur te controleren E ( Figuur 2A-B ).
- Identificeer en verwijder cytokine producerend stroma met verminderde of suboptimale cytokine expressie, evenals eventuele bijbehorende injectieflacons ( Figuur 2A-B ).
- Identificeren en onderhouden van cytokine-producerende stroma die stabiele cytokine concentraties op hoog niveau aantonen. Gebruik deze ontdooien voor experimenten.
- Gebruik de ELISA-kit om stroma gedurende de gehele duur van de celcultuur regelmatig te monitoren (ten minste 1 keer tijdens de vroege, midden- en late na-ontdooipassages) om stabiele cytokineproductie te waarborgen of, in het geval van control stroma, de afwezigheid van cytokineproductie .
3. Fosfostroomcytometrie-analyses om de activiteit van cytokine te beoordelen, geproduceerd door Stroma
OPMERKING: Bepaal de supernatant van gemanipuleerde stroma voor het eerste experiment om de relevante bioactiviteit van het stroma-gegenereerde cytokine voor individueel experiment te verifiëren.Ef "> 6 Nadat de gecontroleerde stroma is gevalideerd, is verder testen niet nodig, tenzij stroma geïntroduceerd wordt die met een nieuwe vector zijn geproduceerd.
- Koop MUTZ5- en / of MHH-CALL4 leukemie cellijnen (TSLP responsive), 14 recombinant humaan cytokine en antilichamen die zijn goedgekeurd voor gebruik in fosfo-flow cytometrie assays om de juiste downstream fosforylatie doelen te detecteren.
- Ontdooide geoogste supernatant van controle en cytokine-expressie stroma.
- Plateer de leukemie cellijnen in R20 medium (zie Tabel van Materialen ) bij een concentratie van 0,2 x 106 cellen per putje in een weefselkweekplaat met 96 putjes. Plate 3 putten per conditie om triplicate assays mogelijk te maken. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. Deze keer zorgt voor verlies van fosforylering die zich voordoet tijdens de vroegere kweekomstandigheden.
OPMERKING: 12 putjes per cellijn leveren triplicate assays voor elke experimentele conditie getoond in stap 3.4. <Li> Na 2 uur in de cultuur, verplaats de cellen uit elke put om 4 ml buizen te scheiden en centrifuge bij 500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Dek de supernatant af. - De cellen opnieuw opschorten in 200 μL voor elk van de volgende experimentele condities (testen in triplicaat uitvoeren): 1) uitsluitend negatieve controle media, 2) positieve controle media met recombinante cytokine bij verzadigende concentratie (s) (TSLP bij 15 ng / Ml, enz .), 3) stroma supernatant van controle stroma en 4) cytokine-stroma supernatant van cytokine producerende stroma.
- Incubeer de cellen gedurende de duur gespecificeerd door specifieke commerciële fosfo-analyse ( bijv. 30 min voor fosfor STAT5 in MUTZ5 of MHH-CALL4 in reactie op TSLP).
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C en dekant het supernatant.
- Voer fosfostroomcytometrieverf per protocol van de fabrikant uit en verzamel de flowcytometrie data. 15
- Poort op intacte cellen op basis van voorwaartse (FSC, indicatie van celgrootte) en zijde (SSC, geeft cijferkorreligiteit aan) lichtverdeling.
- Bepaal de gemiddelde fluorescerende intensiteit (MFI) van de intacte cellen in elk monster. Vergelijk de gemiddelde MFI verkregen uit de drievoudige waarden van stromale cel supernatant met die van positieve en negatieve media controles.
4. Injectie van Cytokine-Transduced Stroma in Muizen
OPMERKING: Cultuur HS-27A stroma voor minimaal 3 na-dode passages voorafgaand aan injectie in muizen om gezonde cellen en adequate cytokine productie te waarborgen.
- Voorbereiding van stroma
- Breng de geoogste stromacellesuspensie over op een conische buis en doseer 10 μL voor hemocytometer tellen; Getallencijfers verkrijgen met behulp van trypan blauw. 16 Centrifugeer de resterende ceLl suspensie bij 500 xg gedurende 5 min.
- Aspirateer de supernatant uit de gepelleteerde cellen en resusteer de cellen zachtjes in het benodigde volume steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor muisinjectie (afhankelijk van het aantal muizen om te injecteren).
OPMERKING Typische stromale celconcentratie voor muisinjectie: 0,5 x 10,6 -5 x 106 cellen per muis in 200 μl PBS. - Bewaar de stromale cel suspensie bij 4 ° C (of op ijs) tot direct voor de injectie. Zorg ervoor dat de cel suspensie tenminste bij kamertemperatuur (RT) (~ 25 ° C) voor muizeninjectie is.
- Stroomcellen injectie
- Desinfecteer de bio-veiligheidskap, monteer materialen voor injecties en plaats de muiskooi erin.
