Summary
Hier beschrieben ist eine Methode zur Herstellung von exogenem Cytokin in Patienten-abgeleiteten Xenotransplantat (PDX) -Mäusen über eine wöchentliche intraperitoneale Injektion einer Cytokin-transduzierten Stromazellenlinie. Diese Methode erweitert den Nutzen von PDX und bietet die Möglichkeit für transiente oder nachhaltige exogene Cytokin-Zustellung in einer Vielzahl von PDX-Modellen.
Abstract
Patient-abgeleitete Xenotransplantat (PDX) -Mäuse werden durch Transplantation von menschlichen Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Diese Modelle sind ein wichtiges Instrument für das Studium der Mechanismen der normalen und malignen Hämatopoese und sind der Goldstandard für die Identifizierung effektiver Chemotherapien für viele Malignome. PDX-Modelle sind möglich, weil viele der Maus-Zytokine auch auf menschliche Zellen wirken. Allerdings ist dies nicht der Fall für alle Zytokine, darunter viele, die für das Studium der normalen und malignen Hämatopoese in menschlichen Zellen kritisch sind. Techniken, die Mäuse zur Herstellung von menschlichen Zytokinen (transgene und knock-in Modelle) erfordern, erfordern erhebliche Kosten, bevor die Nützlichkeit des Modells nachgewiesen wurde. Andere Techniken sind arbeitsintensiv (Injektion von rekombinantem Cytokin oder Lentivirus) und erfordern in manchen Fällen ein hohes Maß an technischem Fachwissen (hydrodynamische Injektion von DNA). Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode zur Erzeugung von PDX-Mäusen, die exogenes menschliches Cy habenTokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) über wöchentliche intraperitoneale Injektion von Stroma, die transduziert wurden, um dieses Zytokin zu überexprimieren. Die Verwendung dieser Methode liefert eine in vivo Quelle der kontinuierlichen Zytokinproduktion, die physiologische Konzentrationen von zirkulierendem menschlichem Zytokin in der Maus erreicht. Die Plasmaspiegel des menschlichen Zytokins können auf der Grundlage der Anzahl der injizierten Stromazellen variiert werden, und die Zytokinproduktion kann an jedem Punkt des Experiments initiiert werden. Diese Methode umfasst auch Cytokin-negative Kontrollmäuse, die in ähnlicher Weise produziert werden, aber durch intraperitoneale Injektion von Stroma, die mit einem Kontrollvektor transduziert wird. Wir haben zuvor gezeigt, dass Leukämiezellen, die aus TSLP-exprimierendem PDX gewonnen wurden, im Vergleich zu Kontroll-PDX ein Genexpressionsmuster mehr wie die ursprüngliche Patientenprobe aufweisen. Gemeinsam bilden die durch diese Methode hergestellten Cytokin-produzierenden und zytokin-negativen PDX-Mäuse ein Modellsystem, das wir erfolgreich eingesetzt habenRolle der TSLP bei normaler und malignen Hämatopoese.
Introduction
Patient-abgeleitete Xenotransplantate (PDX) sind ein leistungsfähiges In-vivo- Modell für das Studium der Produktion von normalen und malignen hämatopoetischen Zellen in einer "nativen" Säugetierumgebung. Am häufigsten werden PDX durch Injektion oder Verpflanzung menschlicher Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Die Produktion von PDX mit normalen menschlichen hämatopoetischen Stammzellen ermöglicht in vivo Studien über normales menschliches Blut und Immunzellenentwicklung. PDX, hergestellt aus Leukämie oder anderen Krebszellen, ermöglicht es, onkogene Mechanismen zu untersuchen und wirksame Therapien im Kontext der genetischen Landschaften und Mutationen, die in der menschlichen Bevölkerung vorhanden sind, zu identifizieren. 1 Infolgedessen sind PDX der gegenwärtige Goldstandard für die Translationsbiomedizinforschung, um wirkungsvolle Therapien zu identifizieren und ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen des Krebsfortschritts zu sein. PDX-Modelle sind ein wichtiges Instrument zur Unterstützung der Erforschung von gesundheitlichen Disparitäten Krankheiten aufgrund spezifischer Genetische Läsionen oder jede Krankheit, bei der die Variationen der genetischen Landschaft eines Patienten wesentlich zum Onkogenese- und Behandlungsergebnis beitragen können.
Maus-menschliche PDX-Modelle sind möglich, weil viele Maus-Zytokine adäquat ihre menschlichen Analoga bei der Aktivierung der Zytokin-Rezeptoren von menschlichen Zellen imitieren, während sie in der Maus sind. Beispielsweise liefert Interleukin-7 (IL-7) ein kritisches Signal für die menschliche B-Zell-Entwicklung. 2 In diesem Fall hat Maus IL-7 eine ausreichende Homologie mit humanem IL-7, dass das Maus-Zytokin Signalwege in menschlichen B-Zell-Vorläufern stimuliert. 2 , 3 , 4 Allerdings ist dies bei Thymus-Stromaz-Lymphopoetin (TSLP), 5 , 6 nicht der Fall , der unter anderen Zytokinen (IL-3, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Stammzellfaktor (SCF) ,Ref "> 7 ist wichtig für die Produktion von normalen und bösartigen menschlichen hämatopoetischen Zellen.Wenn Maus und menschliche Zytokine zeigen eine niedrige Homologie die Maus-Zytokine nicht aktivieren ihre jeweiligen Rezeptoren auf menschlichen Zellen.Um dieses Hindernis zu überwinden, wurden eine Reihe von Strategien verwendet Um die Expression von humanen Zytokinen in PDX-Mäusen zu entwickeln, darunter die Injektion von rekombinanten humanen Zytokinen, die hydrodynamische Injektion von DNA, die lentivirale Expression, die transgene Expression und den Knockin-Gen-Ersatz. 7 Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Herstellung von PDX zur Herstellung von menschlichem Cytokin über Stroma-vermittelte Zytokinabgabe ( Abbildung 1 ).
In der hier vorgestellten Methode werden PDX-Mäuse entwickelt, um das menschliche Zytokin, TSLP, zu exprimieren oder als Zytokin-Negativkontrollen zu dienen. TSLP-exprimierende PDX werden durch wöchentliche intraperitoneale Injektionen von Stromazellen erreicht, die transduziert wurden, um ein hohes Maß an menschlichem TSLP zu exprimieren.Cytokin-negative PDX-Kontroll-Mäuse sind ähnlich konstruiert; Obwohl Kontrollstroma mit einem Kontrollvektor transduziert werden. Diese Methode erreicht normale physiologische Werte von humanem TSLP in PDX-Mäusen, die mit dem TSLP + Stroma injiziert wurden. Bei PDX-Mäusen, die das Cytokin-negative Stroma erhalten, wird kein nachweisbares TSLP beobachtet. Wir haben die menschliche Stromzelllinie HS-27A für unsere Studien ausgewählt, weil sie in der Kultur robust wächst und eine sehr geringe Zytokinproduktion zeigt, die die Proliferation von isolierten Vorläuferzellen in Kokulturen nicht unterstützt. 8 Für die menschliche TSLP-Expression wurden Stroma mit einem fortgeschrittenen, selbstinaktivierenden lentiviralen Vektor transduziert, der aus einem zuvor beschriebenen Rückgrat 9 gewonnen wurde, und umfasst das cPPT / cts-Element und das Woodchuck-Hepatitis-posttranskriptionelle regulatorische Element (WPRE), um die Transgenexpression zu erhöhen. Das menschliche TSLP-Gen wurde unter der Kontrolle des Elongationsfaktors-1 in diesen Vektor konstruiert(EF-1) alpha-Promotor, um eine robuste, konstitutive und langfristige Expression zu erreichen.
