Summary
Burada, sitokin ile transdüksiyona sokulmuş bir stromal hücre hattının haftalık intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla, hastadan türetilen ksenograft (PDX) farelerde eksojen sitokinin üretilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, PDX'in kullanımını genişletir ve bir çok PDX modelinde geçici veya sürekli dış kaynaklı sitokin verme seçeneği sunar.
Abstract
Hastadan türeyen ksenograft (PDX) fareler, insan hücrelerini immün yetersiz farelere naklederek üretilir. Bu modeller, normal ve malign hematopoez mekanizmalarını incelemek için önemli bir araçtır ve bir çok malignite için etkili kemoterapileri belirlemek için altın standarttır. PDX modelleri mümkündür, çünkü birçok fare sitokinleri aynı zamanda insan hücreleri üzerinde de etkindir. Bununla birlikte, insan hücrelerinde normal ve malign hematopoez incelemek için kritik olan birçoğu da dahil olmak üzere, tüm sitokinler için durum böyle değildir. İnsan sitokinleri (transjenik ve knock-in modelleri) üretmek üzere mühendislik farelerinin modelin kullanışlılığı gösterilmeden önce önemli harcamalar gerektiren teknikler. Diğer teknikler emek yoğun (rekombinant sitokin veya lentivirüs enjeksiyonu) ve bazı durumlarda yüksek düzeyde teknik uzmanlık gerektirir (DNA'nın hidrodinamik enjeksiyonu). Bu raporda, eksojen insan cy içeren PDX farelerinin üretilmesi için basit bir yöntem açıklanmaktadırTokine (TSLP, timik stromal lenfopoietin) , bu sitokini aşırı ifade etmek için transdude edilen haftalık intraperitoneal stroma enjeksiyonu yoluyla . Bu yöntemin kullanılması, fare içinde dolaşan insan sitokininin fizyolojik seviyelerine erişen in vivo bir sürekli sitokin kaynağı sağlar. İnsan sitokininin plazma seviyeleri, enjekte edilen stromal hücrelerin sayısına göre değişebilir ve sitokin üretimi, deneydeki herhangi bir noktada başlatılabilir. Bu yöntem, aynı şekilde üretilen sitokin-negatif kontrol farelerini de içerir, fakat bir kontrol vektörü ile transdüze edilen intraperitoneal stroma enjeksiyonu yoluyla. Kontrol PDX'si ile karşılaştırıldığında, TSLP'yi eksprese eden PDX'den hasat edilen lösemi hücrelerinin orijinal hasta örneğine benzeyen bir gen ekspresyonu sergilediğini daha önce göstermiştik. Bu yöntemle üretilen sitokin üreten ve sitokin negatif PDX fareleri, birlikte çalıştıklarımızı incelemek için başarılı bir şekilde kullandığımız bir model sistemi sağlar.TSLP'nin normal ve malign hematopoezdeki rolü.
Introduction
Hastadan türeyen ksenograftlar (PDX) 'yerli' bir memeli ortamında normal ve malign hematopoietik hücrelerin üretiminin incelenmesi için güçlü bir in vivo modeldir. Çoğu zaman, PDX bağışıklık yetersiz farelere insan hücrelerini enjekte ederek ya da naklederek üretilir. Normal insan hematopoietik kök hücrelerini kullanarak PDX üretilmesi, normal insan kanında ve immün hücre gelişiminde in vivo çalışmalara izin verir. Lösemi veya diğer kanser hücrelerinden üretilen PDX, insan popülasyonunda mevcut olan genetik peyzajlar ve mutasyonlar bağlamında, onkojenik mekanizmaların incelenmesini ve etkili terapileri tanımlamayı mümkün kılar. Sonuç olarak PDX, etkili terapileri tanımlamak için translasyonel biyomedikal araştırmalar için mevcut olan altın standart ve kanser ilerlemesinin mekanizmalarını anlamak için önemli bir araçtır. PDX modelleri, sağlık ayrımlarından arındırılmış hastalıkların araştırılmasına yardımcı olmak için özel bir araçtır. Genetik lezyonlar veya bir hastanın genetik görünümündeki varyasyonların onkogenezise ve tedavi sonucuna önemli ölçüde katkıda bulunduğu herhangi bir hastalık.
Fare-insan PDX modelleri mümkündür, çünkü birçok fare sitokinleri, fare içerisindeyken insan hücrelerinin sitokin reseptörlerini harekete geçirirken insan analoglarını yeterince taklit eder. Örneğin, interlökin-7 (IL-7) insan B hücresi gelişimi için kritik bir sinyal sağlar. 2 Bu durumda, fare IL-7, insan IL-7 ile yeterli homologluğa sahiptir ve fare sitokini, insan B hücresi öncüllerinde sinyal yollarını uyarır. Bununla birlikte, diğer sitokinlerin (IL-3, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), kök hücre faktörü (SCF) arasında timik stromal lenfopoietin (TSLP) 5 , 6 için geçerli değildir, ,Ref "> 7 normal ve habis insan hematopoietik hücrelerinin üretilmesi için önemlidir Fare ve insan sitokinleri düşük homologluk gösterdiğinde fare sitokinleri insan hücreleri üzerinde kendi reseptörlerini aktive etmez Bu engeli aşmak için birtakım stratejiler kullanılmıştır PDX farelerinde insan sitokinlerinin ekspresyonunu mühendislere yapıştırmak için rekombinant insan sitokinlerinin enjeksiyonu, DNA'nın hidrodinamik enjeksiyonu, lentiviral ekspresyon, transjenik ekspresyon ve knockin geni değiştirme 7 Bu rapor, PDX'nin stromal aracılı yollarla insan sitokini üretmesi için bir metodu açıklamaktadır Sitokin verimi ( Şekil 1 ).
Burada gösterilen yöntemde, PDX fareleri, insan sitokini, TSLP'yi veya sitokin negatif kontroller olarak görev yapacak şekilde tasarlanmıştır. TSLP'yi ifade eden PDX, yüksek düzeylerde insan TSLP'sini ifade etmek üzere transduced edilen stromal hücrelerin haftalık intraperitoneal enjeksiyonları ile elde edilir.Sitokin-negatif PDX "kontrol" fareleri benzer şekilde tasarlanmıştır; Ancak kontrol stroması bir kontrol vektörüyle dönüştürülür. Bu yöntem, TSLP + stroma enjekte edilen PDX farelerinde insan TSLP'sinin normal fizyolojik seviyelerine ulaşmaktadır. Sitokin negatif stroma alan PDX farelerinde saptanabilir TSLP gözlenmemiştir. Çalışmalarımız için insan stromal hücre hattı HS-27A'yı seçtik çünkü kültürde sağlam bir şekilde büyür ve kokültürlerde izole progenitör hücrelerin çoğalmasını desteklemeyen çok düşük sitokin üretimi gösterir. 8 İnsan TSLP ekspresyonu için, stroma, daha önce tarif edilen omurgadan türetilmiş ileri nesil kendinden inaktif bir lentiviral vektör ile transduced edildi ve transgen ekspresyonunu arttırmak için cPPT / cts elemanı ve post-transkripsiyonel düzenleyici unsuru (WPRE) ağaç talebi hepatitini içerdi. İnsan TSLP geni, bu vektöre, uzatma faktörü -1(EF-1) alfa hızlandırıcıyı sağlam, kurucu ve uzun vadeli ifadeye erişir.