- Meng de celsuspensie voorzichtig door inversie voordat u 200 μl in een tuberculinespuit maakt.
- Met behulp van standaard intra-peritoneale injectietechnieken, 17Belemmer de muis en geef de 200 μL cel suspensie in de peritoneale holte. Details zijn eerder aangetoond door Machholz et al. 18
5. Serie Bloedinzameling en Plasma Monitoring voor Exogene Menselijke Cytokine in Muizen
- Bloedverzameling via staartsnip
- Desinfecteer de biosafety kap en assembleer muissteunen, scharen en andere gereedschappen / benodigdheden voor de procedure.
- Plaats de muis in een aanhanger en bevestig de buis om de beweging van de muis te minimaliseren.
- Desinfecteer de staart en de chirurgische schaar met isopropylalcohol. Breng topical anesthetic cream aan op de staart.
- Met behulp van zeer scherpe chirurgische scharen snij ongeveer 0,5 - 1 mm van de punt van de muisstaart af. Verzamel ongeveer 80 μl perifeer bloed met behulp van gehardiniseerde capillaire buizen.
OPMERKING: Als bloed met deze methode wordt verzameld meer dan zes tiMes, staartverwijdering moet conservatief zijn met inachtneming van de hoeveelheid staart verwijderd. Naarmate de snuitjes de staart vorderen, neemt de diameter toe, het bloeit sneller en de genezing duurt langer.
- Plasmascheiding
- Breng het bloed door met een bolspuit (om het uit de capillaire buizen te verdrijven) in een gelabelde K2 EDTA microtainer buis; Omkeer 20 keer om coagulatie te voorkomen.
OPMERKING: Typisch bloedstolling van staartnip is snel. Echter, als de bloeding langer duurt dan ~ 2 minuten, gebruik een styptische potlood / poeder om coagulatie te ondersteunen. - Centrifugeer de bloedinzamelbuizen volgens de instructies van de fabrikant en monteer het plasma voor opslag (-20 ° C) tot de ELISA-test klaar is.
- Als gegevens van de muis-humane cel chimerisme nodig zijn uit het bloed van de muis, behandel dan de resterende pellet zoals beschreven in stap 6.3.1. Anders, verwijder de bloedcelpellet.
- Breng het bloed door met een bolspuit (om het uit de capillaire buizen te verdrijven) in een gelabelde K2 EDTA microtainer buis; Omkeer 20 keer om coagulatie te voorkomen.
- Gemodificeerde ELISA voor micro-volUmes van muis plasma
OPMERKING: De ELISA-procedure van de fabrikant is gewijzigd van het aanbevolen 100 μL monster volume naar een volume van 40 μL om de microvolumes van muizen op te vangen. Het is niet mogelijk om de in vivo muisplasma-monsters in triplicaat met deze beperkte volumes uit te voeren. Aan het eind van het experiment wordt 500 μL post-mortem bloed verzameld via hartpicking. Cytokine concentraties geëvalueerd in 100 μL euthanasie plasma worden gebruikt om de 40 μL in vivo data voor elke muis te valideren.- Ontdooide bevroren muis plasma monsters.
- Serie-verdunde ELISA-normen en plak ze in drievoud bij 40 μl per putje.
- Voeg 40 μl van elk muisplasma monster toe aan de ELISA plaat.
OPMERKING: als een muismonster minder dan 40 μL is, breng dan het volume tot 40 μL met ELISA-buffer. Noteer dit verdunningsvolume en gebruik het om een verdunningsfactor te berekenen voor elk verdund monster. WanneerAnalyseren van de ELISA-gegevens vermenigvuldigen de verdunde monsterkoncentratie met de verdunningsfactor van het monster om de werkelijke cytokine concentratie in het oorspronkelijke monster te bepalen. - Voltooi ELISA-test volgens de instructies van de fabrikant.
6. Transplantatie van hematopoietische cellen in muizen
- Subletale bestraling om beenmerg voor transplantatie voor te stellen
OPMERKING: De Loma Linda University (LLU) gebruikt een Cobalt-60 stralingsbron. Dieren worden geplaatst in een taartrestrictor die 80 cm van de stralingsbron in een 20 x 20 cm veld geplaatst is en met een 0,5 cm laag Lexan bovenop de restrainer. Blootstellingstijd is berekend om een 225 cGy dosis te behalen op basis van de meest recente kalibratie van de bron (momenteel 2-3 minuten voor deze bron).- Sub-lethaal bestraalde muizen (totale lichaamsbestralingsdosis van 225 cGy maximum voor immuun deficiënte muizen).
- Transplantatie hematopoietische cellen ~ 24 uur later via </ Em> intraveneuze staartveneuze injectie.
- Intraveneuze hematopoietische celtransplantatie
- Bereid menselijke cel suspensies voor transplantatie in een volume van 200 μL steriele PBS per muis: CD34 + hematopoietische stamcellen (HSC): 1 x 10 5 tot 5 x 10 5 cellen per muis en leukemie cellijnen / patiëntmonsters: 1 x 10 6 tot 5 x 10 6 cellen per muis.
