Summary
Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.
Abstract
Bis heute sind die verfügbaren chirurgischen und pharmakologischen Behandlungen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind begrenzt und oft palliativ. Zur gleichen Zeit, Gen- und Zelltherapien sind vielversprechende alternative Ansätze für eine CVD-Behandlung. Allerdings ist die breite klinische Anwendung der Gentherapie durch den Mangel an geeigneten Genabgabesysteme stark eingeschränkt. Die Entwicklung geeigneter Genübertragungsvektoren können, eine Lösung für die aktuellen Herausforderungen in der Zelltherapie bereitzustellen. Insbesondere bestehende Nachteile, wie begrenzte Effizienz und niedrige Zelleinlagerungen im Organe verletzt, konnte durch entsprechendes Zell - Engineering (dh genetische) vor der Transplantation überwunden werden. Das dargestellte Protokoll beschreibt die effiziente und sichere vorübergehende Modifikation von Endothelzellen ein Polyethylenimin superparamagnetischen Nanopartikel (PEI / MNP) -basierten Auslieferungsvektor verwendet wird. Außerdem werden der Algorithmus und Methoden zur Zellcharakterisierung definiert. Die erfolgreiche intracelluLAR Lieferung von microRNA (du) in menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) hat, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen, Funktionalität oder die interzelluläre Kommunikation erzielt worden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz eine starke funktionelle Wirkung in eingeführten exogen ich verursachen unter Beweis gestellt. Wichtig ist, gewährleistet die Anwendung dieser MNP-basierte Vektorzelle Magnetisierung, mit Möglichkeiten des magnetischen Ausrichtung und nicht-invasiven MRI-Tracing begleitet. Dies kann eine Grundlage für die magnetisch geführt wird, gentechnisch hergestellten Zelltherapeutika bereitzustellen, die nicht-invasiv mit MRI überwacht werden kann.
Introduction
Gen- und Zelltherapie sind leistungsfähige Werkzeuge, die das Potenzial haben, um die aktuellen Herausforderungen in CVD-Behandlung zu lösen. Trotz der Tatsache , dass diese beiden Ansätze derzeit in klinischen Studien getestet werden, sind sie noch nicht bereit für eine breite klinische Anwendung 1. Bemerkenswert ist, ein gemeinsames Konzept für die Herausforderungen der Gen- und Zelltherapie zu bekämpfen ist multifunktional Genabgabevektoren geeignet für die klinische Anwendung zu entwickeln. Der Mangel an sicheren und effizienten Genabgabesysteme ist das Hauptanliegen der Gentherapie. Zur gleichen Zeit, die gentechnische Veränderung von Zellprodukten vor der Transplantation konnte die schweren Herausforderungen der Zelltherapie, wie geringe Effizienz (zB im Herzfeld, nur ca. 5% der funktionellen Verbesserung erreichte nach Stammzelltransplantation überwunden 1 ) und schlechte Retention / Verpflanzung an der Stelle der Verletzung (dh fällt Zellbindung unter von 5 bis 10% innerhalb von Minuten bis Stunden post-Anwendung, unabhängig vom Applikationsweg 2, 3, 4).
Bisher überschreiten virale Vektoren stark nicht-virale Systeme in Bezug auf Effizienz, die in ihrer breiteren Anwendung in klinischen Studien (~ 67%) 5 geführt hat. Allerdings trägt virales Vehikel ernsthafte Risiken, wie Immunogenität (und die nachfolgende Entzündungsreaktion mit schweren Komplikationen), Onkogenizität und Einschränkungen in der Größe des durch genetische Material 6. Aufgrund dieser Sicherheitsbedenken und die hohen Kosten der Produktion viraler Vektor, ist die Verwendung von nicht-viralen Systemen bevorzugt in bestimmten Fällen 7, 8. Es ist besonders geeignet für Erkrankungen , die transient genetische Korrektur, wie beispielsweise die Expression von Wachstumsfaktoren erfordern Steuerung der Angiogenese (zB für die CVD - Behandlung) oder die delivery von Impfstoffen.
In unserer Gruppe wurde ein Abgabesystem durch die Kombination von verzweigtem 25 kDa-Polyethylenimin (PEI) und superparamagnetische Eisenoxid - Nanopartikel (MNP) miteinander verbunden ist durch Biotin-Streptavidin - Wechselwirkung 9 ausgelegt. Dieser Vektor ist ein mögliches Instrument für die gentechnische Veränderung von Zellen, so dass für ihre gleichzeitige Magnetisierung vor der Transplantation. Letzteres stellt eine Basis für die magnetische Orientierung / Retention, die heutzutage besonders vielversprechend, da die erweiterte Targeting Techniken erfolgreich 10 entwickelt. Zudem 12 die resultierenden magnetisch ansprechenden Zellen , die das Potential haben , nicht-invasiv durch Magnetresonanztomographie (MRI) oder Magnetic Particle Imaging 11, überwacht zu werden.
Im Fall des PEI / MNP-Vektor, stellt sicher, Polyamin-Kondensations Nukleinsäure- und somit Schutz vor abbauenden Faktor s, Vektor - Internalisierung in Zellen und endosomalen 5 entkommen. Die MNP ergänzen die Eigenschaften von PEI, nicht nur in Bezug auf die magnetische Orientierung, sondern auch durch die bekannte PEI Toxizität reduzieren 7, 13, 14. Zuvor in Bezug auf die Abgabeeffizienz (dh pDNA und miRNA) und Sicherheits PEI / MNP Vektor Eigenschaften wurden eingestellt durch Fibroblasten und humanen mesenchymalen Stammzellen , 15, 16 verwendet wird .
In diesem Manuskript wird ein ausführliches Protokoll zur Anwendung von PEI / MNP zur Erzeugung von miRNA-modifizierten Zellen wird 17 beschrieben. Zu diesem Zweck werden HUVECs verwendet und ein etabliertes Modell für die in - vitro - Angiogenese darstellen. Sie sind schwierig zu transfizieren und sind anfällig für toxische Einflüsse 18, 19,ass = "xref"> 20. Zusätzlich stellen wir einen Algorithmus solche Zellen in vitro zu bewerten, einschließlich ihrer Ausrichtung, die interzelluläre Kommunikation, und MRI - Erkennung.
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Protocol
Menschliche Nabelschnur zur Zellisolierung wurde nach der Geburt aus informiert, gesunden Frauen erhalten , die ihre schriftlichen Einwilligung zur Nutzung dieses Materials für die Forschung nach der Deklaration von Helsinki gab. Die Ethikkommission der Universität Rostock hat die vorliegende Studie bestätigt (Reg. Nr A 2011 06, verlängerter 23. September 2013).
1. Herstellung von Transfektionskomplexen
- Biotinylierung von Polyethylenimin (PEI).
- 400 Umdrehungen pro Minute für 24 h bei Raumtemperatur (RT) und vor Licht geschützt, um eine 0,18 mM-Lösung zu erhalten, - bei 300 auflösen PEI in ultrareinem Wasser unter magnetischem Rühren verzweigt. Lagern Sie die Lösung bei 4 ° C.