Bu insan sitokini ile güçlendirilmiş PDX modelinin mühendisliği 4 ana aşamadan oluşur. Önce transduced stroma, in vitro genişletilir ve kararlı, yüksek seviyeli sitokin üretimi için enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA) ile değerlendirilir. İkincisi, dönüştürülen stromal hücreler tarafından üretilen insan sitokininin (ve kontrol stromasından sitokin aktivitesinin eksikliği) etkinliği, fosfo-akış sitometrisi kullanılarak doğrulanır. İlgi konusu sitokine duyarlı olduğu bilinen hücre hatları (bu örnekte TSLP), stromal hücre süpernatanı ile inkübe edilir ve sitokine bağlı fosforilasyon için denenir. Üçüncü olarak, farelere dönüştürülen insan stroması enjekte edilir ve daha sonra fare plazması, haftalık bazda insan sitokin seviyeleri için ELISA ile değerlendirilir. Dördüncü olarak insan hematopoietik hücreleri nakledilir ve insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkileri bilinen bir hedef üzerinde değerlendirilir ( Stromal hücreler yoluyla insan sitokinin verilmesi, PDX farelerinde insan sitokinleri verme / üretme yöntemlerine kıyasla avantaj ve dezavantajlar sunar. 7 Rekombinant insan sitokinin enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, stroma aracılı doğum genellikle daha ucuzdur (stromal hücre kültürü maliyeti rekombinant sitokin maliyetinden daha düşüktür) ve emek yoğunluğu daha düşüktür (haftada bir kez enjeksiyona karşı haftada birden fazla enjeksiyon). Kısa sitokin yarı ömrü sorunu da hafifletilir çünkü stroma sürekli olarak eksojen sitokin üretir. DNA'nın hidrodinamik enjeksiyonu yoluyla sitokin verilmesi, stroma yoluyla verilmeden daha ucuz olabilir. Bununla birlikte, benzer şekilde geçicidir ve stroma bağlı teslimat için gerekli basit haftalık intraperitoneal enjeksiyona göre daha fazla teknik beceri gerektirebilir. Fare içerisinde Lentiviral gen ekspresyonu daha az travma sağlayabilirSitokin verme yöntemleri; Ancak, elimizde fizyolojik TSLP seviyelerine ulaşılamadı. Ayrıca, bu yöntem emek gerektirir ve sürekli lentiviral vektör üretilmesini gerektirir. Transgenik veya knock-in fareler, sitokinin stabil uzun süreli ekspresyonunu sunar ve bir avantaj sağlayabilecek doku spesifik ekspresyonu için tasarlanabilir. Öte yandan, PDX fareleri için gerekli olan immün yetersiz fare arka planı üzerindeki insan sitokin geninin transgenik ifadesi, modelin değeri belirlenmeden önce büyük bir kaynak yatırımı yapılmasını gerektirir. Dahası, transgenik modeller genellikle sitokin başlatma zamanlamasını veya in vivo sitokin üretim seviyesini değiştirme seçeneği sunmamaktadır. Bunlar, stromal hücre enjeksiyonunun başlatılması için zaman noktasını veya enjekte edilen stromal hücrelerin dozunu değiştirerek stroma bağlı teslimat ile başarılabilir. Stromal-hücre aracılı sitokin verilme metoduBurada detaylı açıklanan normal insan B hücre gelişimi 4 , 6 ve yüksek riskli B hücreli akut lenfoblastik lösemi TSLP rolünü değerlendirmek için PDX geliştirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem, TSLP dışındaki insan sitokinleri ile benzer modellerin üretilmesinde kullanılmak üzere alternatif bir sitokin verme yöntemi sağlar. Bu model, bir sitokin transjenik veya sitokine giren PDX modelinin değerinin önemli miktarda zaman ve para yatırımı yapmaya değip değmeyeceğini belirlemenize yardımcı olabilecek ön verileri üretmek için de yararlı olabilir. 
Şekil 1: Farelerde Eksojen İnsan Sitokini Üretmek üzere Üretilen PDX Modeli. ( 1A ) Tasarım deneyi ve transduced insan stromal hücreleri ( 1B ) elde PDX (hasta türevli ksenograft) fareler üretmek için insan hücreleri (hematopoietik kök hücreler, lösemi hücreleri, vb .) Edinin. ( 2A ) Deneysel çizelgeye göre immün yetersiz farelere insan hücrelerini mühendislik stromasını enjekte edin ve ( 2B ) nakledin. ( 3A-B ) ELISA ile stroma süpernatanı ve fare plazmasında sitokin konsantrasyonlarını izleyin. ( 4 ) İnsan hücrelerini toplayın ve PDX'de bulunan insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkilerini değerlendirin. Lütfen buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışmalar Loma Linda Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan protokollere ve tüm federal kurallara uygun olarak yürütülmüştür.
DİKKAT: PDX ve insan dokuları, kan yoluyla bulaşan patojenlerin bulaşmasını önlemek için güvenlik prosedürlerine uygun olarak ele alınmalıdır.
1. Sitokinle Transmurgasyon Yapılan Stromal Hücrelerin Kültürü ve Genişletilmesi
NOT: Her seferinde pasaj alınır, kültür süpernatantını (1 mL alikot) hasat edin ve gelecekte ELISA tahliliyle sitokin seviyesinin nicelleştirilmesi için -80 ° C'de saklayın.
- R10 kültür ortamını ve donma ortamını Malzemelerin Tablosunda açıklandığı gibi hazırlayın.
- 10 , 11 üreterek veya kontrol stromasını (boş vektör ile transduced) ve sitokin üreten (TSLP +) stromayı elde edin.Kullanıma kadar sıvı azot (LN 2 ) içerisinde saklayın.Dokromatik hücrelerin çözünmesini tarif edin 12 ve ayrı T-25 hücre kültürü şişelerinde 5 mL R10 ortamında plaklayın 37 ° C'de inkübe edicide% 5 CO 2. Bu, post-thaw "pasaj # 1" dir.
- Bir kez stroma birleşince (24-48 saat), hücreleri, 1x tripsin EDTA (% 0.25) kullanarak tripsinlemeye tabi tutun ve bir T-150 kültür şişesi içinde yeniden kaplama yapın. Bu, post-thaw "pasaj # 2" dir.
- Stroma T-150 şişelerde (3-4 gün sonra) konfluance ulaşıldığında, trypken ile hücreleri geçirin. Deneysel ihtiyaçlar için bu hücre süspansiyonunu kullanın.
- Birden fazla şişeye hücre genişletilmesi
- Hasat edilen hücreleri, üç T-150 şişesi ve kültürü arasında birleşinceye kadar bölün. Stroma genişlemesi gerekiyorsa bu adımı tekrarlayın. Bir T-150 şişesindeki konfluansa ait tipik insan stromal (HS-27A) hücre sayısı ~ 5x106'dır.
- Hücre sUZUN SÜRELİ MUHAFAZA
- Toplanan hücre süspansiyonunu konik bir tüp içine aktarın ve 500 xg'de 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı boşaltın ve dondurucu ortamda hücreleri tekrar süspanse edin. Donma ve şişe başına LN 2 ~ 1.5 x 10 6 hücre saklayın.
- Farelere intra-periotoneal stroma enjeksiyonu için adım 4.1'e geçin.