- Bewaar cellen bij 4 ° C (transport op ijs) tot onmiddellijk voor transplantatie. Zorg ervoor dat cellen tenminste bij RT voor transplantatie zijn.
- Desinfecteer de bioveiligheidshuis en berei de afzuigruimte voor transplantaatinjecties voor.
- Plaats de muis gedurende 5 minuten in de kachel om de staartvenen te verruimen.
- Meng de cel suspensie zachtjes en maak 200 μL in een tuberculinespuit. Zet de naald veilig opzij, waar het steriel blijft.
- Plaats de muis in een bevestiging en desinfecteer de staart met isopropylalcohol. </ Li>
- Met behulp van standaard intraveneuze injectietechnieken injecteren 17 de menselijke cel suspensie in muisstaart.
OPMERKING: Inademingen van de taille kan meerdere pogingen doen, vooral voor een beginnende dierenverzorger. Kovacscics en Raper's JoVE video 19 geeft een gedetailleerde demonstratie van deze dieren techniek. - Monitor het herstel van de muis voor ~ 5 min. Noteer bijwerkingen tijdens de injectie ( bijv. Gemorste cellen, grote bloeding, overmatig staarttrauma).
- Analyse van humane cel chimerisme in perifere bloed van het muis
- Verkrijg de bloedcelpelletjes die in de microtainerbuis achterblijven na plasma-scheiding (stap 5.2.3).
- Voor rode bloedcellen (RBC) lysis, resuspendeer de resterende bloedpelletjes in een volume PBS gelijk aan plasma verwijderd (om plasma volume te vervangen) en meng goed (vortex / pipet).
- Breng elk opnieuw gesuspendeerd bloedmonster over op een gelabelde 4 ml buisEn voeg vervolgens RBC lysisbuffer toe aan elke buis in een 1: 9-verhouding (900 μL RBC lysisbuffer voor 100 μL opnieuw gesuspendeerd bloed). Incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Centrifuge (5 min, 500 xg) en decant.
- Voer tweede RBC lysisbuffer incubatie uit (5 minuten bij RT). Centrifugeer en dekant zoals eerder.
- Was de resterende cellen in ~ 1 ml PBS. Centrifugeer en dekant zoals eerder.
- Resuspendeer de pellet in een volume PBS geschikt voor standaard flow cytometry staining (dit varieert volgens fabrikant en individuele laboratoriumprotocollen). 20 Gebruik immunofenotyping antilichamen die zijn gecontroleerd voor flow-cyotmeterie om muiscellen (muis CD45 +) en menselijke cellen (menselijke CD45 +) 6 , 21 te identificeren Evenals aanvullende humane leukocytenmarkers die specifiek zijn voor de cellulaire lijn van belang.
OPMERKING: Het is aan te raden om een klein volume (5 μL-20 μL) van elk muismonster te nemen om "pooled samples" te maken; Gebruiken voor onbeschadigde, levensvatbaarheids- en isotype controlemonsters. Het is de beste praktijk om onbeschadigde en isotype controles voor elke experimentele conditie te hebben.
7. Functionele Evaluatie van In Vivo Cytokine Activiteit
- Muis-euthanasie en weefsel oogst
- Euthanize muizen via CO 2 versmoring bij aangewezen experimentele tijdstip.
- Oogstbloed via cardiale punctie en plasma verzamelen zoals in stappen 5.2.1-5.2.2.
OPMERKING: Verzamel het bloed voorafgaand aan andere weefsels omdat het direct na de dood coaguleert. - Verwerk het muisbloed, aliquot en bewaar plasma zoals in stap 5.2.2.
- Op een later tijdstip beoordelen de exogene cytokine concentratie in plasma verkregen bij euthanasie via ELISA volgens het protocol van de fabrikant. Evalueer en vergelijk exogene cytokineconcentraties in het muisplasma van de seriële in vivoBloedinzameling en de euthanasie plasma monsters (beschreven in rubriek 5.3).
- Voeg PBS toe aan het overblijvende bloedmonster om het plasma volume en het proces te vervangen zoals beschreven in stappen 6.3.1 en 6.3.2. Voer onmiddellijk de flowcytometrie-analyses uit, of verwijder cellen in vriesmedium voor LN 2- opslag.
- Harvest beenmerg (BM) en milt van PDX muizen en bereiden enkele cel suspensies zoals eerder beschreven. 22
- Verkrijg celtellingen voor elk PDX-muisweefselmonster met behulp van 3% azijnzuur met methyleenblauw (lyses celmembranen en RBC's die intacte kernen van levende cellen verlaten) in een 1: 1 verdunning en tellen cellen met behulp van een hemocytometer. Tabelleer totale celtellingen voor beenmerg- en miltmonsters voor elk dier.