- Messung der Konzentration von primären Aminogruppen in der erhaltenen Lösung 21, 22.
- Verwendung 2% Ninhydrin Reagenzlösung als Amin Nachweisreagenz 23 um 100 & mgr; L PR Mischediluted Probe (1: 200 mit Reinstwasser) und 75 & mgr; l Ninhydrin Reagenz. bei 80 ° C für 30 min inkubieren. Abkühlen lassen und mit 100 & mgr; l 50% Ethanol zur Stabilisierung. Messung der Absorption bei 550 nm auf dem Absorptions-Spektrophotometer.
- Erstellen Sie eine Standardkurve mit Glycin.
- Bereiten 0,1 M amino-N-Stammlösung (0,75 g Glycin in 100 ml entionisiertem Wasser) und deren Verdünnungen, 1: 1, 1: 5, 1:10 1:20 1:40 1:80, 1: 100, 1: 200 und 1: 400, 1: 600. Messen, diese Lösungen, wie in Schritt 1.1.2.1 und schaffen eine Handlung mit der Konzentration und der Absorption auf den Achsen.
- Basierend auf der erhaltenen Handlung und die gemessenen Extinktion der Lösung PEI, definiert die Konzentration der α-Aminogruppen in PEI.
HINWEIS: Vorsicht. Ninhydrin Reagenzlösung muß ausschließlich unter der Motorhaube verwendet werden und soll unter einer Stickstoffatmosphäre gelagert werden. Es ist nicht verwendbar, wenn die Farbe der Lösung zu Oxidation aufgrund ändert.
- Man löst 100 mg des Biotin-Linkers in ultrareinem Wasser unmittelbar vor der Anwendung eine 0,01 mM-Lösung zu erhalten. Berechnen der erforderlichen Menge an Biotin an PEI hinzuzufügen, indem die Konzentration von α-Aminogruppen in PEI Multiplizieren (gemessen in Schritt 1.1.2) von 20, um die erforderliche Menge zu erhalten (in Mol) Biotinylierungsreagenz.
- Fügen Sie die Biotin-Lösung auf die PEI-Lösung bei pH 8-9 und Inkubation für 16 h unter magnetischem Rühren bei RT.
- Entfernen Sie die nicht umgesetzten Biotin durch Grßenausschlußchromatographie 23. Verwenden im Handel erhältliche Säulen, die ein Gelfiltrationsmedium geeignet für die Reinigung des 25-kDA PEI enthalten, und die Anweisungen des Herstellers. Nehmen Aliquots nach der Reinigung der Aminkonzentration unter Verwendung eines Amins Nachweisreagenz (Schritt 1.1.2) zu messen und die Biotin Konjugationseffizienz (Schritt 1.2.2) zu bestimmen. Lagern Sie die erhaltene biotinylierte PEI bei 4 ° C.
- Charakterisierung von biotinyliertem PEI.
- Bestimme die Konzentration von α-Aminogruppen in PEI nach der Biotinylierung, wie es in Schritt 1.1.2 beschrieben.
- Bestimmen Sie den Grad der PEI Biotinylierung die Konjugationsprozedur zu überprüfen. Zur Quantifizierung Verwenden eines kommerziell erhältlichen Kits, die auf der Anwendung von HABA - Farbstoff (4'-Hydroxyazobenzol-2-carbonsäure) beruht, 24 , um die korrekte kolorimetrische Bestimmung der Biotinylierung Ebenen, 25 zu gewährleisten. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
- Filtration von MNPs und deren Charakterisierung.
- Filter kommerziell erhältlichen Streptavidin-beschichteten MNP durch einen 0,45 & mgr; m-Spritzenfilter 16 angetrieben , um größere Aggregate toxische auszuschließen. Messen Sie die endgültige Eisenkonzentration einen Standard photometrischer Test unter Verwendung von 26.
- Überprüfen Sie die Qualität der gefilterten MNPs durch Aufnahmedie Magnetisierungskurve und durch TEM - Bildgebung in Übereinstimmung mit Standardprotokollen 27, 28.
- Verdünne die MNP-Suspension mit destilliertem Wasser und legen 3 ul der erhaltenen Suspension auf ein 300-Mesh-Kohlenstoff Formvar-beschichtete Kupfergitter für die TEM-Analyse. Anschließend legt dieses Gitter auf einem Glasobjektträger auf einer Heizplatte und trocknen lassen.
- Analysieren der Probe mit einem Transmissions - Elektronenmikroskop bei 120 kV und überprüfen den Inhalt elementar einen Röntgendetektor 27 verwendet wird .
- 3-farbige Kennzeichnung von Transfektionskomplexen für superauflösende Mikroskopie.
- Beschriften 0,5% der gemessenen primären Aminogruppen in PEI mit NHS-Ester-Farbstoff Atto 488 gemäß der Anweisungen des Herstellers. Entfernen des überschüssigen ungebundenen Farbstoff durch Grßenausschlußchromatographie, wie oben (Schritt 1.1.4) beschrieben. Messen Sie die resultierende Konzentration von Aminogruppen unter Verwendung eines Ninhydrin ASSAy (Schritt 1.1.2).
- Beschriften im Handel erhältlich verschlüsselten sie (scr-du) mit Cyanine5 Farbstoff mit einem geeigneten Markierungssatz 15 mit (in der Materialliste). Messen Sie die resultierende Fluorophor-Konzentration spektralphotometrisch ich.
- Frisch Etikett des MNP jedesmal mit Biotin-konjugierten Farbstoff (zB ATTO 565-Biotin) in einem 1: 1000 w / w - Verhältnis. Direkt um den Farbstoff auftragen , nachdem er während der Bildung der Transfektionskomplexe die MNP zum miR / PEI Zugabe, nach den Angaben in Delyangina et al. 16.
2. Zellpräparation
- HUVEC Isolation.
- Isolat aus den Zellen der Nabelschnur direkt nach der Korde unter Verwendung Kollagenaseverdau aus dem Inneren des Kords vein erhalten; folgt einem zuvor entwickelten Protokoll 29.
- Inkubieren jeder Schnur mit ~ 60 Einheiten / ml Kollagenase Typ IV-Lösung in Puffer - geladen ter Nabelschnurvenen - bei 37 ° C für 13 min.
- Für alle Versuche, bündelt die HUVECs von einem Minimum von 5 Patienten.
HINWEIS: Der Anbau soll nicht mehr als 4-5 Passagen. Verwenden Sie keine Zellen mit Mycoplasmen kontaminiert, da dies eine Verringerung der Transfektionseffizienz verursacht. Mykoplasmen-Kontaminationen sollen getestet werden, bevor das Protokoll unter Verwendung eines PCR-Kits für den hochempfindlichen Nachweis von Mycoplasmen zu starten.- Test auf Mykoplasmen Präsenz.
- Zentrifuge 1 ml Zellkulturüberstand für 10 min (13.000 xg). Suspendiere das Pellet in 17 & mgr; l dH 2 O und Sieden (93 ° C) für 3 min. Verwendung 2 ul der Suspension des DNA-Bereich, das für hochkonservierte ribosomalen RNAs (16S-rRNA) verschiedener Mycoplasma Spezies zu amplifizieren.