- Birden fazla şişeye hücre genişletilmesi
2. Transdüksiyonlu Stromadan İn Vitro Sitokin Üretimini İzlemek İçin ELISA Testleri
- İlgilenen sitokini algılamak için piyasada bulunan ELISA test kiti satın alın.
- Erken, orta ve geç pasajlarda hasat edilen kontrol ve sitokin üreten (TSLP +) stromadan stromal hücre süpernatantını çözünürler ( Şekil 2 ).
- Üreticinin talimatlarına göre bir ELISA kiti kullanarak süpernatan numunelerindeki TSLP konsantrasyonunu belirleyin. 13 Hücre kültürü sırasında sitokin üretiminin stabilitesini izlemek için bu seri veriyi derleyin E ( Şekil 2A-B ).
- İndirgenmiş veya optimal olmayan sitokin ekspresyonu ile sitokin üreten stromayı tanımlayın ve depolamada karşılık gelen tüm şişelerle atın ( Şekil 2A-B ).
- Stabil, yüksek seviyeli sitokin konsantrasyonlarını gösteren sitokin üreten stromayı tanımlayın ve muhafaza edin. Denemelerde bu çözülmeleri kullanın.
- Sitokin üretiminin stabil olmasını sağlamak için ya da kontrol stroması durumunda sitokin üretiminin olmamasını sağlamak için hücre kültürü boyunca stromayı rutin olarak izlemek için ELISA kitini kullanın (en az bir kez erken, orta ve geç post-thaw pasajları boyunca) .
3. Stroma ile Üretilen Sitokinin Aktivitesini Değerlendirmek İçin Fosfo-Akış Sitometri Tahlilleri
NOT: Tek deney için stroma ile oluşturulan sitokinin ilgili biyo-aktivitesini doğrulamak için ilk deneyden önce tasarlanmış stromadan süpernatanı değerlendirin.Ef "> 6 İşlenmiş stroma onaylandıktan sonra, yeni bir vektör ile üretilen stroma girilmedikçe ileri tetkikler gerekmez.
- MUTZ5 ve / veya MHH-CALL4 lösemi hücre çizgileri (TSLP yanıt veren), 14 rekombinant insan sitokini ve uygun fıstıflı fosforilasyon hedeflerini tespit etmek için fosfo-akış sitometri deneylerinde kullanım için onaylanmış antikorları satın alın.
- Kontrol ve sitokin ifade eden stromadan hasat edilmiş süpernatanı çözün.
- Lösemi hücre çizgilerini 96 oyuklu bir doku kültürü plakasında kuyucuk başına 0,2 x 106 hücre hasıl eden konsantrasyonda R20 ortamında (bkz . Malzeme Tablosu ) plaklayın. Üçlü deneyler için izin vermek için koşul başına plaka 3 oyuk. 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Bu zaman, önceki kültür koşulları sırasında oluşan herhangi bir fosforilasyon kaybına izin verir.
Not: hücre hattı başına 12 kuyucuk adım 3.4'te gösterilen her deneysel durum için üçlü testler sağlar. <Li> Kültürde 2 saat sonra, hücreleri her bir kuyudan 4 mL'lik ayrı tüplere aktarın ve 5 dakika boyunca 500 xg'de 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı boşaltın. - Aşağıdaki deneysel koşulların her biri için 200 uL'de hücreleri yeniden askıya alın (doymuş konsantrasyonda rekombinant sitokin ile 1) negatif kontrol-ortamı, 2) pozitif kontrol-ortamı (TSLP 15 ng'de / ML, vb .), 3) kontrol stromasından kontrol stroma süpernatantı ve 4) sitokin üreten stromadan sitokin-stroma süpernatantı.
- Hücreleri, spesifik ticari fosfo-tahliliyle belirtilen süre boyunca inkübe edin ( örn. , TSLP'ye yanıt olarak MUTZ5 veya MHH-CALL4'deki fosfo-STAT5 için 30 dakika).
- 4 dakika ° C'de 5 dakika süreyle 500 xg'de santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
- Üreticinin protokolüne göre fosfo-akış sitometrisi lekesi uygulayın ve akış sitometrisi verileri toplayın. 15
- Sağlam hücreler üzerinde ileriye dayanan kapı (FSC, hücre boyutunu gösterir) ve yan (SSC, hücre parçacıklığını gösterir) ışık dağılımı.
- Her numunedeki bozulmamış hücrelerin medyan floresan yoğunluğunu (MFI) belirleyin. Stromal hücre süpernatantının üçlü değerlerinden elde edilen ortalama MFI'yi, pozitif ve negatif medya kontrollerine kıyasla karşılaştırın.
4. Sitokine Dönüştürülmüş Stromun Fare içine Enjekte Edilmesi
NOT: HS-27A stromasını, sağlıklı hücreleri ve yeterli sitokin üretimini sağlamak için farelere enjekte etmeden önce en az 3 çözülme sonrası pasaj kültürleyin.
- Stroma hazırlanması
- Hasat edilmiş stromal hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve hemositometre sayımı için 10 uL'lik kısım; Trypan mavisi kullanarak canlı hücre sayısını elde edin. 16 Kalan hücreleri santrifüjleyin5 dakika için 500 xg'de süspansiyon alın.
- Peletlenmiş hücrelerden süpernatantı aspire edin ve fare enjeksiyonu için (fare sayısına bağlı olarak) enjekte edilecek farelerin steril fosfat tamponlu salin (PBS) hacmine yavaşça tekrar süspanse edin.
Not Fare enjeksiyonu için tipik stromal hücre konsantrasyonu: 200 uL PBS içinde fare başına 0.5 x 10 6 -5 x 106 hücre. - Enjeksiyondan hemen önceye kadar stromal hücre süspansiyonunu 4 ° C'de (veya buz üzerinde) tutun. Farelerin enjeksiyonu için hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında (~ 25 ° C) en az olduğundan emin olun.
- Stromal hücre enjeksiyonu
- Biyogüvenliğin başlığını dezenfekte edin, enjeksiyon materyalleri toplayın ve sonra içine farenin kafesini yerleştirin.
- Tüberkülin şırınga içine 200 mcL çizmeden önce yavaşça inversiyon ile hücre süspansiyonu karıştırın.
- Standart intra-peritoneal enjeksiyon tekniklerini kullanarak, 17Fare tutun ve 200 μL hücre süspansiyonu peritoneal boşluğa uygulayın. Ayrıntılar Machholz ve ark. Tarafından daha önce gösterilmiştir . 18
5. Farelerde Eksojen İnsan Sitokini İçin Seri Kan Toplama ve Plazma İzleme
- Kuyruk kesimi yoluyla kan alınması
- Biyogüvenlik başlığını dezenfekte edin ve prosedür için fare tutucu, makas ve diğer aletleri / malzemeleri monte edin.
- Fare tutucuya yerleştirin ve fare hareketi en aza indirgemek için tüpü sabitleyin.
- Kuyruk ve ameliyat makaslarını izopropil alkolle dezenfekte edin. Kuyruğa topikal anestetik krem uygulayın.
- Çok keskin cerrahi makas kullanarak, fare kuyruğunun ucunun yaklaşık 0,5-1 mm kadar keskin bir şekilde kesilir. Heparinize kılcal tüpler kullanarak yaklaşık 80 μL periferik kan toplar.