- Centrifugeer (500 xg, 15 min) cel suspensies en dekant het supernatant. Voer de flow-cytometer-assays van beenmerg en / of miltcellen onmiddellijk of resuspendeer in vriesmedium voor LN <Sub> 2 opslag.
OPMERKING: Vries 10 BM-aliquots (voor toekomstige biochemische analyses) en ~ 5 miltquota (voor toekomstige PDX-transplantaties) per muis. - Immunofenotyping om in vivo functionele effecten te identificeren
- Bereid één master-mix (MM) van flowcytometrie antilichamen tegen hematopoëtische populatie (en) voor immunofenotype in, die reageert op de cytokine van belang en een tweede MM van isotype controle antilichamen ( Figuur 5 en Tabel van Materialen).
- Dooi PDX-weefselquota (37 ° C kraalbad) bereid in stap 7.4.
- Was de ontdooide cellen door ze over te brengen naar een conische buis en voeg het minst 3x volume PBS toe. Centrifugeer (500 xg, 5 min) en dekant de supernatant.
- Herhaal de wasstap (7.5.3).
- Maak pooled aliquots door ~ 10 μL-20 μL cellen uit elk PDX monster te nemen voor de ongekleurde controle, levensvatbaarheidscontrole en de isotype controles (zie stap 6.4.6 noot). Vlek alle monsters, behalve de uNstained controle, met een fixeerbare levensvatbaarheid kleurstof (dode cel markering), incuberen en wassen volgens het protocol van de fabrikant.
- Vlek elke PDX-celmonster met fenotyping-MM volgens het standaard flow cytometry staining protocol; Op dezelfde wijze vlek het pooled isotype-controle monster (s) met het isotype-MM. Incubeer alle monsters, wassen met PBS en monsters vastzetten door opnieuw op te schuiven in 1% paraformaldehyde.
- Verzamel flowcytometrie data en analyseer gegevens met behulp van een gate strategie die geschikt is voor de celpopulatie (s) van belang ( Figuur 5 ). Een typische gating is als volgt:
- Definieer intacte cellen door een FSC- en SSC-poort te tekenen die rommel uitsluit.
- Identificeer de levende cellenpopulatie door te gaten op cellen die negatief zijn voor de dode celmerker (dit zijn de "totale levende cellen").
- Gebruik subgates in de "totale levende cellen" om de celpopulaties te definiëren met het gewenste immunofenotype (zie Figuur 5).
- Verkrijg deFrequentie van subsetcelpopulaties binnen de totale aantal levende cellen uit de flowcytometrie analyse. 6 , 21
- Bereken het aantal doelcellen in elk weefsel door de frequentie van de B-cel-subset te vermenigvuldigen, binnen de totale levende cellen (verkregen in stap 7.5.6.4) door de totale levende celtellingen per weefsel verkregen in stap 7.3 (% B-cel subset x " Hemocytometer cel telling ", zie tabel 1 )
- Vergelijk de celtellingen van doelcelpopulaties tussen controle PDX-muizen en cytokine-expressie (TSLP +) PDX-muizen om in vivo functionele effecten van het exogene humane cytokine te bepalen ( tabel 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van het model is weergegeven in figuur 1 . Zodra cytokine-producerende (TSLP + stroma) en controle stroma zijn verkregen, worden ze uitgebreid in cultuur. Vóór stroma injectie in muizen wordt stromale cel supernatant beoordeeld door ELISA om cytokine productie te verifiëren ( Figuur 2 ) en fosfo-flow cytometrie (Protocol # 3) wordt gebruikt om de activiteit van de door de stroma geproduceerde cytokine te verifiëren. Supernatant wordt verzameld uit confluente stromale celculturen (controle stroma en TSLP + stroma) wanneer cellen doorgevoerd worden. ELISA wordt gebruikt om de concentratie van TSLP in supernatant ten minste een keer tijdens de vroege, midden en late passages te controleren. Representatieve gegevens van controle stroma zijn weergegeven in figuur 2A . Controle stromale celculturen die TSLP-expressie tonen (en eventuele flesjes die van hen zijn bevroren) moeten worden weggegooid. Controleculturen met onopspoorbare TSLP worden uitgebreid en ingevroren voor toekomstig gebruik.Zoals blijkt uit figuur 2B worden culturen van TSLP + stroma die op lage niveau TSLP-productie (en injectieflacons bevroren) weggegooid. TSLP + stroma die stabiele productie op hoog niveau van de cytokine toont, worden geselecteerd voor uitbreiding en opslag voor gebruik in toekomstige experimenten. Gemiddelde cijfers van TSLP in supernatant uit meerdere kulturen van controle en TSLP + stroma worden getoond in Figuur 2C .