- Durchführen der PCR 10 pmol eines jeden Primers unter Verwendung von (Vorwärtsprimer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; Rückwärtsprimer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') in kammination mit einem handelsüblichen PCR-Kit unter den folgenden Bedingungen: 94 ° C für 3 min; 45 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 50 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s; und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min.
- Analysieren des PCR-Produkts (292 bp) unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese.
- Test auf Mykoplasmen Präsenz.
- Entweder speichert die erhaltenen Zellen langfristig in flüssigem Stickstoff oder Kultur sie in der endothelialen Wachstumsmedium , ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2.
- Isolat aus den Zellen der Nabelschnur direkt nach der Korde unter Verwendung Kollagenaseverdau aus dem Inneren des Kords vein erhalten; folgt einem zuvor entwickelten Protokoll 29.
- HUVEC Charakterisierung.
- Charakterisieren isoliert HUVECs im Hinblick auf ihre Funktionsfähigkeit Röhren in der Basalmembran - Matrix zu bauen ( zum Beispiel Matrigel) und deren Expression des endothelialen Marker CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1) nach Standardprotokollen 30, 31.
3. Transfection
- Trypsiniere den Bestand HUVEC Kultur (siehe Schritt 4.1.2.) Und die Zellen manuell eine Haemocytometerzählung verwenden. Saatgut die HUVECs auf Kunststoff - Zellkulturplatten gut geeigneter Größe, mit einer Ausgangszelldichte von etwa 13.000 Zellen / cm 2 von Wachstumsoberfläche, 48 h vor der Transfektion , bis 70-80% Konfluenz erreicht wird.
- Bereiten Sie frische miR / PEI / MNP-Komplexe jedes Mal.
HINWEIS: Zuerst ich / PEI-Komplexe sollen (3.2.1 Schritte - 3.2.3) erhalten werden; Anschließend MNP sollte den ihn / PEI-Lösung (Schritt 3.2.4), um die endgültige ich / PEI / MNP-Formulierung zur Transfektion (Schritt 3.3) verwendet, erhalten zugesetzt werden.- Berechnen die Menge der entsprechend im Handel erhältlich ich (verwürfelt, getaggt oder funktionelle, siehe Schritt 4), um die Konzentration der vom Hersteller gelieferten Lager verwenden. Verwenden von 2,5 pmol ich / cm 2 der Zellwachstumsoberfläche. Verdünnen Sie die ich in 5% Glucose-Lösung obtain eine Endkonzentration von 0,125 pmol von miR / & mgr; L.
- Basierend auf der Menge von miR Schritt 3.2.1 und dem optimalen Verhältnis von 25 NP 32, die Berechnung der erforderlichen Menge an PEI - Konzentration unter Verwendung seiner gemessenen (Schritt 1.1.2). Verdünne das PEI (je die berechnete erforderliche Volumen) in einem gleichen Volumen von 5% iger Glucoselösung. Fügen Sie die erhaltenen vorverdünnt PEI auf die miR-Lösung (aus Schritt 3.2.1) und Vortex der erhaltenen Mischung für 30 s.
- Inkubieren des erhaltenen miR / PEI-Gemisch für 30 min bei RT.
- Beschallen der MNP bei 35 kHz für mindestens 20 min in dem Beschallen Wasserbad (siehe die Materialliste) bei RT, fügt die entsprechende Menge an MNP Lösung des ich / PEI (5-25 & mgr; g Eisen / ml hergestellt ich / PEI / MNP Mischung 16), Vortex für 30 s und 30 min bei RT , bis sie bereit inkubiert.
- Fügen Sie die vorbereiten ich / PEI / MNP Mischung tropfenweise direkt zu dem Kulturmedium auf den Zellen. Verwenden der resultierenden Mischung von Zell culture Medium mit miR / PEI / MNP in Glucose als Transfektionslösung verdünnt. Ersetzen Sie diese Mischung mit frischem Kulturmedium 6 h nach der Transfektion.
4. Analyse von Vector Sicherheit
- Prüfung der Lebensfähigkeit der Zellen.
- Transfizieren der HUVECs ausgesät in einer 24-Well-Kulturplatte (Schritte 3.1 und 3.2); verwenden Cy3-mich wie die Testsonden und verwürfelte mich (scr-dich) als die Steuer Gating-Sonden für die Durchflusszytometrie. Bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2 für 24 h.
- Sammeln Sie den Überstand und die transfizierten Zellen durch Trypsinisierung unter Verwendung von 1x Trypsin-EDTA verdünnt in PBS bei 37 ° C zu den Zellen für 4 min hinzugegeben. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min und die Verwendung für die Analyse.
- Untersuchen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und ich Aufnahmeeffizienz von 24 Stunden nach der Transfektion unter Verwendung von Durchflusszytometrie mit einem handelsüblichen Fleck Anwendung zwischen Wohn- / toten Zellen zu unterscheiden; Verwendung von Standardprotokollen 15
- Untersuche die Sicherheit der ich / PEI / MNP-Komplexe für Zellen in funktionellen Assays.
- Bewerten Sie die Proliferationsaktivität von transfizierten Zellen.
- Transfizieren HUVECs ausgesät in einer 12-Well - Kulturplatte (Schritte 3.1 und 3.2) mit funktioneller Antisense ich (zB anti-miR92a für HUVECs 31) und Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre fi ed , die 5% CO 2 für 24 h.
- Verwenden eines kommerziell erhältlichen Kits, die Anzahl der proliferierenden Zellen zu definieren, indem sie mit EdU Anfärben (5-ethinyl-2'-desoxyuridin) und das Scannen mit laserbasierten konfokalen Mikroskopie. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen Mikroskopie: 40X-Objektiv mit Ölkapselung; 633-nm-Anregungslaser (für einen 647-nm-Farbstoff); 5 Zufallsfelder in jeder Probe aufgezeichnet werden. Berechnen der Rate der proliferierenden Zellen durch die Anzahl der EDU-gefärbten Zellkernen durch die Gesamtkeimzahl dividiert (Hoechst-gefärbt).
- Evaluieren der Fähigkeit der transfizierten Zellen schlauchartige Strukturen zu bilden, wie zuvor beschrieben , 17, 31.
- Transfizieren die HUVECs ausgesät in einer 24-Well - Kulturplatte (Schritte 3.1 und 3.2) mit scr-ich und Inkubation für 48 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2. Sammelt die transfizierten Zellen (wie in Schritt 4.1.1).
- Seed 3,5 x 10 4 von modifizierten HUVECs in 24-Well - Platten , beschichtet mit 140 & mgr; l von Basalmembran - Matrix. Bei 37 ° C für 18 h Inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2.
- mit ImageJ Software mit dem „Angiogenesis Analyzer“ Plugin Record Bilder von 10 zufälligen Feldern in jeder Vertiefung unter Verwendung von Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie (Differential-Interferenz-Kontrast) und analysieren. Umfassen solche Parameter wie die Gesamtlänge der Äste, die Anzahl der Verzweigungen und die Anzahl der junctions in der Auswertung. Vergleichen Sie dies mit der unbehandelten Kontrolle.