NOT: Bu yöntemle altı ti'den fazla kan toplanacaksaMes, kuyruk çıkarma kuyruk kaldırılan miktara saygı ile muhafazakâr olmalıdır. Çataklar kuyruk boyunca ilerledikçe çap artar, kanamalar hızlanır ve iyileşme daha uzun sürer.
- Plazma ayrımı
- Bir ampul şırınga (kılcal tüplerden atmak için) etiketli bir K 2 EDTA mikro torbasına tüp aktarın; Pıhtılaşmayı önlemek için 20 kez ters çevirin.
NOT: Tipik olarak kuyruk sıkışma kan pıhtısı hızlıdır. Bununla birlikte, eğer kanama yaklaşık 2 dakika daha uzun süre devam ederse, koagülasyona yardımcı olmak için stipit kalem / toz kullanın. - Kan alma tüplerini imalatçının talimatlarına göre santrifüjleyin ve ELISA testine hazır oluncaya kadar depolamaya yönelik plazma miktarını (-20 ° C) kullanın.
- Fare kanından fare-insan hücre benzeri veri gerekliyse, kalan pelleti 6.3.1. Adımda tarif edildiği gibi tedavi edin. Aksi halde, kan hücresi pelletini atın.
- Bir ampul şırınga (kılcal tüplerden atmak için) etiketli bir K 2 EDTA mikro torbasına tüp aktarın; Pıhtılaşmayı önlemek için 20 kez ters çevirin.
- Mikro hacimli modifiye edilmiş ELISAFare plazması umaları
NOT: Üreticinin ELISA prosedürü farelerden toplanan mikro hacimleri karşılamak için önerilen 100 μL numune hacminden 40 μL hacmine değiştirilmiştir. İn vivo fare plazma örneklerini bu sınırlı hacimlerle üçlü olarak çalıştırmak mümkün değildir. Deneyin sonunda, 500 μL ölüm sonrası kan, kardiyak ponksiyon yoluyla toplanır. 100 μL ötanazi plazması içinde değerlendirilen sitokin konsantrasyonları, her fare için 40 uL in vivo verileri doğrulamak için kullanılır.- Dondurulmuş fare plazma örneklerini çözdüm.
- Ciddi olarak ELISA standartlarını inceltin ve çukur başına 40 mcL'de üç kez plakaya koyun.
- Her fare plazma örneğinden 40 μL, ELISA plakasına ekleyin.
NOT: Bir fare numunesi 40 μL'den düşükse, hacmi ELISA tamponu ile 40 μL'ye getirin. Bu seyreltici hacmi kaydedin ve her seyreltilmiş numune için bir seyreltme faktörü hesaplamak için kullanın. Ne zamanELISA verilerini analiz etmek, orijinal numunedeki fiili sitokin konsantrasyonunu belirlemek için seyreltilmiş numune konsantrasyonunu numunenin seyreltme faktörü ile çarpar. - Üreticinin talimatlarına göre komple ELISA testi.
6. Hematopoietik Hücrelerin Fare Transplantasyonu
- Kemik iliğini nakil için duruma getirmek için kısır ışınlama
NOT: Loma Linda Üniversitesi (LLU), bir Cobalt-60 radyasyon kaynağı kullanmaktadır. Hayvanlar, 20 x 20 cm'lik bir alanda radyasyon kaynağından 80 cm uzaklıkta ve tutucu üstünde 0.5 cm'lik bir Lexan tabakasıyla konumlandırılmış bir turta sınırlandırıcıya yerleştirilir. Maruz kalma süresi, kaynağın son kalibrasyonunu temel alarak 225 cGy doz elde etmek üzere hesaplanmaktadır (şu an bu kaynak için 2-3 dakika).- Alt ölümcül ışınlama fareleri (bağışıklık yetersiz fareler için maksimum vücut ışınlama dozu 225 cGy).
- Transplant hematopoietik hücreler ~ 24 saat sonra </ Em> intravenöz kuyruk damarı enjeksiyonu.
- İntra venöz hematopoetik hücre nakli
- Fare başına 200 μL steril PBS hacmi içinde nakiller için insan hücre süspansiyonları hazırlayın: CD34 + hematopoietik kök hücreler (HSC): 1 x 10 5 ila 5 x 10 5 fare ve lösemi hücre hatları / hasta numuneleri için hücre: 1 x 10 6 ila Fare başına 5 x 106 hücre.
- Transplantasyondan hemen önceye kadar hücreleri 4 ° C'de tutun (buz üzerinde nakliye). Transplantasyondan önce hücrelerin en az RT'de olduğundan emin olun.
- Biyolojik güvenlik kapağını dezenfekte edin ve nakil enjeksiyonları için kaput alanını hazırlayın.
- Kuyruk damarlarının genişlemesine izin vermek için fareyi ısıtma kafesine en az 5 dakika bekletin.
- Hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve bir tüberkülin enjektörüne 200 mcL kadar kazın. İğneyi steril kalacağı yerden güvenli bir yere koyun.
- Fareyi bir tutma yerine yerleştirin ve kuyruk izopropil alkol ile dezenfekte edin. </ Li>
- Standart intravenöz enjeksiyon tekniklerini kullanarak, insan hücre süspansiyonunu fare kuyruk damarına enjekte edin.
NOT: Kuyruk damarı enjeksiyonları, özellikle acemi bir hayvan işleyicisi için birkaç girişim alabilir. Kovacscics ve Raper'ın JoVE videosu 19 , bu hayvan tekniklerinin detaylı tanıtımını sağlar. - Yaklaşık 5 dakika boyunca farenin kurtarma işlemini izleyin. Enjeksiyondaki olumsuz olayları kaydedin ( örn. Dökülen hücreler, majör kanama, aşırı kuyruk travması).
- Fare periferik kandaki insan hücre kimerizmasının analizi
- Plazma ayrılmasından sonra mikrotever tüp içinde kalan kan hücresi peletini elde edin (adım 5.2.3).
- Kırmızı kan hücresi (RBC) lizisi için kalan plazma plazma hacmine eşit plazma PBS hacminde kalan kan peletini tekrar süspanse edin ve iyice karıştırın (vorteks / pipet).
- Her bir yeniden süspanse edilmiş kan örneğini etiketli bir 4 mL tüp içine aktarınVe sonra her tüpe 1: 9 oranında (100 uL yeniden askıya alınan kan için 900 μL RBC lizis tamponu) RBC liziz tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Santrifüj (5 dak, 500 xg) ve döküntü.
- İkinci RBC liziz tamponu inkübasyonunu gerçekleştirin (oda sıcaklığında 5 dakika). Daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve dökün.
- ~ 1 mL PBS'de kalan hücreleri yıkayın. Daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve dökün.
- Pelleti, standart akış sitometrisi lekelenmesi için uygun bir PBS hacminde tekrar süspanse edin (bu üretici ve bireysel laboratuvar protokollerine göre değişir). 20 Fare hücrelerini (fare CD45 +) ve insan hücrelerini (insan CD45 +) tanımlamak için akış-cyotmetery için onaylanmış immünofenotiplendirme antikorlarını kullanın 6 , 21 Ayrıca ilgi konusu hücre soyına spesifik ek insan lökosit işaretleyicileri.
NOT: "toplanmış numuneler" oluşturmak için her fare örneğinden küçük bir hacim (5 μL-20 μL) alınması önerilir.; Renklendirilmemiş, yaşayabilirlik ve izotip kontrol örnekleri için kullanılmıştır. Her deneysel koşul için renksiz ve izotip kontrollerinin yapılması en iyi yöntemdir.