De experimentele tijdlijn voor de productie van controle PDX-muizen met humaan cytokine is weergegeven in figuur 3 . Stromale celculturen worden geïnitieerd 3 weken voor transplantatie en ELISA-analyse van in vitro TSLP-productie in cultuursupernatant wordt uitgevoerd zoals beschreven in Figuur 2. In vivo wordt de menselijke TSLP in het muisplasma wekelijks bewaakt ( Figuur 4 ) onder gebruikmaking van de "gemodificeerde ELISA voor Microvolumes van muisplasma "beschreven in protocol nr. 4. peripheraBloed wordt gelijktijdig met plasma verzameld en wordt geanalyseerd zoals beschreven in Protocol nr. 6 onder "Analyse van humane celchimerisme in perifere bloed van het muis." PDX geïnjecteerd met control stroma vertoonde constant plasma menselijke TSLP niveaus die onder de drempel voor detectie liggen ( Figuur 4A ). Het plasma niveau van TSLP in PDX muizen geïnjecteerd met TSLP + stroma is evenredig aan het aantal TSLP + stromale cellen geïnjecteerd gedurende de voorafgaande 1 - 2 weken. De plasma-niveaus van TSLP dalen snel als stromale celinjecties worden stopgezet. 6 Zoals in Figuur 4B is gezien, gaf wekelijkse injecties van 0,5 x 106 TSLP + stroma (die gemiddeld> 1000 pg / ml TSLP in kweek supernatant produceren) plasma TSLP niveaus dichtbij de onderste grens van fysiologische niveaus (~ 5-10 pg / ml ). Wekelijkse injectie van 5 x 10 6 TSLP + stroma in PDX-muizen resulteerde in plasma TSLP-niveaus die hoge fysiologische niveaus bereiken (~ 35 pg / ml) zoals getoond in
TSLP is aangetoond dat de productie van normale menselijke B-celprecursoren wordt verhoogd. 23 Om de in vivo functie van TSLP te evalueren, hebben we het product dus vergeleken Ion van normale humane B-cel precursoren in controle en TSLP + PDX muizen getransplanteerd met hematopoietische stamcellen, zoals getoond in Figuur 5 en in Tabel 1 . Figuur 5A toont de stroomcytometrie gating voor immunofeneotyping gebruikt om subsets van humane B-afstammingscellen te identificeren. Voorbeeldberekeningen voor het opgeven van het aantal cellen in elke subset voor één controle PDX en één TSLP + PDX worden weergegeven in Tabel 1 . Zoals getoond in Figuur 5B, worden B-lijncellen significant verhoogd in TSLP + in vergelijking met controle PDX en deze toename begint met de vroegste B-celprecursoren (pro-B-cellen). Het aantal niet-B-lijncellen was niet significant verschillend tussen de controle en TSLP + PDX (gegevens niet getoond). Deze test biedt een manier om te verifiëren dat de menselijke TSLP die in vivo is geproduceerd in TSLP + PDX, in vivo functionele effecten op een doelcellenpopulatie uitoefent.
Ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
Figuur 2: ELISA om TSLP Cytokine Concentraties te monitoren in Stroma Supernatant. ELISA-analyses werden gebruikt om de TSLP-concentraties in de supernatant van controle stroma (getransduceerd met controlevector) en TSLP + stroma (getransduceerd om menselijke TSLP te transduceren) ten minste eenmaal tijdens de volgende celpassages te meten: vroeg (passage 1-5), midden 6-12), en laat (passages 13-20). De detectiedrempel voor de menselijke TSLP ELISA-analyse die hier wordt gebruikt is 1,9 pg / ml (rode streeplijn). ( A ) Control stroma produceren minimaal detecteerbare menselijke TSLP concentraties; Deze niveaus liggen over het algemeen onder de ELISA detectiedrempel voor de duur van het experiment. Control stroma in cultuur die toenemende TSLP concentraties (> 15 pg / mL) tonen, worden weggegooid samen met alle aliquots bevroren van die cultuur. ( B ) De menselijke TSLP-productie varieert tussen culturen die voortkomen uit differenT ontdooide flesjes van TSLP + stroma ( n = 9) en gedurende de kweekperiode. TSLP stroma die een verminderde of onstabiele cytokineproductie (TSLP <1000 pg / mL) tonen, worden ook weggegooid. ( C ) Gemiddelde TSLP concentraties voor controle (groen) en TSLP + (blauw) stroma (middelen en 95% vertrouwensintervallen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Experimentele tijdlijn voor het genereren van PDX-muizen met exogene humane cytokineproductie. In vitro en in vivo delen van het experiment gaan tegelijkertijd vooruit. Controle- en + TSLP stroma celcultuur wordt 2-3 weken voorafgaand aan hematopoietische celtransplantatie gestart, die voor de eerste (bijWk -1) van de wekelijkse stromale injecties. Dit zorgt ervoor dat de stromacellen gezond, proliferatief zijn en voldoende cytokine niveaus produceren. Supernatantquota worden verzameld wanneer cellen doorgegeven worden en ELISA-analyses worden gebruikt om TSLP-concentratie te bepalen (zie Figuur 2 ) in het stroma supernatant. Dieren worden bestraald op dag 0, één dag voorafgaand aan humane hematopoietische celtransplantatie op dag 1. De wekelijkse bloedinzameling begint 1 tot 2 weken na de eerste stroma-injecties. Op dit moment zouden exogene humane cytokineconcentraties detecteerbaar zijn in het