- Bewerten Sie die Proliferationsaktivität von transfizierten Zellen.
- Untersuche den möglichen toxischen Einflusses von Transfektionskomplexen auf gap junction (GJ) -vermittelten interzelluläre Kommunikation (GJIC) durch Testen 3D fluorescence recovery nach (FRAP) 33 in 3D Photobleaching.
- Pflanzensamen, die Zellen auf mit Gelatine beschichteten Glasobjektträgern mit einem dünnen Boden geeignet für Bildgebung lebender Zellen (Ölkapselung). Transfizieren der Zellen wie in Schritt 3.2 mit nicht-markierte, nicht-funktional ich (scr-ich) und Inkubation für 24 h oben beschrieben.
- Bereiten Sie die Zellen für die Abbildung, indem sie mit Calcein unmittelbar vor der Mikroskopie zu laden. Insbesondere ersetzt das Kulturmedium durch frisches Medium, 5 & mgr; M Calcein enthält, Inkubieren für 20 Minuten, Waschen mit PBS und frischem Kulturmedium hinzuzufügen. Vorwärmen des Inkubators des Mikroskops auf 37 ° C und die CO 2 -Konzentration auf 5% einzustellen.
HINWEIS: Alle Reagenzien sollten warm Zelle contrac zu vermeidention vor der Messung. - Verwenden, um einen 561-nm-Anregungslaser für Zell Visualisierung und das FRAP Experiment. Zuerst manuell auswählen Zellen für die Messung als Bereiche von Interesse (ROI); Prüfzellen sollte mindestens 3 benachbarte Zellen haben. Definieren eine Referenzzelle mit heller, stabiler Fluoreszenz, die nicht gebleicht werden. Definieren die Grenzen eines z-Stack. Aufzeichnung der Fluoreszenz von der Oberseite der Zellen auf dem Boden 10 umfassen - 15 Schichten.
- Bleichmittel Bleichmittel, die Testzellen mit 100% Laserleistung und die anschließenden Aufzeichnung fluorescence recovery (aufgrund GJ spezifische Farbstoffübertragung von benachbarten Zellen) während der folgenden 15 min. Notieren Sie die Rohdaten in den z-Stapel alle 60 s. Insgesamt führt die FRAP Messungen mit nicht weniger als von 5 bis 10 Testzellen pro Experiment. Vergleichen Sie die Ergebnisse auf untransfizierten Zellen.
5. Prüfung von Transfektionseffizienz
- Prüfung von miR-Aufnahme.
- Bereiten Sie die Sonden wie in Ste beschriebenp 4.1 und nutzen sie gleichzeitig ich-Aufnahme mit Durchflusszytometrie zu definieren.
- Bestätigen und beschreiben, um die intrazelluläre Lokalisation von Transfektionskomplexen durch konfokale und Hochauflösungs-strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM).
- Saatgut die HUVECs auf mit Gelatine beschichteten Glasplättchen gelegt in den Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatten, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.1). Transfizieren der Zellen mit 3-Farben beschriftet miR / PEI / MNP (Schritt 1.4) und Inkubation für 24 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2.
- Waschen Sie die Deckgläser zuerst mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und dann mit nur PBS. Fix - Zellen durch 16 in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 37 ° C für 15 min und Fleckenkerne mit DAPI nach Standardprotokollen inkubierte. 3 x waschen auf dem Schüttler (jeweils 15 min) überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
HINWEIS: PFA ist krebserregend und müssen sorgfältig behandelt werden. - Legen Sie die prepared Deckgläser auf Objektträger unter Verwendung von geeigneten Befestigungsmedien, trocknen lassen für mindestens 1 h, und verwenden sie für die Mikroskopie, wie unten beschrieben.
- Acquire Bilder eines 63X Ölimmersionsobjektiv und die folgenden SIM-Einstellungen: 405-, 488-, 561- und 633-nm-Laserlinien für die Anregung; Z-Stapel-Modus mit einer 32-Bit-Tiefe bei 5 Winkeln, 5 Phasen, mit Mitteln von 4; G2-Gitter 405 mit einer Laserlinie, G3 mit 488, G4 mit einem 561 und G5 mit einem 633.
- Bewerten Sie die Funktionalität des gelieferten ich von RT-qPCR in ich / PEI / MNP-HUVECs im Vergleich zu unbehandelten.
- Transfizieren die HUVECs ausgesät in einem 12-Well - Kulturplatte Schritten (3.1 und 3.2) mit funktioneller Antisense mich (zB anti-miR92a für HUVECs 31) und Inkubation für 48 h bei 37 ° C in einer befeuchteten ed Atmosphäre mit 5% CO 2.
- Bewerten Sie die anti-miR92a Lieferung und Verarbeitung mit RT-qPCR im Handel erhältlichen Kits (die Materialien sehen); folgen ter Anweisungen des Herstellers, wie an anderer Stelle 17, 31 beschrieben. Parallel dazu untersucht , die Expression des Zielgens (zB ITGA5 31).
HINWEIS: Antagomir Lieferung gegen endogen ich ist ahmt bevorzugt über, da sie die Messung der tatsächlichen Ergebnisse des ich gewährleistet und nicht nur seine intrazelluläre Akkumulation.
6. Zellbeurteilung und Targeting-Magnetzellseparation
- Zelle unter statischen Bedingungen in vitro - Targeting.
- Transfizieren den HUVECs in einer 24-Well - Platte (2,5 pmol / cm 2 scr-ich, NP 25 und 15-25 & mgr; g / mL MNP), inkubiere für 24 h, waschen und sammeln , wie oben (Schritt 4) beschrieben.
- Mischen Sie die erhaltene Zellpellet aus 1 und mit 1 ml frischem Kulturmedium und sie in den Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Fix einen kleinen Magnet vor Ort (an der Seite) an der Unterseite der Platte mit Klebeband.
- Inkubieren die Zellsuspension für 24 h und die Zellanheftung und das Wachstum in dem Bereich über den Magneten beobachten und in der Umgebung ohne einen Magneten. Für eine qualitative Bewertung, die ein herkömmliches inverses Mikroskop verwenden.
- Zelle in simulierten dynamischen Bedingungen in vitro - Targeting.
- Transfizieren den HUVECs in einer 24-Well - Platte pro Schritte 3.1 und 3.2 (2,5 pmol / cm 2 Cy3-ich, 25 NP, und 15 bis 25 & mgr; g / mL MNP), inkubiere für 24 h, Waschen, und sammelt durch Trypsinisierung unter Verwendung von 1x Trypsin-EDTA in PBS verdünnt, hinzugefügt, um die Zellen für 4 min bei 37 ° C. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min.
- Mischen Sie die erhaltene Zellpellet aus 1 und mit 1 ml frischem Kulturmedium und es in der Vertiefung einer 12-Well-Platte. Fix einen kleinen Magnet lokal (auf der Seite eines gut) unter Verwendung von Klebeband. Platzieren der Kulturplatte auf dem Schüttler und Inkubieren der Zellsuspension für 12 h bei 150 Umdrehungen pro Minute 34 dynamischen Bedingungen zu simulieren.