7. İn vivo Sitokin Aktivitesinin Fonksiyonel Değerlendirilmesi
- Fare ötenazi ve doku hasatı
- Atanan deneysel zaman noktasında CO 2 asfiksasyonu yoluyla fareleri euthanize edin.
- Kan kardiyak ponksiyondan topar ve adım 5.2.1-5.2.2'deki gibi plazma toplar.
NOT: Diğer dokulara kıyasla kan toplayın çünkü ölüm sonrası hemen pıhtılaşmaya başlar. - Adım 5.2.2'de olduğu gibi fare kanını, alikuotu ve plazmayı işleyin.
- Daha sonra, imalatçının protokolüne göre Ötanazi'de elde edilen plazmada ELISA yoluyla eksojen sitokin konsantrasyonunu değerlendirin. Fare plazmasındaki exogenous sitokin konsantrasyonlarını seri olarak in vivo değerlendirin ve karşılaştırınKan toplama ve ötanazi plazma örnekleri (bölüm 5.3'de açıklanmıştır).
- 6.3.1 ve 6.3.2 adımlarında anlatıldığı gibi plazma hacmini ve prosesi değiştirmek için kalan kan numunesine PBS ekleyin. Akış sitometri testlerini derhal yapın ya da hücreleri dondurucu ortamda LN 2 depolaması için tekrar süspanse edin.
- PDX farelerinden kemik iliği (BM) ve dalak hasat edin ve daha önce anlatıldığı gibi tekli hücre süspansiyonları hazırlayın. 22
- Bir hemositometre kullanarak 1: 1 seyreltme ve sayım hücrelerinde metilen mavisi (lizleri hücre zarları ve canlı hücrelerin bozulmamış çekirdeğini bırakan RBC'ler) içeren% 3 asetik asit kullanarak her bir PDX fare doku örneği için hücre sayıları elde edin. Her bir hayvan için kemik iliği ve dalak örnekleri için toplam hücre sayılarını tablolaştırın.
- Santrifüj (500 xg, 15 dakika) hücre süspansiyonları ve süpernatanı boşaltın. Kemik iliği ve / veya dalak hücrelerinin akış-sitometri analizlerini derhal yapın veya LN <Alt> 2 depolama alanı.
NOT: Fare başına 10 BM alikotları (gelecek biyokimyasal analizler için) ve ~ 5 dalak alikosu (gelecek PDX nakilleri için) dondurun. - In vivo fonksiyonel etkileri tanımlamak için immünofotasyon
- İlgi sitokinine yanıt veren immünofenotip hematopoietik popülasyon (lar) a bir akış sitometri antikorlarının bir master-mix (MM) hazırlayın ve ikinci bir izotip kontrol antikoru MM'si hazırlayın ( Şekil 5 ve Malzeme Tablosu).
- Adım 7.4'te hazırlanan PDX doku alikoları (37 ° C boncuk banyosu) çözülür.
- Çözülmüş hücreleri konik bir tüpe aktararak ve en az 3x hacim PBS ilave ederek yıkayın. Santrifüj (500 xg, 5 dakika) ve süpernatanı boşaltın.
- Yıkama adımını tekrarlayın (Madde 7.5.3).
- Renklendirilmemiş kontrol, canlılık kontrolü ve izotip kontrolleri için her bir PDX örneğinden ~ 10 μL-20 μL hücre alarak havuzlanmış alikotlar oluşturun (bkz. Adım 6.4.6 not). Tüm örnekleri boyayın, ancak siz hariçSabit bir yaşayabilirlik boyası (ölü hücre işaretleyicisi) ile kontrol edin, inkübe edin ve üreticinin protokolüne göre yıkayın.
- Her PDX hücre örneğini, standart akış sitometrisi boyama protokolüne göre fenotipleme-MM ile boyayın; Benzer şekilde, izole edilmiş izotip kontrol örneğini izotip-MM ile boyayın. Tüm numuneleri kuluçkaya yatırın, PBS ile yıkayın ve% 1 paraformaldehitle tekrar süspanse ederek örnekleri düzeltin.
- Akış sitometrisi verilerini toplayın ve ilgilenen hücre popülasyonu için uygun bir geçiş stratejisi kullanarak verileri analiz edin ( Şekil 5 ). Tipik bir geçiş aşağıdaki gibidir:
- Hasarsız hücreleri, enkazı dışlayan bir FSC ve SSC geçidi çizerek tanımlayın.
- Ölü hücre işaretleyicisi için negatif olan hücreler üzerinde kapıları tutarak canlı hücrelerin popülasyonunu belirleyin (bu "toplam canlı hücreler" dir).
- İstenen imünofenotip ile hücre popülasyonlarını tanımlamak için "toplam canlı hücreler" içinde alt kapılar kullanın (bkz. Şekil 5).
- Elde etAkım sitometrisi analizinden toplam canlı hücre sayısı içindeki alt grup hücre popülasyonlarının sıklığı. 6 , 21
- Toplam canlı hücrelerde (adım 7.5.6.4'te elde edilen) B hücresi alt kümesinin frekansıyla, adım 7.3'te elde edilen doku başına toplam canlı hücre sayısı ile çarpılarak her dokuda hedef hücre sayısını hesaplayın (% B hücre alt kümesi x " Hemositometre hücre sayısı ", bakınız Tablo 1 )
- Kontrol dışı PDX fareleri ile sitokin eksprese eden (TSLP +) PDX fareler arasındaki hedef hücre popülasyonlarının hücre sayılarını, eksojen insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkilerini belirlemek için karşılaştırın ( Tablo 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modele genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir . Sitokin üreten (TSLP + stroma) ve kontrol stroması elde edildiğinde kültürde genleşirler. Farelere stroma enjeksiyonundan önce, stromal hücre yüzer maddesi, sitokin üretimini doğrulamak için ELISA ile değerlendirilir ( Şekil 2 ) ve stroma tarafından üretilen sitokinin aktivitesini doğrulamak için fosfo-akış sitometresi (Protokol 3) kullanılır. Hücreler pasajlandığında, konfluent stromal hücre kültürlerinden (kontrol stroması ve TSLP + stroma) süpernatant toplanır. ELISA, yüzer kısımdaki TSLP konsantrasyonunu, erken, orta ve geç pasajlar sırasında en az bir kez izlemek için kullanılır. Kontrol stromasından temsili veriler Şekil 2A'da gösterilmiştir. TSLP ekspresyonunu (ve bunlardan dondurulmuş tüm tüpleri) gösteren kontrol stromal hücre kültürleri atılmalıdır. Saptanamayan TSLP ile kontrol kültürleri gelecekteki kullanımlar için genişletilir ve dondurulur.Şekil 2B'de gösterildiği üzere, düşük seviyeli TSLP üretimi (ve bunlardan dondurulmuş şişeler) gösteren TSLP + stroma kültürleri atılır. Sitokinin stabil, yüksek düzeyde üretilmesini gösteren TSLP + stroma, gelecekteki deneylerde kullanılacak genişleme ve depolama için seçilir. Çoklu kontrol kültürleri ve TSLP + stromadan gelen süpernatandaki TSLP'nin ortalama seviyeleri Şekil 2C'de gösterilmektedir.