Die Technik dieses menschlich-zytokinverstärkten PDX-Modells besteht aus 4 Hauptschritten. Zuerst werden transduziertes Stroma in vitro expandiert und durch enzymgebundenen Immunosorbens-Assay (ELISA) für eine stabile, hochgradige Zytokinproduktion bewertet. Zweitens wird die Aktivität der menschlichen Zytokine, die durch die transduzierten Stromazellen (und der Mangel an Zytokinaktivität aus Kontrollstroma) erzeugt wird, unter Verwendung von Phospho-Flow-Zytometrie verifiziert. Zelllinien, von denen bekannt ist, dass sie auf Cytokin von Interesse (in diesem Fall TSLP) reagieren, werden mit dem stromalen Zellüberstand inkubiert und auf Zytokin-induzierte Phosphorylierung untersucht. Drittens werden Mäuse mit transduziertem menschlichem Stroma injiziert und dann wird das Mausplasma durch den ELISA auf der Ebene des menschlichen Zytokins auf wöchentlicher Basis beurteilt. Viertens werden menschliche hämatopoetische Zellen transplantiert und die in vivo funktionellen Effekte des menschlichen Zytokins werden auf einem bekannten Ziel ( Die Zufuhr von humanem Cytokin über Stromazellen bietet sowohl Vor- als auch Nachteile im Vergleich zu anderen Methoden der Bereitstellung / Herstellung von menschlichen Zytokinen in PDX-Mäusen. 7 Im Vergleich zur Injektion von rekombinantem humanem Cytokin ist die Stroma-vermittelte Verabreichung im Allgemeinen weniger teuer (die Kosten der Stromazinkultur sind weniger als die Kosten des rekombinanten Cytokins) und weniger arbeitsintensiv (eine Injektion pro Woche gegenüber mehreren Injektionen pro Woche). Die Frage der kurzen Zytokin-Halbwertszeit wird ebenfalls gemildert, da Stroma kontinuierlich das exogene Cytokin produziert. Die Verabreichung von Zytokin über die hydrodynamische Injektion von DNA kann weniger teuer sein als die Lieferung über Stroma. Allerdings ist es ähnlich vorübergehend und kann mehr technische Fähigkeiten erfordern als die einfache wöchentliche intraperitoneale Injektion, die für die Stroma-vermittelte Lieferung erforderlich ist. Die lentivirale Genexpression in der Maus kann wenigerNsient Methode der Zytokin-Lieferung; In unseren händen wurden jedoch physiologische TSLP-Werte nicht erreicht. Darüber hinaus ist diese Methode arbeitsintensiv und erfordert eine kontinuierliche Produktion von lentiviralen Vektor. Transgene oder knock-in Mäuse bieten eine stabile Langzeit-Expression von Zytokin und können für die gewebespezifische Expression entwickelt werden, was ein Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite erfordert die transgene Expression des menschlichen Zytokin-Gens auf dem immune defizienten Maushintergrund, der für PDX-Mäuse erforderlich ist, eine immense Investition von Ressourcen, bevor der Wert des Modells hergestellt wurde. Darüber hinaus erlauben transgene Modelle im Allgemeinen nicht die Möglichkeit, den Zeitpunkt der Zytokininitiierung oder des Grades der in vivo- Zytokinproduktion zu variieren. Diese können mit der Stroma-vermittelten Verabreichung durch einfaches Ändern des Zeitpunkts für die Initiation der Stromazelleninjektion oder der Dosis der injizierten Stromazellen erreicht werden. Die stromalzellvermittelte Cytokin-Abgabe methOd hier wurde verwendet, um PDX für die Bewertung der Rolle von TSLP in der normalen menschlichen B-Zell-Entwicklung 4 , 6 und hoher Risiko B-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie zu entwickeln. 6 Diese Methode stellt eine alternative Cytokin-Verabreichungsmethode zur Verwendung bei der Erzeugung von ähnlichen Modellen mit menschlichen Zytokinen außer TSLP zur Verfügung. Dieses Modell kann auch nützlich sein, um vorläufige Daten zu erzeugen, die helfen können, festzustellen, ob der Wert eines Zytokin-transgenen oder zytokinischen Klopf-in-PDX-Modells der erheblichen Zeit- und Geldinvestition würdig wäre. 
Abbildung 1: PDX-Modell entwickelt, um exogenes menschliches Cytokin in Mäusen zu produzieren. ( 1A ) Design-Experiment und erhalten transduzierte menschliche Stromazellen ( 1B ) Erhalten menschliche Zellen (hämatopoetische Stammzellen, Leukämie-Zellen, etc. ), um PDX (Patient-abgeleitete Xenotransplantat) Mäuse zu erzeugen. ( 2A ) Injizieren Sie konstruiertes Stroma und ( 2B ) transplantieren menschliche Zellen in immune defiziente Mäuse nach experimentellen Zeitplan. ( 3A-B ) Überwachen Sie die Zytokinkonzentrationen im Stroma-Überstand und das Maus-Plasma durch ELISA. ( 4 ) Ernten Sie menschliche Zellen und beurteilen Sie die in vivo funktionellen Effekte des im PDX vorhandenen menschlichen Zytokins. Klicken Sie bitte hierUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Protocol
Studien wurden in Übereinstimmung mit Loma Linda University's Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) und Institutional Review Board (IRB) genehmigt Protokolle und nach allen Bundesrichtlinien durchgeführt.
ACHTUNG: PDX und menschliches Gewebe sollten nach Sicherheitsverfahren behandelt werden, um die Übertragung von Blut übertragenen Krankheitserregern zu verhindern.
1. Kultur und Erweiterung von Cytokin-transduzierten Stromzellen
ANMERKUNG: Jedes Mal, wenn Stroma passagiert sind, ernten Sie den Kulturüberstand (1 ml Aliquot) und lag bei -80 ° C für die zukünftige Quantifizierung des Zytokinspiegels über den ELISA-Test.
- Bereiten Sie R10-Kulturmedium und Gefriermedium, wie in der Tabelle der Materialien beschrieben, vor.
- Generieren Sie 10 , 11 oder erhalten Sie Kontrollstroma (transduziert mit leerem Vektor) und Zytokin-produzierenden (TSLP +) Stroma."> 6 In flüssigem Stickstoff (LN 2 ) bis zur Verwendung aufbewahren, wie beschrieben 12 auftauen und in 5 ml R10-Medium in getrennten T-25-Zellkulturkolben pipettieren. Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 Dies ist nach der Tauwetter "Passage # 1".
- Sobald Stroma konfluent sind (24-48 h), Durchgangszellen durch Trypsinierung unter Verwendung von 1 × Trypsin-EDTA (0,25%) und Umplattieren in einem T-150 Kulturkolben. Dies ist nach der Tauwetter "Passage # 2".
- Wenn Stroma die Konfluenz in den T-150-Flaschen (3-4 Tage später) erreichen, durchlaufen die Zellen durch Trypsinisierung. Verwenden Sie diese Zellsuspension für experimentelle Bedürfnisse.
- Zellexpansion zu Mehrkolben
- Die geernteten Zellen zwischen drei T-150 Flaschen und Kultur bis zur Konfluenz aufteilen. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn eine Stromverlängerung erforderlich ist. Typische menschliche stromale (HS-27A) Zellzahl am Zusammenfluss in einem T-150-Kolben ist ~ 5 x 10 6 .
- Zellensich aufregen
- Die geerntete Zellsuspension auf ein konisches Röhrchen überführen und 5 min bei 500 xg zentrifugieren, den Überstand dekantieren und die Zellen im Gefriermedium auffrischen. Gefrieren und lagern in LN 2 ~ 1,5 x 10 6 Zellen pro Durchstechflasche.