- Waschen Sie die Zellen und behebensie mit 4% PFA. Beflecken die Kerne mit DAPI 16. Zeichnen Sie die Zellanheftung mittels Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie mit einem 514-nm-Anregungslaser, z-Stapelmodus (5-12 slices) Rohdaten zu erhalten, und die maximale Projektionsbildintensitätsverarbeitung, um Bilder für die Analyse zu erstellen.
- Quantitative Analyse von magnetisch ansprechenden und nicht-ansprechenden Zellen.
- Transfizieren den HUVECs in einer 24-Well - Platte (2,5 pmol / cm 2 scr-du, NP 25 und 15-25 & mgr; g / mL MNP), inkubiere für 24 h, waschen und sammeln , wie zuvor beschrieben (Schritt 6.2.1) . Vorwärmen PBS und Zellsortierungspuffer (sterilfiltriert, siehe die Materialliste) bis 37 ° C. Resuspendieren des Zellpellets aus jeder Vertiefung mit 500 ul Zellsortierungspuffer erhalten.
- Anwenden dieser Zellsuspension auf ein magnetisches Sortierspalten durch die zugeführte Magneten befestigt, wäscht die Säulen auf den Magneten 3-mal mit frischem Zellsortierungspuffer und Sammeln des Durchflusses als magnetinisch nicht reagierenden Fraktion (MAG-).
- Entfernen Sie die Spalten aus dem Magneten und sofort sammeln, um die magnetisch ansprechenden Zellfraktion (MAG +) durch Drücken frischen Zellsortierungspuffer durch die Säule unter Verwendung eines Kolbens.
- Zentrifuge sowohl MAG- und MAG + bei 300 xg für 10 min. Das Zellpellet in PBS resuspendieren, zähle die Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen mit einem blauen Trypan Ausschluss - Assay 35 auszuwerten. Verwenden des erhaltenen Zellpellet entweder zur Langzeitanalyse (dh Wieder Samen und bewerten nach 24, 48 und 72 h in Kultur 17) oder direkt für die Durchflusszytometrie (Schritt 4.1.).
- Definiert die Eisenbeladung der transfizierten Zellen.
HINWEIS: Während der Vorbereitung, jeder Kontakt der Zellsonden mit Eisenoxidmaterialien und Instrumenten muss vermieden werden.- Sammle die transfizierte HUVECs und untransfizierten Kontrolle (wie in Schritt 4.1.1). Waschen Sie die gesammelten Zellen zweimal in 2% BSA in PBS 36 b y sorgfältig die Zellen mit 1 ml dieser Waschpuffer gemischt und dann bei 300 xg für 10 min zentrifugiert. Re-suspendieren des erhaltenen Zellpellet in 250 uL PBS, 100 ul 4% PFA, und inkubiere für 20 min Zellen zu fixieren. Waschen 3 mal mit PBS, wie oben beschrieben.
- die resultierende feste Zellpellet in 110 ul PBS und überträgt es auf 100 & mgr; l-PCR-Röhrchen resuspendieren.
- Nimm 10 & mgr; l-Aliquote für die Zellzählung und verwenden, um die restliche Probe für die Magnetpulverspektroskopie (MPS).
- Führen Sie die Messung auf einem handelsüblichen MPS-Gerät. Während der Messung gelten die folgenden Einstellungen: Magnetfeld B = 25 mT Antrieb und Frequenz f 0 = 25 kHz. Für Eisen Quantifizierung der Proben, normalisieren die dritten Harmonischen A 3 des MPS-Spektrums zu der entsprechenden A 3, ref eines MNP Referenzprobe mit einer bekannten Eisenmenge von 2,1 & mgr; gxref "> 37. Verwenden unbehandelte Zellen als Kontrolle.
7. Definieren von MRI Nachweisgrenzen
- Zellpräparation.
- Seed HUVECs in einer 6-Well - Platte und transfizieren (2,5 pmol / cm 2 scr-dich, NP 25 und 15 bis 25 & mgr; g / mL MNP) in Duplikaten oder Triplikaten in Übereinstimmung mit der erforderlichen Menge an Zellen (für Phantom Vorbereitung). Inkubieren der Zellen für 24 h und waschen, sammeln, und fixieren sie mit 4% PFA, wie zuvor beschrieben (Schritt 4).
- Zählen Sie die Zellen erhalten, bereiten Aliquots mit entsprechender Zellzahl (beispielsweise 10 3, 10 4, 10 5, etc.) und stellen ihr Volumen auf 50 & mgr; l.
- Agarose phantom Vorbereitung
- Vorbereiten mehrere Schichten von 2% Agarose in 50-ml - Röhrchen mit unterschiedlichen Mengen an transfizierter zwischen den Schichten 38 eingebetteten Zellen. Während der Zubereitung, beschallte Material und die heiße Agarose Zentrifuge 38Luftblasen zerstören, die Artefakte verursachen.
HINWEIS: Wichtig ist , Phantome 5,5 x 10 5 HUVECs , behandelten mit nicht-magnetisch ich / PEI - Komplexen enthalten , sollten in der gleichen Weise hergestellt werden , um als Kontrollen zu dienen.
- Vorbereiten mehrere Schichten von 2% Agarose in 50-ml - Röhrchen mit unterschiedlichen Mengen an transfizierter zwischen den Schichten 38 eingebetteten Zellen. Während der Zubereitung, beschallte Material und die heiße Agarose Zentrifuge 38Luftblasen zerstören, die Artefakte verursachen.
- Abtastung , die die in vitro erhaltenen Phantomen mit einem 7,1 T Tiere MRI System nach der Phantom zentral in der Spule platziert, parallel zur z-Achse des Magnetfeldes.
- Gelten die folgenden Sequenzparameter für einen Gradienten-Echo-Sequenz Erfassung: TR = 66 ms; TE1 / 2 TE / TE 3/4 TE / TE 5 / TE = 1.44 6 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; Flipwinkel = 3º; Matrix = 128 × 128, interpoliert auf 256 x 256; Sichtfeld = 42 mm; 100%; Mittelwert = 1, Echozuglänge = 1; Schichtdicke = 1,5 mm; und 16 Scheiben.
- Beurteilung der Signalabfall aller vier Echozeiten berechnen und R2 * Karten (R2 * = 1 / T2 *) unter Verwendung geeigneter Software, wie an anderer Stelle beschrieben 39.
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Representative Results
Der Hauptzweck des vorgeschlagenen Protokolls ist magnetisch ansprechende ich-modifizierten Zellen zu erzeugen , und ihre genaue Charakterisierung (Figur 1) zu leiten. Als Ergebnis sollten effizient transfizierten Zellen, die auf magnetische Auswahl und Führung und nachweisbar mit MRI, erhalten werden.