İnsan sitokini ile kontrol PDX farelerinin üretimi için deneysel zaman çizelgesi Şekil 3'te gösterilmektedir. Stromal hücre kültürleri transplantasyondan 3 hafta önce başlatılır ve kültür süpernatantında in vitro TSLP üretiminin ELISA tahlili, Şekil 2'de açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Fare plazmasındaki in vivo insan TSLP'si, "modifiye edilmiş ELISA'yı kullanarak haftalık olarak izlenir ( Şekil 4 ) Mikro hacimlerde fare plazması "olarak tanımlanmıştır. Periphera1 kan plazma ile aynı anda toplanır ve Protokol 6'da "Fare periferik kanındaki insan hücre kimerikizmasının analizi" bölümünde tarif edildiği gibi denenir. Kontrol stroması ile enjekte edilen PDX, tespit için eşik değerin altında olan plazma insan TSLP seviyelerini sürekli olarak gösterdi ( Şekil 4A ). TSLP + stroma enjekte edilen PDX farelerindeki TSLP plazma seviyesi, önceki 1 ila 2 hafta boyunca enjekte edilen TSLP + stromal hücrelerin sayısıyla orantılıdır. Stromal hücre enjeksiyonları kesilirse TSLP'nin plazma seviyeleri hızla düşer. Şekil 4B'de görüldüğü gibi haftalık 0.5 x 10 6 TSLP + stroma enjeksiyonu (kültür süpernatanında ortalama> 1,000 pg / mL TSLP üreterek) fizyolojik seviyelerin alt sınırına yakın plazma TSLP düzeyleri verdi (~ 5-10 pg / mL ). PDX farelerinde haftalık 5 x 10 6 TSLP + stroma enjeksiyonu, yüksek fizyolojik seviyelere (~ 35 pg / mL) ulaşan plazma TSLP seviyeleri ile sonuçlandı
TSLP'nin normal insan B hücresi öncüllerinin üretimini arttırdığı gösterilmiştir. 23 Böylece, TSLP'nin in vivo fonksiyonunu değerlendirmek için, Iyonu, hematopoietik kök hücreleri ile nakledilen kontrol ve TSLP + PDX farelerinde Şekil 5 ve Tablo 1'de gösterildiği gibi. Şekil 5A , insan B soy hücrelerinin alt kümelerini belirlemek için kullanılan immünofenotiplendirme için akış sitometrisi geçişini göstermektedir. Bir alt bölümdeki bir kontrol PDX ve bir TSLP + PDX için hücre sayısını numaralandırma için örnek hesaplamalar Tablo 1'de gösterilmektedir. Şekil 5B'de gösterildiği gibi, B soy hücreleri, kontrol PDX ile karşılaştırıldığında TSLP + 'da önemli ölçüde artmış ve bu artış, en erken B hücresi öncüleri (pro-B hücreleri) ile başlar. B olmayan lineage hücrelerin sayısı, kontrol ve TSLP + PDX arasında istatistiksel olarak farklı değildi (veriler gösterilmemiştir). Bu deney, TSLP + PDX'de in vivo üretilen insan TSLP'sinin bir hedef hücre popülasyonu üzerinde in vivo fonksiyonel etkiler ortaya koyduğunu doğrulamanın bir yolunu sağlar.
Ure 2 "src =" / dosyalar / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
Şekil 2: Stroma Süpernatantında TSLP Sitokin Konsantrasyonlarını İzlemek için ELISA. Aşağıdaki hücre geçitleri sırasında kontrol stromasından (kontrol vektörü kullanılarak transduze edilen) ve TSLP + stromadan (insan TSLP'sini ifade etmek için transduze edilen) süpernatan içerisindeki TSLP konsantrasyonlarını en az bir kez bir kez ölçmek için ELISA tahlilleri kullanılmıştır: erken (geçiş 1-5), orta 6-12) ve geç (pasajlar 13-20). Burada kullanılan insan TSLP ELISA tahlilinin tespit eşiği 1.9 pg / mL'dir (kırmızı kesikli çizgi). ( A ) Kontrol stroması, minimum düzeyde saptanabilir insan TSLP konsantrasyonlarını üretir; Bu seviyeler genellikle deney süresince ELISA tespit eşiğinin altındadır. Kültürde, TSLP konsantrasyonlarının (> 15 pg / mL) arttığını gösteren kontrol stroması, bu kültürden dondurulmuş tüm alikotlarla birlikte atılır. ( B ) İnsan TSLP üretimi, farklılardan üretilen kültürler arasında değişirTSLP + stroma ( n = 9) çözülmemiş tüpleri ve kültür periyodu boyunca. Azalan veya kararsız sitokin üretimi (TSLP <1000 pg / mL) gösteren TSLP stroması da atılır. ( C ) Kontrol (yeşil) ve TSLP + (mavi) stroma için ortalama TSLP konsantrasyonları (ortalama ve% 95 güven aralıkları). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Exogenous İnsan Sitokin Üretimi ile PDX Faresi Oluşturma Deneysel Zaman Çizelgesi. Deneyin in vitro ve in vivo kısımları aynı anda ilerlemektedir. Kontrol ve + TSLP stroma hücre kültürü, hematopoietik hücre naklinden 2-3 hafta önce başlatılır; bu, birinci hücreden önce en az 3 hücre pasajı sağlar.Wk-1) haftalık stromal hücre enjeksiyonlarının. Bu, stromal hücrelerin sağlıklı, proliferatif olmasını ve yeterli sitokin seviyeleri üretmesini sağlar. Süpernatant alikotları, hücreler pasajlandığında toplanır ve stroma süpernatantında TSLP konsantrasyonunu belirlemek için ELISA tahlilleri kullanılır (bkz. Şekil 2 ). Hayvanlar, 1. günde insan hematopoietik hücre naklinden bir gün önce 0 günde ışınlanır. Haftalık kan toplanması, ilk stroma enjeksiyonundan 1-2 hafta sonra başlar. Şu anda, eksojen insan sitokin konsantrasyonları değiştirilmiş ELISA tahlilleri ( Şekil 4 ) kullanılarak fare plazması saptanabilir olmalıdır. Deney bitiş noktası, insan hücre naklinden 5-16 hafta sonra; Bu fare periferik kanında saptanan insan hücre kimerikizmasının miktarına bağlıdır. Normal hematopoez, tipik olarak 5-7. Haftalarda ortaya çıkar, lösemi hücre kimerizmi hücre hatları ve primer numuneler arasında değişir (3-16 hafta). PDX nakli başarısı ve progresyonu da bağlıdırNakilde enjekte edilen insan hücrelerinin sayısı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Fare Plazmasındaki Fizyolojik İnsan TSLP Sitokin Konsantrasyonlarına Ulaşmak. Farelere, transduced hücrelerin haftalık intraperitoneal enjeksiyonlar (200 uL) verilir ve zamanla farelerdeki in vivo insan TSLP konsantrasyonlarını (ELISA testi) değerlendirmek için plazmaları toplanır. TSLP + düşük "(düşük TSLP stroma dozu) farelerde 0.5 x 10 6 TSLP + stroma hücresi," TSLP + yüksek "(yüksek TSLP stroma dozu) farelere 5 x 10 6 kontrol stroma hücresi verilmiştir. 6 TSLP + stromal hücreler her hafta. İnsan TSLP ELISA testi Tespit eşiği 1.9 pg / mL'dir (kırmızı kesikli çizgi) ve TSLP'nin insan fizyolojik aralığı ~ 5 ila 35 pg / mL'dir (gri gölgeleme). 