- Für intraperiotoneale Stroma-Injektionen in Mäuse geht es weiter mit Schritt 4.1.
- Zellexpansion zu Mehrkolben
2. ELISA-Assays zur Überwachung der In-vitro- Cytokin-Produktion aus transduziertem Stroma
- Kaufen Sie im Handel erhältliches ELISA-Assay-Kit, um das interessierende Cytokin zu erkennen.
- Tauen Sie den stromalen Zellüberstand von der Kontrolle und dem Zytokin produzierenden (TSLP +) Stroma, das in frühen, mittleren und späten Passagen geerntet wurde (Abbildung 2 ).
- Bestimmen Sie die TSLP-Konzentration in überstehenden Proben mit einem ELISA-Kit gemäß Herstelleranweisung. 13 Kompilieren Sie diese seriellen Daten, um die Stabilität der Zytokinproduktion während der Zellkultur zu überwachen E ( Fig. 2A-B ).
- Identifizieren und verwerfen von Zytokin-produzierendem Stroma mit reduzierter oder suboptimaler Zytokin-Expression sowie jeglichen entsprechenden Fläschchen in der Lagerung (Abbildung 2A-B ).
- Identifizieren und Aufrechterhalten von Zytokin-produzierenden Stroma, die stabile, hochgradige Zytokinkonzentrationen zeigen. Verwenden Sie diese Tauwetter für Experimente.
- Verwenden Sie das ELISA-Kit, um das Stroma während der gesamten Dauer der Zellkultur (mindestens 1 Mal während der frühen, mittleren und späten Nachtauung) routinemäßig zu überwachen, um eine stabile Cytokinproduktion oder im Falle von Kontrollstroma die Abwesenheit der Zytokinproduktion zu gewährleisten .
3. Phospho-Flow-Cytometrie-Assays zur Bewertung der Aktivität von Cytokin, hergestellt von Stroma
HINWEIS: Überprüfen Sie den Überstand vor dem ersten Experiment, um die relevante Bioaktivität des Stroma-erzeugten Zytokins für einzelne Experimente zu überprüfen.Ef "> 6 Sobald das konstruierte Stroma validiert ist, ist eine weitere Prüfung nicht notwendig, wenn kein Stroma eingeführt wird, das mit einem neuen Vektor hergestellt wurde.
- Erwerben Sie MUTZ5- und / oder MHH-CALL4-Leukämie-Zelllinien (TSLP-responsive), 14 rekombinantes humanes Cytokin und Antikörper, die für die Verwendung in Phospho-Flow-Zytometrie-Assays zugelassen sind, um geeignete nachgeschaltete Phosphorylierungsziele zu detektieren.
- Tau geernteten Überstand aus Kontrolle und Zytokin-exprimierenden Stroma.
- Tafeln Sie die Leukämie- Zelllinien in R20-Medium (siehe Tabelle der Materialien ) in einer Konzentration von 0,2 x 10 & sup6; Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Tafel 3 Vertiefungen pro Zustand, um dreifache Assays zu ermöglichen. Inkubieren für 2 h bei 37 ° C. Diese Zeit ermöglicht den Verlust einer Phosphorylierung, die während früherer Kulturbedingungen auftrat.
ANMERKUNG: 12 Vertiefungen pro Zelllinie liefert dreifache Assays für jeden in Schritt 3.4 gezeigten experimentellen Zustand. <Li> Nach 2 h in Kultur die Zellen aus jeder Vertiefung zu trennen, um 4 ml Röhrchen zu trennen und bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C zu zentrifugieren. Dekantieren den Überstand. - Die Zellen in 200 μl für jede der folgenden experimentellen Bedingungen erneut suspendieren (Assays in dreifacher Ausfertigung durchführen): 1) nur negative Kontrollmedien, 2) positives Kontrollmedium mit rekombinantem Cytokin bei Sättigungskonzentration (s) (TSLP bei 15 ng / Ml, etc. ), 3) Kontrolle des Stroma-Überstandes aus Kontrollstroma und 4) Zytokin-Stroma-Überstand aus Zytokin-produzierendem Stroma.
- Inkubieren Sie die Zellen für die Dauer, die durch spezifische kommerzielle Phospho-Assay ( z. B. 30 min für Phospho-STAT5 in MUTZ5 oder MHH-CALL4 als Reaktion auf TSLP) angegeben ist.
- Bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
- Durchführen von Phospho-Flow-Zytometrie-Färbung pro Hersteller-Protokoll und sammeln Durchflusszytometrie Daten. 15
- Gate auf intakten Zellen basierend auf Vorwärts (FSC, zeigt Zellgröße) und Seite (SSC, zeigt Zellgranularität) Lichtstreuung.
- Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der intakten Zellen in jeder Probe. Vergleichen Sie den durchschnittlichen MFI, der aus den dreifachen Werten des Stromazellenüberstandes gewonnen wird, zu dem der positiven und negativen Medienkontrollen.
4. Injektion von Cytokin-transduzierten Stroma in Mäuse
HINWEIS: Kultur HS-27A Stroma für mindestens 3 Nach-Tau-Passagen vor der Injektion sie in Mäuse, um gesunde Zellen und ausreichende Zytokin-Produktion zu gewährleisten.
- Vorbereitung von Stroma
- Die geerntete Stromaztensuspension auf ein konisches Röhrchen übertragen und 10 μl für die Hämocytometerzahl aliquotieren; Erhalten Sie die lebende Zellzahl mit Trypanblau. 16 Die restliche ce zentrifugierenLl Suspension bei 500 xg für 5 min.
- Ansaugen des Überstandes aus den pelletierten Zellen und sanftes Resuspendieren der Zellen in dem notwendigen Volumen der sterilen phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) für die Mausinjektion (abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Mäuse).
HINWEIS Typische stromale Zellkonzentration für die Mausinjektion: 0,5 x 10 6 -5 x 10 6 Zellen pro Maus in 200 μl PBS. - Halten Sie die Stromzelle Suspension bei 4 ° C (oder auf Eis) bis unmittelbar vor der Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension mindestens bei Raumtemperatur (RT) (~ 25 ° C) für Mäuseinjektion ist.
- Stromzelle Injektion
- Desinfizieren Sie die Bio-Schutzhaube, montieren Sie Materialien für Injektionen und legen Sie dann den Mauskäfig hinein.
- Die Zellsuspension vor der Inversion vor dem Aufziehen von 200 μl in eine Tuberkulinspritze vorsichtig mischen.
- Mit Standard-Intra-Peritoneal-Injektionstechniken, 17Die Maus zurückhalten und die 200 μL Zellsuspension in die Peritonealhöhle verabreichen. Details wurden bisher von Machholz et al. 18
5. Serielle Blutentnahme und Plasmaüberwachung für exogenes menschliches Cytokin bei Mäusen
- Blutsammlung über Schwanzschneider
- Desinfizieren Sie die Biosafety-Kapuze und montieren Sie den Mausrestrainer, die Scheren und andere Werkzeuge / Vorräte für das Verfahren.
- Legen Sie die Maus in einen Restrainer und sichern Sie die Tube, um die Mausbewegung zu minimieren.
- Desinfizieren Sie den Schwanz und die chirurgische Schere mit Isopropylalkohol. Tragen Sie topische Anästhesie Creme auf den Schwanz.
- Mit sehr scharfen chirurgischen Scheren schnippen Sie etwa 0,5 - 1 mm der Spitze des Schwanzes der Maus. Sammeln Sie etwa 80 μl peripheres Blut mit heparinisierten Kapillarröhrchen.