Zunächst wird die Identitäten von isolierten HUVECs wurden durch typische Färbung mit dem endothelialen Marker CD31 (PECAM) (2A) und durch ihre Fähigkeit bestätigt , Rohre auf der entsprechenden Basalmembranmatrix (2B) zu bilden. Die erhaltenen Zellen nahmen die ich eingeführt durch PEI / MNP sehr effizient auf; Mikroskopie zeigte , dass alle Zellen , die positiv für ein Signal von markierten sie (Cy3) 24 h nach der Transfektion (3A) waren. Wichtig ist , dass kein Zelltod aufgezeichnet im Vergleich zu unbehandelten Zellen (3B), und normal Erscheinungsbild wurde (3A) gehalten. Wie bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet wurde das Signal von Cy3-miR hauptsächlich innerhalb der Zellen befindet. Darüber hinaus ist eine genauere Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von allen Teilen des Transfektionsvektor und ich wurde mit höherer Auflösung unter Verwendung von 3-Farb-markierten Komplexen durchgeführt. SIM, du, PEI und MNP - Signale wurden alle im Zytoplasma in der perinukleären Region (3C) festgestellt.
Darüber hinaus hat eine detaillierte Untersuchung der Transfektionsvektor Sicherheit bewiesen , dass ich / PEI / MNP-HUVECs der Lage ist , Rohre auf der entsprechenden Basalmembranmatrix und dass das resultierende Netzwerk ist vergleichbar mit dem von unbehandelten Zellen als Positivkontrolle (4A bilden ). Darüber hinaus erhalten transfizierten Zellen GJIC, als 3D-FRAP Experimente zeigten. Insbesondere werden, wenn die Zellen mit fluoreszierendem GJ-Permea beladenble Farbstoff und eine von ihnen wird gebleicht, wieder seine Fluoreszenz mit benachbarten Zellen auf die Kommunikation aufgrund und die resultierende Farbstoffübertragung (4B).
Wichtig ist ermöglicht, aufgrund des Vorhandenseins der superparamagnetischen Verbindung 40 (5A), PEI / MNP - Anwendung nicht nur Zelltransfektion, sondern auch die gleichzeitige Magnetisierung. Die sich ergebende Menge an intrazellulärem Eisen wurde unter Verwendung von MPS (5B) für alle angelegten MNP Konzentrationen innerhalb des optimalen Bereichs (2,5 pmol / cm 2 miR; NP 25 ergänzt mit 5-25 & mgr; g / mL MNP) gemessen: 0,37 ± 0,079 bis 0,7 ± 0.150 pg Eisen / Zelle 17. Da die Verwendung von magnetischen Trennsäulen gezeigt, für alle diese MNP - Konzentrationen, ist die Menge der magnetisch reagierenden Zellen in dem Gesamtvolumen von transfizierten Zellen ~ 70% (5C). Zusätzlich transfizierte HUVECs ist mit MRI (5D) im Innern der in vitro Agarose Phantomen Mausgewebe Suszeptibilität nachahmt. Außerdem wurde die magnetische Ausrichtung der transfizierten HUVECs in dynamischen Bedingungen simuliert , in vitro bewiesen effizient (Abbildung 6) sein. In diesem Versuchsaufbau, auch die ständige kräftige Bewegung des Kulturmediums nicht verhindern, dass das Zellwachstum in dem Bereich in der Nähe von Magnetanwendung vorherrscht.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von Magnetized miR-modifizierten HUVECs und deren Analyse. Das PEI / MNP (Polyethylenimin / superparamagnetische Nanopartikel-Vektor) angewandt microRNA (du) an humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) zu liefern. Die erhaltene Zellprodukt durch die folgenden Parameter gekennzeichnet: Sicherheit (einschließlich die Lebensfähigkeit der Zellen, funktionelleity, und die Kapazität für die interzelluläre Kommunikation); Transfektionseffizienz (dh ich Aufnahmeeffizienz und die Funktionalität danach); Magnet in vitro in statischen und dynamischen Bedingungen simuliert Targeting; Magnetresonanztomographie (MRI) Detektion. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Charakterisierung von isolierten HUVEC. A. Repräsentative Bild des isolierten und kultivierten HUVECs mit endothelialen CD31 Marker gefärbt. Die Kerne sind mit DAPI gegen (blau). Der Maßstab ist 20 um. B. Repräsentative Ergebnis des Assays an isolierten Tubusbildung HUVECs durchgeführt wird ; das Bild wurde unter Verwendung einer Laser-Scanning-Konfokalmikroskop (differential aufgezeichnet interferenz Kontrast) 18 h nach dem Einschalten der Basalmembranmatrix Aussähen der Zellen. Der Maßstab beträgt 100 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. ich Lieferung in HUVECs mit PEI / MNP. A. Die Aufnahme von miR getaggt (Cy3, rot) 24 h nach der Transfektion (2,5 pmol / cm 2 von Cy3-markiert miR, NP 25 und MNP 25 & mgr; g / ml) und die Aufrechterhaltung des normalen Zell Aussehens dargestellt. Bilder wurden durch konfokale Laserrastermikroskopie aufgenommen unter Verwendung eines 514-nm-Anregungslaser (Cy3, rot) und Differential-Interferenz-Kontrast. Der Maßstab ist 50 um. B. Die Lebensfähigkeit der Zellen 24 h nach der Transfektion wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Das Grundstück stellt die Ergebnisse für HUVEC erhaltenS mit den folgenden komplexen Zusammensetzungen behandelt: 2,5 pmol / cm 2 von Cy3-miR; NP-Verhältnis 25 mit 5 bis 25 & mgr; g / ml ergänzt MNP. Die Balken zeigen das Verhältnis zwischen der mittleren Anzahl von lebensfähigen Zellen und der gesamten Zellpopulation (n = 6; Fehlerbalken: SEM). C. strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) Bildgebung von 3-Farb - markiert sie / PEI / MNP - Komplexe von HUVECs aufgenommen. Die Zellen wurden transfiziert, wie oben beschrieben, inkubiert und 24 h nach der Behandlung festgelegt; die Kerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Raw SIM-Daten wurden in z-Stapel aufgezeichnet und verarbeitet werden; Die repräsentativen Bilder sind das Ergebnis der maximalen Intensitätsprojektion. Der folgende Anregungslaser wurde angewandt: 405 nm (DAPI, blau), 488 nm (Atto488-PEI, orange), 565 nm (ATTO565-MNP, cyan) und 633 nm (Cy5-mich, rot). Der Maßstab beträgt 5 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Sicherheit von HUVECs Modifikation mit miR / PEI / MNP. 48 h nach der Behandlung; A. Eine Rohrbildungstest wurde mit transfizierten Zellen (NP 25 und MNP 25 ug / ml 2,5 pmol / cm 2 von scr-miR) durchgeführt. Die Bilder wurden mit einem Laser - Scanning - Konfokalmikroskop erfaßt (dh Differentialinterferenzkontrast) 18 h nach der Zellaussaat an Basalmembran - Matrix. HUVECs mit miR / PEI transfiziert wurden als Toxizitätskontrolle und unbehandelten Zellen als eine positive Kontrolle verwendet. Der Maßstab beträgt 100 um. Das Diagramm gibt das Verhältnis zwischen den transfizierten HUVECs und den unbehandelten Zellen unter Verwendung von mehreren Parametern ab: Rohrlänge, Anzahl der Verzweigungen und Kreuzungen (n = 3, Fehlerbalken: SEM). B. Die gap junction-vermittelte interzelluläre Kommunikation von miR / PEI / MNP-modifiziertes HUVECs wurde bewertet von 24 h post-transfection. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit dem GJ-permeable Farbstoff Calcein (orange) geladen wird; Frap (FRAP) wurde durch Scannen Testzellen in Z-Stapel in 3D untersucht. Repräsentative Bilder von Calcein-beladenen Zellen vor dem Bleichen, unmittelbar nach dem Bleichen, und 15 min nach dem Bleichen (mit wiederhergestellter Fluoreszenz) dargestellt. Der Maßstab ist 20 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Zell Magnetisierung Transfection Resultierende mit PEI / MNP und seiner Anwendung. A. Repräsentative Bild gefilterter MNP mit TEM genommen, die gruppierten Morphologie veranschaulicht. Eine geringe Größe (~ 5 bis 15 nm) von einzelnen Eisenoxidteilchen (was zu Superparamagnetismus) dadurchbestätigt. Der Maßstab beträgt 100 nm. B. Die intrazelluläre Beladung von transfizierten Zellen wurde durch Magnetteilchen - Spektroskopie (MPS) 24 h nach der Transfektion bewertet. Der repräsentative Panel zeigt das MPS-Spektrum der untersuchten Proben. Insbesondere reine MNP-Suspension (50 ul) diente als Referenz (blaue Quadrate); die Kreise sind die MPS-Spektren der beiden transfizierten Zellproben (rote Kreise: MNP 25 & mgr; g / ml; grüne Kreise: MNP 5 ug / ml), während die graue Dreiecke des erfaßten Hintergrundspektrum, erhalten durch eine Messung ohne Proben zeigen. Man beachte die logarithmische Skala der Amplitude (A). Die Menge an magnetisch modifizierten Zelle wurde durch die Anwendung von transfizierten HUVECs (2,5 pmol / cm 2 ich; NP 25 ergänzt mit 5-25 & mgr; g / ml MNP) quantifiziert, gesammelt durch Trypsinisierung 24 h nach der Behandlung auf einen magnetisches Zelltrennsäule. Die sich ergebende positive magnetisch Fraktion (dh die in der Spalte blieb)wurde gezählt, und dessen Anteil wird für jede Konzentration MNP (rote Dreiecke) auf dem Grundstück aus der Gesamtmenge an transfizierter Zellen reflektiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde anschließend durch Trypanblau-Ausschluss-Assay (graue Rauten) untersucht. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben (n = 3). D. Ein illustrativen MRI - Bild von transfizierten HUVECs (300.000 Zellen; 2,5 pmol / cm 2 ich; NP 25 & 25 & mgr; g / ml MNP) in ein Agarose - Phantom mit einem eingebetteten System 7.1 T Tier MRI aufgezeichnet wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. In - vitro - Magnetic - Targeting von miR / PEI / MNP-HUVECs in Simulierte Dynamische Bedingungen. HUVECs wurden 24 Stunden nach der Transfektion gesammeltIon (2,5 pmol / cm 2 von Cy3-miR; NP 25 & MNP 25 ug / ml) und erneut ausgesät in frischem Kulturmedium in den Vertiefungen mit einem kleinen Magneten an die Seitenwand befestigt ist lokal. Dann wurde diese Kulturplatte auf einen Schüttler bei 150 rpm fixiert dreht. Zellanheftung und das Wachstum wurden 12 h später bewertet, indem die Zellen mit PFA, Anfärben ihre Kerne mit DAPI, und Durchführen von Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie Befestigungs (Anregungslaser: 405 nm, DAPI, blau, 514 nm, Cy3, orange). Repräsentative Bilder zeigen das Zellwachstum in dem Bereich mit Magnetanwendung; ohne Magnet-Anwendung; und in der Mitte der Kultur gut, wo die Strömung der Flüssigkeit, die die Zellen konzentriert. Die Maßstabsbalken sind 50 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Herstellung von gentechnisch veränderten Zellen, beladen mit superparamagnetische Nanopartikel für ihre weiteren magnetisch gesteuerte Führung wird in dem aktuellen Protokoll dargestellt. Die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie ermöglicht die Auflösung einiger Schwierigkeiten der Zelltherapie, wie geringe Retention und schlechte Einpflanzung in dem verletzten Bereich 2, 3, 4, durch ein anzielbare Zellprodukt zur Transplantation bereitstellt. Darüber hinaus könnte die gleichzeitige Einführung von richtig ausgewählten genetischen Materials Zelleigenschaften fördern und damit funktionelle Vorteile 41 erhöhen könnte.
Das aktuelle Protokoll wurde auf HUVECs als Modell entwickelt. Diese Zellen sind dafür bekannt , schwierig zu transfizieren und anfällig für toxische Einflüsse 18, 19, 20. die DMonstrated Ebene der fluorophormarkierten miR - Aufnahme mehr als 95% nach PEI / MNP Transfektion wird typischerweise mit PEI basierenden Vektoren und am häufigsten verwendete kationischen Lipidbasis Transfektionsreagenzien (zB Lipofectamine) 42 erhalten. Darüber hinaus entspricht das optimale NP-Verhältnis von 25 mit bisher veröffentlichten Werten von 20 bis 40 für den NP. Trotzdem ist die hoch effiziente Aufnahme der getesteten Fluorophor-markierte sie nicht unbedingt garantiert richtige du Verarbeitung und Funktion nach der Entbindung 43. Dieser Punkt ist besonders relevant im Fall von PEI mit seiner engen elektrostatischen Kondensation von NA. Somit muss die resultierende Funktionsfähigkeit der gelieferten ich auch getestet werden. Hierbei wird ein funktionell ich endogen in HUVEC ausgedrückt, du-92a , 31, wurde ausgewählt, und anti-ich dagegen wurde mit PEI PEI und / MNP geliefert. Als Ergebnis erwies sich ein nahezu vollständiger Zuschlags des Ziel miR-92a die effiziente Freisetzung der anti-ich fROM Die Transfektionskomplexe.
Wichtig ist , dass in früheren Arbeiten wurde die erfolgreiche Anwendung des PEI / MNP - Vektor für die Zuführung von Plasmid - DNA (pDNA) und ich zu anderen Zelltypen nachgewiesen, sowohl adhärent (zB COS - 7, Menschliche mesenchymale Stammzellen 15, 16) und in Suspension (zB Knochenmark stamm CD133 + hämatopoetische Stammzellen 44). All diese Versuche haben die bekannte Tatsache bestätigt , dass die Transfektionseffizienz und Toxizität ist zelltypabhängig 45. Somit sollte die Auswahl der optimalen Vektor Zusammensetzung (dh ich Menge, NP - Verhältnis und die Menge an Eisen MNP) für jeden bestimmten Zelltyp durchgeführt werden, zuvor festgelegte optimale Bedingungen als Bezugspunkte verwendet.