24 (Referans 11 ve Katlanmamış yayınlar) ( A ) "Kontrol" fare plazması sürekli olarak TSLP seviyeleri <5 pg / mL veya ELISA tespit eşiğinin altındadır. ( B ) "TSLP + düşük" fare plazması TSLP'nin düşük fizyolojik düzeylerini gösterir; ( C ) "TSLP + yüksek" fare plazması yüksek fizyolojik seviyeler gösterir. ( D ) Her bir deney grubu için ortalama TSLP konsantrasyonları (tüm farelerin ve zaman noktalarının ortalama ± SEM'i) fare plazmasında saptanan TSLP seviyelerinin alınan stroma oranla orantılı olduğunu; Kontrol fare plazma seviyeleri ELISA tespit eşiğinin altındadır ve "TSLP + yüksek" plazma seviyeleri, "TSLP + düşük" fare plazma seviyelerinin dört katındadır."> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Normal İnsan B Hücre Popülasyonlarının Tayini, PDX Faresinde Eksojen İnsan TSLP'sinin n Vivo İşlevsel Etkilerini Doğruladı. PDX fareleri kontrol ve TSLP + stroma ile işlenmiş ve göbek kordonu kanından izole edilmiş insan CD34 + hücreleri ile nakledilmiştir. Kontrol ve TSLP + PDX'den hasat edilen kemik iliğinde, insan B hücresi öncüllerinin alt gruplarını aşağıdaki gibi tanımlamak için akış sitometresi ile bağışıklık-fenotiplendirme kullanıldı: Hasat edilmiş kemik iliği çözüldü ve sabitlenebilir viabilite boyası ile boyandı ve anti- Insan CD45, CD19, CD34, κ ve λ hafif zinciri ve yüzey IgD ve IgM veya hücre içi IgM (cμ). ( A ) Toplam yaşayan celBir yaşayabilirlik işaretine dayanıyorduk. Ardışık parseller, gelişimsel olarak ardışık B soy gruplarını tanımlamak için sonraki kapıları göstermektedir (gösterilen veriler TSLP + PDX'ten alınmıştır). ( B ) Toplam canlı hücreler içerisindeki her bir alt grubun frekansı, akış sitometrisi yazılımı ile belirlendi ve her bir B hücresi alt kümesindeki hücre sayısı hesaplandı. (Bkz. Tablo 1). Kontrol (siyah, n = 3) ve TSLP + (mavi, n = 5) PDX farelerindeki her bir B hücre alt kümesi için hücre sayısı grafiksel olarak gösterilmektedir. (Ortalama ± SEM, * p <0.05, ** p <0.01, **** p <0.0001). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| İnsan Hücresi Nüfusu | Frekans. Yaşayan Hücrelerin Toplamı | Yaşayan Hücre Sayısı iN BM | Nüfustaki Hücreler |
| Kontrol Fare | |||
| Toplam canlı hücreler | 100.00% | 39.5 x 10 6 | 39.5 x 10 6 |
| hCD45 + | 98.50% | 39.5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Toplam CD19 + | 27.20% | 39.5 x 10 6 | 10.7 x 10 6 |
| Pro-B | 24.20% | 39.5 x 10 6 | 9.56 x 10 6 |
| Ön-B | % 1.70 | 39.5 x 10 6 | 0.68 x 10 6 |
| Olgunlaşmamış B | % 0.83 | 39.5 x 10 6 | 0.33X 10 6 |
| Olgun B | % 0.68 | 39.5 x 10 6 | 0.27 x 10 6 |
| TSLP + Fare | |||
| Toplam canlı hücreler | 100.00% | 72.0 x 10 6 | 72.0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99,30% | 72.0 x 10 6 | 71.5 x 10 6 |
| Toplam CD19 + | 65.10% | 72.0 x 10 6 | 46.8 x 10 6 |
| Pro-B | 60.20% | 72.0 x 10 6 | 43.3 x 10 6 |
| Ön-B | % 2.70 | 72.0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Olgunlaşmamış B | % 1.60 | 72.0 x 10 6 | 0.11 x 10 6 |
| Olgun B | % 0.40 | 72.0 x 10 6 | 0.29 x 10 6 |
Tablo 1: PDX Kemik İliği'nde Normal İnsan B Hücre Altkümelerinin Frekansı ve Sayısı. Toplam canlı hücreler içerisindeki her bir B hücresi alt grubunun frekansı (%), akış sitometrisi analizi ile belirlendi (geçiş stratejisi için Şekil 5A'ya bakınız). Bir kontrol PDX fare (kontrol stroma enjeksiyonu, haftada 5 x 10 6 hücre alınan) ve bir TSLP + PDX fare (TSLP stroma enjeksiyonu, 5 x 10 6 hücre / hafta alındı) Temsilci kemik iliği (BM) verileri. Toplam yaşayan BM hücre sayıları ötenazide kaydedildi ve alt-grup frekansını (%) değerlendirmek ve bağışıklık-fenotipleme akış sitometrisi kullanıldı ve her B hücresi alt-kümesi popülasyonunun boyutunu hesapladı (alt küme hücre sayısı = "totYaşayan hücreler "x" alt set frekansı ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazması, eksojen insan sitokini sentezlemek için PDX'in mühendisliği için basit, hızlı ve nispeten düşük maliyetli bir yöntemi anlatmaktadır. Burada tarif edilen strateji, insan sitokini, TSLP'yi eksprese etmek için transduze edilen bir stromal hücre hattının haftalık intraperitoneal enjeksiyonuna dayanır. Burada açıklanan yöntemleri uygulamadan önce, yüksek sitokin düzeyini (TSLP) ifade etmek üzere tasarlanmış stroma ve benzer şekilde tasarlanmış kontrol stroması üretildi. Burada sunulan protokollerde, stroma kültür içinde genişletilir ve zamanla istikrarlı, yüksek seviyeli sitokin üretimi sağlamak (veya kontrol stroması durumunda sitokin üretimi olmadığı sürece) için tarama yapılır. Stroma ile oluşturulan sitokinin aktivitesini doğrulamak için denemeler yapıldı ve fizyolojik insan TSLP'si (ve insan TSLP'si olmayan kontrol fareleri) ile PDX üretmek için stromal hücre enjeksiyonu için deneysel zaman çizelgeleri geliştirildi. İnsan TSLP'sinin plazma seviyelerinin izlenmesi için prosedürler veIn vivo sitokine duyarlı hücre popülasyonları üzerindeki işlevsel etkilerini doğrulamak için gerçekleştirilmiştir.
Burada sunulan protokollerde kullanılacak stromal hücrelerin ve vektörlerin seçiminde birkaç faktör göz önüne alınmalıdır. Stromal hücre çizgileri endojen olarak yüksek düzeyde sitokin üretmemeli ve ilgi konusu sitokine duyarlı olmamalıdır. Burada yapılan çalışmalar için insan kemik iliği stromal hücre hattı HS-27A seçildi, çünkü kültürde düşük seviyeli sitokin üretimi ile sağlam bir şekilde büyür. 8 Burada açıklanan yöntem, TSLP + PDX ile aynı stroma sahip, ancak TSLP'nin aşırı ifadesi olmadan tasarlanmış "kontrol" PDX'i de içerir. TSLP + ve kontrol PDX sonuçlarının karşılaştırılması, endojen stromal hücre sitokin üretiminden kaynaklanan tüm etkileri kontrol etmemizi sağlar. Flüoresan proteinleri veya diğer seçilebilir belirteçleri içeren vektörler ile stromal hücrelerin iletilmesi, hücre izolasyonu için yararlı olabilir.Ilgi konusu sitokini aşın ifade edecektir. Bununla birlikte, sitokin süpernatantının, stromal hücreler tarafından üretilen sitokinin seviyesini belirlemek için analiz edilmesi esastır, çünkü farelerde in vivo plazma sitokin seviyeleri, stromal hücre süpernatantındaki sitokin konsantrasyonu ile ilişkilidir [ 6] ve aynı zamanda, enjekte edilen stroma sayısı ( Şekil 4 ).