HINWEIS: Wenn Blut mit dieser Methode mehr als sechs ti gesammelt wirdMes, Schwanz Entfernung sollte konservativ in Bezug auf die Menge an Schwanz entfernt werden. Als Snips den Schwanz fortschreiten, steigt der Durchmesser, er hemmt schneller und die Heilung dauert länger.
- Plasma-Trennung
- Übertragen Sie das Blut mit einer Glühbirnenspritze (um es aus den Kapillarrohren zu vertreiben) in ein markiertes K 2 EDTA Mikrotainerrohr; 20 mal umdrehen, um die Koagulation zu verhindern.
HINWEIS: Normalerweise ist die Blutgerinnung aus dem Schwanzspalt schnell. Allerdings, wenn die Blutung länger als ~ 2 min besteht, verwenden Sie einen styptischen Bleistift / Pulver, um die Koagulation zu unterstützen. - Zentrifugen von Blutentnahmeröhrchen nach Anweisung des Herstellers und aliquotieren das Plasma zur Lagerung (-20 ° C) bis zum ELISA-Test.
- Wenn Maus-Mensch-Zelle Chimärismus Daten aus dem Maus-Blut benötigt wird, dann behandeln die restlichen Pellets wie in Schritt 6.3.1 beschrieben. Andernfalls verwerfen Sie das Blutzellpellet.
- Übertragen Sie das Blut mit einer Glühbirnenspritze (um es aus den Kapillarrohren zu vertreiben) in ein markiertes K 2 EDTA Mikrotainerrohr; 20 mal umdrehen, um die Koagulation zu verhindern.
- Modifizierter ELISA für Mikro-VolUmes von Mausplasma
HINWEIS: Das ELISA-Verfahren des Herstellers wurde von dem empfohlenen 100 μl Probenvolumen auf ein Volumen von 40 & mgr; l modifiziert, um die von Mäusen gesammelten Mikrovolumina aufzunehmen. Es ist nicht möglich, die In-vivo- Maus-Plasmaproben in dreifacher Ausfertigung mit diesen begrenzten Volumina zu führen. Am Ende des Experiments werden 500 μl post-mortem Blut über Herzpunktion gesammelt. Cytokinkonzentrationen, die in 100 & mgr; l Euthanasieplasma bewertet wurden, werden verwendet, um die 40 & mgr; l in vivo Daten für jede Maus zu validieren.- Tauen Sie gefrorene Mausplasmaproben auf.
- Seriell verdünnte ELISA-Standards verdünnen und in dreifacher Ausfertigung mit 40 μl pro Vertiefung pipettieren.
- Füge 40 μl jeder Maus-Plasmaprobe der ELISA-Platte zu.
HINWEIS: Wenn eine Mausprobe weniger als 40 μl beträgt, dann bringen Sie das Volumen auf 40 μl mit ELISA-Puffer. Notieren Sie dieses Verdünnungsmittelvolumen und verwenden Sie es, um einen Verdünnungsfaktor für jede verdünnte Probe zu berechnen. WannDie Analyse der ELISA-Daten multipliziert die verdünnte Probenkonzentration mit dem Verdünnungsfaktor der Probe, um die tatsächliche Zytokinkonzentration in der ursprünglichen Probe zu bestimmen. - Kompletter ELISA-Test nach Herstellerangaben.
6. Transplantation von Hämatopoetischen Zellen zu Mäusen
- Subletale Bestrahlung zur Bedingung des Knochenmarks für die Transplantation
ANMERKUNG: Die Loma Linda Universität (LLU) verwendet eine Cobalt-60 Strahlungsquelle. Die Tiere werden in einen Kuchenrestrainer gelegt, der 80 cm von der Strahlungsquelle in einem 20 x 20 cm großen Feld und mit einer 0,5 cm langen Lexanschicht auf dem Rückhalter angeordnet ist. Die Belichtungszeit wird berechnet, um eine 225 cGy-Dosis basierend auf der jüngsten Kalibrierung der Quelle zu erreichen (derzeit 2-3 min für diese Quelle).- Unter-letale Bestrahlung von Mäusen (Gesamtkörper-Bestrahlungsdosis von 225 cGy Maximum für immundefiziente Mäuse).
- Transplantation hämatopoetischen Zellen ~ 24 h später über </ Em> intravenöse Schwanzveneninjektion
- Intra-venöse hämatopoetische Zelltransplantation
- Bereiten Sie menschliche Zellsuspensionen für das Transplantat in einem Volumen von 200 μl sterilem PBS pro Maus vor: CD34 + hämatopoetische Stammzellen (HSC): 1 x 10 5 bis 5 x 10 5 Zellen pro Maus und Leukämiezelllinien / Patientenproben: 1 x 10 6 to 5 x 10 6 Zellen pro Maus.
- Halten Sie die Zellen bei 4 ° C (Transport auf Eis) bis unmittelbar vor der Transplantation. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vor der Transplantation mindestens bei RT liegen.
- Desinfizieren Sie die Bio-Schutzhaube und bereiten Sie den Haubenbereich für Transplantatinjektionen vor.
- Legen Sie die Maus für mindestens 5 Minuten in den wärmenden Käfig, um eine Erweiterung der Schwanzvenen zu ermöglichen.
- Die Zellsuspension vorsichtig mischen und 200 μl in eine Tuberkulinspritze auftragen. Sicher die Nadel beiseite legen, wo es steril bleibt.
- Legen Sie die Maus in eine Zurückhaltung und desinfizieren Sie den Schwanz mit Isopropylalkohol. </ Li>
- Mit Standard-intravenösen Injektionstechniken, 17 injizieren die menschliche Zelle Suspension in Maus Schwanz Vene.
HINWEIS: Schwanzveneninjektionen können mehrere Versuche durchführen, vor allem für einen Anfänger Tierhandler. Kovacscics und Raper's JoVE Video 19 bietet detaillierte Demonstration dieser Tiertechnik. - Überwachen Sie die Wiederherstellung der Maus für ~ 5 min. Aufzeichnen von unerwünschten Ereignissen während der Injektion ( z. B. verschüttete Zellen, große Blutung, übermäßiges Schwanztrauma).
- Analyse der menschlichen Zelle Chimärismus in Maus peripheres Blut
- Erhalten Sie das nach der Plasmaseparation verbleibende Blutzellpellet in der Mikrotiterröhre (Schritt 5.2.3).
- Für die rote Blutkörperchen (RBC) Lyse, resuspendieren die verbleibenden Blutpellets in einem Volumen von PBS gleich Plasma entfernt (um Plasma Volumen zu ersetzen) und gut mischen (Vortex / Pipette).
- Übertragen Sie jede wieder suspendierte Blutprobe auf ein markiertes 4-ml-RöhrchenUnd dann RBC-Lysepuffer zu jedem Röhrchen in einem 1: 9-Verhältnis (900 & mgr; l RBC-Lysepuffer für 100 & mgr; l re-suspendiertes Blut) hinzufügen. 5 min bei RT inkubieren. Zentrifuge (5 min, 500 xg) und dekantieren.
- Zweite RBC-Lysepuffer-Inkubation durchführen (5 min bei RT). Zentrifuge und dekantieren wie zuvor.
- Waschen Sie die restlichen Zellen in ~ 1 ml PBS. Zentrifuge und dekantieren wie zuvor.