muisplasma onder gebruikmaking van gemodificeerde ELISA-analyses ( Figuur 4 ). Het eindpunt van het experiment is 5-16 weken na menselijke celtransplantatie; Dit hangt af van de hoeveelheid menselijk cel chimerisme dat is gedetecteerd in het perifeer bloed van de muis. Normale hematopoiesis is doorgaans goed vastgesteld bij week 5-7, leukemie cel chimerisme varieert tussen cellijnen en primaire monsters (3-16 weken). PDX transplantatie succes en progressie ook afhankelijkOp het aantal menselijke cellen geïnjecteerd bij transplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het bereiken van fysiologische humane TSLP Cytokine Concentraties in Muis Plasma. Muizen ontvangen wekelijkse intraperitoneale injecties (200 μl) getransduceerde cellen en hun plasma wordt verzameld om de menselijke TSLP concentraties (ELISA assay) in vivo in de muizen te evalueren over de tijd. " Control" -muizen kregen 5 x 10 6 controle stromacellen, terwijl muizen met "TSLP + low" (low TSLP stroma dosis) 0,5 x 10 6 TSLP + stromacellen kregen en de muizen "TSLP + high" (hoge TSLP stroma dosis) 5 x 10 6 TSLP + stromacellen per week. De menselijke TSLP ELISA-analyse Detectiedrempel is 1,9 pg / ml (rode streeplijn) en het humane fysiologische bereik van TSLP is ~ 5 tot 35 pg / ml (grijze schaduw). 24 (Referentie 11 en Coats ongepubliceerde data) ( A ) "Control" muis plasma heeft consequent TSLP niveaus <5 pg / ml of onder de ELISA detectiedrempel. ( B ) "TSLP + laag" muis plasma toont lage fysiologische niveaus van TSLP; Terwijl ( C ) "TSLP + hoge" muisplasma hoge fysiologische niveaus toont. ( D ) De gemiddelde TSLP concentraties voor elke experimentele groep (gemiddelde ± SEM van alle muizen en tijdspunten) laten zien dat TSLP niveaus gedetecteerd in muis plasma evenredig zijn aan de ontvangen stroma dosis; Controle-plasma plasmaniveaus liggen onder de ELISA detectiedrempel en de 'TSLP + high' plasmaniveaus zijn vier keer groter dan de plasma-niveaus van de TSLP + lage plasma."> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 5: Beoordeling van normale humane B-cel populaties Valideren I n Vivo Functionele effecten van exogene humane TSLP in PDX-muizen. PDX-muizen werden gecontroleerd met controle en TSLP + stroma en getransplanteerd met menselijke CD34 + cellen geïsoleerd uit navelstrengbloed. Immunofenotyping door stromingscytometrie werd gebruikt om subgroepen van menselijke B-celprecursoren in botmarg geoogst uit controle en TSLP + PDX als volgt te identificeren: geoogst beenmerg, ontdooid en gekleurd met fixeerbare levensvatbaarheidsverf, en gekleurd voor stromingscytometrie om anti- Menselijke CD45-, CD19-, CD34-, K & A- lichte keten, en ofwel oppervlak-IgD- en IgM- of intracellulaire IgM (cμ). ( A ) Totale levende celIk was gated op basis van een levensvatbaarheidsmerker. Opeenvolgende plots tonen volgende poorten om ontwikkelingsvolgorde B-subsets te identificeren (de getoonde gegevens zijn van TSLP + PDX). ( B ) Frequentie van elke subset binnen totale levende cellen werd bepaald door flowcytometrie software en getallen van cellen in elke B-cel subset werden berekend. (Zie tabel 1). Celtellingen voor elke B-cel subset in de controle (zwart, n = 3) en TSLP + (blauw, n = 5) PDX-muizen worden afgebeeld. (Gemiddelde ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Menselijke celbevolking | Freq. Van de totale levende cellen | Living Cell Count iN BM | # Cellen in de bevolking |
| Control Mouse | |||
| Totale levende cellen | 100.00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| hCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Totaal CD19 + | 27.20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24.20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Pre-B | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 10 6 |
| Onvolwassen B | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0.33X 10 6 |
| Oudere B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 10 6 |
| TSLP + Muis | |||
| Totale levende cellen | 100.00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| Totaal CD19 + | 65.10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60.20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Pre-B | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Onvolwassen B | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 10 6 |
| Oudere B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 10 6 |