Stroma tarafından üretilen sitokinin etkinliğinin PDX çalışmalarından önce doğrulanması önemlidir. TSLP'ye yanıt veren hücrelerdeki TSLP uyarılmasının akış aşağısında fosforile edilen moleküller için fosfo-akış sitometrisi kullandık. TSLP, JAK-STAT5 ve PI3 / AKT / mTOR yolaklarını aktive eder. MUTZ5 ve MHH-CALL4 lösemi hücre çizgileri, TSLP reseptör bileşenlerini yüksek düzeyde ifade eder ve TSLP uyarımını takiben STAT5, AKT ve ribozomal protein S6 fosforilasyonunu gösterir. 14 Burada, fofo-flow sitometri kullandıkTSLP stimülasyonunun aşağı akışında indüklenen STAT5'in (pSTAT5) fosforilasyonunu değerlendirmek. Daha önceki çalışmalarda, ilave TSLP ile uyarılan fosforilasyon olaylarını değerlendirdik: fosfo-AKT (pAKT) ve fosfo-ribozomal protein S6 (mTOR'nin aşağı akışında pS6). Sonuçlar pAKT testinin daha az duyarlı olduğunu ve pS6'nın pSTAT5 testinden daha duyarlı olduğunu gösterdi. 6 Fosfo tahlilleri yapıldığında, duyarlı hücreler doymuş seviyelerde pozitif kontrol olarak rekombinant insan TSLP'si ve sadece negatif kontrol olarak ortam (sitokin içermez) ile kültür edilmelidir. Kontrol stromasından gelen üst faz, TSLP'nin kontrol stroması tarafından üretilmediğini doğrulamak için ikinci bir doğrulama yöntemi olarak (ELISA'ya ek olarak) TSLP + stromadan gelen teste tabi tutulmalıdır. Bu aynı zamanda endojen sitokin üretiminin, TSLP + hücrelerinin tahlillerinde gözlenen fosforilasyondan sorumlu olmadığını temin etmek için bir kontrol görevi görür. İdeal olarak sitokin üreten stroma örneklerinden indüklenen fosforilasyon simil olmalıdırRekombinant sitokin koşulu ile gözlemlemek mümkündür, ancak süpernatant içerisindeki sitokin konsantrasyonu doymuş, pozitif kontrole göre daha düşük olmasına rağmen. TSLP + stroma için ELISA ile gözlemlenen seviyelere uyan rekombinant TSLP seviyeleri ile pozitif bir kontrol iyi bir alternatiftir.
İn vivo sitokin aktivitesinin bilinen fonksiyonel göstergelerinin belirlenmesi bir mücadele olabilir. Fosforilasyon tahlilleri mümkün olmayabilir çünkü eksojen insan sitokininin in vivo yol açtığı fosforilasyon, doku hasatı sırasında hızla kaybolabilir. TSLP'nin insan B hücresi öncüllerinin üretimini arttırdığı gösterildiğinden, TSLP'nin PDX'deki işlevsel etkisi, akış sitometri immünfotasyonunun kullanılmasıyla insan B hücre prekürsör popülasyonundaki in vivo artışlar için denenerek doğrulanmıştır. Alternatif bir strateji, gen ekspresyonunda spesifik sitokin kaynaklı değişiklikler için ve karşılaştırmadaSitokin eksprese edici PDX'den hasat edilen hücrelerde, kontrol PDX'den hücrelere sentezleme. 6
PDX'de insan sitokin ekspresyonunun nihai hedefi, hastalarda mevcut in vivo ortamı daha yakından modelleyen bir klinik öncesi model oluşturmaktır. Bu, kontrol PDX'den izole edilen insan dokularındaki tüm genom ekspresyonunu ve sitokin eksprese eden (TSLP +) PDX'den orijinal hasta örneklerine kıyasla test edildi. Bu çalışmalar, hasta numunelerindeki gen ifadesinin TSLP + PDX'den kontrollerden daha lösemi hücrelerine çok daha yakın olduğunu gösterdi. Ancak, çalışmalarımız lenfopoez üzerine yoğunlaşmıştır. Fare içerisinde üretilen birkaç miyeloid teşvik eden sitokin insan reseptör karşılıklarını aktive etmez. Bu konuyu ele alan insan sitokin knockin fareleri (NSGS fareleri ve diğerleri) vardır. Nitekim, burada açıkladığımız modelin bir değeri, NSGS farelerinde daha yakın bir model yaratmak için kullanılabileceğidir.Ely, miyeloid destekleyici insan sitokinlerine ek olarak TSLP'yi eksprese ederek insan in vivo ortamda modelleme yapar. Öte yandan, bir sitokin +/- sistemi, burada bu miyeloid teşvik eden sitokinlerin her biri için tarif edilen yöntemi kullanarak NSG farelerinde üretilebilir. Bu model, myelopoieis ve / veya miyeloid lösemide her birinin in vivo olarak kesin rolünü incelemek için kullanılabilir.
Fizyolojik seviyelerde insan TSLP üreten tasarlanmış PDX, klasik PDX'e kıyasla hastalarda mevcut in vivo ortamı daha yakından taklit eden bir preklinik model sağlar. Benzer şekilde işlenmiş kontrol PDX farelerinin üretimi de açıklanmaktadır. Birlikte kontrol ve sitokin üreten PDX, normal ve malign insan B hücrelerinin in vivo üretimi için TSLP'nin rolünü değerlendirmek için başarıyla kullandığımız bir insan TSLP +/- model sistemi oluşturur. 4 , 6 BuModeli, CRLF2'nin aşırı ekspresyonuna yol açan genetik değişikliklerle karakterize edilen belirli yüksek riskli B hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) çalışmalarıyla oldukça yakından ilgilidir. CRLF2, TSLP sitokini için bir reseptördür ve dolayısıyla TSLP ile indüklenen CRLF2 sinyali, muhtemelen CRLF2 + B-ALL'in onkogenezine ve ilerlemesine katkıda bulunur. Bu hastalığın araştırılması için PDX kullanımı özellikle önemlidir çünkü PDX, hastanın genetik peyzajı bağlamında lösemi çalışmamıza izin verir. Bir hastalık katkısı olan genetik manzara, Hispanik / Latino çocuklarında diğerlerinden daha beş kat daha sık görülen ve Down Sendromlu hastalardaki tüm B-ALL vakalarının yarısını oluşturan CRLF2 + B-ALL'de güçlü bir şekilde rol oynuyor. Burada açıklanan gibi insan TSLP'sini ifade eden PDX modelleri, CRLF2 + B-ALL'in hastalık mekanizmalarını anlamada ve normal hematopoezi anlamada önemli bir araç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