- Resuspendieren des Pellets in einem PBS-Volumen, das für die Standard-Durchflusszytometrie-Färbung geeignet ist (dies variiert je nach Hersteller und individuellen Laborprotokollen). 20 Verwenden Sie immunphänotypisierende Antikörper, die für den Durchflusszytometer validiert wurden, um die Mauszellen (Maus CD45 +) und menschliche Zellen (humanes CD45 +) 6 , 21 zu identifizieren Sowie zusätzliche menschliche Leukozytenmarker, die für die Zelllinie von Interesse spezifisch sind.
HINWEIS: Es wird empfohlen, von jeder Mausprobe ein kleines Volumen (5 μL-20 μL) zu nehmen, um "gepoolte Proben"; Für ungefärbte, lebensfähige und isotypische Kontrollproben zu verwenden. Es ist die beste Praxis, ungefärbte und isotypische Kontrollen für jeden experimentellen Zustand zu haben.
7. Funktionelle Auswertung der In-vivo- Cytokin-Aktivität
- Maus-Euthanasie und Gewebeernte
- Euthanisieren Mäuse über CO 2 Erstickung zu bestimmten experimentellen Zeitpunkt.
- Ernte Blut über Herzpunktion und sammle Plasma wie in den Schritten 5.2.1-5.2.2.
HINWEIS: Sammeln Sie das Blut vor anderen Geweben, weil es beginnt, sofort nach dem Tod zu koagulieren. - Verarbeiten Sie das Mausblut, aliquotieren und speichern Sie Plasma wie in Schritt 5.2.2.
- Zu einem späteren Zeitpunkt die exogene Zytokinkonzentration im Plasma, die bei der Euthanasie über ELISA nach dem Protokoll des Herstellers erhalten wird, beurteilen. Auswertung und Vergleich exogener Zytokinkonzentrationen im Mausplasma aus der seriellen in vivoBlutentnahme und die Euthanasie-Plasmaproben (siehe Abschnitt 5.3).
- Füge PBS zur verbleibenden Blutprobe hinzu, um das Plasmavolumen zu ersetzen und wie in den Schritten 6.3.1 und 6.3.2 beschrieben zu verarbeiten. Durchführen von Durchflusszytometrie-Assays sofort oder resuspendieren Zellen im Gefriermedium für LN 2- Speicherung.
- Ernten Sie Knochenmark (BM) und Milz von PDX-Mäusen und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen wie zuvor beschrieben vor. 22
- Erhalten Sie Zellzählungen für jede PDX-Mausgewebeprobe unter Verwendung von 3% Essigsäure mit Methylenblau (Lyseszellmembranen und RBCs, die intakte Kerne von lebenden Zellen verlassen) in einer 1: 1-Verdünnung und zählen Sie Zellen mit einem Hämocytometer. Tabulieren Sie die Gesamtzellzahl für Knochenmark und Milzproben für jedes Tier.
- Zentrifuge (500 xg, 15 min) Zellsuspensionen und dekantieren den Überstand. Durchflusszytometrie-Assays von Knochenmark und / oder Milzzellen sofort durchführen oder im Gefriermedium für LN <resuspendierenSub> 2 Speicher.
HINWEIS: Einfrieren von 10 BM-Aliquoten (für zukünftige biochemische Assays) und ~ 5 Milzaliquots (für zukünftige PDX-Transplantationen) pro Maus. - Immunphänotypisierung zur Identifizierung von in vivo funktionellen Effekten
- Bereiten Sie einen Master-Mix (MM) von Durchflusszytometrie-Antikörpern gegen Immunophenotyp-hämatopoetische Population (en) in Reaktion auf das interessierende Cytokin und eine zweite MM von Isotyp-Kontroll-Antikörpern vor (Abbildung 5 und Tabelle der Materialien).
- Tau-PDX-Gewebealiquots (37 ° C Wulstbad), hergestellt in Schritt 7.4.
- Waschen Sie die aufgetauten Zellen, indem Sie sie auf ein konisches Röhrchen übertragen und das kleinste 3fache Volumen an PBS hinzufügen. Zentrifugieren (500 xg, 5 min) und dekantieren den Überstand.
- Wiederholen Sie den Waschschritt (7.5.3).
- Erstellen Sie gepoolte Aliquots, indem Sie ~ 10 μL-20 μL Zellen aus jeder PDX-Probe für die ungefärbte Kontrolle, die Lebensfähigkeitssteuerung und die Isotyp-Kontrollen (siehe Schritt 6.4.6 Note) aufnehmen. Färben Sie alle Proben, außer der uNfained Kontrolle, mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Farbstoff (tote Zell-Marker), inkubieren und waschen wie pro Hersteller-Protokoll.
- Färben Sie jede PDX-Zellprobe mit Phänotyping-MM gemäß Standard-Durchflusszytometrie-Färbung Protokoll; Ähnlich färben Sie die gepoolte Isotyp-Kontrollprobe (s) mit dem Isotyp-MM. Inkubieren Sie alle Proben, waschen Sie mit PBS und fixieren Sie Proben durch erneutes Suspendieren in 1% Paraformaldehyd.
- Sammeln Sie Durchflusszytometrie-Daten und analysieren Sie Daten unter Verwendung einer Gating-Strategie, die für die interessierende Zellpopulation (en) geeignet ist (Abbildung 5 ). Ein typisches Tor ist wie folgt:
- Definieren Sie intakte Zellen, indem Sie ein FSC- und SSC-Tor zeichnen, das Schutt ausschließt.
- Identifizieren Sie die lebende Zellpopulation, indem Sie auf Zellen treiben, die für den toten Zellmarker negativ sind (dies ist die "totale lebende Zellen").
- Verwenden Sie Sub-Gates innerhalb der "totalen lebenden Zellen", um die Zellpopultionen mit dem gewünschten Immunophenotyp zu definieren (siehe Abbildung 5).
- Erhalten Sie dieHäufigkeit der Teilmengenzellpopulationen innerhalb der gesamten lebenden Zellzahl aus der Durchflusszytometrieanalyse. 6 , 21
- Berechnen Sie die Anzahl der Zielzellen in jedem Gewebe durch Multiplikation der Häufigkeit der B-Zell-Untermenge innerhalb der gesamten lebenden Zellen (erhalten in Schritt 7.5.6.4) durch die gesamte lebende Zellzahl pro Gewebe, erhalten in Schritt 7.3 (% B-Zell-Teilmenge x " Hämocytometer-Zellzahl ", siehe Tabelle 1 )
- Vergleichen Sie die Zellzahlen von Zielzellpopulationen zwischen Kontroll-PDX-Mäusen und Cytokin-exprimierenden (TSLP +) PDX-Mäusen, um in vivo funktionelle Effekte des exogenen menschlichen Zytokins zu bestimmen ( Tabelle 1 ).
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Representative Results
Eine Übersicht über das Modell ist in Abbildung 1 dargestellt . Sobald Cytokin-produzierende (TSLP + Stroma) und Kontrollstroma erhalten wurden, werden sie in Kultur expandiert. Vor der Stroma-Injektion in Mäuse wird der stromale Zellüberstand durch ELISA zur Überprüfung der Zytokinproduktion (Abbildung 2 ) und der Phospho-Flow-Zytometrie (Protokoll Nr. 3) beurteilt, um die Aktivität des durch das Stroma erzeugten Zytokins zu verifizieren. Der Überstand wird aus konfluenten Stromazellenkulturen (Kontrollstroma und TSLP + Stroma) gesammelt, wenn die Zellen passagiert sind. ELISA wird verwendet, um die Konzentration von TSLP im Überstand mindestens einmal in frühen, mittleren und späten Passagen zu überwachen. Repräsentative Daten aus Kontrollstroma sind in Fig. 2A gezeigt . Kontrollieren Sie stromale Zellkulturen, die TSLP-Expression zeigen (und jegliche Fläschchen, die von ihnen heruntergefroren sind) sollten verworfen werden. Kontrollkulturen mit nicht nachweisbarem TSLP werden erweitert und für zukünftige Verwendung eingefroren.Wie in 2B gezeigt, werden Kulturen von TSLP + Stroma, die eine niedrige TSLP-Produktion zeigen (und von ihnen eingefrorene Fläschchen), verworfen. TSLP + Stroma, die eine stabile, hochrangige Produktion des Zytokins zeigen, werden für die Expansion und Lagerung für den Einsatz in zukünftigen Experimenten ausgewählt. Durchschnittliche Werte von TSLP im Überstand aus mehreren Kulturen der Kontrolle und TSLP + Stroma sind in Abbildung 2C gezeigt .