Darüber hinaus sollte der vorübergehende Charakter der erzielten genetischen Veränderung berücksichtigt werden. Auf der einen Seite, it ist sehr geeignet für bestimmte Funktion, wie die kurzfristigen Lieferung von Wachstumsfaktoren. Auf der anderen Seite, für eine Vielzahl von Zwecken für die langfristige Expression möglicherweise nicht lange genug dauern, die Dauer des Ausdrucks. Dennoch unterstützt die bewährte Sicherheit des PEI / MNP-Vektor seine mögliche wiederholte Verabreichung sobald die Bedingungen weiter optimiert werden.
PEI und seine Derivate werden im allgemeinen aufgrund ihrer hohen Effizienz verwendet im Vergleich zu anderen nicht-viralen Fahrzeuge und ihre Flexibilität zu 7 - Modifikation. Jedoch trotz PEI Erfolgs in vitro und in vivo, ihre Anwendung in klinischen Studien ist sehr begrenzt (dh wenige Phase 1 und 2 Studien oder Krebspatienten) 7, 14 aufgrund PEI Toxizität 7, 13. Wie schon in früheren Arbeiten unserer Gruppe 16 sowie dieses Protokoll, hat gezeigt, MNPsPEI Toxizität verringern signifikant können. Insbesondere hat ich / PEI - Transfektion die Fähigkeit von HUVECs beschädigten Rohre auf ihrer Matrix zu bilden, wodurch ein Haupt in vitro Funktionstest für diese Zellen versagen. Im Gegensatz dazu tube formation Leistung von miR / PEI / MNP-HUVECs war vergleichbar mit unbehandelten Zellen. Bemerkenswerterweise wurde diese Abnahme der Toxizität PEI durch Einführen niedrige Niveaus von Komponenten, wie Eisenoxid erreicht, die biokompatibel sind und routinemäßig als ein Kontrastmittel in menschlichen Patienten 40 eingesetzt.
Neben der funktionalen Eigenschaften beibehalten wird , ist es wichtig , dass die modifizierten Zellen sind in der Lage zur Festlegung der interzelluläre Kommunikation, da dieses Merkmal für die korrekte Integration von Zelltherapeutika post-Transplantation 46 notwendig ist. Darüber hinaus können modifizierte Zellen als Träger für die Abgabe von therapeutisch miR zu verletzten Geweben 47 ausgenutzt werden. In diesem Fall ihre capacity-Moleküle mit benachbarten Zellen auszutauschen definiert ihren Erfolg als ein Fahrzeug. Da PEI / MNP Transfektion GJIC in modifizierter HUVECs erlaubt, haben sie das Potenzial für die Integration in vivo und du Lieferung an geschädigte Bereiche zu liefern.
Bemerkenswerterweise haben früher veröffentlichte Arbeiten über Zell Magnetisierung für nachfolgendes Targeting des Zellbeladung von ~ berichten 4 und 30 pg von Eisen / Zelle 48, 49, 50, 51. Diese Zahlen übersteigen deutlich die Werte von 0,16 bis 0,7 ~ pg / Zelle, die für die in vitro - Targeting von NA / PEI / MNP-HUVECs in statischen und dynamischen Bedingungen simuliert ausreichten. Solche niedrigen Eisen Mengen sind in Bezug auf die Sicherheit von Vorteil: ein allgemein bekannter Mechanismus von Eisenoxid - Nanopartikel-assoziierte Toxizität (dh die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)) ist bekannt , direkt mit der Menge der inte zugeordnet werdenrnalized Nanopartikel 40. Außerdem haben mehrere Studien gezeigt , dass die hohe intrazelluläre Spiegel von Eisenoxid - Nanopartikeln zu dosisabhängigen Zytoskelett Desorganisation und Beschädigungen führen kann 52, 53. Wichtig ist, berichtet die meisten Fälle von Zell Magnetisierung für Targeting-Zwecke enthalten keine genetische Zellmanipulation. Im Gegensatz dazu stellt die ich / PEI / MNP Vektor die Möglichkeit, gleichzeitig Zellen zu modifizieren und magnetische Eigenschaften hinzuzufügen.
Allerdings könnte niedrige MNP Beladung für die magnetische Ausrichtung in einer turbulenten Umgebung mit Blutfluss nicht ausreichend sein. Um die anspruchsvollen näher zu kommen in vivo Situation wurden die dynamischen Bedingungen in vitro simuliert: Kulturplatten mit magnetisiert ich / PEI / MNP-HUVECs in Suspension auf der rotierenden Schüttelmaschine 34 gelegt wurden. Dieses Experiment eindeutig nicht alle Interaktionen die auftreten , invivo. Allerdings führte sie zu einem besseren Verständnis des Targeting-Potenzials von PEI / MNP-modifizierten Zellen. Als Ergebnis wurde hocheffiziente Zelltargeting demonstriert , als auch aktive Schütteln des Kulturmediums nicht mit der Zellbewegung in Richtung des Magneten 54 nicht störten. Zu diesem Zweck wurde ich-modifizierte HUVECs mit mindestens ca. 0,16 pg von Eisen / Zelle geladen. Darüber hinaus magnetisch reagierende Zellen können sortiert werden. Ein Magnet-basierten Zelltrennungsverfahren der vorliegenden Studie angewandt haben nicht die Lebensfähigkeit der ich / PEI / MNP-Zellen beeinträchtigt. Wichtig ist , dass die Anwendung eines statischen Magnetfeldes (dh Targeting - Experimente, die die Anwendung eines Magnetfeldes für 12 beteiligt - 24 h) hat keinen schädigenden Effekt auf die Zielzellen haben. Daher stellt die Produktion von demonstriert magnetisiert genetisch veränderten Zellen , die die Grundlage für weitere in - vivo - Studien , die Effizienz der Zellbindung durch Magnetkraft sichergestellt Adressierung. Bemerkenswert ist, th51, 54, 55 verwendet , um Zellbindung nach lokaler Verabreichung anstelle von Zellführung nach intravenöser Injektion e erfolgreichsten in vivo Studien , die die Ausrichtung der magnetisierten Zellen verwendet. Daher erscheint wünschenswert , auf Magnetbasis Retention an der Injektionsstelle für weitere in - vivo - Anwendungen von miR / PEI / MNP-modifizierten Zellen.
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Disclosures
Wir haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.
Acknowledgments
Wir möchten, dass beim Erwerb von TEM-Aufnahmen von gefilterten superparamagnetische Nanopartikel und bei der Durchführung ihrer Röntgenanalyse G. Fulda (Elektronenmikroskopie Zentrum, Universität Rostock, Deutschland) für die technische Unterstützung. Die Arbeit an der RTC Rostock durchgeführt wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 und VIP + 03VP00241) und dem Staat Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF / IV-WM-B34- unterstützt 0030/10 und ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) und von der DFG (DA 1296-1), die Damp-Foundation und der deutschen Herz Foundation (F / 01/12). Frank Wiekhorst wurde von dem EU FP7 Forschungsprogramm "Nanomag" FP7-NMP-2013-LARGE-7 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
| Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 µm |
| Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120 kV | |
| Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
| Cell culture plastic | TPP | ||
| NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
| NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
| Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
| Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
| MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
| Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
| Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
| Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
| NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
| hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
| FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
| ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
| RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
| 18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | ||
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
| MPS device | Bruker Biospin | ||
| Matlab software | Mathworks | ||
| Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
| FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |
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