Tabel 1: Frequentie en tellingen van normale humane B-cel subsets in PDX Beenmerg. De frequentie (%) van elke B-cel subset binnen de totale levende cellen werd bepaald door middel van flow cytometry analyse (zie Figuur 5A voor gateway strategie). Representatieve bone marrow (BM) gegevens van één controle PDX muis (ontvangen control stroma injecties, 5 x 10 6 cellen / week) en een TSLP + PDX muis (ontvangen TSLP stroma injecties, 5 x 10 6 cellen / week). De totale levende BM-celcijfers werden geregistreerd bij euthanasie en immuun-fenotyping-flowcytometrie werd gebruikt om subsetfrequentie (%) te beoordelen en de grootte van elke B-cel subsetpopulatie te berekenen (subset cel telling = "totAl levende cellen "x" subset frequentie ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een eenvoudige, snelle en relatief kosteneffectieve methode voor het ontwerpen van PDX om exogeen humaan cytokine uit te drukken. De hier beschreven strategie is gebaseerd op wekelijkse intraperitoneale injecties van een stromale cellijn die getransducteerd wordt om de menselijke cytokine, TSLP uit te drukken. Voordat de hier beschreven methoden werden uitgevoerd, werden stroma ontwikkeld om hoge niveaus van het cytokine van belang (TSLP) en soortgelijk gecontroleerde controle stroma uit te drukken gegenereerd. In de hier gepresenteerde protocollen worden stroma uitgebreid in cultuur en gescreend op het vermogen om over de tijd stabiel, hoog niveau cytokine productie te produceren (of voor de afwezigheid van cytokine productie in het geval van control stroma). Analyses om de activiteit van stroma-gegenereerde cytokine te verifiëren werden uitgevoerd en experimentele tijdlijnen voor stromale celinjectie werden ontwikkeld om PDX te produceren met fysiologische menselijke TSLP (en controlemuizen die geen menselijke TSLP hebben). Procedures voor het monitoren van plasma niveaus van menselijke TSLP enVoor het verifiëren van zijn in vivo functionele effecten op cytokine-responsieve celpopulaties werden uitgevoerd.
Verscheidene factoren moeten in aanmerking worden genomen bij het selecteren van stromacellen en vectoren die in de hier beschreven protocollen zullen worden gebruikt. Stromale cellijnen mogen geen endogene hoeveelheden cytokine produceren en zouden niet reageren op het cytokine van belang. Voor studies hier werd de menselijke beenmergstromale cellijn, HS-27A, geselecteerd omdat het robuust groeit in cultuur met een lage cytokineproductie. 8 De hier beschreven werkwijze bevat ook "control" PDX die met dezelfde stroma is ontworpen als TSLP + PDX, maar zonder overexpressie van TSLP. Vergelijkingen van resultaten in TSLP + en control PDX stellen ons in staat om te controleren op eventuele effecten als gevolg van endogene stromalcelcytokine productie. Transductie van stromacellen met vectoren die fluorescerende eiwitten of andere selecteerbare markers bevatten kunnen nuttig zijn voor het isoleren van cellen thBij het waarschijnlijk overbelasten van de cytokine van belang. Het is echter essentieel om cytokinesupernatant te bepalen om het niveau van cytokine geproduceerd door de stromale cellen te bepalen omdat het in vivo plasmacytokinegehalte in muizen correleren met de cytokine-concentratie in stromale celsupernatant, 6 evenals het aantal stroma geïnjecteerd op een Wekelijkse basis ( figuur 4 ).
Het is belangrijk dat de activiteit van het door stroma geproduceerde cytokine voorafgaand aan PDX-studies wordt geverifieerd. We gebruikten fosfostroomcytometrie om te analyseren voor moleculen die gefosoryleerd werden stroomafwaarts van TSLP stimulatie in cellen die responsief zijn op TSLP. TSLP activeert de JAK-STAT5- en PI3 / AKT / mTOR-trajecten. De MUTZ5- en MHH-CALL4 leukemiecellijnen lijken hoge niveaus van de TSLP-receptorcomponenten uit en tonen stroomafwaartse STAT5-, AKT- en ribosomale eiwit-S6-fosforylering na TSLP-stimulatie. 14 Hier gebruikten we phopho-flow cytometrieFosforylering van STAT5 (pSTAT5) te evalueren die stroomafwaarts van TSLP stimulatie wordt geïnduceerd. In eerdere werkzaamheden hebben we getoetst op aanvullende TSLP-gestimuleerde fosforyleringsgebeurtenissen: fosfo-AKT (pAKT) en fosfo-ribosomale proteïne S6 (pS6, stroomafwaarts van mTOR). Resultaten toonden aan dat de pAKT-analyse minder gevoelig is en de pS6 gevoeliger is dan de pSTAT5-analyse. 6 Wanneer fosfo-assays worden uitgevoerd, dienen responsieve cellen te worden gekweekt met verzadigende niveaus van recombinante humane TSLP als een positieve controle en alleen met media (geen cytokine) als een negatieve controle. Supernatant uit controle stroma moet naast die van TSLP + stroma worden geanalyseerd als tweede middel om te verifiëren (naast ELISA) dat TSLP niet door controle stroma wordt geproduceerd. Dit dient ook als een controle om te verzekeren dat endogene cytokine productie niet verantwoordelijk is voor de fosforylatie waargenomen in assays van TSLP + cellen. Ideaal gezien zou fosforylering geïnduceerd door cytokine-producerende stroma monsters gelijk moeten zijnDat is waargenomen met recombinante cytokine conditie, hoewel het lager kan zijn als de concentratie van cytokine in het supernatant lager is dan bij de verzadigende positieve controle. Een positieve controle met recombinante TSLP niveaus die overeenkomen met de niveaus waargenomen door ELISA voor TSLP + stroma zijn een goed alternatief.