Die experimentelle Zeitleiste für die Herstellung von Kontroll-PDX-Mäusen mit humanem Cytokin ist in Abbildung 3 dargestellt. Strom-Zellkulturen werden 3 Wochen vor der Transplantation initiiert und der ELISA-Assay der in vitro- TSLP-Produktion im Kulturüberstand wird wie in Abbildung 2 beschrieben durchgeführt . In vivo wird menschliches TSLP im Mausplasma wöchentlich überwacht (Abbildung 4 ) unter Verwendung des "modifizierten ELISA" Mikrovolumen von Mausplasma ", beschrieben in Protokoll Nr. 4. PeripheraL Blut wird gleichzeitig mit Plasma gesammelt und wird wie in Protokoll Nr. 6 unter "Analyse des menschlichen Zellchimärismus im Maus-peripheren Blut" beschrieben untersucht. PDX, das mit Kontrollstroma injiziert wurde, zeigte konsequent Plasma-menschliche TSLP-Werte, die unterhalb des Schwellenwerts für die Detektion liegen (Abbildung 4A ). Der Plasmaspiegel von TSLP in PDX-Mäusen, die mit TSLP + Stroma injiziert wurden, ist proportional zur Anzahl der in den vorangegangenen 1 - 2 Wochen injizierten TSLP + Stromazellen. Die Plasmaspiegel von TSLP fallen schnell ab, wenn Stromazellen-Injektionen abgebrochen werden. Wie in Fig. 4B gezeigt , zeigten wöchentliche Injektionen von 0,5 x 10 & sup6; TSLP + Stroma (durchschnittlich> 1000 pg / ml TSLP im Kulturüberstand) Plasma-TSLP-Spiegel nahe der unteren Grenze der physiologischen Niveaus (~ 5-10 pg / ml ). Die wöchentliche Injektion von 5 x 10 & sup6; TSLP + Stroma in PDX-Mäusen führte zu Plasma-TSLP-Werten, die hohe physiologische Werte (~ 35 pg / ml) erreichen, wie in gezeigt
TSLP hat gezeigt, dass die Produktion von normalen menschlichen B-Zell-Vorläufern zu erhöhen. 23 Um die in vivo Funktion von TSLP zu bewerten , verglichen wir das Produkt Ionen von normalen menschlichen B-Zellvorläufern in der Kontrolle und TSLP + PDX-Mäuse, die mit hämatopoetischen Stammzellen transplantiert wurden, wie in 5 und in Tabelle 1 gezeigt . Fig. 5A zeigt die Durchflußzytometrie-Gating für die Immunphototypisierung, die verwendet wird, um Teilmengen von menschlichen B-Linienzellen zu identifizieren. Beispielberechnungen zur Aufzählung der Anzahl von Zellen in jeder Teilmenge für eine Steuerung PDX und eine TSLP + PDX sind in Tabelle 1 dargestellt. Wie in 5B gezeigt, sind B-Linienzellen in TSLP + im Vergleich zu Kontroll-PDX signifikant erhöht und diese Zunahme beginnt mit den frühesten B-Zell-Vorläufern (Pro-B-Zellen). Die Anzahl der Nicht-B-Linienzellen war nicht signifikant unterschiedlich zwischen Kontrolle und TSLP + PDX (Daten nicht gezeigt). Dieser Assay bietet einen Weg, um zu überprüfen, dass das in TSVP + PDX in vivo produzierte menschliche TSLP in vivo funktionelle Effekte auf eine Zielzellpopulation ausübt.
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Abbildung 2: ELISA zur Überwachung von TSLP-Cytokinkonzentrationen im Stroma-Überstand. ELISA-Assays wurden verwendet, um die TSLP-Konzentrationen im Überstand aus Kontrollstroma (transduziert mit Kontrollvektor) und TSLP + Stroma (transduziert, um menschliches TSLP zu exprimieren) mindestens einmal während der folgenden Zellpassagen zu messen: früh (Durchgang 1-5), Mitte (Passagen 6-12) und spät (Passagen 13-20). Die Nachweisgrenze für den hier verwendeten humanen TSLP-ELISA-Assay beträgt 1,9 pg / ml (rote gestrichelte Linie). ( A ) Kontrollstroma produzieren minimal nachweisbare menschliche TSLP-Konzentrationen; Diese Werte liegen im Allgemeinen unterhalb der ELISA-Erkennungsschwelle für die Dauer des Experiments. Kontroll-Stroma in Kultur, die zunehmende TSLP-Konzentrationen (> 15 pg / ml) zeigen, werden zusammen mit allen aus dieser Kultur eingefrorenen Aliquoten verworfen. ( B ) Die menschliche TSLP-Produktion variiert zwischen den Kulturen, die aus dem Unterschied gemacht wurdenT aufgetaute Phiolen von TSLP + Stroma ( n = 9) und während der gesamten Kulturperiode. TSLP-Stroma, die eine verminderte oder instabile Zytokinproduktion zeigen (TSLP <1.000 pg / ml), werden ebenfalls verworfen. ( C ) Durchschnittliche TSLP-Konzentrationen für die Kontrolle (grün) und TSLP + (blau) Stroma (Mittel und 95% Konfidenzintervalle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Experimentelle Zeitleiste zur Erzeugung von PDX-Mäusen mit exogener Mensch-Zytokin-Produktion. In vitro und in vivo treten Teile des Experiments gleichzeitig auf. Kontroll- und + TSLP-Stroma-Zellkultur wird 2-3 Wochen vor der hämatopoetischen Zelltransplantation initiiert, die ein Minimum von 3 Zellpassagen vor dem ersten (atWk -1) der wöchentlichen Stromazellen-Injektionen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Stromazellen gesund, proliferativ sind und ausreichende Zytokinspiegel produzieren. Überstandsaliquots werden gesammelt, wenn Zellen passagiert sind und ELISA-Assays verwendet werden, um die TSLP-Konzentration (siehe 2 ) im Stroma-Überstand zu bestimmen. Die Tiere werden am Tag 0 bestrahlt, einen Tag vor der menschlichen hämatopoetischen Zelltransplantation am Tag 1. Die wöchentliche Blutentnahme beginnt 1 bis 2 Wochen nach den ersten Stroma-Injektionen. Zu diesem Zeitpunkt sollten exogene humane Cytokinkonzentrationen im Mausplasma unter Verwendung modifizierter ELISA-Assays nachweisbar sein (Abbildung 4 ). Der Experiment Endpunkt ist 5-16 Wochen nach der menschlichen Zelltransplantation; Dies hängt von der Menge der menschlichen Zelle Chimärismus in Maus peripheres Blut erkannt. Die normale Hämatopoese ist typischerweise in der Woche 5-7 gut etabliert, der Leukämiezellchimärismus variiert zwischen Zelllinien und Primärproben (3-16 Wochen). PDX Transplantation Erfolg und Progression auch abhängenAuf die Anzahl der bei der Transplantation injizierten menschlichen Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Erreichen von physiologischen menschlichen TSLP-Cytokinkonzentrationen im Mausplasma. Mäuse erhalten wöchentliche intraperitoneale Injektionen (200 & mgr; l) von transduzierten Zellen und ihr Plasma wird gesammelt, um menschliche TSLP-Konzentrationen (ELISA-Assay) in vivo in den Mäusen über die Zeit zu bewerten. " Kontroll" -Mäuse erhielten 5 x 10 & sup6; Kontroll-Stromazellen, während & ldquor; TSLP + low "(niedrige TSLP-Stroma-Dosis) Mäuse 0,5 x 10 & sup6; TSLP + Stromazellen erhielten und & ldquor; TSLP + Hoch" (hohe TSLP-Stroma-Dosis) Mäuse 5 x 10 erhielten 6 TSLP + Stromazellen pro Woche. Der menschliche TSLP-ELISA-Assay Erkennungsschwelle beträgt 1,9 pg / ml (rote gestrichelte Linie) und der menschliche physiologische Bereich von TSLP beträgt ~ 5 bis 35 pg / ml (graue Schattierung). 24 (Referenz 11 und Coats unveröffentlichte Daten) ( A ) "Kontroll" Mausplasma hat konsequent TSLP-Werte <5 pg / mL oder unterhalb der ELISA-Erkennungsschwelle. ( B ) "TSLP + low" Maus-Plasma zeigt niedrige physiologische Werte von TSLP; Während ( C ) "TSLP + high" Maus-Plasma hohe physiologische Werte zeigt. ( D ) Durchschnittliche TSLP-Konzentrationen für jede experimentelle Gruppe (Mittelwert ± SEM aller Mäuse und Zeitpunkte) zeigen, dass TSLP-Spiegel, die im Mausplasma nachgewiesen wurden, proportional zur erhaltenen Stroma-Dosis sind; Kontroll-Maus-Plasmaspiegel unterhalb der ELISA-Nachweisgrenze und "TSLP + high" Plasmaspiegel sind vierfach größer als die "TSLP + low" Maus-Plasmaspiegel."> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Assay von normalen menschlichen B-Zellpopulationen Validieren von I n Vivo- Funktionseffekte von exogenem menschlichem TSLP in PDX-Mäusen. PDX-Mäuse wurden mit Kontrolle und TSLP + Stroma entwickelt und mit menschlichen CD34 + Zellen, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, transplantiert. Immuno-Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Teilmengen von menschlichen B-Zellvorläufern in Knochenmark zu identifizieren, die von der Kontrolle und TSLP + PDX geerntet wurden, wie folgt: geerntetes Knochenmark, wurde aufgetaut und mit fixierbarem Lebensfähigkeitsfarbstoff gefärbt und für die Durchflusszytometrie gefärbt, um Anti- Menschliche CD45, CD19, CD34, κ & λ leichte Kette und entweder die Oberfläche IgD und IgM oder intrazelluläre IgM (cμ). ( A ) Gesamtleben celSie wurden auf der Grundlage eines Lebensfähigkeitsmarkers vergeben. Aufeinanderfolgende Plots zeigen nachfolgende Tore, um entwicklungsbasierte B-Linien-Teilmengen zu identifizieren (die Daten sind von TSLP + PDX). ( B ) Die Häufigkeit jeder Teilmenge innerhalb der gesamten lebenden Zellen wurde durch die Durchflusszytometrie-Software bestimmt, und die Anzahl der Zellen in jeder B-Zell-Untergruppe wurde berechnet. (Siehe Tabelle 1). Zellzählungen für jede B-Zellen-Untergruppe in der Kontrolle (schwarz, n = 3) und TSLP + (blau, n = 5) PDX-Mäuse werden dargestellt. (Mittelwert ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Menschliche Zellbevölkerung | Freq. Der gesamten lebenden Zellen | Lebendzellzähler iN BM | # Zellen in der Bevölkerung |
| Kontrolle Maus | |||
| Gesamt lebende Zellen | 100,00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| HCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Gesamt CD19 + | 27,20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24,20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Vor-B | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 10 6 |
| Unreife B | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Reife B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 10 6 |
| TSLP + Maus | |||
| Gesamt lebende Zellen | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| HCD45 + | 99,30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| Gesamt CD19 + | 65,10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60,20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Vor-B | 2.70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Unreife B | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 10 6 |
| Reife B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 10 6 |
Tabelle 1: Häufigkeit und Zählungen von normalen menschlichen B-Zellen-Subsets in PDX-Knochenmark. Die Häufigkeit (%) jeder B-Zell-Teilmenge innerhalb der gesamten lebenden Zellen wurde durch Durchflusszytometrieanalyse bestimmt (siehe 5A für die Gating-Strategie). Repräsentative Knochenmark (BM) Daten von einer Kontroll-PDX-Maus (empfangene Kontrollstroma-Injektionen, 5 x 10 6 Zellen / Woche) und eine TSLP + PDX-Maus (empfangene TSLP-Stroma-Injektionen, 5 x 10 6 Zellen / Woche). Die Gesamtlebens-BM-Zellzahl wurde bei der Euthanasie aufgezeichnet, und die Immunphänotypisierungs-Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Teilmengenfrequenz (%) zu bestimmen und die Größe jeder B-Zell-Teilmengenpopulation zu berechnen (Teilmengenzellzahl = "totAl lebende Zellen "x" Teilmenge Frequenz ").
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Herstellung von PDX, um exogenes menschliches Zytokin auszudrücken. Die hier beschriebene Strategie basiert auf wöchentlichen intraperitonealen Injektionen einer Stromazelle, die transduziert wurden, um das menschliche Cytokin, TSLP, zu exprimieren. Vor der Durchführung der hier beschriebenen Verfahren wurden Stroma entwickelt, um hohe Konzentrationen des Cytokins von Interesse (TSLP) und ähnlich entwickelten Kontrollstroma zu exprimieren. In den hier vorgestellten Protokollen wird das Stroma in Kultur erweitert und auf die Fähigkeit hingewiesen, eine stabile, hochgradige Zytokinproduktion im Laufe der Zeit bereitzustellen (oder für das Fehlen einer Zytokinproduktion im Falle von Kontrollstroma). Assays zur Überprüfung der Aktivität von Stroma-erzeugtem Zytokin wurden durchgeführt und experimentelle Zeitlinien für die Stromazellen-Injektion wurden entwickelt, um PDX mit physiologischem menschlichem TSLP (und Kontrollmäusen, die menschliches TSLP fehlen) zu produzieren. Verfahren zur Überwachung der Plasmaspiegel von humanem TSLP undZur Verifizierung seiner in vivo funktionellen Effekte auf Cytokin reagierende Zellpopulationen wurden durchgeführt.
Bei der Auswahl von Stromazellen und Vektoren, die in den hier vorgestellten Protokollen verwendet werden, sollten mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Stromale Zelllinien sollten nicht endogen produzieren hohe Mengen an Zytokin, und sollte nicht auf das Zytokin von Interesse reagieren. Für Studien hier wurde die menschliche Knochenmark-Stromazelle, HS-27A, ausgewählt, weil sie in der Kultur mit einer niedrigen Zytokinproduktion robust wächst. 8 Die hier beschriebene Methode beinhaltet auch "control" PDX, das mit dem gleichen Stroma wie TSLP + PDX konstruiert wurde, aber ohne Überexpression von TSLP. Vergleiche der Ergebnisse in TSLP + und Kontrolle PDX ermöglichen es uns, für alle Effekte durch endogene Stromazellen-Zytokin-Produktion zu kontrollieren. Die Transduktion von Stromazellen mit Vektoren, die fluoreszierende Proteine oder andere selektierbare Marker einschließen, kann für die Isolierung von Zellen th hilfreich seinAt sind wahrscheinlich, das Cytokin von Interesse zu überexprimieren. Es ist jedoch wichtig, den Zytokinüberstand zu bestimmen, um den Grad der von den Stromazellen erzeugten Zytokine zu bestimmen, da die in vivo- Plasma-Zytokinspiegel in Mäusen mit der Zytokinkonzentration im Stromazellenüberstand 6 zusammenhängen, sowie die Anzahl der auf ein injizierten Stroma Wöchentliche Basis ( Abbildung 4 ).