Het herkennen van bekende functionele indicatoren van in vivo cytokine-activiteit kan een uitdaging zijn. Analyses van fosforylering zijn mogelijk niet mogelijk omdat fosforylering geïnduceerd door het exogene humane cytokine in vivo snel kan worden verloren tijdens weefseloogst. Aangezien TSLP aangetoond is de productie van humane B-celprecursoren te verhogen, werd 23 het functionele effect van TSLP in PDX geverifieerd door te analyseren voor in vivo toenames in de humane B-celprecursorpopulatie met behulp van flowcytometrie-immunofenotyping. Een alternatieve strategie kan worden geanalyseerd voor specifieke cytokine geïnduceerde veranderingen in gen expressie en compariNg expressie in cellen geoogst van cytokine-expressie PDX naar cellen uit controle PDX. 6
Het uiteindelijke doel van de expressie van menselijke cytokine in PDX is het genereren van een preklinisch model dat de in vivo omgeving die bij patiënten aanwezig is, nauwkeuriger modelleren. Dit werd getest door het vergelijken van volledige genoom expressie in menselijke weefsels die geïsoleerd zijn van controle PDX en van cytokine-expressie (TSLP +) PDX aan de oorspronkelijke patiëntmonsters. Deze studies toonden aan dat genuitdrukking in patiëntmonsters significant dichter bij leukemacellen van TSLP + PDX dan controles ligt. 6 Onze studies richten zich echter op lymfopoïese. Een aantal myeloïde bevorderende cytokinen die in de muis worden geproduceerd, activeren hun human receptor tegenhangers niet. Er zijn humane cytokine knockin muizen (NSGS muizen en anderen) die dit probleem aanpakken. Inderdaad, één waarde van het model dat we hier beschrijven, is dat het in NSGS-muizen gebruikt kan worden om een model te creëren dat meer sluitEly modellen de menselijke in vivo omgeving door TSLP te expressen naast myeloid-bevorderende humane cytokines. Anderzijds kan een cytokine +/- systeem gegenereerd worden in NSG-muizen onder toepassing van de hier beschreven methode voor elk van deze myeloïde bevorderende cytokinen. Dit model kan gebruikt worden om de precieze in vivo rol van elk van hen in myelopoieïs en / of myeloïde leukemie te bestuderen.
Geproduceerde PDX die fysiologische niveaus van de menselijke TSLP produceert, biedt een preclinisch model dat de in vivo omgeving die bij patiënten aanwezig is, beter naboots dan de klassieke PDX. 4 De productie van controle PDX-muizen die op dezelfde wijze zijn ontworpen, worden ook beschreven. Samen controle en cytokine-producerende PDX creëren een menselijk TSLP +/- model systeem dat we succesvol hebben gebruikt om de rol van TSLP bij de in vivo productie van normale en kwaadaardige menselijke B-cellen te evalueren. 4 , 6 DitModel is zeer relevant voor studies van een bepaalde risicovorm van B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) die wordt gekenmerkt door genetische veranderingen die leiden tot overexpressie van CRLF2. CRLF2 is een receptor voor het TSLP cytokine en dus TSLP geïnduceerde CRLF2 signaling draagt waarschijnlijk bij aan oncogenese en progressie van CRLF2 + B-ALL. Het gebruik van PDX om deze ziekte te bestuderen is bijzonder kritisch omdat PDX ons in staat stelt leukemie te bestuderen in de context van het genetische landschap van de patiënt. Genetisch landschap als ziekteverlener is sterk betrokken bij CRLF2 + B-ALL, die vijf keer vaker voorkomt in Spaanse / Latino-kinderen dan anderen en maakt de helft van alle B-ALL-gevallen in Down Syndrome-patiënten uit. PDX-modellen die menselijke TSLP uitdrukken, zoals die hier beschreven, zullen een belangrijk instrument zijn bij het identificeren van therapieën en het begrijpen van ziekte-mechanismen van CRLF2 + B-ALL, evenals voor het begrijpen van normale hematopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