Es ist wichtig, dass die Aktivität des durch Stroma produzierten Zytokins vor PDX-Studien überprüft wird. Wir verwendeten Phospho-Flow-Zytometrie zur Untersuchung von Molekülen, die stromabwärts der TSLP-Stimulation in Zellen phosphoryliert wurden, die auf TSLP ansprechen. TSLP aktiviert die JAK-STAT5- und PI3 / AKT / mTOR-Wege. Die MUTZ5- und MHH-CALL4-Leukämie-Zelllinien exprimieren hohe Werte der TSLP-Rezeptorkomponenten und zeigen nach der TSLP-Stimulation stromabwärtige STAT5-, AKT- und ribosomale Protein-S6-Phosphorylierung. 14 Hier haben wir Phospho-Durchflusszytometrie eingesetztUm die Phosphorylierung von STAT5 (pSTAT5) zu untersuchen, die stromabwärts der TSLP-Stimulation induziert wurde. In früheren Arbeiten wurden für weitere TSLP-stimulierte Phosphorylierungsereignisse: Phospho-AKT (pAKT) und phospho-ribosomales Protein S6 (pS6, stromabwärts von mTOR) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass der pAKT-Assay weniger empfindlich ist und der pS6 empfindlicher als der pSTAT5-Assay ist. 6 Wenn Phospho-Assays durchgeführt werden, sollten ansprechende Zellen mit sättigenden Mengen an rekombinantem humanem TSLP als Positivkontrolle und nur mit Medium (kein Cytokin) als Negativkontrolle kultiviert werden. Der Überstand aus Kontrollstroma sollte auf der Seite des TSLP + Stromas als zweites Mittel zur Überprüfung (zusätzlich zu ELISA) untersucht werden, dass TSLP nicht durch Kontrollstroma produziert wird. Dies dient auch als Kontrolle, um sicherzustellen, dass die endogene Zytokinproduktion nicht für die in Assays von TSLP + -Zellen beobachtete Phosphorylierung verantwortlich ist. Idealerweise sollte die Phosphorylierung, die aus Zytokin-produzierenden Stroma-Proben hervorgerufen wird, gleich seinAr, die mit rekombinantem Zytokin-Zustand zu beobachten, obwohl es niedriger sein kann, wenn die Konzentration von Zytokin im Überstand niedriger ist als in der sättigenden, positiven Kontrolle. Eine positive Kontrolle mit rekombinanten TSLP-Werten, die mit den von ELISA für TSLP + Stroma beobachteten Werten übereinstimmen, ist eine gute Alternative.
Die Identifizierung bekannter funktioneller Indikatoren der in vivo- Zytokin-Aktivität kann eine Herausforderung sein. Assays der Phosphorylierung können nicht möglich sein, da die Phosphorylierung, die durch das exogene menschliche Cytokin in vivo induziert wird, während der Gewebeernte schnell verloren gehen kann. Da gezeigt worden ist, dass TSLP die Produktion von menschlichen B-Zell-Vorläufern erhöht, wurde die funktionelle Wirkung von TSLP in PDX durch die Untersuchung der in vivo- Zunahmen der menschlichen B-Zell-Vorläuferpopulation unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Immunphänotypisierung verifiziert. Eine alternative Strategie könnte für spezifische Zytokin-induzierte Veränderungen in der Genexpression und compari untersuchenNg-Expression in Zellen, die von Cytokin-exprimierendem PDX zu Zellen aus der Kontrolle PDX geerntet wurden. 6
Das ultimative Ziel der menschlichen Zytokin-Expression in PDX ist es, ein präklinisches Modell zu erzeugen, das die in vivo- Umgebung vorhandene in vivo- Umgebung genauer modelliert. Dies wurde durch Vergleich der vollständigen Genom-Expression in menschlichen Geweben, die von Kontroll-PDX isoliert wurden, und von Cytokin-exprimierenden (TSLP +) PDX zu den ursprünglichen Patientenproben getestet. Diese Studien zeigten, dass die Genexpression in Patientenproben signifikant näher an Leukämiezellen von TSLP + PDX als Kontrollen liegt. 6 Unsere Studien konzentrierten sich jedoch auf die Lymphopoese. Eine Anzahl von Myeloid-fördernden Zytokinen, die in der Maus produziert werden, aktivieren nicht ihre menschlichen Rezeptor-Pendants. Es gibt menschliche Zytokin-Knockin-Mäuse (NSGS-Mäuse und andere), die dieses Problem ansprechen. In der Tat ist ein Wert des Modells, das wir hier beschreiben, dass es in NSGS-Mäusen verwendet werden kann, um ein Modell zu schaffen, das enger istEly modelliert die menschliche in vivo- Umgebung, indem sie TSLP zusätzlich zu myeloidenfördernden menschlichen Zytokinen exprimiert. Auf der anderen Seite könnte ein Cytokin +/- System in NSG-Mäusen unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens für jedes dieser myeloid-fördernden Zytokine erzeugt werden. Dieses Modell kann verwendet werden, um die genaue in vivo Rolle von jedem von ihnen in myelopoieis und / oder myeloischen Leukämie zu studieren.
Engineered PDX, die physiologische Ebenen der menschlichen TSLP produzieren, bietet ein präklinisches Modell, das die in vivo- Umgebung, die bei Patienten als dem klassischen PDX vorhanden ist, genauer nachahmt. 4 Die Herstellung von kontrollierten PDX-Mäusen, die ähnlich konstruiert sind, werden ebenfalls beschrieben. Gemeinsam kontrollieren und zytokinproduzierende PDX ein menschliches TSLP +/- Modellsystem, das wir erfolgreich genutzt haben, um die Rolle von TSLP bei der in vivo Produktion von normalen und malignen menschlichen B-Zellen zu bewerten. 4 , 6 dasModell ist sehr relevant für Studien einer bestimmten hohen Risiko-Form der B-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie (B-ALL), die durch genetische Veränderungen, die zu Überexpression von CRLF2 gekennzeichnet ist. CRLF2 ist ein Rezeptor für das TSLP-Zytokin und somit führt die TSLP-induzierte CRLF2-Signalisierung wahrscheinlich zur Onkogenese und Progression von CRLF2 + B-ALL. Die Verwendung von PDX, um diese Krankheit zu studieren, ist besonders kritisch, weil PDX uns erlaubt, Leukämie im Zusammenhang mit der genetischen Landschaft des Patienten zu studieren. Die genetische Landschaft als Krankheitsmitarbeiter ist stark in CRLF2 + B-ALL verwickelt, was fünfmal häufiger bei Hispanic / Latino-Kindern auftritt als andere und macht die Hälfte aller B-ALL-Fälle bei Down-Syndrom-Patienten aus. PDX-Modelle, die menschliches TSLP ausdrücken, wie das hier beschriebene, wird ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Therapien und zum Verständnis von Krankheitsmechanismen von CRLF2 + B-ALL sowie zum Verständnis der normalen Hämatopoese sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
